Способ морфометрической оценки прогноза течения иммунной тромбоцитопении после спленэктомии по индексу соотношения масс CD4+/CD8+ T-лимфоцитов селезенки Российский патент 2017 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, в частности к гематологии. Способ может быть использован для прогнозирования течения иммунной тромбоцитопении (ИТП) после спленэктомии путем морфометрической оценки в гистологических срезах селезенки количества CD4+ и CD8+ Т-клеток после иммуногистохимического окрашивания лимфоцитов, вычисления их массы и расчета индекса соотношения масс (ИСМ) CD4+/CD8+ Т-клеток.

Цель изобретения - разработка способа морфометрического прогнозирования течения ИТП после спленэктомии по ИСМ CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов селезенки.

ИТП является одним из наиболее распространенных аутоиммунных заболеваний, характеризующимся изолированным снижением содержания тромбоцитов крови преимущественно за счет их разрушения. В основе развития патологического процесса лежат сложные иммунные механизмы, конечным этапом которых является образование антитромбоцитарных антител, приводящих к снижению количества тромбоцитов в периферической крови (P.Y. Choi, F. Roncolato, X. Badoux [et al.] A novel triple therapy for ITP using high-dose dexamethasone, low-dose rituximab, and cyclosporine (TT4) // Blood. - 2015. - Vol. 126, №4. - P. 500-5003; D. Provan, R. Stasi, A. Newland [et al.] International consensus report on the investigation and management of primary immune thrombocytopenia // Blood. - 2010. - Vol. 115, №2. - P. 178-186).

Известно, что ключевую роль в патогенезе ИТП играет селезенка. В последнее время появились сообщения о Т-клеточном механизме ингибирования активации клеточных линий с участием CD4+ регуляторных лимфоцитов, играющих ведущую роль в иммунном ответе при данном заболевании (W. Bao, J.B. Bussel, S. Heck [et al.] Improved regulatory T-cell activity in patients with chronic immune thrombocytopenia treated with thrombopoietic agents // Blood. - 2010. - Vol. 116, No 22. - P. 4639-4645; B.H. Chong ITP: Tregs come to the rescue // Blood. - 2010. - Vol. 116, No 22. - P. 4388-4390). Встречаются работы, указывающие на активацию CD8+ Т-клеток в лимфоидном органе и их участие в разрушении тромбоцитов у пациентов с ИТП, не отвечающих на иммуносупрессивную терапию (S. Audia, M. Samson, M. Mahevas [et al.] Preferential splenic CD8+ T-cell activation in rituximab-nonresponder patients with immune thrombocytopenia // Blood. - 2013. - Vol. 122. - P. 2477-2486; W. Bao. J.B. Bussel, S. Heck [et al.] Improved regulatory T-cell activity in patients with chronic immune thrombocytopenia treated with thrombopoietic agents // Blood. - 2010. - Vol. 116, No 22. - P. 4639-4645). Однако до сих пор недостаточно изучена роль CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов селезенки в патогенезе ИТП. Отсутствуют сведения о влиянии массы CD4+ и CD8+ клеток лимфоидного органа, а также ИСМ CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов на течение патологического процесса после спленэктомии.

Способа морфометрической оценки прогноза течения ИТП после спленэктомии по индексу соотношения масс CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов селезенки не существует.

Прототип отсутствует.

Аналогом является известный способ оценки CD4+ и CD8+ Т-клеток селезенки у больных ИТП, не отвечающих на терапию ритуксимабом (S. Audia, M. Samson, M. Mahevas [et al.] Preferential splenic CD8+ T-cell activation in rituximab-nonresponder patients with immune thrombocytopenia // Blood. - 2013. - Vol. 122. - P. 2477-2486).

Отличия заявляемого способа от аналога включают:

1. В заявляемом способе после иммуногистохимического окрашивания гистологических срезов селезенки производят подсчет количества CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, вычисляют их массу и рассчитывают индекс соотношения масс, по значениям которого прогнозируют варианты течения ИТП после спленэктомии.

2. В аналоге цитофотометрически по относительному количеству (%) CD8+ и CD8+/CD4+ Т-клеток в селезенке и крови оценивают результаты лечения ИТП у пациентов, не отвечающих на терапию ритуксимабом, метод не позволяет прогнозировать варианты течения ИТП.

В процессе проведения патентно-информационного поиска не выявлено источников, порочащих новизну предлагаемого изобретения.

Заявляемое изобретение разработано в лаборатории патоморфологии крови ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России в соответствии с планом научно-исследовательской работы.

Способ осуществляется следующим образом.

После проведения спленэктомии у больных ИТП определяют массу удаленной селезенки. Гистологическую проводку образцов исследуемого материала выполняют общепринятым способом. Приготовление срезов осуществляют из парафиновых блоков селезенок, толщиной 3-5 мкм. Для идентификации CD4+ и CD8+ T-лимфоцитов в селезенке используют метод иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания; постановку реакции осуществляют по стандартной методике. Морфометрическую оценку количества CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов выполняют на световом микроскопе со встроенной фото- и видеокамерой с помощью программного обеспечения анализа изображений ImageScope Color, версии М, с окуляром х10, при объективе х100. Исследования проводят в 20 полях зрения для каждого образца, начиная от капсулы вглубь лимфоидного органа. Исходя из полученных результатов, вычисляют массу CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов и рассчитывают ИСМ CD4+/CD8+ клеток селезенки по формулам:

М₁=m×D₁/100%

М₂=m×D₂/100%

ИСМ=М₁/M₂,

где:

M₁ - масса CD4+ Т-лимфоцитов (г),

М₂ - масса CD8+ Т-лимфоцитов (г),

D₁ - количество CD4+ Т-лимфоцитов, %,

D₂ - количество CD8+ Т-лимфоцитов, %,

m - масса селезенки, г,

ИСМ - индекс соотношения масс CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов селезенки.

Исследования выполнены на гистологических срезах парафиновых блоков селезенок от 20 больных ИТП после спленэктомии в возрасте от 21 до 65 лет (10 - мужского пола и 10 женского). После спленэктомии определяли массу селезенки, выполняли проводку образцов послеоперационного материала, морфометрически после ИГХ окрашивания подсчитывали количество CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов селезенки, вычисляли их массу и рассчитывали ИСМ CD4+/CD8+ клеток. При значениях ИСМ CD4+/CD8+ лимфоидных элементов менее 2,3 прогнозировали рефрактерную форму ИТП, а при показателях, равных и более 2,4, - вариант ИТП с благоприятным течением заболевания. По результатам анализа у 10 пациентов после спленэктомии была установлена рефрактерная форма патологического процесса и у 10 - благоприятное течение заболевания.

Результаты исследований представлены в примерах, подтверждающих возможность заявляемого способа прогнозировать варианты течения ИТП после спленэктомии по ИСМ CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов селезенки.

Пример 1.

Больная М, 59 лет, поступила в гематологическое отделение ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России 03.04.2011 г. Анализ крови при поступлении: гемоглобин 154 г/л, эритроциты 5,5×10¹²/_л, лейкоциты 14,4×10⁹/_л, тромбоциты 9×10⁹/_л. Диагноз при поступлении: ИТП, тяжелая форма, плохо контролируемая лекарственными препаратами. Через 2 месяца выполнена операция (07.06.2011): спленэктомия - без осложнений. Масса селезенки больной (m) составила 119,0 г. Проведено ИГХ окрашивание лимфоцитов в гистологических срезах селезенки по стандартной методике. С помощью морфометрического исследования определено количество (D₁) CD4+ 13,4% и (D₂) CD8+ 7,9% Т-лимфоцитов. По ранее приведенным формулам вычислены их массы: (M₁) CD4+ и (М₂) CD8+ Т-клеток. Установленные величины масс получены в ходе следующих расчетов: М_1(CD4+)=119,0 г × 13,4%/100 (15,9 г) и М_2(CD8+)=119,0 г × 7,9%/100 (9,4 г). ИСМ CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов селезенки составил 1,7 (<2,3).

Заключение: по результатам иммуногистохимического и морфометрического анализа установлено, что у пациентки с ИТП рефрактерная форма течения заболевания. При динамическом наблюдении за больным уже спустя 2 месяца после спленэктомии прогноз был подтвержден лабораторными показателями (15.08.10): гемоглобин 134 г/л, эритроциты 4,89×10¹²/_л, лейкоциты 10,3×10⁹/_л, тромбоциты 75×10⁹/_л. Пациентка до настоящего времени нуждается в поддерживающей терапии.

Пример 2.

Больная Б., 57 лет, поступила в гематологическое отделение ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России 27.04.2010 г. Анализ крови при поступлении: гемоглобин 117 г/л, эритроциты 4,74×10¹²/_л, лейкоциты 4,73×10⁹/_л, тромбоциты 21×10⁹/_л. Диагноз при поступлении: ИТП, тяжелая форма, плохо контролируемая лекарственными препаратами. Через 5 месяцев выполнена операция (12.10.2010): спленэктомия - без осложнений. Масса селезенки больной (m) составила 101,0 г. Проведено ИГХ окрашивание лимфоцитов в гистологических срезах селезенки по стандартной методике. С помощью морфометрического исследования определено количество (D₁) CD4+ 18,2% и (D₂) CD8+ 2,3% Т-лимфоцитов. По ранее приведенным формулам вычислены их массы: (M₁) CD4+ и (М₂) CD8+ Т-клеток. Установленные величины масс получены в ходе следующих расчетов: M_1(CD4+)=101,0 г × 18,2%/100 (18,4 г) и М_2(CD8+)=101,0 г × 2,3%/100 (2,4 г). ИСМ CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов селезенки составил 7,7 (≥2,4).

Заключение: по результатам иммуногистохимического и морфометрического анализа установлено, что у пациентки с ИТП благоприятный вариант течения заболевания. При динамическом наблюдении за больной прогноз был подтвержден лабораторными показателями, значения которых находились в пределах нормы в течение 47 месяцев после спленэктомии (29.09.14): гемоглобин 136 г/л, эритроциты 4,55×10¹²/л, лейкоциты 7,03×10⁹/л, тромбоциты 360×10⁹/л. В настоящее время пациентка не нуждается в поддерживающей терапии.

Заявляемое изобретение обладает новизной, дает при использовании положительный результат, заключающийся в возможности по ИСМ CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов селезенки прогнозировать течение ИТП после спленэктомии. При значениях ИСМ CD4+/CD8+ Т-клеток селезенки <2,3 прогнозируют рефрактерную форму патологического процесса, а при величинах ≥2,4 - благоприятное течение заболевания.

Предлагаемый способ информативен, может быть использован в гематологических отделениях, патоморфологических и гистологических лабораториях в качестве дополнительного критерия, предопределяющего прогноз ИТП у больных после удаления селезенки, а также дифференцированного подхода при назначении терапии.

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и предназначено для прогнозирования течения иммунной тромбоцитопении после спленэктомии. Для осуществления изобретения определяют массу удаленной селезенки, выполняют гистологическую проводку образцов послеоперационного материала общепринятым способом с приготовлением парафиновых блоков. Для идентификации и подсчета CD4+ и CD8+ лимфоцитов в гистологических срезах селезенки проводят иммуногистохимическое окрашивание. В гистологических срезах селезенки подсчитывают количество CD4+ и CD8+ клеток, вычисляют их массу и рассчитывают индекс соотношения масс (ИМС) CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов. При значениях ИСМ CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов <2,3 прогнозируют рефрактерную форму иммунной тромбоцитопении, а при ≥2,4 устанавливают благоприятное течение заболевания. Использование изобретения обеспечивает эффективную морфометрическую оценку течения иммунной тромбоцитопении после спленэктомии. 2 пр.

Способ морфометрической оценки прогноза течения иммунной тромбоцитопении после спленэктомии по индексу соотношения масс CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов селезенки, характеризующийся тем, что после удаления селезенки определяют ее массу, в гистологических срезах лимфоидного органа после иммуногистохимического окрашивания подсчитывают количество CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, вычисляют их массу и рассчитывают индекс соотношения масс CD4+/CD8+ Т-клеток и при значениях индекса соотношения масс CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов селезенки <2,3 прогнозируют рефрактерную форму иммунной тромбоцитопении, а при ≥2,4 устанавливают благоприятное течение заболевания.