СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТЯЖЕСТИ ТЕЧЕНИЯ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ ПРИ СНИЖЕНИИ В ГЛАДКОЙ МУСКУЛАТУРЕ СЛИЗИСТОЙ БРОНХОВ АКТИВНОСТИ МИОГЛОБИНПЕРОКСИДАЗЫ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/50 

1. Цель изобретения - разработать способ определения тяжести течения бронхиальной астмы по степени активности миоглобинпероксидазы в гладких мышечных клетках слизистой оболочки бронхов.

2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке способа оценки тяжести течения бронхиальной астмы по степени активности миоглобинпероксидазы в гладких мышечных клетках слизистой оболочки бронхов.

3. Раскрытие изобретения

Пероксидазы являются гемопротеидами, которые катализуют окисление различных веществ с помощью перекиси водорода. Эти ферменты обнаружены в мышечных элементах, щитовидной железе, молочной железе. Чрезвычайно важна роль пероксидаз как сильно действующего фактора на антиокислительные ферменты [3-5]. Разработанный калориметрический метод, основанный на регистрации кинетики теплопродукции при разложении перекиси водорода, позволяет дифференцировать пероксидазный путь разложения перекисей [2]. Установлено, что в эритроцитах основным защитным фактором от перекисной деструкции гемоглобина являются пероксидазы (одна из ее разновидностей - каталаза).

4. Новая техническая задача

Определять с помощью гистохимической реакции в гладких мышечных клетках слизистой оболочки, полученной в результате забора биоптатов стенки бронхов, активность миоглобинпероксидазы, позволяющая оценить антиокислительные процессы в мышечных клетках слизистой бронхов, влияющей на степень тяжести течения бронхиальной астмы.

5. Прототипом исследования взята работа Титова В.Ю. (2003) [6] «Роль антиокислительных ферментов в защите эритроцитарного гемоглобина и внеклеточных физиологических сред от перекисной деструкции». В своей работе автор предлагает новый способ оценки защитного действия пероксидаз на антиокислительные процессы в эритроцитах периферической крови путем регистрации кинетики теплопродукции при разложении перекиси водорода с участием одной из разновидностей пероксидаз - пероксидазы эритроцитов каталазы. В отличие от вышеописанного способа в настоящей работе имеются следующие отличия:

1) Материалом для исследования у человека используется гладкая мускулатура слизистой бронхов, полученная путем биопсии.

2) Оценка антиперекисного процесса в гладких мышечных клетках проводится путем определения активности гемоглобинпероксидазы гистохимическим методом.

3) Интенсивность гемоглобинпероксидазной реакции в гладкой мускулатуре бронхов позволяет давать оценку степени тяжести течения бронхиальной астмы.

6. Осуществление изобретения

6.1. Обследовано 68 пациентов в возрасте 35-40 лет с диагнозом

бронхиальная астма тяжелой формы (3-я) и 85 пациентов (1-я) с легкой формой течения бронхиальной астмы (БА) в возрасте 30-35 лет. Исследования проводились на базе пульмонологического отделения клиники Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Дальневосточный центр физиологии и патологии дыхания».

6.2. Исследования проводили с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с участием человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в РФ, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г.

6.3. Всем пациентам выполнялась бронхоскопия с последующим забором биопсийного материала. Осмотр трахеобронхиального дерева осуществляли при бронхофиброскопии, которую проводили при обследовании во время вводного периода и на этапах 12-48 недель наблюдения за больными бронхиальной астмой. Бронхофиброскопию выполняли под местной анестезией Sol. Lidocaini 2% в количестве 10-12 мл бронхофиброскопом фирмы «Olympus» BFIT-20 (Япония). У больных тяжелой и среднетяжелой БА при необходимости применяли премедикацию бронхолитиками и вентиляционную поддержку кислородом. При осмотре трахеобронхиального дерева оценивали эндоскопический признак гиперреактивности бронхов (ЭГРБ). В зависимости от выраженности развивающегося сужения бронхов выделяли три степени ЭГРБ: 1-я степень - сужение просвета бронха не более чем на 30% от исходного размера; 2-я степень - сужения просвета на 30-50%; 3-я степень - сужения просвета бронха более чем на 50% от исходного размера.

Биопсию слизистой оболочки на уровне среднедолевого бронха и сегментарных бронхов базальной пирамиды нижней доли правого легкого выполняли биопсийными щипцами FB 19-C «Olympus» (Япония) через инструментальный канал бронхофиброскопа. Определялось состояние функции внешнего дыхания (ФВД) у больных с бронхиальной астмой в % на аппарате Ultracreen (Германия) (фигура 1)·

ЖЕЛ-здоровые - 103,0±2,0; легкая форма - 94,9±3,7; тяжелая - 69,1±4,2

ФЖЕЛ-здоровые - 99,4±2,2; легкая форма - 92,3±3,0; тяжелая - 64,2±3,8

ОФВ₁-здоровые - 93,0±2,4; легкая форма - 83,5±4,3; тяжелая - 45,7±4,4

МОС₇₅-здоровые - 84,9±5,2; легкая форма - 56,2±5,0; тяжелая - 32,4±2,9.

При оценке средних параметров, характеризующих объем легких, у больных с легким течением БА достоверного снижения ЖЕЛ и ФЖЕЛ по сравнению со здоровыми лицами не установлено. Наиболее выраженное снижение функциональных параметров бронхиальной проходимости наблюдалось у больных с тяжелой формой течения БА. У них зафиксировано выраженное снижение показателей бронхиальной проходимости, вероятно обусловленное выраженными воспалительными процессами в сочетании с гладкомышечным спазмом.

6.4. На биопсийном материале выполнялась гистохимическая реакция на выявление интенсивности реакции миоглобинпероксидазы. Реакция выполнялась по рекомендации Дрюс и Энгель [1].

Ход реакции следующий:

а) Биопсийный материал в течение 5 дней фиксировали в 10% формалине, приготовленном на физиологическом растворе.

б) После этого кусочки ткани замораживают и приготовляют срезы толщиной 5-10 мк и помещают их на 1 мин в бензол.

в) Окрашивают 5-8 мин в инкубационном растворе, состоящем из 100 мг бензидина в 0,85% NaCl при 80°С. Раствор охлаждают и фильтруют. К 9 мл раствора добавляют 1 мл 40% раствора хлористого аммония и 1 каплю 3% раствора перекиси водорода. Раствор каждый раз готовят заново.

г) Споласкивают в 0,85% физиологическом растворе, заключают в глицерин-желатину и сразу исследуют под микроскопом, так как продукт реакции быстро обесцвечивается.

7. Статистический анализ и обработка данных проводилась с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0». Характеристика вариационных рядов: средняя арифметическая (М), стандартная ошибка (m), коэффициент вариации 95%, доверительный интервал для средних значений М±m, где t определялось по таблице граничных значений критерия Стьюдента при доверительном уровне 95% и числе степеней свободы F=n₁+n₂-2. Для определения достоверности различий использовался непарный параметрический критерий Стьюдента. Принимались во внимание р<0,05; 0,01; 0,001. Для определения достоверности различий в случае негауссовых распределений, непараметрические критерии Колмогорова-Смирнова и Манна-Уитни.

Исследование препаратов на миоглобинпероксидазу изучали под цифровым микроскопом MEIJI (Япония), связанным с компьютером с помощью цитофотометрической программы Scion (США). Цитофотометрический анализ показал, что у больных с легкой формой БА содержание миоглобинпероксидазы определяется в пределах 90,5±2,9 усл. ед., а у пациентов с тяжелой формой она резко снижается до 27,5±1,1 усл. ед.

Таким образом, вследствие накопления в гладкой мускулатуре слизистой оболочки перекисей на фоне выраженного воспаления отмечается сужение просвета бронхов до 55,0±2,3% от исходного; нарушение проходимости МОС₇₅ - до 32,4±2,9%; ΟΦΒ₁ - до 45,7±4,4%; ЖЕЛ - до 69,1±4,2%; ФЖЕЛ - до 64,2±3,8% (здоровые - 93,0±2,4%). На этом фоне активность миоглобинпероксидазы в мышцах слизистой оболочки бронхов у больных с тяжелой формой БА снижается до 27,5±1,1 усл. ед. (контроль - 90,5±2,9 усл. ед.) (фигура 2, 3).

Следовательно, гладкая мускулатура бронхов содержит большое количество перекисей и формирует резкое снижение проходимости мелких бронхов.

На фигуре 1 изображены показатели внешнего дыхания у больных здоровых, с легкой формой течения заболевания (1-я) и тяжелой формой бронхиальной астмы (3-я). Основные показатели, отражающие внешнее дыхание: ЖЕЛ, ФЖЕЛ, ΟΦΒ₁ и проходимость бронхов МОС₂₅, МОС₅₀ и МОС₇₅ (нижние отделы бронхиального дерева).

Примечание: p - уровень значимости различий по отношению к здоровым лицам; p₁ - уровень значимости различий средних значений показателей между группами больных с легким течением бронхиальной астмы и астмой средней степени тяжести; р₂ - между группами больных с легким течением бронхиальной астмы и тяжелой формой течения бронхиальной астмы; р₃ - между группами больных бронхиальной астмы средней степени тяжести и тяжелой формой течения бронхиальной астмы.

На фигуре 2 изображена активность миоглобинпероксидазы участка гладких мышечных клеток слизистой оболочки бронха больного бронхиальной астмой легкой степени заболевания. Интенсивность реакции цитофотометрически выполненной - 90,5±2,9 усл. ед. Реакция гистохимическая на выявление миоглобинпероксидазы по Дрюс и Энгелю [1]. Увеличение 10×100.

На фигуре 3 изображена гистохимическая реакция на миоглобинпероксидазу на участке гладких мышечных клеток слизистой оболочки бронхов у больного бронхиальной астмой тяжелой степени заболевания. Активность реакции, проанализированная цитофотометрически - 27,5±1,1 усл. ед. Реакция выполнена по методу Дрюс и Энгелю [1]. Увеличение 10×100.

Литература

1. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М.: «Мир». 1969. 639 с.

2. Петренко Ю.М., Титов В.Ю. Калориметрический метод определения эффективности функционирования каталазы в биообъектах // Вопросы мед. химии. 1989. Т. 35, №6. С. 143-148.

3. Сперанский С.Д., Полюхович Г.С., Сперанская Б., Терещенко СМ. Сравнительное изучение активности противогипоксических срезов при гемической гипоксии // Эксп. Клин. Фармак. 1992. Т. 55, №4. С. 38-40.

4. Титов В.Ю., Петренко Ю.М., Петров В.А., Владимиров Ю.А. Механизм окисления оксигемоглобина, индуцированного перекисью водорода // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 1991. Т. 112, №7. С. 46-49.

5. Титов В.Ю., Марголина А.А., Петренко Ю.М. Ингибирование нитритами каталазы важный элемент их токсичности. Возможность использования каталазы как детектора на нитриты // Агрохим. Вестник. 1997. №1. С. 8-12.

6. Титов В.Ю. Роль антиокислительных ферментов в защите эритроцитарного гемоглобина и внеклеточных физиологических сред от перекисной деструкции: возможность их использования для экологического мониторинга. Автореф. на ученую степень доктора биологических наук. 2003, г. Боровск.

7. Arduini Α., Mancinelli G., Radatti G., Hochsteia P., Cadeaas E. Possible mechanism of inhibition of nitrite induced oxidation of oxyhemoglobin by ergothioneine and uric acid // Ach. Biochem. Biphys. 1992. V. 294, №2. P. 398-402.

Изобретение относится к медицине и касается способа диагностики тяжести течения бронхиальной астмы. Способ осуществляют путем выявления пероксидазной активности миоглобина гистохимическим методом после фиксации биоптатов слизистой бронхов в 10% растворе формалина в течение 5 дней, замораживания их и приготовления срезов толщиной 5 мк, которые помещают на 1 мин в бензол и окрашивают 5-8 мин при 80°C в растворе, состоящем из 100 мг бензидина в 0,85% NaCl, раствор охлаждают и фильтруют, добавляют к 9 мл раствора 1 мл 40% раствора хлористого аммония и 1 каплю 3% раствора перекиси водорода, после проведенной реакции срезы споласкивают в 0,85% NaCl и заключают в глицерин-желатину для последующего изучения пероксидазной активности миоглобина по программе «Scion». При снижении пероксидазной активности миоглобина в гладкой мускулатуре бронхов до 27,5±1,1 усл. ед., сужении просвета бронхов до 55,0±2,3%, снижении ЖЕЛ до 69,1±4,2%, ФЖЕЛ до 64,2±3,8%, ОФВ₁ до 45,7±4,4%, проходимости бронхов МОС₇₅ до 32,4±2,9% диагностируют тяжелую форму бронхиальной астмы. 3 ил.

Способ диагностики тяжести течения бронхиальной астмы путем выявления пероксидазной активности миоглобина гистохимическим методом после фиксации биоптатов слизистой бронхов в 10% растворе формалина в течение 5 дней, замораживания их и приготовления срезов толщиной 5 мк, которые помещают на 1 мин в бензол и окрашивают 5-8 мин при 80°C в растворе, состоящем из 100 мг бензидина в 0,85% NaCl, раствор охлаждают и фильтруют, добавляют к 9 мл раствора 1 мл 40% раствора хлористого аммония и 1 каплю 3% раствора перекиси водорода, после проведенной реакции срезы споласкивают в 0,85% NaCl и заключают в глицерин-желатин для последующего изучения пероксидазной активности миоглобина по программе «Scion», и при снижении пероксидазной активности миоглобина в гладкой мускулатуре бронхов до 27,5±1,1 усл. ед., сужении просвета бронхов до 55,0±2,3%, снижении ЖЕЛ до 69,1±4,2%, ФЖЕЛ до 64,2±3,8%, ОФВ₁ до 45,7±4,4%, проходимости бронхов МОС₇₅ до 32,4±2,9% диагностируют тяжелую форму бронхиальной астмы.