Изобретение относится к медицине, в частности к патофизиологии, пульмонологии, биохимии.
Известен способ определения продуктов перекисного окисления липидов в выдыхаемом воздухе - этана и пентана, образующихся при распаде окисленных жирных кислот, который можно считать аналогом данного изобретения. Этот способ однако не пригоден для оценки просупероксидной активности выдыхаемого воздуха, то есть способности потенцировать генерацию супероксидного анион-радикала (САР). Прототип изобретения отсутствует.
Целью предложения является разработка метода определения просупероксидной активности выдыхаемого воздуха больных и здоровых людей.
Указанная цель достигается путем собирания выдыхаемого воздуха в полиэтиленовый мешок, соединенный с клапаном и нагубником, позволяющим свободно вдыхать атмосферный воздух и выдыхать его из легких с последующей инкубацией собранного воздуха с клетками, генерирующими САР.
Способ осуществляют следующим образом. У исследуемого человека (больного и здорового) с помощью нагубника с дыхательным клапаном собирают выдыхаемый воздух в герметичный полиэтиленовый мешок объемом 6 л. Клапан устроен так, что позволяет свободно вдыхать воздух из окружающей среды и выдыхать его из легких в полиэтиленовый мешок.
В газовую камеру помещают тест-систему, которая состоит из пяти компонентов:
1) 3 мг биоптата какого-либо органа (обычно печени) мыши после отмывки буферной смесью (БС) pH 7,35 (2 мл фосфатно-щелочного буфера pH 7,35 + 7,5 мл изотонического 0,9% раствора хлористого натрия) и высушивания фильтровальной бумагой, измельченного глазными ножницами, инкубированного в течение 3-5 мин с 0,5-1,0 мл 0,2% водно-спиртового раствора тритона Х-100 для разрыхления мембран и облегчения проникновения внутрь клеток реагентов, необходимых для определения САР (супероксиддисмутазы - СОД и др.), отмытого от следов тритона (время инкубации с тритоном может варьировать в зависимости от вида органа, из которого взят биоптат);
2) 0,3 мл БС;
3) 250 мкг СОД в 0.2 мл БС, инкубация с компонентами 1) и 2) в течение 15-20 мин при 36,9oC;
4) 0,1 мл 3% раствора НАДФН в БС;
5) 0,2 мл 0,2% раствора нитросинего тетразолия (НСТ) в БС.
Подготовку тест-системы, включая отмывку и измельчение биоптата, проводят в пробирке с диаметром 1 см и длиной 5-6 см. Параллельно с описанной опытной пробой готовят контрольную, отличающуюся от опытной только заменой СОД на альбумин в равном количестве и в равном объеме БС.
Из газовой камеры откачивают воздух до 310 мм рт.ст. (то есть разряжают воздух в ней на 450 мм) и вводят в камеру испытуемый воздух человека (пациента или здорового) до общего давления 730 мм рт.ст. Остающееся относительно небольшое разрежение в камере, равное 30 мм рт.ст., необходимо для ее герметизации.
Опытную и контрольную пробы в газовой камере инкубируют с испытуемым воздухом 40-60 мин в термостате при 36,9oC, после чего останавливают реакцию добавлением 0,5 мл 5 М соляной кислоты. Пробы центрифугируют при 3000 об/мин 10 мин. В супернатанте измеряют (спектрофотометр, длина волны 560 нм) оптическую плотность мелкодисперсного окрашенного продукта взаимодействия САР и НСТ - формазана. Из осадка экстрагируют смесью диметилсульфоксид - хлороформ (2: 1) крупнодисперсную фракцию (гранулы) формазана и также измеряют оптическую плотность экстракта. Все измерения проводят против смеси диметилсульфоксид - хлороформ. Результаты измерения оптической плотности супернатанта и экстракта из осадка суммируют раздельно в опытной пробе (инкубация с СОД) и контрольной пробе (инкубация с альбумином). Полученные данные оптической плотности пересчитывают на 1 мг биоптата. Разность между оптическими плотностями контрольной и опытной проб соответствует концентрации САР в единицах оптической плотности продукта реакции - формазана.
Аналогичную вышеописанной паре проб (опытной с СОД и контрольной с альбумином) с испытуемым выдыхаемым воздухом пациента (или загрязненного помещения) приготавливают с выдыхаемым воздухом здорового человека (или с условно нормальным атмосферным воздухом) и проводят точно такое же, как описано выше, исследование. По разности (абсолютной и в процентах) между генерацией САР в воздухе пациента и здорового человека судят об изменении просупероксидной активности выдыхаемого воздуха больного.
Пример. У исследуемого человека (больного и здорового) с помощью нагубника с дыхательным клапаном собирают выдыхаемый воздух в герметичный полиэтиленовый мешок объемом 6 л. Клапан устроен так, что позволяет свободно вдыхать воздух из окружающей среды и выдыхать его из легких в полиэтиленовый мешок. В газовую камеру помещают тест-систему, которая состоит из пяти компонентов:
1) 3 мг биоптата какого-либо органа (обычно печени) мыши после отмывки буферной смесью (БС) pH 7,35 (2 мл фосфатно-щелочного буфера pH 7,35 + 7,5 мл изотонического 0,9% раствора хлористого натрия) и высушивания фильтровальной бумагой, измельченного глазными ножницами, инкубированного в течение 5 мин с 1,0 мл 0,2% водно-спиртового раствора тритона Х-100 для разрыхления мембран и облегчения проникновения внутрь реагентов, необходимых для определения САР (супероксиддисмутазы - СОД и др.), отмытого от следов тритона (время инкубации с тритоном может варьировать в зависимости от вида органа, из которого взят биоптат);
2) 0,3 мл БС;
3) 250 мкг СОД в 0,2 мл БС, инкубация с компонентами 1) и 2) в течение 20 мин при 36,9oC;
4) 0,1 мл 3% раствора НАДФН в БС;
5) 0,2 мл 0,2% раствора НСТ в БС.
Подготовку тест-системы, включая отмывку и измельчение биоптата, проводят в пробирке диаметром 1 см и длиной 5-6 см. Параллельно с описанной пробой готовят контрольную, отличающуюся от опытной только заменой СОД на альбумин в равном количестве и в равном объеме БС. Из газовой камеры откачивают воздух до 310 мм рт.ст. (то есть разрежают воздух в ней на 450 мм рт.ст.) и вводят в камеру испытуемый воздух человека (пациента или здорового) до общего давления 730 мм рт. ст. Остающееся небольшое разрежение в камере, равное 30 мм рт.ст., необходимо для ее герметизации. Опытную и контрольную пробы в газовой камере инкубируют с испытуемым воздухом 60 мин в термостате при 36,9oC, после чего останавливают реакцию добавлением 0,5 мл 5 М соляной кислоты. Пробы центрифугируют при 3000 об/мин 10 мин. В супернатанте измеряют (спектрофотометр, длина волны 560 нм) оптическую плотность мелкодисперсного окрашенного продукта взаимодействия САР и НСТ - формазана. Из осадка экстрагируют смесью диметилсульфоксид - хлороформ (2:1) крупнодисперсную фракцию (гранулы) формазана и также измеряют оптическую плотность экстракта. Все измерения оптической плотности проводят против смеси диметилсульфоксид - хлороформ. Результаты измерения оптической плотности супернатанта и экстракта из осадка суммируют раздельно в опытной пробе (инкубация с СОД) и контрольной пробе (инкубация с альбумином). Полученные данные оптической плотности пересчитывают на 1 мг биоптата. Разность между оптическими плотностями контрольной и опытной проб соответствует концентрации САР в единицах оптической плотности продукта реакции - формазана. Аналогичную вышеописанной паре проб (опытной с СОД и контрольной с альбумином) с испытуемым выдыхаемым воздухом пациента приготавливают с выдыхаемым воздухом здорового человека и проводят точно такое же, как описано выше, исследование. По разности (абсолютной и в процентах) между генерацией САР в воздухе пациента и здорового человека можно судить об изменении просупероксидной активности выдыхаемого воздуха больного. Так, в данном конкретном опыте разность между показателями оптической плотности опытной (СОД) и контрольной (альбумин) пробами составила: с воздухом больного бронхиальной астмой человека - 0,196, с воздухом практически здорового человека - 0,084 ед. оптической плотности. Разность 0,196 - 0,084 = 0,112 характеризует просупероксидную активность выдыхаемого воздуха больного человека (в условных единицах).
Предлагаемый способ является уникальным, не имеющим соответствующего прототипа. Он позволяет проводить прижизненное физиологическое наблюдение за человеком, находящимся в различных функциональных состояниях, в том числе экстремальных и патологических. Область применения данного способа: для изучения патогенеза, для диагностики и контроля лечения болезней внутренних органов людей, а также для оценки качества атмосферного воздуха окружающей среды и помещений.
Литература
A. L. Tappel, Cora J. Dillard. In vivo lipid peroxidation; measurement via exhaled pentane and protection by vitamine E. Federat. Proc. 1981, v.40, 174-178.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУПЕРОКСИДНОЙ АКТИВНОСТИ ВЫДЫХАЕМОГО ВОЗДУХА У БОЛЬНЫХ И ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ | 1997 |
|
RU2128338C1 |
| СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНЕРАЦИИ СУПЕРОКСИДНОГО АНИОН-РАДИКАЛА КЛЕТКАМИ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ | 1994 |
|
RU2064679C1 |
| СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНЕРАЦИИ СУПЕРОКСИДНОГО АНИОН-РАДИКАЛА ФАГОЦИТАМИ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ | 1994 |
|
RU2064680C1 |
| СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЛИЯНИЯ СО*002 НА ГЕНЕРАЦИЮ СУПЕРОКСИДНОГО АНИОН-РАДИКАЛА ФАГОЦИТАМИ | 1993 |
|
RU2108572C1 |
| СПОСОБ ОЦЕНКИ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОГО БАЛАНСА ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА | 2001 |
|
RU2206891C1 |
| Способ определения супероксидного анион-радикала при фагоцитозе | 1990 |
|
SU1735784A1 |
| СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОГО АБАКТЕРИАЛЬНОГО ПРОСТАТИТА | 2007 |
|
RU2327997C1 |
| СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОГО АБАКТЕРИАЛЬНОГО ПРОСТАТИТА | 2006 |
|
RU2315318C1 |
| СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СТАДИИ ОСТРОГО ПИЕЛОНЕФРИТА | 1994 |
|
RU2115124C1 |
| СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ | 2004 |
|
RU2272074C1 |
Использование: в медицине, в частности в патофизиологии, пульмонологии, биохимии. Технический результат: способ позволяет проводить прижизненное физиологическое наблюдение за человеком, находящимся в различных функциональных состояниях, в том числе экстремальных и патологических. Сущность: получают биоптат внутреннего органа животного, инкубируют с нитросиним тетразолием в атмосфере выдыхаемого воздуха больного, а для контроля и здорового человека, экстрагируют органическим растворителем продукты взаимодействия супероксидного анион-радикала и нитросинего тетразолия - формазаном, спектрофотометрически определяют концентрацию формазанов по оптической плотности. На завершающем этапе рассчитывают концентрацию продуктов реакции (формазанов) на 1 мг биоптата, по которой оценивают интенсивность образования супероксидного анион-радикала в присутствии выдыхаемого воздуха пациента и здорового человека. По различию интенсивности образования супероксидного анион-радикала клетками биоптата в присутствии воздуха пациента и здорового человека судят о просупероксидной активности выдыхаемого воздуха исследуемых людей.
Способ определения просупероксидной активности выдыхаемого воздуха у больных и здоровых людей, заключающийся в том, что получают биоптат внутреннего органа животного, инкубируют его с нитросиним тетразолием в атмосфере выдыхаемого воздуха больного, а для контроля и здорового человека экстрагируют органическим растворителем продукты взаимодействия супероксидного анион-радикала и нитросинего тетразолия формазаны, спектрофотометрически определяют их оптическую плотность, рассчитывают концентрацию формазанов на 1 мг биоптата, которая пропорциональна содержанию супероксидного анион-радикала, образующегося в присутствии воздуха пациента и здорового человека, и вычисляют разность последних величин.
