НОВЫЕ ЭКСТРАКТЫ ВАЛЕРИАНЫ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ Российский патент 2016 года по МПК A61K36/84 A61P25/20 A61P25/24 

Настоящее изобретение относится к использованию экстракта валерианы для лечения и профилактики ГАМК-зависимых расстройств, предпочтительно ГАМК_А-зависимых, более предпочтительно из группы: тревога, депрессия, беспокойство и бессонница. Соотношение валереновой кислоты (ВК, valerenic acid, VA) к ацетоксивалереновой кислоте (АВК, acetoxyvalerenic acid, AVA) в экстракте по меньшей мере 2:1. Это изобретение также предлагает способы создания фармацевтических композиций, содержащих такие экстракты, а также способы получения самих экстрактов.

Предпосылки к созданию изобретения

Валериана - одно из наиболее часто используемых средств для лечения бессонницы и тревоги. Валереновая кислота (ВК) - одно из самых активных соединений валерианы. Седативный потенциал ВК был подтвержден в лабораторных экспериментах in-vitro на рецепторах гамма-аминомасляной кислоты типа А (ГАМК_А), а также в экспериментах in-vivo на мышах и крысах. Действие ВК на ГАМК_А рецепторы в экспериментах in-vitro происходит преимущественно на β3 субъединицы, что подтверждается в экспериментах in-vivo, демонстрирующих анксиолитическую активность, потому что точковая мутация β3 субъединицы отменила анксиолитический ответ на ВК, но не на диазепам.

ГАМК - это основной тормозной нейромедиатор в головном мозге. Он нужен для соблюдения общего баланса активности нейронов возбуждения и торможения и потому жизненно необходим для нормального функционирования мозга. Дисбаланс может привести к ГАМК-зависимым расстройствам: тревоге, депрессии, беспокойству, седативному эффекту и бессоннице. ГАМК_А рецепторы являются местом воздействия различных широко используемых в фармакологии агентов, таких как бензодиазепины, барбитураты, нейроактивные стероиды, анестетики и антиконвульсанты.

Было показано, что экстракты валерианы (ВЭ, valerian extracts, VE) аллостерически модулируют ГАМК_А рецепторы и что это действие связано с ВК. Предположительно за это отвечают ГАМК_А рецепторы, содержащие субъединицы β2 или β3. Производные ВК - ацетоксивалереновая кислота (АВК, acetoxyvalerenic acid AVA) или гидроксивалереновая кислота (ГВК, hydroxyvalerenic acid, HVA) - аллостерически не модулируют ГАМК_А рецепторы. Тем не менее АВК при высоких концентрациях может блокировать открытый ГАМК_А канал, как и ГВК. Кроме того, было показано, что ГВК замещает ³Н-валереновую кислоту в активных центрах рецепторов мембран головного мозга, таким образом указывая, что оба производных ВК могут воздействовать на одни и те же активные центры, даже если они аллостерически не модулируют рецепторы.

Сегодня ВК и ее производные широко используются как маркеры при качественной и количественной оценке корней валерианы, корневищ и ВЭ. Продукты валерианы, как правило, стандартизированы в процентах ВК, определяемых как отношение количеств ВК и АВК, иногда включая и ГВК. Хотя ВК стабильна в экстракте, АВК в зависимости от условий хранения рано или поздно превращается в ГВК. Большинство доступных и используемых в лечении в настоящее время экстрактов валерианы имеют отношение ВК к АВК от 1:3 до 1:1.

Задачей настоящего изобретения является предоставление улучшенных экстрактов валерианы и фармацевтических композиций, основанных на этих экстрактах. Еще одной предпочтительной задачей является создание улучшенных лекарственных средств для лечения и профилактики ГАМК-зависимых расстройств, в частности ГАМК_А-зависимых, предпочтительно тревоги, депрессии, беспокойства и бессонницы.

Вышеуказанные задачи решаются с помощью экстракта валерианы для лечения и профилактики ГАМК-зависимых расстройств, в котором отношение ВК к ацетоксивалереновой кислоте (АВК) как минимум 2:1.

Неожиданно было обнаружено, что экстракты валерианы, показывающие отношение ВК к АВК как минимум 2:1, воздействуют на ГАМК-рецепторы более эффективно, чем обычно используемые экстракты, у которых отношение ВК к АВК от 1:3 до 1:1. Соотношение кислот в изобретенном экстракте имеет дополнительное преимущество в том, что общее количество валереновой кислоты и ее производных можно существенно снизить - это позволит избежать типичных побочных эффектов и интоксикации.

В более предпочтительном варианте экстракт, описываемый в изобретении, имеет отношение валереновой кислоты (ВК) к ацетоксивалереновой кислоте (АВК) не меньше 3:1, предпочтительнее 4:1, предпочтительнее не меньше 10:1, соотношение в наиболее предпочтительном варианте около 12:1.

Используемый здесь термин «экстракт валерианы» означает любой продукт экстракции из корней или корневищ валерианы, который содержит валериановые сесквитерпены (как минимум ВК и АВК), а также определимые количества по меньшей мере одного, предпочтительно больше, из флавоноидов, тритерпенов, лигнанов, алкалоидов и аминокислот, предпочтительно валериановые сесквитерпены и определимые количества по меньшей мере одного, предпочтительно больше, флавоноидов, тритерпенов, лигнанов, алкалоидов и аминокислот.

Экстрактом валерианы принято считать результат экстракции корней валерианы и/или корневищ с помощью липофильных растворителей, по меньшей мере с помощью частично липофильных растворителей, наиболее предпочтительно использование растворителя из группы: петролейный эфир, этилацетат и/или водные спирты, иногда называемые гидро-спирты, предпочтительно водный раствор метанола или этанола, более предпочтительно водный раствор этанола. Термин «липофильный экстракт», используемый здесь, означает экстракт валерианы, полученный с помощью липофильного растворителя или по крайней мере с помощью частично липофильного растворителя (например, растворители, указанные выше), которые позволяют сольватировать валереновую кислоту. Липофильный или частично липофильный растворитель, используемый для практической реализации настоящего изобретения, исключает чистую воду, но включает любые растворители или смеси растворителей, которые значительно повышают сольватацию валереновой кислоты. Растворитель может быть более липофильным, например петролейный эфир, или менее липофильным, например водные спирты. К примеру, 70% водный раствор этанола или 50% водный раствор метанола являются предпочтительными для экстракции валереновой кислоты. В то же время более полярный, то есть гидрофильный, растворитель (например, 30% водный раствор спирта), вряд ли извлечет достаточно валереновой кислоты с получением экстракта валерианы для практической реализации настоящего изобретения. Процесс изготовления экстрактов валерианы, содержащих валереновую кислоту, достаточно обширно освящен в публикациях, например в дополнении 5.7 «Сухой водно-спиртовой экстракт валерианы» Европейской фармакопеи (1898). В настоящее время экстракты валерианы для использования в медицинских целях обычно изготавливаются методом экстракции с помощью водных спиртовых растворов с содержанием спирта 40-80%. Специалист в данной области может легко выбрать подходящие растворители для приготовления экстракта валерианы, подходящего к использованию в настоящем изобретении.

Изобретатели провели сравнительный анализ множества растений валерианы и определили одно, которое в естественных условиях производит валереновую кислоту в гораздо более высокой концентрации по отношению к ее производным. Это растение было размножено, чтобы получить достаточное количество для производства экстракта, содержащего ВК, который имеет подтвержденную экспериментами in-vivo фармацевтическую ценность и преимущества.

Другой путь получения экстракта валерианы, пригодного для использования в настоящем изобретении, - уменьшение содержания АВК, например, путем фракционирования обычного экстракта либо путем искусственного увеличения содержания валереновой кислоты, например методом добавления к обычному экстракту синтетической, изолированной и/или концентрированной ВК.

Полученный согласно данному изобретению экстракт особенно подходит для модуляции ГАМК_А-рецепторов, более предпочтительно ГАМК_А-рецепторов, содержащих β2 или β3 субъединицы. В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к изобретению экстракта валерианы для лечения и профилактики ГАМК_А-зависимых расстройств, предпочтительно связанных с ГАМК_А-рецепторами, содержащими β2 или β3 субъединицы.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к лечению и профилактике ГАМК_А-зависимых расстройств из группы: тревога, депрессия, беспокойство и бессонница.

Дополнительный аспект настоящего изобретения - применение указанного выше экстракта валерианы для приготовления лекарственного средства для лечения и профилактики ГАМК_А-зависимых расстройств, предпочтительно из группы: тревога, депрессия, беспокойство и бессонница.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей экстракт валерианы, полученный описанным в изобретении методом. Фармацевтические композиции, созданные по методике настоящего изобретения, обычно содержат терапевтически или профилактически эффективное количество экстракта валерианы, полученного в соответствии с описанием в изобретении, а также вспомогательных веществ, таких как фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество(а) и/или носитель(и). Кроме того, фармацевтическая композиция может содержать дополнительные компоненты экстракта и/или действующее вещество.

Более предпочтительно фармацевтическая композиция также включает по меньшей мере один экстракт из группы экстрактов, полученных из бальзама [Melissa], хмеля и страстоцвета. В предпочтительном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция дополнительно содержит экстракт(ы), полученный(ые) из бальзама [Melissa], хмеля и страстоцвета.

Еще один аспект настоящего изобретения представляет собой способ получения экстракта валерианы, включающий следующие стадии:

а) выбор корней валерианы и/или корневища, в которых отношение валереновой кислоты (ВК) к ацетоксивалереновой кислоте (АВК) не меньше 3:1, предпочтительнее 4:1, предпочтительнее не меньше 10:1, соотношение в наиболее предпочтительном варианте около 12:1;

б) извлечение валереновой кислоты (ВК) и ацетоксивалереновой кислоты (АВК) от корней и/или корневищ с использованием подходящего растворителя;

в) необязательная дополнительная обработка сырого экстракта, чтобы сделать его пригодным для использования человеком.

Предпочтительно, подходящим растворителем является липофильный, более предпочтительно по меньшей мере частично липофильный, наиболее предпочтительны растворители из указанных выше. Специалист может в рабочем порядке отбирать корни и/или корневища валерианы с требуемым отношением ВК к АВК. Примеры таких растений валерианы упоминались выше и будут показаны ниже. Кроме того, специалист знает о подходящих растворителях для экстрагирования валерианы - это, например, петролейный эфир, этилацетат и водные спирты.

Липофильный экстракт может и чаще всего подвергается дальнейшей обработке, что делает его пригодным для введения человеку, то есть он стандартизирован, например, количественно для ВК, АВК и других компонентов валерианы, и это сформулировано в терапевтически или профилактически эффективных дозах. Это делает его также стабильным при хранении и пригодным для конкретного пути введения, предпочтительно пероральное введение.

Еще один предпочтительный способ получения экстракта валерианы согласно изобретению включает в себя этапы:

а) обеспечение корнями и/или корневищами валерианы;

б) экстракция валереновой кислоты (ВК) и ацетоксивалереновой кислоты (АВК) из корней и/или корневищ с использованием подходящего растворителя;

в) коррекция содержания валереновой кислоты (ВК) и ацетоксивалереновой кислоты (АВК) в экстракте таким образом, чтобы отношение валереновой кислоты (ВК) к ацетоксивалереновой кислоте (АВК) было не меньше 3:1, предпочтительнее 4:1, предпочтительнее не меньше 10:1, соотношение в наиболее предпочтительном варианте около 12:1;

г) необязательная дальнейшая переработка экстракта, чтобы сделать его пригодным для введения человеку.

Предпочтительно, подходящим растворителем является липофильный, более предпочтительно по меньшей мере частично липофильный, наиболее предпочтительны растворители из указанных выше. Например, содержание ВК и АВК в экстракте могут быть адаптированы к желаемой пропорции путем добавления ВК и/или снижения содержания АВК. Например, в экстракт может быть добавлена синтетическая, изолированная и/или концентрированная ВК, пока не достигается желаемое для изобретения отношение ВК к АВК. Предпочтительным способом введения является пероральный. Предпочтительны к использованию корни и/или корневища валерианы лекарственной (Valeriana officinalis L).

В последнем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения и профилактики ГАМК_А-зависимых заболеваний, включающему стадию введения экстракта валерианы пациенту, нуждающемуся в этом, в котором отношение валереновой кислоты (ВК) к ацетоксивалереновой кислоте (АВК) не меньше 3:1, предпочтительнее 4:1, предпочтительнее не меньше 10:1, соотношение в наиболее предпочтительном варианте около 12:1.

Для терапевтического или профилактического применения приготовленные согласно изобретению экстракты могут быть введены в любой обычной лекарственной форме любым традиционным способом. Способы введения включают, но не ограничиваются ими: внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно, подкожно, путем инфузии, сублингвально, трансдермально, перорально, ректально и местно. Предпочтительным способом введения является пероральный, предпочтительно в твердой или жидкой дозированной форме.

Экстракты могут быть введены отдельно или в сочетании с адъювантами, которые повышают устойчивость компонентов экстракта, облегчают введение фармацевтических композиций, содержащих их, обеспечивают повышенную растворимость или диспергирование, повышают биодоступность, обеспечивают вспомогательную терапию и тому подобное, в том числе другие активные ингредиенты. Преимущество таких комбинированных препаратов также в том, что они используют дозы меньше обычных терапевтических, что позволяет избежать возможной интоксикации и побочных эффектов в случаях, когда эти вещества используются в качестве монотерапии.

Как упоминалось выше, лекарственные формы описанных здесь соединений включают фармацевтически приемлемые носители и адъюванты, известные специалистам в данной области. Эти носители и адъюванты включают, например, ионообменники, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки, буферные вещества, воду, соли или электролиты и вещества на основе целлюлозы. Кроме того, мальтодекстрин может быть использован для получения сыпучего сухого экстракта, который особенно подходит для дальнейшей переработки в таблетки и капсулы. Предпочтительные дозированные формы включают таблетки, капсулы, капли, жидкости, раствор, суспензию, эмульсию, пастилки, сироп, восстанавливаемый порошок, гранулы, суппозитории и трансдермальный пластырь. Также предусмотрены лекарственные формы с контролируемым высвобождением с порциями немедленного высвобождения или без них. Способы получения таких лекарственных форм известны (смотрите, например, Н.С. Ansel and N.G. Popovish, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5^th ed., Lea and Febiger (1990)). Уровни дозировки и требования хорошо известны в данной области и могут быть выбраны обычным специалистом из доступных способов и методов, пригодных для конкретного пациента. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения вводят экстракт валерианы, который содержит ВК в количестве 0,2-0,5 мг/кг массы тела, при этом содержание АВК должно быть как можно меньше. Хотя одной дозы в день может быть достаточно, количество их может быть увеличено до 5 доз в день. В случае пероральных доз может быть необходимо до 200 мг препарата в день. Специалисту в данной области будет понятно, что более низкие или более высокие дозировки могут потребоваться в зависимости от конкретных факторов. Например, конкретные дозировки и схемы лечения будут зависеть от таких факторов, как общее здоровье пациента, тяжесть и течение заболевания, а также особенности характера пациента, и мнение лечащего врача, которое включает потенциальное взаимодействие с другими необходимыми лекарствами.

Приготовленные согласно данному изобретению экстракты могут быть введены таким же образом, как и другие экстракты валерианы и их фармацевтические композиции. Предпочтительно введение перорально, более предпочтительно в виде твердых или жидких лекарственных форм.

В следующем разделе описания настоящее изобретение иллюстрируется с помощью примеров, которые относятся к предпочтительным вариантам осуществления изобретения и которые не должны быть истолкованы как ограничивающие изобретение, как описано в его формуле.

Диаграммы

На рис. 1а, б, в показаны диаграммы, иллюстрирующие результаты теста с приподнятым крестообразным лабиринтом для эталонных веществ (рис. 1а, верхний график) и обоих экстрактов валерианы (ВЭ-1, рис. 1б, средний график; ВЭ-2, рис. 1в, нижний график). На оси ординат изображено время, которое животные проводили в открытом рукаве, выраженное в %. На рис. 1а показаны процентные значения для эталонных веществ: диазепама (ДЗП) и имипрамина (ИМИ) по сравнению с NaCl (0,9% физиологический раствор) в качестве контроля. На рис. 1б изображены процентные значения, полученные для ВЭ-1 и на рис. 1с процентные значения для ВЭ-2. Числовые значения, указанные для ВЭ-1 и 2 на рис. 1б и 1в соответственно, относятся к сумме валереновых кислот ВК и АВК, вводимых на кг массы тела.

На рис. 2а, б, в показаны диаграммы, изображающие результаты теста подвешивания за хвост для эталонных веществ (рис. 2а, верхний график) и обоих экстрактов валерианы (ВЭ-1, рис. 2б, средний график; ВЭ-2, рис. 2в, нижний график). По оси ординат отложено время неподвижности. Рис. 2а показывает значения времени для эталонных веществ: диазепама (ДЗП) и имипрамина (ИМИ) по сравнению с NaCl в качестве контроля. На рис. 3б изображены результаты, полученные для ВЭ-1 и на рис. 3с изображены данные для ВЭ-2. Числовые значения, указанные для ВЭ-1 и 2 соответственно, относятся к сумме валереновых кислот ВК и АВК, вводимых на кг массы тела.

На рис. 3а, б, в показаны диаграммы, изображающие результаты измерения внутренней температуры тела для эталонных веществ (рис. 2а, верхний график) и обоих экстрактов валерианы (ВЭ-1, рис. 36, средний график; ВЭ-2, рис. 3в, нижний график). По оси ординат отложены значения внутренней температуры тела. На рис. 3а приведены значения внутренней температуры тела для эталонных веществ: диазепама (ДЗП) и имипрамина (ИМИ) по сравнению с NaCl в качестве контроля. На рис. 3б изображены результаты, полученные для ВЭ-1 и на рис. 3с изображены данные для ВЭ-2. Числовые значения, указанные для ВЭ-1 и 2 соответственно, относятся к сумме валереновых кислот ВК и АВК, вводимых на кг массы тела.

На рис. 4а, б, в и г показаны диаграммы, изображающие результаты контрольного теста с приподнятым крестообразным лабиринтом, описанного в примере 5, для экстракта валерианы 1 (ВЭ-1). На оси ординат изображено время, которое животные проводили в открытом рукаве, выраженное в % (верхние и нижние полосы на левой стороне, 4а, 4в), а также ряд перемещений между рукавами в течение 7-минутного периода наблюдения (верхний и нижний графики на правой стороне, 4б, 4г). Количество добавленной в ВЭ-1 ацетоксивалереновой кислоты обозначено (мг АВК), n равно числу экспериментальных животных.

На рис. 5а и б показаны диаграммы, изображающие внутреннюю температуру тела животных во время контрольного теста с приподнятым крестообразным лабиринтом, описанного в примере 5, для различных экстрактов валерианы. Количество добавленной в ВЭ-1 ацетоксивалереновой кислоты обозначено (мг АВК), n равно числу экспериментальных животных.

На диаграммах * указывает на значительное отклонение р<0,05 для отмеченного столбца.

Образцы

Животные

Для поведенческих экспериментов мужские особи беспородных белых мышей CD-1 (Charles River, Зульцфельд, Германия) содержались в контролируемых лабораторных условиях с циклом дня и ночи 12:12 (свет включали в 6:00 утра), температура 20±2°C, влажность воздуха от 55 до 60%. Животные имели свободный доступ к гранулам (ssniff R/MH, ssniff Spezialdiaten GmbH, 3ост, Германия) и питьевой воде. Животных содержали в группах по 10 в клетках Macrolon III. После прибытия животным давали время на адаптацию в течение 2 недель. В начале опытов мыши были в возрасте 8 недель. Количество животных в группе было от 12 до 18.

Для эксперимента на связывание были использованы мужские особи крыс RjHan:WI (Janvier, Le Genest-Saint-lsle, Франция). Крыс держали в контролируемых лабораторных условиях, как описано выше. Животных содержали в группах по 5 в клетках Macrolon IV.

Описанные исследования были проведены в соответствии с правилами ЕС и национального закона по использованию экспериментальных животных (Германия). Протокол был утвержден Комитетом по уходу за животными в Саксонии-Ангальт.

Пример 1 - Подготовка и анализ экстрактов валерианы (ВЭ)

Для проверки влияния различных соотношений ВК:АВК на ГАМК_А-связанные рецепторы в эксперименте in-vivo два различных экстракта валерианы (ВЭ 1 и ВЭ 2) были получены следующим образом.

Были использованы корни и корневища от выбранной линии растений валерианы, а также стандартные справочные материалы из Польши (Европейская фармакопея, Дополнение 5.7 «Сухой водно-спиртовой экстракт валерианы» (1898)). Выбранная линия была отобрана из природных линий стандартным анализом соотношения ВК:АВК. Было обнаружено, что природные линии валерианы, показывающие соотношение ВК:АВК более 2:1 распространены шире, чем первоначально ожидалось. Выбранные виды также сохранялись в гербарии (травяной сбор) Института биологии Martin-Luther-University в Галле, Германия, с целью публикации (номер экземпляра HAL 115562). Последующее культивирование дало необходимое количество исходного материала. Исходное вещество перемешивали с водным спиртом, то есть водным раствором этанола (объемная доля 70%) в соотношении 1:5 при 45°C в течение 3 с половиной дней, затем фильтровали под давлением 2 бар. Полученные настойки были сконцентрированы с помощью роторного испарителя. Пробы обоих экстрактов анализировали с помощью ультраэффективной жидкостной хроматографии (UPLC) (метод основан на монографии Европейской фармакопеи «Сухой водно-спиртовой экстракт валерианы» [6.8./1898]). Точное содержание ВК и АВК, суммы ВК и АВК, а также отношения ВК:АВК перечислены в таблице ниже.

Экстракт валерианы 1 имел соотношение ВК:АВК около 12:1 и экстракт валерианы 2 имел соотношение около 1:1,5. Содержание ГВК была слишком низким, чтобы была возможность измерить его.

Экстракты валерианы (ВЭ1 и ВЭ2), диазепам (Faustan®, AWD Pharma GmbH & Со KG, Дрезден, Германия) и имипрамин (Sigma, Дюссельдорф, Германия) как эталонные вещества были растворены в физиологическом растворе и вводились перорально через желудочный зонд. Контрольной группе вводился растворитель (0,9% физиологический раствор). Применяемый объем доз был 0,1 мл/10 г массы тела.

Отдельное и общее содержание ВК и АВК, а также доза, вводимая экспериментальным животным, перечислены в таблице ниже.

Пример 2 - Тест с приподнятым крестообразным лабиринтом (ПКЛ, Elevated plus maze test, ЕРМ)

Ситуационная тревожность была измерена в тесте приподнятого крестообразного лабиринта. Лабиринт был изготовлен из черного поливинилхлорида и имел два открытых и два закрытых рукава (50×10×40 см), установленные в 50 см от пола. Пол в рукавах был гладким. Уровень света был установлен в 30 люкс. Мышь помещали напротив закрытого рукава на центральную платформу устройства. На потолке испытательного помещения была установлена камера, съемки с которой использовались для оценки поведения животных. Наблюдение проводилось из смежной комнаты в течение 7 мин. Записывалось количество заходов в открытые рукава, время, проведенное в них, и время, проведенное в закрытых рукавах. Для оценки анксиолитического действия время, проведенное в открытом рукаве, было ограничено. Ограничения менялись в зависимости от используемых анксиолитиков. Кроме того, все изменения в движениях были также проанализированы, включая двигательную активность. (Rodgers RJ. Animal models of anxiety: where next? Behav Pharmacol 1997; 8:477-96). После каждого испытания лабиринт отмывали.

Пример 3 - Тест подвешивания за хвост

Антидепрессирующий эффект экстракта валерианы измеряли с помощью теста подвешивания за хвост (L. Stem, R. Chermat, В. Thierry and P. Simon, The tail suspension test: a new method for screening antidepressants in mice. Psychopharmacology (Berl), 85 (1985), pp. 367-370). Испытание проводили сразу же после измерения беспокойства в приподнятом крестообразном лабиринте. Мышей подвешивали на хвостах с помощью клейкой ленты, размещенной в 1 см от кончика хвоста, на высоту около 30 см над столом. Животные были подвешены в течение 6 мин, продолжительность неподвижности была установлена вручную во время испытания. Неподвижность была определена как отсутствие любых движений конечностей или тела, за исключением вызванных дыханием, когда мыши висели пассивно и без движений. Для оценки эффектов препаратов измерялось время неподвижности со 2-й до 6-й минуты.

Пример 4 - Внутренняя температура тела (ВТТ, Body core temperature, ВСТ)

После теста подвешивания за хвост внутренняя температура тела измерялась с помощью цифрового термометра (ama digit) производства Amarell GmbH (Кройцвертайм, Германия). Для этой цели смазанный зонд (диаметром 1 мм) осторожно вставляется на 3 см в прямую кишку. Ректальная температура позволяет определять различия между результатами, связанные с действием экстрактов на центральную нервную систему и эффектами передозировки (Haffner F.; Die pharmakologische Wertbestimmung des Baldrians. Münch med Wschr 7: 271-272 [1929]).

Пример 5 - Контрольный тест с приподнятым крестообразным лабиринтом (ПКЛ)

Для проверки результатов теста ПКЛ в примере 2, которые указывают, что соотношение ВК:АВК имеет важное значение для анксиолитической активности ВЭ, экстракт ВЭ-1 с высоким содержанием ВК и низким содержанием АВК (12:1) был снова использован для воспроизведения анксиолитической активности 0,5 мг валереновых кислот. Затем АВК (HWI Analytik GmbH, Рюльцхайм, Германия) была добавлена в экстракт, чтобы изменить соотношение ВК:АВК от 12:1 (ВЭ-1), до 1:0,5, 1:1 и 1:1,5 (ВЭ 1-А; ВЭ 1-В; ВЭ 1-С) соответственно. Количество экстракта было адаптировано таким образом, чтобы сумма ВК, т.е. ВК плюс АВК, была всегда одинакова. Отличия экстрактов по соотношению в них ВК:АВК приведены в таблице 3 ниже.

ВК (0,5 и 2,0 мг/кг, по отношению к общей сумме ВК и АВК) вводили перорально с помощью желудочного зонда (24 калибр, FST, Гейдельберг, Германия). Контрольной группе вводили 0.9% солевой раствор. Вводимый объем был рассчитан исходя из соотношения 0,1 мл/10 г массы тела. После ПКЛ измерялась внутренняя температура тела (ВТТ) с помощью цифрового термометра (ama digit) производства Amarell GmbH (Кройцвертайм, Германия). Для этой цели смазанный зонд (диаметром 1 мм) осторожно вводился на 3 см в прямую кишку.

Пример 6 - Проверка теста внутренней температуры тела (ВТТ)

ВТТ для животных, принимающих участие в тесте ПКЛ из примера 5, оставалась для всех экспериментальных групп в пределах диапазона изменения (рис. 4), несмотря на то, что значения для групп, получавших 2 мг/кг, несколько различались (для экстракта 0,5 мг/кг F₄,₈₂=0,725, р=0,725; для экстракта 2,0 мг/кг F₄,₇₈=2,48, р=0,051). У некоторых животных была пониженная ВТТ, ниже 34°C (0,5 мг/кг=1; 2,0 мг/кг=3). Результаты измерений для этих животных не принимались во внимание при оценке данных.

Пример 7 - Анализ связывания

3H-ГАМК (SA - 1,43 ТБк/ммоль) и 3H-флунитразепам (SA - 1,85 ТБк/ммоль) были получены от PerkinElmer (Бостон, США), диазепам и хлордиазепоксид от AWD.pharma GmbH (Дрезден, Германия). Тестируемые ВЭ были идентичны экстрактам ВЭ-1 и ВЭ-2, использованным в других примерах.

Ткани для анализа связывания 3H-ГАМК (иссеченная лобная кора головного мозга крысы) гомогенизировали в 50 мМ растворе буфера Трис-HCl, pH 7,4, содержащем 120 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl₂ и 1 мМ MgCl₂; для 3H-флунитразепама их гомогенизировали в 50 мМ растворе буфера Трис-HCl, pH 7,4, содержащего 1 мМ EGTA, 10 мМ ЭДТА и 3 мМ MgCl₂, затем центрифугировали (50000 г, 15 мин) и промывали дважды в соответствующем буфере. Полученный в результате осадок ресуспендировали в буфере. Аликвоты суспензии мембранной фракции (50 мкг белка) инкубировали в течение 45 мин при 37°C с 2,5 нМ 3H-ГАМК или 1 нМ 3H-флунитразепама при 0-4°C в течение 60 мин. Специфическое связывание рассчитывали путем вычитания неспецифического связывания - определяемого в присутствии 1 мкМ немеченого ГАМК или 1 мкМ диазепама, или хлордиазепоксида - из общего связывания радиоактивного лиганда. Для всех анализов связывания ВЭ-1, ВЭ-2 и АВК использовались параллельно. Инкубирование прекращали добавлением охлажденного льдом буфера и скорой фильтрацией через стекловолоконные фильтры. Фильтры промывали, сушили, добавляли сцинтилляционную смесь, затем подсчитывали радиоактивность с использованием β-счетчика (Beckman Coulter, Германия). Значения ЕС₅₀ были определены путем добавления немаркированных препаратов (ГАМК, хлордиазепоксид, диазепам, АВК, ВЭ-1 и ВЭ-2) в широком диапазоне концентраций (от 10^-10 до 10^-4 М).

Статистический анализ данных, полученных в тесте приподнятого крестообразного лабиринта, проводили с использованием Н-критерия Краскела - Уоллиса, затем с использованием двустороннего U-критерия Манна - Уитни. Внутренняя температура тела была проанализирована с помощью дисперсионного анализа. Порог значимости был установлен на уровне p<0,05.

Оба тестируемых экстракта валерианы не связывались с рецепторами бензодиазепина в синаптосомальных мембранах лобной коры крыс, а диазепам и хлордиазепоксид связывались (таблица 4). Но, в отличие от них, оба ВЭ связывались с ГАМК-рецепторами, аффинность связывания была более выражена у ВЭ-1 по сравнению с ВЭ-2 (таблица 5).

Все поведенческие тесты проводились в световой период между 8:00 и 14:00. Животные для тестирования были отобраны случайным образом.

Аннотация к экспериментам 1-4

Описанные выше эксперименты in-vivo показывают, что отношение ВК к АВК является важным параметром для ГАМК_А-активных экстрактов валерианы. Даже при том, что общее содержание ВК и АВК было одинаковым для двух экстрактов валерианы, используемых в экспериментах выше, только экстракт валерианы 1, который имел значительно более высокое содержание ВК, чем экстракт валерианы 2, продемонстрировал анксиолитическое действие. Кроме того, экстракт с высоким содержанием ВК по сравнению с АВК не только более эффективен, но и позволяет уменьшить дозировку и, таким образом, устранить или уменьшить интоксикацию, связанную с применением валерианы. Таким образом, изготовленные по настоящему изобретению экстракты валерианы являются более эффективными и в то же время более безопасными.

Аннотация к экспериментам 5-7

Для групп животных в контрольном тесте с ПКЛ, получавших экстракт с дозировкой 0,5 мг/кг + АВК, был обнаружен значительный эффект ( $$X_{\mathrm{4,87}}^2=\mathrm{24,37}$$ , р<0,001). Время, которое контрольная группа животных (получавшая солевой раствор) провела в открытом рукаве, составляет 15,15±1,76%. Животные, которые получали ВЭ-1 (общий объем ВЭ 0,5 мг/кг; ВК:АВК=12:1), провели больше времени в открытом рукаве (20,16±1,24%; U_2,18,17=89,0, р=0,035). Это следует интерпретировать как анксиолитическое действие (рис. 4). Результаты других групп животных, которые получали ВЭ с различным соотношением валереновых кислот (ВК:АВК=1:0,5 или 1:1,5), были либо в диапазоне контрольной группы, получавшей физиологический раствор, или продемонстрировали противоположный эффект, т.е. анксиогенное действие (ВК:АВК=1:1, U_2,18,18=79,5, р=0,008).

Группы, получавшие экстракт в дозировке 2,0 мг/кг + АВК, также существенно отличались ( $$X_{\mathrm{4,86}}^2=\mathrm{11,05}$$ , р=0,026). ВЭ-1 в увеличенной дозе (общее количество ВК 2,0 мг/кг; ВК:АВК=12:1) индуцировал скорее анксиогенное действие (9,61±2,02%, U_2,18,17=93,0, р=0,049). Аналогичный результат был получен с ВЭ-1 А (ВК:АВК=1:0,5) (9,06±1,64%, U_2,18,17=86,0, р=0,027), тогда как результаты для двух других ВЭ оставались в том же диапазоне, что и для физиологического раствора.

Двигательная активность (сокращения конечностей) была одинаковой во всех экспериментальных группах (экстракт с дозировкой 0,5 мг/кг X²=4,89, р=0,298; экстракт с дозировкой 2,0 мг/кг X²=6,27, р=0,18, рис. 4).

ВТТ оставалась в диапазоне контрольной группы для всех экспериментальных групп, даже если значения для групп, получивших 2 мг/кг, были несколько иными (экстракт с дозировкой 0,5 мг/кг F=0,725, р=0,725 (рис. 5); экстракт с дозировкой 2,0 мг/кг F=2,48, р=0,051). У несколько животных ВТТ была ниже 34°С (0,5 мг/кг=1; 2,0 мг/кг=3). Результаты измерений у этих животных не учитывались при оценке данных.

Оба протестированных экстракта валерианы не связываются с рецепторами бензодиазепина в синаптосомальных мембранах лобной коры головного мозга крыс, в то время как диазепам и хлордиазепоксид связываются. Однако оба ВЭ связываются с ГАМК-рецепторами, при этом аффинность связывания была более выражена у ВЭ-1, чем у ВЭ-2.

Группа изобретений относится к фармацевтической области и раскрывает экстракт валерианы для лечения ГАМК_А-зависимых расстройств, в котором отношение содержания валереновой кислоты (ВК) к ацетоксивалереновой кислоте (АВК) составляет, по меньшей мере, 3:1. Кроме того, раскрыты способы получения указанного экстракта, а также фармацевтическая композиция на его основе. Группа изобретений обеспечивает экстракт валерианы, более эффективный для лечения ГАМК_А-зависимых расстройств. Кроме того, группа изобретений обеспечивает снижение типичных побочных эффектов и интоксикации. 6 н. и 13 з.п. ф-лы, 5 ил., 7 пр., 5 табл.

1. Экстракт валерианы для лечения и профилактики ГАМК-зависимых расстройств, в котором отношение валереновой кислоты (ВК) к ацетоксивалереновой кислоте (АВК) в экстракте, по меньшей мере, 3:1 (вес./вес.).

2. Экстракт по п. 1, в котором отношение валереновой кислоты (ВК) к ацетоксивалереновой кислоте (АВК) (вес./вес.) не меньше 4:1, предпочтительнее не меньше 10:1, соотношение в наиболее предпочтительном варианте около 12:1.

3. Экстракт по п. 1 или 2, при изготовлении которого применяют растворитель из группы: петролейный эфир, этилацетат и/или водные спирты (гидро-спирты), предпочтительно гидро-спирты с содержанием спирта от 40-80%, более предпочтительно водный раствор метанола или этанола, наиболее предпочтителен водный раствор этанола.

4. Экстракт по п. 1 или 2 для лечения ГАМК-зависимых расстройств из группы: тревога, депрессия, беспокойство и бессонница.

5. Применение экстракта валерианы для приготовления лекарственного средства для лечения и профилактики ГАМК-зависимых расстройств, при котором отношение валереновой кислоты (ВК) к ацетоксивалереновой кислоте (АВК) в экстракте равно по меньшей мере 3:1 (вес./вес.).

6. Применение по п. 5, при котором отношение валереновой кислоты (ВК) к ацетоксивалереновой кислоте (АВК) (вес./вес.) в экстракте не меньше 4:1, предпочтительнее не меньше 10:1, соотношение в наиболее предпочтительном варианте около 12:1.

7. Применение по п. 5 или 6, при котором при изготовлении экстракта валерианы применяют растворитель из группы: петролейный эфир, этилацетат и/или водные спирты (гидро-спирты), предпочтительно гидро-спирты с содержанием спирта от 40-80%, более предпочтительно водный раствор метанола или этанола, наиболее предпочтителен водный раствор этанола.

8. Применение по пп. 5-6 для лечения ГАМК-зависимых расстройств из группы: тревога, депрессия, беспокойство и бессонница.

9. Фармацевтическая композиция для лечения и профилактики ГАМК-зависимых расстройств, содержащая экстракт валерианы, в котором отношение валереновой кислоты (ВК) к ацетоксивалереновой кислоте (АВК) равно, по меньшей мере, 3:1 (вес./вес.), и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество и/или носитель.

10. Фармацевтическая композиция п. 9, в которой отношение валереновой кислоты (ВК) к ацетоксивалереновой кислоте (АВК) в экстракте (вес./вес.) не меньше 4:1, предпочтительнее не меньше 10:1, соотношение в наиболее предпочтительном варианте около 12:1.

11. Фармацевтическая композиция по п. 9 или 10, при получении экстракта которой используют растворитель из группы: петролейный эфир, этилацетат и/или водные спирты (гидро-спирты), предпочтительно гидро-спирты с содержанием спирта от 40-80%, более предпочтительно водный раствор метанола или этанола, наиболее предпочтителен водный раствор этанола.

12. Фармацевтическая композиция по п. 9 или 10, которая дополнительно содержит, по меньшей мере, один экстракт из группы экстрактов, полученных из Melissa officinalis, хмеля и страстоцвета.

13. Способ получения экстракта валерианы, который включает следующие стадии:
а) выбор корней и/или корневища валерианы, в которых отношение валереновой кислоты (ВК) к ацетоксивалереновой кислоте (АВК) в экстракте, по меньшей мере, 3:1 (вес./вес.);
б) экстракция валереновой кислоты (ВК) и ацетоксивалереновой кислоты (АВК) из корней и/или корневищ с использованием подходящего растворителя;
в) необязательная дополнительная обработка полученного экстракта, чтобы сделать его пригодным для введения человеку.

14. Способ получения экстракта валерианы включает следующие стадии:
а) культивирование корней и/или корневищ валерианы;
б) экстракция валереновой кислоты (ВК) и ацетоксивалереновой кислоты (АВК) из корней и/или корневищ с использованием подходящего растворителя;
в) коррекция содержания валереновой кислоты (ВК) и ацетоксивалереновой кислоты (АВК) в экстракте таким образом, чтобы отношение валереновой кислоты (ВК) к ацетоксивалереновой кислоте (АВК) в экстракте было, по меньшей мере, 3:1 (вес./вес.);
г) при необходимости дополнительная обработка полученного экстракта, чтобы сделать его пригодным для введения человеку.

15. Способ по п. 13, в котором содержание валереновой кислоты (ВК) и ацетоксивалереновой кислоты (АВК) корректируют таким образом, чтобы отношение валереновой кислоты (ВК) к ацетоксивалереновой кислоте (АВК) было (вес./вес.) не меньше 4:1, предпочтительнее не меньше 10:1, соотношение в наиболее предпочтительном варианте около 12:1.

16. Способ по пп. 14-15, в котором применяют растворитель из группы: петролейный эфир, этилацетат и/или водные спирты (гидро-спирты), предпочтительно гидро-спирты с содержанием спирта от 40-80%, более предпочтительно водный раствор метанола или этанола, наиболее предпочтителен водный раствор этанола.

17. Способ лечения и профилактики ГАМК_А-зависимых расстройств, который включает стадию введения пациенту экстракта валерианы, в котором отношение валереновой кислоты (ВК) к ацетоксивалереновой кислоте (АВК) равно, по меньшей мере, 3:1.

18. Способ по п. 14, где отношение валереновой кислоты (ВК) к ацетоксивалереновой кислоте (АВК) в экстракте (вес./вес.) не меньше 4:1, предпочтительнее не меньше 10:1, соотношение в наиболее предпочтительном варианте около 12:1.

19. Способ по п. 18, в котором применяют растворитель из группы: петролейный эфир, этилацетат и/или водные спирты (гидро-спирты), предпочтительно гидро-спирты с содержанием спирта от 40-80%, более предпочтительно водный раствор метанола или этанола, наиболее предпочтителен водный раствор этанола.