СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НЕМАТОПСИОЗИСА У ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ (УСТРИЦ И МИДИЙ), КУЛЬТИВИРУЕМЫХ В ЧЕРНОМ МОРЕ Российский патент 2016 года по МПК A01K61/00 

Изобретение относится к биотехнологиям и предназначено для установления заболевания коммерческих моллюсков: устрицы съедобной Ostrea edulis и мидии средиземноморской Mytilus galloprovincialis, выращиваемых на фермах в Черном море.

Заболевание двустворчатых моллюсков возникает в результате заражения грегариной Nematopsis legeri de Beachamp, 1910 (сем. Porosporidae) и называется нематопсиозисом. Грегарины N. legeri являются паразитическими простейшими и характеризуются наличием гетероксенности, в их жизненном цикле участвуют два хозяина. Моллюски играют роль промежуточного хозяина в жизненном цикле нематопсисов, в их соединительных тканях проходит спорогония. Окончательным хозяином N. legeri в Черном море является каменный краб Eriphia verrucosa Forskal, 1775 [1, 2, 3], в пищеварительном тракте которого происходит вегетативное и половое размножение паразита. Двустворчатые моллюски заражаются гимноспорами грегарин в процессе фильтрации ими воды. Гимноспоры раздражают жаберный эпителий моллюсков и стимулируют скопление в нем фагоцитов, которые захватывают гимноспоры и транспортируют их в жаберные лакуны, где паразит развивается, формирует оболочку и образует ооцисту, уже способную заразить краба.

Отрицательное влияние N. legeri на моллюсков проявляется в том, что скапливающиеся в кровеносных сосудах жабр ооцисты, по размерам превышающие элементы крови моллюсков, вызывают закупорку кровеносных сосудов, при которой нарушается кровоток, разрывается жаберный эпителий. Размеры ооцист варьируют в зависимости от видовой принадлежности хозяина: у Ostrea edulis они составляют 12,7×8 мкм, у Mytilus galloprovincialis - 15,4×7,7 мкм. В одном моллюске может содержаться несколько миллионов ооцист, что ведет к их ослаблению, в таких случаях наблюдается несмыкание створок раковины, в результате чего в мантийную полость набивается ил, и они теряют свою коммерческую ценность. Острая форма заболевания приводит к гипоксии, нарушению углеводного обмена, истощению запасов гликогена и, в конечном итоге, к гибели моллюска [3, 4]. Иными словами, поражение культивируемых устриц и мидий грегариной Nematopsis legeri может вызвать большие экономические потери в марихозяйствах по выращиванию этих моллюсков.

Авторами проанализирована существующая научная литература о систематическом положении, встречаемости и особенностях биологии грегарины N. legeri. Выяснилось, что к настоящему времени не известна методика, которая помогла бы фермерам, не имеющим специального биологического образования, пошагово произвести ряд действий, позволяющих безошибочно идентифицировать инвазию моллюсков нематопсисом, что особенно важно для профилактики нематопсиозиса в марихозяйствах.

Известен ряд способов диагностики заболеваний устриц и мидий, вызываемых чужеродными организмами (паразитами и комменсалами). К их числу относится способ диагностики и профилактики проктэкозиса черноморских мидий в условиях марикультуры [5]. У вскрытых мидий проводят внешний осмотр мягких тканей и выявляют морфологические и цветовые аномалии мантии и гепатопанкреаса. Затем образцы тканей изучают компрессорным методом под микроскопом и по конкретным признакам выявляют спороцист - возбудителей заболевания.

Известен также способ диагностики полидорозиса у выращиваемых в Черном море двустворчатых моллюсков [6]. В соответствии с данной методикой, вначале производится внешний осмотр раковин живых мидий и устриц с целью выявления двойных отверстий (вход-выход), проделанных сверлящей полихетой из рода Polydora. Затем моллюсков вскрывают и исследуют внутренний слой раковины для того, чтобы обнаружить выделяющиеся цветом проделанные полихетами извилистые U-образные ходы или пузырчатые вздутия. В случае обнаружения указанных аномалий ходы и вздутия на раковине взламывают скальпелем, обнаруженных полихет извлекают и определяют их таксономическую принадлежность.

Существует способ диагностики пионозиса у выращиваемых в Черном море устриц и мидий [7]. Согласно этой методике, моллюска вначале осматривают для выявления характерных отверстий в периостракуме и количественной оценки площади поражения раковины перфорирующей губкой (%), затем раскрывают раковину, удаляют тело моллюска и осматривают гипостракум, для выявления конической горбистости на поверхности раковины. Затем раковину осматривают на просвет с целью выявления отверстий в периостракуме и гипостракуме или систем галерей в остракуме. Образцы ткани губки исследуют под микроскопом с помощью компрессорного метода, кремневые спикулы измеряют и зарисовывают, что позволяет определить видовую идентичность их хозяина.

К недостаткам перечисленных способов, не позволяющим использовать их для диагностики нематопсиозиса, относятся невозможность их применения из-за различий в систематическом положении, морфо-анатомических признаков и биологических особенностей. В аналогах фигурируют виды: плоский червь Proctoeces maculatus, (тип Plathelminthes, класс Trematoda), два вида сверлящих полихет из рода Polydora (тип Annelida, класс Polychaeta) и перфорирующая губка Pione vastifica (тип Porifera, класс Demospongiae).

В основу Способа диагностики нематопсиозиса у выращиваемых в Черном море устриц и мидий поставлена задача контроля состояния моллюсков в марихозяйствах, а также естественного эпизоотического фона в конкретной акватории путем выявления признаков заболевания.

Поставленная задача достигается тем, что заболевание (нематопсиозис) диагностируют путем внешнего и внутреннего обследования моллюсков для выявления клинических признаков и последующего паразитологического анализа. Для выявления заболевания, в течение всего срока культивирования, ежемесячно исследуют пробу по 15-25 экз. живых моллюсков, включающую годовиков, 2- и 3-годовалых моллюсков.

Моллюска рассматривают под бинокуляром с целью выявления возможного несмыкания створок. Затем его вскрывают скальпелем и осматривают под бинокуляром ткани. Из раскрытой раковины удаляют тело моллюска, образцы тканей с помощью компрессорного метода исследуют под микроскопом (увеличение ×180) для выявления наличия ооцист грегарин.

По результатам анализа моллюсков считают слабо инвазированными, если среднее количество ооцист на 1 мм² мазка жабр в исследуемой пробе составляет 0,1-1; средне инвазированными - при наличии от 1 до 10 ооцист на 1 мм² мазка. Сильно инвазированными считаются моллюски, у которых количество ооцист достигает - 11-50 ооцист·мм^-2 жабр. Гиперзараженными считают моллюсков, у которых количество ооцист превышает 51 ооцист·мм^-2 жабр.

Изобретение поясняется чертежами.

Фиг. 1 - ооцисты грегарин Nematopsis legeri из жаберных лепестков О. edulis (А) и M. galloprovincialis (Б, В); Фиг. 2 - аномальный вид жабер моллюска (разрывы, бледный цвет), пораженного грегариной Nematopsis legeri (А), внешний вид жабр здорового моллюска (Б); Фиг. 3 - несмыкание створок раковины устрицы О. edulis, пораженной нематопсиозисом.

Способ осуществляется следующим образом.

Клинические признаки. На начальном этапе развития заболевания происходит внутриклеточное развитие паразита в фагоцитах моллюсков, в результате чего они гипертрофируются и увеличиваются в размерах в 3-4 раза. В соединительных тканях моллюсков скапливаются ооцисты грегарины N. legeri (Фиг. 1). Жабры моллюсков становятся бледными (Фиг. 2). При усилении инвазии наблюдается закупорка кровеносных сосудов, происходит разрыв жаберного эпителия и нарушение жаберных нитей (Фиг. 3). При гиперинвазии, помимо всех перечисленных выше признаков, наблюдается несмыкание створок устриц и мидий (Фиг. 4).

Клинические признаки нематопсиозиса:

а) наличие в жабрах моллюсков ооцист грегарин N. legeri;

б) изменение цвета жабр и соединительных тканей, появление на жабрах темных пятен;

в) разрыв жаберного эпителия и разрушение жаберных нитей;

г) несмыкание створок раковин моллюсков.

Паразитологический (эпизоотологический) анализ. При изучении эпизоотологической ситуации акватории конкретного марихозяйства по выращиванию двустворчатых моллюсков или акватории, предполагаемой для этих целей, берут пробу в размере 15-25 экз. моллюсков 2-3-годовалого возраста из разных частей морской фермы или 4-5 участков, удаленных друг от друга на 150-200 м. Для выявления корректной эпизоотологической картины акватории хозяйства анализ проб проводится непосредственно после их отбора.

Каждую устрицу или мидию тщательно очищают от обрастателей и промывают в морской воде. После этого моллюска рассматривают под бинокуляром с целью выявления возможного несмыкания створок. После внешнего осмотра раковину моллюска вскрывают скальпелем, перерезая основной мускул-замыкатель, осматривают под бинокуляром ткани, выявляя изменение цвета и появление темных пятен на жабрах и соединительных тканях.

Затем из раскрытой раковины удаляют тело моллюска, образцы тканей с помощью компрессорного метода исследуют под микроскопом (увеличение ×180) для выявления наличия ооцист грегарин. Обнаруженные ооцисты грегарин измеряют и зарисовывают, на основании чего устанавливают их видовую принадлежность. Количество ооцист грегарин подсчитывают в 100 полях зрения микроскопа, вычисляют среднее значение ооцист на 1 мм поверхности жабр.

Оценка эпизоотического фона

Для оценки паразитологической ситуации на акватории марихозяйств авторами предлагается шкала степеней заражения устриц и мидий нематопсисом, которая свидетельствует о потенциальной угрозе для культивируемых моллюсков по фактору нематопсиозиса. Заражение считается слабым, если заражено от 0,1 до 10% моллюсков в пробе, средним - при 11-30%, сильным - 31-55%; гиперзараженность констатируется, когда 56-100% обследованных моллюсков поражены нематопсисом.

Примеры

Пример 1

Пробу устрицы обыкновенной Ostrea edulis 2-4-летнего возраста в количестве 56 экз. (опытная устричная ферма б. Казачья, г. Севастополь) исследовали для выявления признаков нематопсиозиса. Каждого из моллюсков помещали в чашку Петри и проводили внешний осмотр в отраженном свете на стереоскопическом микроскопе МБС-10. Затем устриц вскрывали, образцы тканей с помощью компрессорного метода исследовали под микроскопом, обнаруженные ооцисты грегарин измеряли, зарисовывали, анализ характеристик ооцист подтвердил их идентичность N. legeri. Экстенсивность инвазии составила 26,8%, среднее количество ооцист, обнаруженных на 1 мм² мазка жабр, составляло 16,7. С учетом частоты встречаемости инвазированных нематопсисом устриц в этой пробе ситуацию в марихозяйстве в б. Казачья по фактору нематопсиозиса можно охарактеризовать как соответствующую средней степени зараженности. Это свидетельствовало об относительно благополучном положении эпизоотического фона в бухте Казачья по фактору нематопсиозиса.

Пример 2

На предмет нематопсиозиса исследовали пробу мидий 2-3-летнего возраста из 71 экз., собранную в акватории Карадагского природного заповедника (Кузмичевы камни). Исследования проводили в специализированной лаборатории Карадагской биостанции НАН Украины. Анализ характеристик ооцист, обнаруженных в жабрах мидий, подтвердил их идентичность N. legeri. Среднее количество ооцист в 1 мм² жабр составляло 3,73. В этой пробе 33,8% мидий были заражены нематопсисом, что позволило охарактеризовать эпизоотический фон по фактору нематопсиозиса в данной акватории как имеющий сильную степень заражения.

Пример 3

Пробу мидий 2-3-летнего возраста из 46 экз. выбирали в Сердоликовой бухте Карадагского природного заповедника, исследования проводили в специализированной лаборатории Карадагской биостанции НАН Украины. Обнаруженные ооцисты грегарин идентифицировали как N. legeri. Среднее количество ооцист в 1 мм² жабр составляло 6,18. В этой пробе 63% мидий были заражены нематопсисом. С учетом высокой частоты встречаемости инвазированных нематопсисом мидий эпизоотологическую ситуацию в этом районе по нематопсиозису следует считать крайне неблагоприятной, соответствующей степени гиперзараженности.

Предлагаемый способ позволяет диагностировать нематопсиозис у мидий и устриц на самых ранних стадиях его возникновения и минимизировать убытки, которые может нанести нематопсиозис марихозяйству.

Литература

1. Белофастова И.П. Грегарины рода Nematopsis (Eugregarinida, Porosporidae) - паразиты черноморских моллюсков / И.П. Белофастова // Паразитология. - 1996. - Т. 30, вып. 2. - С. 159-173.

2. Белофастова И.П. Nematopsis legeri De Beachamp, 1910 (Eugregarinida, Porosporidae) - паразиты моллюсков Черного моря / И.П. Белофастова // Экология моря. - 1997. - Вып. 46. - С. 3-6.

3. Гаевская А.В. Паразиты, болезни и вредители мидий (Mytilus, Mytilidae). VI. Полихеты (Polychaeta). - Севастополь: ЭКОСИ-Гидрофизика, 2008. - 137 с.

4. Ковальчук Н.А. Распространение в Черном море грегарины Nematopsis legeri, возбудителя нематопсиоза мидий и устриц / Н.А. Ковальчук, Е.В. Холодковская, В.В. Губанов // V Всесоюзная конференция по промысловым беспозвоночным: тезисы докладов (Минск, 9-13 октября 1990 г.). - Минск, 1990. - С. 180-181. (7).

5. Способ диагностики и профилактики проктэкозиса черноморских мидий в условиях марикультуры. Пат. №82302, Украина, МПК А01К 61/00.

6. Спосiб дiагностики полiдорозису у вирощуваних у Чорному мopi двостулкових молюскiв (устриць i мiдiй). Пат. №60630, Украина, МПК А01К 61/00.

7. Спосiб дiагностики пioнозicу у мiдiй i устриць, що культивують у Чорному мopi. Пат №82820, Украина, МПК А01К 61/00.

Способ предусматривает ежемесячный отбор 15-25 экземпляров моллюсков в исследуемой акватории, внешнее и внутреннее обследование и последующий паразитологический анализ. Внешнее обследование включает изучение створок моллюсков. Внутреннему обследованию подвергают жабры и соединительные ткани тела моллюсков, которые затем удаляют из раковин, и под микроскопом выявляют наличие ооцист грегарин и определяют степень зараженности моллюсков. Эпизоотологической фон исследуемой акватории по фактору нематопсиозиса считают слабо инвазированным, если заражено от 0,1 до 10% моллюсков в пробе; средним - при 11-30%; сильным - 31-55%, и гиперзараженность констатируется, когда 56-100% обследованных моллюсков поражены нематопсисом. Способ позволяет диагностировать нематопсиозис у мидий и устриц на самых ранних стадиях его возникновения и минимизировать убытки, который он может нанести. 3 ил., 3 пр.

Способ диагностики нематопсиозиса у двустворчатых моллюсков (устриц и мидий), культивируемых в Черном море, включающий ежемесячный отбор 15-25 экз. моллюсков в исследуемой акватории, внешнее и внутреннее обследование моллюсков для изучения клинических признаков заболевания и последующий паразитологический анализ, отличающийся тем, что внешнее обследование включает изучение створок моллюсков; внутреннему обследованию подвергают жабры и соединительные ткани тела моллюсков, которые затем удаляют из раковин, и под микроскопом выявляют наличие ооцист грегарин и определяют степень зараженности моллюсков, а эпизоотологический фон исследуемой акватории по фактору нематопсиозиса считают слабо инвазированным, если заражено от 0,1 до 10% моллюсков в пробе; средним - при 11-30%; сильным - 31-55%, и гиперзараженность констатируется, когда 56-100% обследованных моллюсков поражены нематопсисом.