ИНАКТИВИРОВАННАЯ ПОЛИОВАКЦИНА Российский патент 2016 года по МПК C12N7/04 A61K39/13 A61P31/14 

Область техники, к которой относится изобретение

Это изобретение относится к инактивированным полиовакцинам. В частности, это изобретение относится к инактивированным полиовакцинам, аттенуированным полиовирусам, используемым в получении инактивированных полиовакцин, и к получению таких инактивированных полиовакцин.

Уровень техники

Инициатива глобальной ликвидации полиомиелита Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) произвела большой прогресс. Основным инструментом, используемым в этой программе, была живая аттенуированная пероральная вакцина полиомиелита. В течение многих лет было известно, что эта живая аттенуированная вакцина вызывает ассоциированный вакциной полиомиелит в малой части реципиентов или лиц, контактирующих с ними, и с более недавнего времени стало известно, что она способна обращать трансмиссивный фенотип, вызывающий появления эпидемий в некоторых частях света, где программы вакцинации становились менее интенсивными по мере исчезновения полиомиелита. Была задокументирована также пролонгированная экскреция происходящих из вакцины полиовирусов несколькими пациентами с иммунодефицитом. Таким образом, применение пероральной полиовакцины и ее способности изменения ее фенотипа является проблемным вопросом в ликвидации полиомиелита во всем мире.

Было бы крайне неразумным немедленно останавливать вакцинацию, как только будет считаться, что последний вирус дикого типа был выделен, так как вирус дикого типа может циркулировать недетектированным вследствие слабого инспектирования (сервейланса) в некоторых зонах. Кроме того, индивидуумы с иммунодефицитом могут продолжать экскретировать вирус в течение продолжительного времени после вакцинации и могут быть источником повторного появления. Кроме того, все еще могут быть эпидемии, вызываемые пероральной вакциной, из последних раундов ее применения.

Таким образом, вакцинация и инспектирование должны повторяться в течение некоторого времени после объявления о ликвидации вируса дикого типа. Это требует применения полиовируса в лабораториях, привлеченных к инспектированию и к продуцированию вакцины, которые будут главным образом заниматься изготовлением инактивированной полиовакцины (IPV) способом, разработанным Salk.

Эта вакцина Salk основана на трех вирулентных штаммах полиовируса дикого типа, а именно, штаммах Mahoney (типа 1 поливируса), MEF-1 (типа 2 полиовируса) и Saukett (типа 3 полиовируса), выращиваемых в клетках Vero ex vivo (Wood et al, Biologicals 25:59-64, 1997). Затем эти полиовирусы дикого типа инактивируют формалином с получением IPV. Известно, что штаммы дикого типа, используемые в настоящее время в получении IPV, являются паралитическими в людях и применяются в больших количествах в производстве IPV. Это представляет собой серьезную проблему сдерживания, которая не может быть легкой для примирения с масштабами производства, требуемыми для IPV. Некоторый интерес был выражен в применении тех же самых штаммов в производстве инактивированной вакцины, что и штаммы, используемые в пероральных вакцинах, на тех основаниях, что они являются аттенуированными и, следовательно, представляют меньший риск при ускользании от надзора. Однако их нестабильность при применении к людям означает, что они остаются вредными, и их иммуногенные свойства отличаются от иммуногенных свойств штаммов дикого типа, используемых в настоящее время, так что может потребоваться большая программа клинического развития для развития IPV на основе этих штаммов.

Живые аттенуированные полиовирусные вакцины, разработанные Sabin в 1950-ых годах, с использованием по существу эмпирических процедур, использовали во всем мире в виде живых пероральных полиовакцин. На протяжении нескольких последних лет исследователи использовали ряд молекулярно-биологических способов в попытке выяснения механизма, при помощи которого уменьшается нейровирулентность этих вакцинных штаммов. Наибольшая часть исследования концентрировалась на серотипах 1 и 3. Для обоих из них полные нуклеотидные последовательности этих вакцинных штаммов сравнивали с последовательностями их нейровирулентных предшественников. В случае типа 1 полиовируса, этот вакцинный штамм отличается от его предшественника в положении 47 в геноме из 7441 оснований (Nomoto et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5793-5797, 1982). Аналогичные исследования на типе 3 полиовируса выявили только 10 различий нуклеотидной последовательности в геноме из 7432 оснований между этой вакциной и ее штаммом-предшественником (Stanway et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1539-1543, 1984).

Штамм типа 2 был разработан из природно аттенуированного родителя, но анализ нейровирулентного ревертантного штамма, выделенного из случая вакцина-ассоциированного полиомиелита, идентифицировал 17 различий из Sabin 2 (Pollard et al., J. Virol. 63:4949-4951, 1989).

Модель для вторичной структуры 5'-некодирующего района генома штамма типа 3 полиовируса была предложена ранее (Skinner et al., J. Mol. Biol. 207:379-392, 1989). Что касается домена V (нуклеотидов 471-538), основания в положениях 471-473 и 477-483, являются спаренными с основаниями в положениях 538-536 и 534-528, соответственно, следующим образом:

Для удобства, эти спаренные районы называют стеблем (a) (471-473/538-536) и стеблем (b) (477-483/534-528). Аттенуированные полиовирусы, в которых пара оснований стебля (a) или пара оснований стебля (b) домена V является обратимой, раскрыты в EP-A-0383433. Аттенуированные полиовирусы, которые не имеют пары основания U-G или другой ошибочно связанной пары оснований (отклонения от спаривания оснований Watson-Crick) в стебле (a) или (b) домена V 5'-некодирующего района генома полиовируса, описаны в WO98/41619 и WO 2008/017870. Эти аттенуированные полиовирусы имеют по существу такую же аттенуацию, что и аттенуация родительского штамма Sabin, или более сильную аттенуацию, чем аттенуация родительского штамма Sabin (так что они являются безопасными для использования), но являются гораздо более стабильными генетически.

Сущность изобретения

Авторы изобретения разработали межтиповые рекомбинантные штаммы полиовируса для применения в качестве посевного материала IPV. Эти штаммы полиовируса данного изобретения имели улучшенные иммуногенные свойства и способности усиленного роста в клетках культуры ткани. Полиовирусные штаммы по изобретению являются также аттенуированными и генетически стабильными, что делает их безопасными в приготовлении IPV. В частности, авторы изобретения неожиданно обнаружили, что межтиповые рекомбинантные полиовирусы, содержащие генетически модифицированный 5'-некодирующий район Sabin 3, капсидные белки из Sabin 1, Mahoney, MEF или Saukett, и неструктурные кодирующие районы и 3'-некодирующие районы из Sabin 3, имели улучшенные иммуногенные свойства в сравнении со штаммом Sabin 3 с теми же самыми генетическими модификациями в 5'-некодирующем районе. Штаммы полиовируса по изобретению могут выращиваться в культуре ткани и иметь необходимую иммуногенность для действия в качестве семенного материала IPV, но они не будут воспроизводиться вообще в людях, даже при экспонировании их до больших количеств.

Таким образом, настоящее изобретение относится к аттенуированному рекомбинантному полиовирусу, имеющему:

(i) 5'-некодирующий район, состоящий из 5'-некодирующего района Sabin 3, модифицированный таким образом, что он не имеет ошибочного спаривания оснований в стебле (a) или (b) домена V, где семь или восемь пар оснований в стеблях (a) и (b) являются парами основания U-A или A-U; и

(ii) капсидный белок из штамма Sabin 1, Mahoney, MEF или Saukett.

Это изобретение также относится к:

- инактивированному полиовирусу по изобретению для применения в качестве вакцины;

- применению полиовируса по изобретению в качестве посевного материала инактивированной полиовакцины (IPV);

- вакцине, содержащей инактивированный полиовирус и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель и, необязательно, адъювант;

- способу получения инактивированной полиовакцины, включающему:

(i) выращивание полиовируса по любому из пунктов 1-7 в культуре клеток ex vivo;

(ii) инактивирование указанного полиовируса; и

(iii) составление указанного инактивированного полиовируса с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.

Краткое описание фигур

Фиг.1 показывает предсказанную вторичную структуру РНК домена V (нуклеотиды 471-538) вакцинного штамма типа 3 Sabin 3 и штаммов S15, S17, S18 и S19. Мутации, введенные в модифицированные штаммы, показаны жирным шрифтом.

Фиг.2 показывает геномные структуры модифицированных штаммов на основе S18. Уникальный сайт рестрикции, присутствующий или введенный в штамм S18, используют для реципрокного обмена кодирующих районов домена V и/или капсидного белка (P1). Номенклатура вирусов соответствует формату, где "S19/MahP1” обозначает вирус с последовательностью домена V S19, капсидной последовательностью Mahoney и неструктурным кодирующим районом Sabin 3.

Фиг.3 иллюстрирует температурную чувствительность штаммов типа 3 в различных клетках. Вирусы анализировали по образованию бляшек (пятен) при различных температурах в клетках L20B, клетках Vero, MRC5 и Hep2C и результаты строили в виде графиков, показывающих уменьшение PFU (бляшкообразующих единиц, БОЕ) при каждой температуре в сравнении с БОЕ при 31°C.

Фиг.4 показывает одноступенчатый рост в клетках MRC5 при 33°C. Пласты репликатных клеток синхронно инфицировали вирусами типа 3, инкубировали при 33°C, затем собирали в различных временных точках и определяли титры вирусов.

Подробное описание изобретения

Геном полиовируса представляет собой единственную линейную молекулу РНК, которая транслируется клеткой-хозяином в виде длинного полипептида. Эта РНК полиовируса содержит длинный высоко структурированный 5'-конец, который не кодирует полипептидный продукт и содержит шесть доменов, I-VI. Несколько из этих доменов (в том числе домен V) вместе содержат Внутренний Сайт Входа Рибосом (IRES), который определяет инициацию трансляции. Кодирующий район РНК полиовируса разделен на два района, один из которых кодирует структурные белки, которые составляют капсид, а другой кодирует неструктурные белки, такие как вирусные протеазы и вирусная РНК-зависимая РНК-полимераза. 3'-нетранслируемый район является менее сложным, чем 5'-некодирующий район.

Авторы изобретения разработали межтиповые рекомбинантные штаммы полиовируса, которые имеют мутации в домене V 5'-некодирующего района, и таким образом являются как аттенуированными в сравнении со штаммами полиовируса дикого типа, так и генетически стабильными. Межтиповые рекомбинантные штаммы полиовируса по изобретению также имеют один или несколько капсидных белков из штаммов полиовируса Sabin 1, Sabin 2, Sabin 3, Mahoney, MEF или Saukett. Капсидные белки полиовируса образуют белковую оболочку, которая окружает частицу полиовируса. Таким образом эти капсидные белки являются экспонированными иммунной системе хозяина и направляют иммунную реакцию хозяина на полиовирус. Изменение капсидного белка межтипового рекомбинантного полиовируса позволяет манипулировать иммуногенными свойствами этого полиовируса.

Таким образом, аттенуированные полиовирусы по изобретению содержат 5-некодирующий район Sabin 3, который был модифицирован таким образом, что стебли (а) и (b) домена V не содержат ошибочного спаривания пар оснований и семь или восемь пар оснований в стеблях (a) и (b) являются парами оснований A-U или U-A. Этот аттенуированный полиовирус по изобретению содержит также капсидный белок, например, один капсидный белок, более одного капсидного белка или все структурные белки из штамма Sabin 1, Sabin 2, Sabin 3, Mahoney, MEF или Saukett, предпочтительно из Sabin 1, Mahoney, MEF и/или Saukett и более предпочтительно из Mahoney, MEF и/или Saukett.

Модификация домена V

Аттенуированные полиовирусы по изобретению являются генетически стабильными и безопасными для применения в качестве посевного материала IPV. Это достигается ослаблением структуры домена V в 5-некодирующем районе заменой пар оснований GC парами оснований AU таким образом, что требуются две одновременные реакции для регенерации дикого типа, и заменой пар оснований GU парами оснований AU для предотвращения реверсии GC единственной мутацией и последующего усиления этих структур. Было показано, что вирусы, приспособленные таким образом, что термодинамическая стабильность домена V является такой же, что и термодинамическая стабильность вакцинного штамма Sabin типа 3, имеют такие же биологические свойства, но являются стабильными при пассаже (Macadam et al (2006) J Virol. 80(17):8653-63). Аттенуированный полиовирус по изобретению содержит 5'-некодирующий район, состоящий из 5'-некодирующего района Sabin 3, модифицированного таким образом, что он не имеет ошибочного спаривания оснований в стебле (а) или (b) домена V, где семь или восемь пар оснований в стеблях (a) и (b) являются парами оснований U-A или парами оснований A-U.

В одном предпочтительном варианте осуществления, аттенуированный полиовирус по изобретению содержит модифицированный домен V из 5'-некодирующего района Sabin 3, в котором пара оснований U-A присутствует в положениях 471-538 и 472-537 в стебле (a) и в положениях 478-533, 480-531 и 481-530 в стебле (b) и пара оснований A-U присутствует в положениях 479-532 и 482-529 в стебле (b). Этой последовательностью модифицированного домена V может быть:

AUUCUAACUAUUAAGCAGGCAGCUGCAACCCAGCAGCCAGCCUGUGGUA ACGCGCAAGUUAAUAGCGAAA (SEQ ID NO:1).

В другом предпочтительном варианте осуществления, аттенуированный полиовирус по изобретению содержит модифицированный домен V из 5'-некодирующего района Sabin 3, в котором пара оснований U-A присутствует в положениях 471-538 и 472-537 в стебле (a) и в положениях 478-533, 480-531 и 481-530 в стебле (b) и пара оснований A-U присутствует в положениях 477-534 и 479-532 и 482-529 в стебле (b). Этой последовательностью модифицированного домена V может быть:

AUUCUAAAUAUUAAGCAGGCAGCUGCAACCCAGCAGCCAGCCUGUCGUA ACGCGCAAGUUAAUAUCGAAA (SEQ ID NO:2).

Полиовирусы по изобретению могут быть соответственно получены из последовательности стеблей (a) и (b) полиовирусов Sabin 1 или Sabin 2.

Мутации в 5'-некодирующем районе полиовируса по изобретению аттенуируют вирулентность этих вирусов и генетически стабилизируют эти вирусы, делая менее вероятной их реверсию к вирулентности. Таким образом, эти мутации делают этот вирус безопасным для получения более низкого уровня содержания, чем уровень содержания, требуемый для вирусов дикого типа, используемых в настоящее время для производства инактивированных полиовакцин.

Мутации в домене V могут вводиться любым из стандартных способов мутагеназа, известных в данной области. Мутация может, например, вводиться в штамм полиовируса, обычно в штамм Sabin, сайт-направленным мутагенезом комплементарной ДНК, соответствующей геномной РНК полиовируса. Это может достигаться субклонированием подходящего района из инфекционной комплементарной ДНК генома полиовируса в одноцепочечную ДНК бактериофага, такого как M13. Альтернативно, мутированная последовательность может быть синтезирована целиком in vitro.

После введения мутаций или каждой мутации, модифицированные субклонированные комплементарные ДНК повторно вводили в полную комплементарную ДНК, из которой они были произведены. Живой вирус извлекали из мутированной полноразмерной комплеметарной ДНК получением положительной смысловой РНК, обычно с использованием промотора T7 для управления транскрипцией in vitro (Van der Werf et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2330-2334, 1986).

Эта извлеченная РНК может быть применена к культурам ткани с использованием стандартных способов (Koch, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 61:89-138, 1973). Спустя три дня после инкубирования, вирус может быть извлечен из супернатанта культуры ткани. Уровень нейровирулентности и, следовательно, аттенуация этого модифицированного вируса может затем сравниваться с уровнем нейровирулентности и аттенуации немодифицированного вируса с использованием стандартного LD₅₀-теста в мышах, которые являются трансгенными, на рецептор полиовируса человека, или WHO-одобренного теста на безопасность вакцины в обезьянах (WHO Tech. Rep. Ser. 687:107-175).

Было также показано, что аттенуация вследствие ослабления домена V коррелирует приближенно с температурной чувствительностью в клетках BGM cells (Macadam et al, Virology 181:451-458, 1991) или в клетках L20B (как описано для клеток CM-1 в Macadam et al, Virology 189:415-422, 1992). Таким образом, температурная чувствительность модифицированного вируса может быть определена в качестве предварительного скрининга для определения уровня ожидаемой аттенуации. Она может выражаться в виде температуры (Т), при которой количество бляшкообразующих единиц (бое) уменьшается на показатель степени 10 (1,0 log₁₀) от количества, полученного, например, при 33°С или 35°С в тех же самых клетках. Чем ниже величина T, тем выше степень аттенуации.

Структурный кодирующий район

Структурный кодирующий район генома полиовируса кодирует капсидные белки, которые образуют защитную белковую оболочку частиц полиовируса. Аттенуированный полиовирус по изобретению может содержать один или несколько капсидных белков из штамма Sabin 1, Sabin 2, Sabin 3, Mahoney, MEF или Saukett, предпочтительно из штамма Mahoney, MEF и/или Saukett. В одном предпочтительном варианте осуществления, аттенуированный полиовирус по изобретению содержит все из капсидных белков штамма Sabin 1, Mahoney, MEF или Saukett. Полиовирус по изобретению может содержать капсидные белки из любой комбинации различных штаммов, например, из Mahoney и MEF, из Mahoney и Saukett, из MEF и Saukett или из Mahoney, MEF и Saukett.

Межтиповые рекомбинантные штаммы могут быть получены стандартными способами, известными в данной области.

Неструктурный кодирующий район и 3'-некодирующий район

Полиовирус по изобретению может иметь неструктурный кодирующий район и 3'-некодирующий район из любого из штаммов Sabin 1, Sabin 2, Sabin 3, Mahoney, MEF и Saukett.

В одном предпочтительном варианте осуществления, аттенуированный полиовирус по изобретению имеет неструктурный кодирующий район и 3'-некодирующий район, произведенные из Sabin 3. Получение полиовирусов по изобретению на каркасе штамма Sabin 3 обменом капсидных белков в виде кассеты элиминирует любой известный или неизвестный эффект рекомбинации, in vitro или in vivo, между штаммами вне капсидных районов. Это также делает эту конструкцию более легкой и свойства этих вирусов более прогнозируемыми.

В одном варианте осуществления, аттенуированный полиовирус по изобретению имеет неструктурный кодирующий район и 3'-некодирующий район, произведенные из Sabin 1 или Sabin 2, в частности, когда 5'-некодирующий район произведен из Sabin 1 или Sabin 2.

Мутации в гене протеазы 2А

Аттенуированный полиовирус по изобретению может содержать мутацию в гене протеазы 2А, причем указанная мутация ассоциирована с более высокими выходами иммуногенных частиц в клеточных линиях, происходящих из обезьяны, таких как клетки Vero. Такие мутации могут быть получены пассажем полиовируса по изобретению в клетках Vero или любым стандартным мутагенным способом.

Эта мутация в гене протеазы 2А обычно является мутацией, которую обычно получают пассажем полиовируса по изобретению в клетках Vero. Могут быть также введены другие мутации в гене протеазы 2А, которые увеличивают выход полиовируса в клетках обезьяны. Мутация в гене протеазы 2А может быть введена прямым мутированием инфекционного клона полиовируса.

В одном варианте осуществления, аттенуированный полиовирус по изобретению содержит мутацию в гене протеазы 2А, которая не изменяет остатки H20, D38 или C109. В одном предпочтительном варианте осуществления, мутация гена протеазы 2А полиовируса содержит одно из следующих изменений аминокислот: A8V, Y10C, 17CY, N18S, T19C, Y19H, L21R, T23I, E25G, A30P, I33V, W35R, K45E, G48D, E65K, E65V, Y70C, T79A, F80L, Y82H, Y93H, H96Y, S105T, P106S, I122V, V123A, G127R, V131A и S134T.

Мутации в гене протеазы 2А ассоциированы с уменьшенной температурной чувствительностью и/или большей пригодностью для применения в клеточных линиях, происходящих из обезьяны, таких как клетки Vero, при сохранении степени аттенуации, которая наблюдается в соответствующих полиовирусах, которые лишены мутации протеазы 2А.

Таким образом, это изобретение относится также к способу получения аттенуированных полиовирусов, содержащих мутацию в гене протеазы 2А, включающему пассирование полиовируса по изобретению в клетках Vero и селекцию на полиовирусы с мутацией в гене протеазы 2А, ассоциированной с высокими выходами иммуногенных частиц, причем эта селекция включает:

(i) секвенирование гена протеазы 2А и идентификацию подходящих мутаций; или

(ii) скрининг этих полиовирусов для идентификации вирусных частиц с неизмененной, или по существу неизмененной, степенью аттенуации и уменьшенной температурной чувствительностью в сравнении с полиовирусами по изобретению, которые не пассировались в клетках Vero.

Анализы температурной чувствительности могут, например, проводиться с использованием клеток Vero, как описано в Macadam et al., Virology 189:415-22, 1992.

Мутации в гене протеазы 2А могут вводиться любым из известных способов введения мутаций в ДНК, описанных выше.

Предпочтительно, полиовирусы по изобретению, которые растут в клетках, не являющихся клетками человека, таких как клетки Vero, в способах получения IPV содержат по меньшей мере одну мутацию в гене протеазы 2А, как описано выше.

Вакцины

Полиовирусы по изобретению могут быть использованы в малом масштабе в мероприятиях по контролю, таких как исследования серологической реактивности, и в большом масштабе в получении IPV. Полиовирусы по изобретению требуют минимальных мер предосторожности перед ликвидацией полиовируса, и меры предосторожности после ликвидации в категории BSL3-polio, как это требуется существующим руководством WHO для жизнеспособных штаммов, инфекционных для людей, уже не требуются.

Таким образом, аттенуированные полиовирусы могут быть использованы в качестве посевного материала (IPV). Таким образом, это изобретение обеспечивает инактивированный аттенуированный полиовирус данного изобретения. Это изобретение относится также к применению полиовируса по этому изобретению в качестве посевного материала IPV.

Это изобретение относится также к способу получения инактивированной полиовакцины, включающему:

(i) выращивание аттенуированного полиовируса по этому изобретению в культуре клеток ex vivo;

(ii) инактивирование указанного полиовируса и

(iii) составление указанного инактивированного полиовируса с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.

Этот аттенуированный полиовирус может выращиваться в культивируемых клетках, не являющихся клетками человека, таких как клетки L20B и клетки Vero. Этот аттенуированный полиовирус может выращиваться в культивируемых клетках, таких как клетки MRC5 и Hep2C.

Поливирус может быть инактивирован любым подходящим способом. Обычно используют способы, применяемые для инактивации полиовируса дикого типа в используемых в настоящее время IPV. Например, полиовирус может быть инактивирован обработкой формальдегидом, β-пропиолактоном или бинарной обработкой этиленимином, предпочтительно обработкой формальдегидом.

Аттенуированный полиовирус по этому изобретению может быть инактивирован. Эти инактивированные аттенуированные штаммы полиовируса по изобретению могут быть объединены с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Может быть использован любой носитель или разбавитель, обычно используемый в инактивированных вирусных препаратах, таких как препараты IPV. Препарат IPV может содержать инактивированные полиовирусы, содержащие капсидные белки типа 1, типа 2 и/или типа 3.

Таким образом, аттенуированные инактивированные полиовирусы по изобретению могут быть использованы для вакцинирования против полиомиелита в пациенте-хозяине. Таким образом, это изобретение относится к способу вакцинации пациента против полиовируса, включающему введение пациенту эффективного количества инактивированного полиовируса по изобретению. Эффективным количеством является количество, достаточное для вызывания защитной иммунной реакции против полиовируса. Для этой цели, они могут вводиться любым подходящим способом, например, парентерально. Парентеральное введение может быть подкожной, внутрикожной или внутримышечной инъекцией. Инактивированные полиовирусы по изобретению могут вводиться с адъювантом.

Может вводиться доза, соответствующая количеству, вводимому для обычной IPV, такая как 8-40 единиц антигена D.

Доза инактивированного межтипового рекомбинантного полиовируса может быть установлена для достижения требуемой степени иммуногенности. Например, когда капсидный белок происходит из Sabin 2 или Sabin 3, может быть использована более высокая доза, чем в случае, когда капсидный белок происходит из Sabin 1, MEF, Mahoney или Saukett. Например, может быть использована доза от приблизительно 16 до приблизительно 80 единиц антигена D, например, приблизительно 30 единиц антигена D (например, 32 единицы антигена D) или приблизительно 60 единиц антигена D (например, 64 единицы антигена D). Могут быть использованы меньшие дозы, если эту вакцину вводят с подходящим адъювантом.

Настоящее изобретение относится к вакцине, содержащей инактивированный полиовирус по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Эта вакцина может дополнительно содержать адъювант. Эта вакцина может содержать один или несколько различных межтиповых рекомбинантных штаммов полиовируса по изобретению. Например, эта вакцина может содержать смесь вирусов, содержащих структурные белки из штаммов полиовируса типа 1 и типа 2, типа 1 и типа 3, типа 2 и типа 3 или типа 1, типа 2 и типа 3. Обычно капсидные белки типа 1 будут капсидным белком из Sabin 1 или Mahoney, предпочтительно Mahoney, капсидным белком типа 2 из Sabin 2 или MEF, предпочтительно MEF, и капсидными белками типа 3 из Sabin 3 или Saukett, предпочтительно Saukett.

Ввиду различных относительных иммуногенностей полиовирусов типа 1, типа 2 и типа 3 по изобретению, эта вакцина может содержать различные количества полиовирусов, содержащих капсидные белки типа 1, типа 2 и/или типа 3. Например, может быть использовано соотношение тип 1: тип 2: тип 3 x:y:z, где x<y<z. В одном конкретном примере, это отношение может быть 30:32:45 единиц антигена D.

Инактивированный полиовирус по изобретению может вводиться в виде автономной полиовакцины или в комбинированной вакцине, содержащей другие компоненты, такие как DTP (дифтерия, коклюш, столбняк), Hib (тип В Haemophilus influenza) или Гепатит В.

Настоящее изобретение относится также: к применению инактивированного полиовируса в соответствии с этим изобретением в получении лекарственного средства для применения в способе вакцинации против полиовируса; и к инактивированному полиовирусу в соответствии с изобретением для применения в способе вакцинации против полиовируса.

Следующие примеры иллюстрируют это изобретение.

Примеры

Пример 1: Конструирование новых штаммов

S15, S17, S18 и S19 (таблица 1, фиг.1) являются производными перорального полиовакцинного штамма Sabin 3 типа 3. Вирусы конструировали и выделяли стандартными способами. Мутированные нуклеотиды показаны жирным шрифтом на фиг.1, в противном случае последовательности являются идентичными Sabin 3. Замена пар оснований CG парами оснований UA или AU, прогрессивно снижает термодинамическую стабильность домена V; удаление всех пар оснований UG делает эту структуру генетически стабильной, тогда как любая отдельная мутация могла бы затем ослаблять релевантную пару оснований. Две одновременные мутации могли бы требоваться для усиления этой структуры, тогда как это могло бы достигаться изменением только пары оснований UA на пару оснований CG (или GC).

Вирусы конструировали и выделяли стандартными способами. Более конкретно, S17, S18 и S19 конструировали при помощи ПЦР-мутагенеза. Для каждой полимеразы, три фрагмента 5'-некодирующего района Sabin 3 амплифицировали при помощи ПЦР с использованием праймеров, включающих в себя необходимые изменения последовательности (как показано на фиг.1), локализованные при нуклеотидах (a) 31-50 и 471-489, (b) 471-489 и 522-540 и (c) 522-540 и 755-778. Эти три перекрывающихся фрагмента (a)-(c) очищали на геле, смешивали и повторно амплифицировали с наружными праймерами, затем фрагмент 747 п.н., содержащий мутированный 5'-некодирующий район клонировали в pCR2.1 (Invitrogen) и секвенировали. Фрагменты MluI-SacI (279-751) с корректными последовательностями лигировали в клоны Sabin, лишенные фрагмента SacI-SacI (751-1900). Полноразмерные инфекционные клоны генерировали добавлением частичного фрагмента SacI/SmaI (2768).

Кодирующие районы капсидного белка (P1) как S18, так и S19, заменяли точно районами P1 живых-аттенуированных вакцинных штаммов серотипа 1 и серотипа 2 (Sabin 1 и Sabin 2) или районами Р1 существующих штаммов для посева IPV дикого типа Mahoney (типа 1), MEF (типа 2) и Saukett (типа 3). Капсидные последовательности амплифицировали при помощи ПЦР с использованием РНК из релевантного штамма полиовируса в качестве матрицы и праймеров, которые включали в себя сайты рестрикции SacI и SacII на 5'- и 3'-концах (фиг.2) без изменения кодирующей последовательности.

Районы Р1 Sabin 1 и Mahoney амплифицировали с использованием праймеров:

- SAC1[5'-ATCATAATGGGAGCTCAGGTTTCA-3'] (SEQ ID NO:3) и

- 2ASAC1(-)[5'-TTGTAACCCGCGGTGTACACAGCTTTATTCTGA

TGCCCAAAGCCATATGTGGTCAGAT-3'] (SEQ ID NO:4).

Район Р1 Sabin 2 амплифицировали с:

- SAC2a[5'-ACAATGGGCGCTCAA-3'] (SEQ ID NO:5) и

- 2ASAC2(-)[5'-TTGTAACCCGCGGTGTACACAGCTTTATTCTGA

TGCCCAAAGCCATAAGTCGTTAATC-3'] (SEQ ID NO:6).

Район Р1 MEF амплифицировали с:

- SAC2b[5'-ACAATGGGAGCTCAA-3'] (SEQ ID NO:7) и

- 2ASACMEF(-)[5'-TTGTAACCCGCGGTGTACACAGCTTTATTC

TGATGCCCAAAGCCATAGGTTGTCAAGC-3'] (SEQ ID NO:8).

Район Р1 Saukett амплифицировали с использованием праймеров:

- S3P1[5'-AACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGGAGCTC

AAGTATCATCCCAA-3'] (SEQ ID NO:9) и

- 2ASACSkt(-)[5'-TTGTAACCCGCGGTGTACACAGCTTTATTC

TGATGCCCAAAGCCGTAGGTGGTCAAAC-3'] (SEQ ID NO:10).

Сайт рестрикции SacII вводили в S18 при помощи ПЦР-мутагенеза с использованием праймеров:

- 2ASAC3(+)[5'-GTGTACACCGCGGGTTACAA-3'] (SEQ ID NO:11) и

- 2ASAC3(-)[5'-TTGTAACCCGCGGTGTACAC-3'] (SEQ ID NO:12).

Последовательности ДНК-фрагментов, содержащие копии всех районов Р1, подтверждали перед включением в полноразмерные геномные плазмиды с использованием сайтов рестрикции SacI и SacII. Таким образом получали двенадцать конечных штаммов (таблица 2, фиг.2), которые различались в последовательности их домена V (S18-подобной или S19-подобной) и в их последовательности, кодирующей капсидный белок (Sabin или дикого типа; серотипы 1, 2 или 3). Последовательности 5'-некодирующих районов всех мутантов подтверждали после экстракции РНК и ОТ-ПЦР.

Вирусы выделяли трансфекцией монослоев HEp2C≥2 мкг T7-транскриптами (Van der Werf et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2330-2334, 1986) с последующим инкубированием при 33°C в течение 24-48 часов, когда был очевидным полный цитопатический эффект.

Пример 2: Фенотипы аттенуации и инфективность

На протяжении последних 15 лет было установлено и валидизировано использование трансгенных мышей, экспрессирующих рецептор полиовируса, для оценивания вирулентности полиовирусов.

Интраспинальное заражение трансгенных мышей, экспрессирующих рецептор полиовируса (мышей TgPVR), является высокочувствительным способом измерения инфективности in vivo, поскольку репликация вируса приводит к потере нейронов и очевидным клиническим признакам паралича. Менее чем десять БОЕ вирусов дикого типа являются обычно достаточными, чтобы парализовать 50% мышей с использованием этого способа инокуляции (Chumakov et al, Dev. Biol. (Basel) 105:171-177, 2001).

Фенотипы аттенуации мутированных штаммов Sabin 3 и межтиповых рекомбинантных штаммов определяли этим стандартным способом. Эти результаты показаны в таблицах 1 и 2.

С использованием высокочувствительного интраспинального способа менее 10 инфекционных единиц для культуры клеток штаммов дикого типа Mahoney и Leon были достаточными, чтобы парализовать половину этих мышей (таблица 1). Штамм S15 был неотличим от Sabin 3, как наблюдали в тесте с обезьянами (Macadam et al, 2006), и все S18-произведенные вирусы имели PD_50i.s. в избытке 10⁸ CCID₅₀ (таблицы 1 и 2). Возможно, имеются недооценки, так как они представляют максимальный титр, практикуемый в инокулированной дозе, который равен 5 мкл. Эффект обменов 3 пар оснований CG-UA в произведенных из S19 вирусов, при экстраполяции, находится, вероятно, в избытке миллиард-кратного уменьшения в инфективности в этой модели. Эти результаты предполагают, что вирусы на основе S18 и S19 могли бы быть существенно менее инфекционными для людей, чем Sabin 3, который имеет низкую инфективность, пока он не ревертирован в домене V (чего не способны делать эти штаммы).

Пример 3: Стабильность при пассировании

Для оценивания стабильности вирусы пассировали при 37°С в клетках L20B в условиях, которые быстро отбирают реверсию в домене V Sabin 3, имитируя отбор в кишечнике человека. При этих условиях последовательности домена V S15 и S16 (фенотипически сходного с S15) были полностью стабильными (Macadam et al, 2006). Произведенные из S18 и S19 вирусы были также стабильными при пассаже и имеют преимущество дополнительных неревертируемых спаренных мутаций. То же самое относится к клеткам Vero, но отбор реверсии в домене V Sabin 3 осуществлялся при меньшей скорости.

Все отобранные вирусы Vero имели мутацию в гене протеазы 2А и росли при более высоких температурах, чем их родители, до ограниченной степени. Этот феномен представляет адаптацию к клеткам обезьяны и не наблюдается в клетках, происходящих из человека или мыши. Эти мутации, по-видимому, не влияют на фенотипы in vivo (таблица 3). PD_50i.s. одного из этих вирусов после 10 пассажей в клетках VERO при 37°С и три из бляшек, выбранных при 37°С, были неотличимыми от этих показателей их родителя, S18. Подобным образом, присутствие мутации N18S в 2A не влияло на аттенуацию фенотипов штаммов S19-IPV с капсидами дикого типа (таблица 4). При наивысшей дозе, вводимой интраспинально, не было клинического заболевания ни у одной из этих мышей. Сходный результат был получен ранее в модели полиомиелита обезьяны. Две различные мутации 2A, которые супрессировали чувствительный к температуре фенотип Sabin 2, обусловленный аттенуирующей мутацией в 481 в домене V, не влияли на аттенуацию (Rowe et al.; Virology 269:284-293, 2000).

Пример 4: Свойства роста в культуре клеток

В культуре клеток, прогрессирующее ослабление вторичной структуры РНК домена V прогрессирующим образом снижало верхний предел температур, при которых этот вирус был способен воспроизводиться (фиг.3). Фактические пределы зависели от клеточного субстрата, используемого с клетками Hep2C, которые являются наиболее допустимыми, клетками L20B, которые являются наименее допустимыми, и клетками Vero, которые являются промежуточными.

Кинетика роста и выход всех этих штаммов были сходными в клетках MRC5 при 33°C, дающими выходы, такие же высокие, что и выходы вирусов дикого типа (10⁸-10⁹ TCID₅₀/мл), в пределах 24 часов (фиг.4). Клетки MRC5 валидизированы и лицензированы для производства IPV, хотя не многие изготовители используют их, предпочитая бессывороточную культуру клеток Vero на микроносителях. Первоначальные выходы в клетках Vero были вариабельными в зависимости от источника и уровня пассирования этих клеток, но были рутинным образом более низкими, чем в клетках MRC5. До сих пор, титры 2×10⁸/мл получали при 24 часах для вирусов S18 и 5×10⁷/мл для вирусов S19. Тем не менее, предварительное доказательство авторов (ниже) позволяет предположить, что могут быть получены выходы D-антигена в клетках Vero, эквивалентные существующим посевным материалам дикого типа.

Пример 5: Иммуногенность

Двумя стандартными анализами периодического выделения для продуктов IPV являются ELISA-тест на D-антиген и тест на иммуногенность крыс (European Pharmacopoeia-supplement 2001 2000:0214 1289-1293). ELISA-анализ использует антитела, специфические в отношении нативных полиовирионов, для измерения антигенности и затем выражает иммуногенность сравнением со стандартным препаратом. Для анализа in vivo группы крыс иммунизируют четырьмя разведениями вакцины и их сыворотки тестируют на присутствие нейтрализующих антител. Иммуногенность вакцины рассчитывают статистическим сравнением индексов сероконверсии для тест-препаратов с индексом сероконверсии, полученным со стандартным препаратом. Оба эти анализа использовали для оценивания иммуногенности описанных выше новых штаммов.

Для всех вирусов, перечисленных в таблице 5, готовили исходные штаммы вирусов с высокими титрами и инактивировали формальдегидом с использованием протокола уменьшения масштаба изготовителя (Martin et al., J. Gen. Vir. 84:1781-1788, 2003). ELISA D-антигена проводили на материале до и после инактивации. Эти данные использовали для расчета подходящих доз для анализов in vivo, которые проводили с использованием Стандартных Операционных Процедур периодического выделения вакцин. Вакцины проходят тест на крысах, если 95% доверительные границы иммуногенности включают в себя величину 1,0; таким образом, все конструкты с капсидами дикого типа (и S18/S1P1) были достаточно иммуногенными для выделения в виде IPV.

Полиовирус MEF-1 был выделен в 1942 году и содержал по меньшей мере два близкородственных компонента; штаммы MEF-1, используемые в настоящее время изготовителями IPV, также различаются несколькими нуклеотидными положениями (Odoom, JK; PhD Thesis, London School of Hygiene and Tropical Medicine, 2008). Было обнаружено, что аминокислотная последовательность капсидного белка вируса S18/MEFP1 отличается от аминокислотной последовательности ссылочного штамма IPV-иммуногенности в одном положении, так что конструировали другую версию, S18/MEF2P1, которая имела такую же капсидную аминокислотную последовательность, что и эта ссылочная последовательность. В крысиных анализах иммуногенности S18/MEF2P1 был неотличим от ссылочного штамма, имеющего относительную иммуногенность 1,0 (таблица 4), тогда как вирус S18/MEFP1 имел слегка более низкую иммуногенность. Оба штамма были достаточно иммуногенными для прохождения теста периодического выделения вакцины (CI должен включать в себя величину 1,0), но штаммы с последовательностями капсидного белка MEF2P1, являются, вероятно, предпочтительными для получения вакцины.

После статистического анализа эти результаты показали:

(i) Изменения, введенные в домен D, не влияли на инактивацию, антигенность или иммуногенность.

(ii) Выходы иммуногена в виде DAgU/титр инфекционности находились в соответствии с данными изготовителя.

(iii) Штаммы с капсидными белками дикого типа были приблизительно такими же иммуногенными, как эквивалентный штамм IPV.

(iv) В сравнении с релевантным ссылочным штаммом дикого типа, штаммы с капсидными белками Sabin были слегка более (тип 1), гораздо менее (тип 2), и слегка менее (тип 3) иммуногенными.

Пример 6: Рост и стабильность клеток Vero

При выращивании штаммов полиовирусов S18 и S19 в клетках Vero, их первоначальное воспроизведение является довольно медленным. Полиовирусы с конкретными мутациями в гене протеазы 2А растут более эффективно в клетках Vero. При выращивании многих полиовирусов в клетках Vero, они адаптируются для роста в этом типе клеток, и именно мутации в гене протеазы 2А являются ответственными за увеличенную эффективность роста. Версии штаммов S18 и S19, которые имеют подходящую модификацию, введенную в ген 2А (например, мутацию N18S), не требуют стадии адаптации и воспроизводятся эффективно в клетках Vero с самого начала.

Действие мутации V123A в присутствии гена протеазы 2А Sabin 3, S18 и S19 на рост в клетках Vero было продемонстрировано инфицированием клеток Vero при множественности заражения 1,0 и инкубированием этих клеток в течение 48 ч при 33°C. Выходы измеряли анализом CCID₅₀ в клетках Hep2C при 33°C. Эти результаты показаны в таблице 6 ниже.

Вирус S18/MahP1 и эквивалентный вирус с мутацией, введенной в ген 2А, S18/MahP1/2A N18S, оба, росли в клетках Vero при трех различных температурах на протяжении 10 пассажей для определения стабильности последовательности гена протеазы 2А и последовательности домена V. Как показано в таблице 7 ниже, последовательность домена V и последовательность N18S-мутированного гена протеазы 2А были полностью стабильными. Немутированная последовательность гена протеазы 2А захватывала мутации, которые облегчают рост в клетках Vero, как и ожидалось.

Таблица 7
Стабильность последовательности после 10 пассажей в клетках Vero   Температура пассажа Последователь-ность домена V Последовательность 2A^pro S18/MahP1 33°C Нет изменений Отобранные мутации* 35°C Нет изменений Отобранные мутации* 37°C Нет изменений Отобранные мутации* S18/MahP1/2A
N18S 33°C Нет изменений Нет изменений 35°C Нет изменений Нет изменений 37°C Нет изменений Нет изменений *L17R, N18S, L21R, P90S, S105T или D138N.

Изобретения касаются живого аттенуированного рекомбинантного полиовируса, его применения для получения вакцины, в качестве посевного материала или для получения лекарственного средства, способа получения такой вакцины и способа вакцинации пациента. Охарактеризованный полиовирус имеет 5'-некодирующий район, состоящий из 5'-некодирующего района Sabin 3, модифицированный таким образом, что он не имеет ошибочного спаривания пар оснований в стебле (a) или (b) домена V, где семь или восемь пар оснований в стеблях (a) и (b) являются парами оснований U-A или A-U; и капсидный белок из штамма Sabin 1, Mahoney, MEF или Saukett. Представленные изобретения могут быть использованы для получения безопасных вакцин с улучшенными иммуногенными свойствами против полиовируса. 7 н. и 7 з.п. ф-лы, 4 ил., 7 табл., 6 пр.

1. Жизнеспособный аттенуированный рекомбинантный полиовирус, имеющий:
(i) 5′-некодирующую область, состоящий из 5′-некодирующей области вакцинного штамма Sabin 3, модифицированную таким образом, что она не имеет ошибочного спаривания пар оснований в стебле (а) или (b) домена V, где семь или восемь пар оснований в стеблях (а) и (b) являются парами оснований U-A или A-U; и в которой:
(a) пара оснований U-A присутствует в положениях 471-538 и 472-537 в стебле (а) и в положениях 478-533, 480-531 и 481-530 в стебле (b) и пара оснований A-U присутствует в положениях 479-532 и 482-529 в стебле (b); или
(b) пара оснований U-A присутствует в положениях 471-538 и 472-537 в стебле (а) и в положениях 478-533, 480-531 и 481-530 в стебле (b) и пара оснований A-U присутствует в положениях 477-534, 479-532 и 482-529 в стебле (b); и
(ii) кодирующую капсид область Р1 из штамма Sabin 1, Mahoney, MEF или Saukett;
причем указанный полиовирус пригоден для применения в качестве посевного материала полиовакцины (IPV).

2. Полиовирус по п. 1, имеющий неструктурную кодирующую область и 3′-некодирующую область, происходящие из Sabin 3.

3. Полиовирус по п. 1, дополнительно содержащий мутацию в гене протеазы 2А, причем указанная мутация ассоциирована с более высокими выходами иммуногенных частиц в клетках, происходящих из обезьяны.

4. Полиовирус по п. 3, где указанная мутация в гене протеазы 2А может быть получена пассированием полиовируса по любому из пп. 1 или 2 в клетках Vero.

5. Полиовирус по п. 3, где эта мутация не изменяет остатки Н20, D38 или С109.

6. Полиовирус по п. 3, где эта мутация является одной или несколькими аминокислотными изменениями: A8V, Y10C, C17Y, N18S, Y19C, Y19H, T23I, E25G, A30P, I33V, W35R, K45E, G48D, E65K, E65V, Y70C, Т79А, F80L, Y82H, Y93H, H96Y, S105T, P106S, I122V, V123A, G127R, V131A и S134T.

7. Полиовирус по п. 1, который является инактивированным.

8. Применение аттенуированного полиовируса по п. 7 в вакцине, дополнительно содержащей фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, для вакцинации пациента, представляющего собой человека, против полиовируса.

9. Вакцина, содержащая полиовирус, определенный в п. 7, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, причем указанная вакцина пригодна для вакцинации пациента, представляющего собой человека, против полиовируса.

10. Применение жизнеспособного аттенуированного полиовируса по любому из пп. 1-6 в качестве посевного материала инактивированной полиовакцины (IPV).

11. Способ получения инактивированной полиовакцины, включающий:
(i) выращивание жизнеспособного аттенуированного полиовируса по любому из пп. 1-6 в культуре клеток ex vivo;
(ii) инактивирование указанного полиовируса; и
(iii) составление указанного инактивированного полиовируса с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.

12. Способ по п. 11, где этот полиовирус выращивается в клетках, не являющихся клетками человека.

13. Применение аттенуированного полиовируса по п. 7 в получении лекарственного средства для применения в способе вакцинации против полиовируса.

14. Способ вакцинации пациента против полиовируса, включающий введение пациенту эффективного количества аттенуированного полиовируса по п. 7.