Способ внутритиповой дифференциации полиовирусов Советский патент 1990 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано для дифференциации вирусов полиомиелита.

Цель изобретения - повышение точности дифференциации.

Для этого исследуемые изоляты вирусов полиомиелита параллельно культивируют в фибробластах эмбриона человека и перевиваемой линии клеток Нер-2 и при наличии разницы в титре

2,0; 2-3 и 3,0 lg ЦПД 5й /л|л относят к диким, промежуточным или вакцинным соответственно.

Пример 1. Приготовление тест- культуры. Ткани туловища и конечностей плода 2-Ц мес беременности измельчают ножницами до мелких кусочков размером 2-k мм, затем промывают три

раза в растворе Хенкса, рН 7,1. Измельченную ткань трипсинизируют.

Полученную суспензию клеток осаждают центрифугированием при 1500 - 2000 об /мин в течение 15 мин и помещают в холодильник до смешивания с клетками последующих экстракций. Смешанную суспензию клеток, полученную после всех экстракций, центрифугируют при 1500-2000 об /мин в течение 15 мин, надосадочную жидкость отбрасывают, клетки ресуспендируют в среде с 0,5%-ным раствором гидро- лизата лактальбумина на растворе Хенкса, рН 7,0. Осадок ресуспендируют в питательной среде для выращивания клеток до концентрации 250 тыс. клеток в 1,0 мл. В качестве среды для выращивания клеток использовали

in

00

w

4ь

5

31

среду с 0,5% гидролизата лактальбу- мина на растворе Хенкса, рН 7S0V среду .199 на растворе Хенкса, рН 7,2, в каждую из которых добавляли сыворотку крупного рогатого скота (10,0% и антибиотики из расчета 25 тыс„единиц пенициллина и 25,0 мг стрептомицина на 100,0 мл среды.

Перед пересевом культуры Нер-2 проводят просмотр и оценку монослоя. Отбирают культуру со сплошным монослоем клеток, имеющих типичную для данной линии морфологию, с четко выраженными границами между клетками,, Клетки снимают со стекла матрасов трип- син-версеном. Для этого готовят смес равных объемов 0,25%-ного раствора трипсина и раствора версена, подогревают ее в водяной бане до 30-350С Вначале с матраса выливают питательную среду, клеточный слой промывают три раза фосфатно-буферным раствором (рН 7,5), не содержащим ионы кальция и магния. Затем теплой смесью (трипсин-вереей) заливают монослой культуры клеток. В матрасы объемом 100, 250 и 1000 мл раствор добавляют соответственно по 10, 15 и 30 мл. Матр сы встряхивают и помещают в термоста (37°С) на 15-20 мин до полного отделения клеток от поверхности стекла. Взвесь клеток разводят питательной средой с таким расчетом, чтобы в 0,1 мл содержалось 60 тыс. клеток.

В качестве среды для выращивания клеток используют среду Игла, MEM, рН 7,2, с добавлением телячьей сыворотки или сыворотки крупного рогатого скота (10,0%-ной) и антибиотиков. Первично трипсинизированные клетки ФЭЧ и перевиваемые Нер-2 разливают в пробирки по 1, 0 мл.Для поддержива- ния клеток используют приведенные питательные среды без добавления сыворотки. В пробирках среду меняют через k сут культивирования клеток. Обновление сплошного монослоя клеток новой генерации наблюдают через 5 - 6 сут.

П р и м е р 2. Проводят сравнительную внутритиповую дифференциацию 96 вирусов полиомиелита, выделенных от больных полиомиелитом, из сточных вод, а также стандартных штаммов: диких - flahoney, MEP-1 , Saukett, и вакцинных - Ls с2ав, P712Ch 2ав и

по ряду известных марке

L еоп12э в

ров (ret tO , Lu, A A, N, Ag) , а так

n

5

S

же по предлагаемому признаку ФЭЧ. Титрование изолятов вируса осуществляют параллельно в культуре клеток ФЭЧ и Нер-2 методом конечного разведения по цитопатическому действию и выражают в lg ЦПД. Для титрования полиовирусов готовят десятикратные разведения от 10 до 10 &.

Перед заражением моиослоя культуры ФЭЧ и Нер-2 полиовирусами производят 3-кратное смывание культуры клеток от сыворотки раствором Хэнкса, рН 7s1, или раствором Зрла, рН 7,6. На каждое десятикратное разведение вируссодержащего материала используют по четыре пробирки с культурой клеток. Вируссодержащий материал вносят на монослой клеток в объеме 0,1 мл, затем клетки инкубируют при 37,0+0,1°С в течение 60 мин, после чего вносят поддерживающую среду . без сыворотки. Инкубирование зараженных полиовирусами культур ФЭЧ и Нер-2 производят при 37,0+0,1°С в течение 7 дн. Результат цитопатического действия ЦПД полиовирусов считают положительным, если не менее половины клеток в культуре подвергались специфической дегенерации.

Результаты исследований уровня репродукции изолятов вирусов полиомиелита того или иного иммунологического типа в параллельно зараженных культурах ФЭЧ и Нер-2 учитывают при соблюдении следующих контролей: монослой незараженных культур Нер-2 и ФЭЧ должен сохраниться до конца

0

5

чительно после заражения (контроль культуры клеток); разница в уровне репродукции в культуре клеток Нер-2 и ФЭЧ для аттенуированных стандартных полиовирусов (Ls с2ав, Р712Сп2ав, Ьеоп12а-)в) цолжна быть 103 ° тогда как для диких (уличных стан- дартных вирусов полиомиелита (Maho- ney, MEF-1, Saukett))этот показатель составляет 1 ЦПД Ј-0/мл (табл. 1).

Статистическая обработка данных репродукции аттенуированных, промежуточных и диких (уличных) штаммов вирусов полиомиелита свидетельствует о том, что разница в уровне размножения в культуре клеток ФЭЧ и Нер-2 для отдельных указанных групп,полиовирусов внутри одного и того же иммунологического типа достоверно отличается (Р 0,001). Из № исследованных полиовирусов всех трех иммуноло- .гических типов, для И штаммов вируса полиомиелита типа I, имеющих генетическую характеристику ret 0°, Lu , N , а в антигеннрм отношении сходных со штаммами Коньков, Коньков + + LscZae и Mahoney разница составляет 2,0 lg ЦПДу0//нл . Исключение составляет один штамм, имеющий гене-, тическую характеристику , Lu , А, N в в антигенном отношении сходный с промежуточным вариантом Коньков + LSc2ae. Для этого штамма разница в титре составила 2,5 1§ЦПД5о/мЛ Остальные 39 штаммов этого же типа имеют генетическую характеристику ret Ч О °, Lu-, At, N-, а в антигенном отношении сходны со штаммом LscZae. В данном случае разница титров вирусов полиомиелита 3,0 1ёЦПДЈо/Л,А (табл. 2).

Сходные результаты получают при параллельной количественной индикации 22 и 30 штаммов полиовирусов типа II и III соответственно в этих же культурах клеток. Величина разницы титров штаммов вирусов полиомиелита типа II, имеющих характеристики ret АО0, Lu , A, N а в антигенном отношении сходных со штаммами MEF-1, была 2,0 lg ЦПД 5-о//Ґл тогда как для остальных 18 штаммов полиовирусов, у которых известные генетические маркеры , Lu-9 А, коррелируют между собой, а в антигенном отношении сходные со штаммом Р712СЬ2ав, эта же величина составляет 301§ЦПД 5о/«л. Такая же динамика размножения харак- терна и для штаммов полиовируса типа III, Уровень размножения 18 штаммов

.15

3М1

6

вируса полиомиелита, имеющих генетическую характеристику , Lu , А и сходных в антигенном отношении со штаммом Saukett был на 2 ,0 lg ЦПД 5о/мл выше в клетках Нер-21 чем в ФЭЧ. Для 12 штаммов втруса полиомиелита типа III, сходных по некоторым генетическим признакам с вакцинными штаммами эта разница составляет 3,0 lg

ЦПД Го/мл

Применение способа внутритиповой дифференциации энтеровирусов по признаку ФЭЧ опережает по стабильности ряд генетических признаков, в том числе Ms, и во всех случаях совпадает с антигенным признаком (Ag). Это позволяет использовать признак ФЭЧ как новый генетический маркер, обеспечивающий более точную предварительную дифференциацию вирусов полиомиелита ьа вакцинные, промежуточные и дикие варианты.

25

Формула изобретения

Способ внутритиповой дифференциации полиовирусов, включающий установленные разницы титров при параллельном выращивании вируса в двух культурах различного происхождения, о т- личающийся тем, что, с целью повышения точности дифференциации, в качестве культур используют фибробласты эмбриона человека и перевиваемую линию Нер-2 и при разнице в титре меньше 2 lg ЦПД Ј0/мл , 2,0-3,0 lg ЦПД 5-0/мл и больше 3,0 lg Unfljc/MA штаммы относят к диким, промежуточным или вакцинным соответственно.

Изобретение относится к вирусологии и может применяться для дифференциации вирусов полиомиелита. Цель изобретения - повышение точности дифференциации. Изоляты вирусов полиомиелита параллельно культивируют в фиброобластях эмбриона человека и перевиваемой культуре Нер=2 и при наличии разницы в титре *982,0 LG ЦПД 50/мл, 2,0-3,0 ЦПД 50/мл и *98 3,0 LG0 ЦПД 50/мл относят к диким, промежуточным 0или вакционным соответственно. 2 табл. 0LDЦПД относятся к диким 50/мл, промежуточным или вакцинным соответственно. 2 табл.

Таблица 1

Примечание. Признак N-патогенность вируса полиомиелита

типа II для белых мышей.

Редактор Н.Яцола

Составитель 0.Жакетов Техред Л.Олийнык

Заказ 2231

Тираж 482

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. V5

Таблица 2

Корректор И.Муска

Подписное