СРЕДСТВО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ АТТЕНУАЦИИ ВИРУСА ПОЛИОМИЕЛИТА Российский патент 1996 года по МПК A61K39/00 C12N7/00 

Изобретение относится к вирусологии, а именно, к средствам оценки степени аттенуации вируса полиомиелита. Известно использование триозид-(25S) -5α-3β-22α, 26-триол-26-0-b-D-глюкопиранозида (томатозида) в качестве химического иммунизатора для защиты растений табака от вируса бронзовости табака (ВБТ) (1, 2).

Целью изобретения является расширение ассортимента маркеров, используемых для оценки степени аттенуации вируса полиомиелита за счет выявления новых дополнительных свойств томатозида, ранее неизвестных.

Для достижения цели в качестве маркера используют раствор томатозида. Основой предлагаемого маркера является тот факт, что динамика подавления репродукции вакцинных вариантов вируса полиомиелита в культуре клеток, при наличии в поддерживающей среде раствора томатозида в конечной концентрации 0,01% значительно опережает аналогичный процесс, касающийся диких вариантов вируса полиомиелита. При отличии показателей интенсивности подавления репродукции изолятов вируса полиомиелита в культуре клеток при наличии и отсутствии томатозида в поддерживающей среде до 3,0 lg ЦПД_50/мл включительно, их относят к диким, при разнице больше 4,0 lg ЦПД_50/мл к вакцинным, а если отличие между этими показателями колеблется в пределах от 3,0 до 4,0 lg ЦПД₅₀, то их относят к промежуточным.

Использование предлагаемого маркера для оценки степени аттенуации вируса полиомиелита показывает, что данные, полученные с помощью этого признака, полностью коррелируют с антигенным признаком (Ag).

Использование томатозида для определения степени аттенуации вируса полиомиелита иллюстрирует следующий пример.

Приводят результаты определения степени аттенуации 35 штаммов вируса полиомиелита, в частности, изолированных от больных полиомиелитом, из образцов проб водных объектов, а также музейных штаммов вируса полиомиелита, включая дикие варианты (Mahoney, Луговской, Смирновой, MЕE-1, Saukett), промежуточные (Коньков + LSc2ab) и вакцинные (LSc2ab, P712Ch2ab, Leon12a₁b), по антигенному признаку и по предлагаемому нами маркеру.

Приготовление рабочего раствора томатозида. Отвешивают 100,0 мг томатозида, порошкообразного кристаллического вещества, желто-коричневого цвета, и помещают в стерильную стеклянную емкость (до 200,0 мл), куда добавляют 100,0 мл питательной среды (среда 199, Игла и др.). Взвесь периодически встряхивают в течение 1 ч до полного растворения томатозида. Полученный раствор стерилизуют через асбестовый фильтр и сохраняют в объеме до 25,0 мл в темных флакончиках, хорошо закупоренных, при температуре 4^oC.

Приготовление перевиваемой культуры HEp-2 осуществляют следующим образом: перед посевом культуры обязательно проводят просмотр и оценку монослоя. Отбирают культуру со сплошным монослоем клеток, имеющих типичную для данной линии морфологию, с четко выраженными границами между клетками. Клетки снимают со стекла матрасов трипсин-версеном. Для этого приготавливают смесь равных объемов 0,25%-ного раствора трипсина и раствора версена, подогревают ее в водяной бане до 30 0 35^oС. Вначале с матраса выливают питательную среду, клеточный слой промывают 3 раза фосфатно-буферным раствором (рН 7,5), не содержащим ионы кальция и магния. Затем теплой смесью (трипсин-версен) заливают монослой культуры клеток так, чтобы все участки были покрыты жидкостью. В матрасы объемом 100,0; 250,0 и 1000,0 мл раствор добавляют соответственно по 10,0; 15,0 и 30,0 мл. Матрасы встряхивают и помещают в термостат 37^oС на 15 20 мин до полного отделения клеток от поверхности стекла.

Крупные конгломераты клеток диспергируют, пипетируя несколько раз клеточную взвесь. Суспензию клеток центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин, смесь трипсин-версен удаляют. Осажденные центрифугированием клетки ресуспендируют в небольшом объеме ростовой питательной среды, количество клеток подсчитывают в счетной камере Горяева. Взвесь клеток контролируют на бактериальную стерильность, разводят питательной средой с таким расчетом, чтобы в 1,0 мл содержалось 60 тыс. клеток. В качестве среды для выращивания клеток используют среду Игла, среду 199, Игла-МЕМ с добавлением сыворотки крупного рогатого скота 10,0% и антибиотиков. Перевиваемую культуру НЕр-2 разливают в пробирки по 1,0 мл. В качестве поддерживающей среды используют те же вышеприведенные питательные среды без добавления сыворотки. Обновление сплошного монослоя клеток новой генерации наблюдают через 5 6 суток.

Титрование изолятов вируса полиомиелита того или иного иммунологического типа с целью изучения степени их аттенуации, а также стандартных вакцинных и диких штаммов вируса полиомиелита, проводят и диких штаммов вируса полиомиелита, проводят в культуре клеток НЕр-2 методом конечного разведения по цитопатогенному действию и выражают в lg ЦПД_50/мл. Для титрования штаммов вируса полиомиелита вначале готовят его разведение, обычно десятикратные, от 10^-1 до 10^-9. Во все пробирки вносят по 9,0 мл стерильного физиологического раствора или раствора Хэнкса. Затем в первую пробирку вносят 1,0 мл вируссодержащего материала и получают разведение 10^-1 (1:10). При помощи новой пипетки содержимое первой пробирки тщательно перемешивают и 1,0 мл переносят во вторую пробирку, получая разведение 10^-2 (1:100) и т.д. до 10^-9.

Затем раствор томатозида (0,1%) в объеме 0,5 мл соединяют с равным объемом вируссодержащего материала каждого разведения. Смесь раствора томатозида и вируса выдерживают в течение 1 ч при 37^oС. Предварительно перед заражением монослоя культуры НЕр-2 смесью вирус + раствор томатозида производят 3 раза отмывание культуры клеток от сыворотки раствором Хэнкса, рН 7,4 или раствором Эрла, рН 7,6. На каждое десятикратное разведение вируссодержащего материала используют по 4 пробирки с культурой клеток. Смесь раствора томатозида и вируса в объеме 0,2 мл добавляют в пробирки с культурой клеток, в которые предварительно заливают поддерживающую среду в объеме 0,8 мл. Пробирки помещают в термостат в специальных лотках в горизонтальном положении. Состояние зараженных культур периодически проверяют под световым микроскопом в течение 7 дней. Результат цитопатического действия ЦПД₅₀ вируса считается положительным, если не менее половины клеток в культуре подвергались специфической дегенерации.

Опыт сопровождается следующими контролями:
1. контроль репродукции стандартных штаммов вируса полиомиелита титруют вирус полиомиелита в культуре клеток НЕр-2 при отсутствии и наличии раствора томатозида в поддерживающей среде клеток в конечной концентрации 0,01%
2. контроль культуры клеток используют интактную культуру клеток НЕр-2 при отсутствии и наличии в поддерживающей среде 0,01%-ного раствора томатозида. Титр (50,0% эффективной дозы) вычисляют по методу Рида-Менча (Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний. М. Медицина, 1974, с. 7 56; под ред. проф. Э. Леннета и Н. Шмидта; Методы лабораторной диагностики энтеровирусных инфекций. М. Медицина, c. 150, Ворошилова М.К. Жевандрова В.И. Балоян М.С.) и методом пробитов, используя специальные таблицы (Методические рекомендации по санитарно-вирусологическому контролю объектов окружающей среды, М. c. 76, под ред. проф. Дроздова С.Г. и Казанцевой В.А.).

Результаты оценки динамики подавления интенсивности репродукции штаммов вируса полиомиелита в культуре клеток НЕр-2 при наличии и отсутствии томатозида в поддерживающей среде учитывают только при соблюдении следующих контролей:
1. Монослой незараженной культуры НЕр-2 (при наличии и отсутствии в поддерживающей среде томатозида в конечной концентрации 0,01%) должен сохраниться до конца опыта, т.е. до седьмых суток включительно после заражения (контроль культуры клеток).

2. Разница в интенсивности репродукции в культуре клеток НЕр-2 при отсутствии и наличии томатозида в поддерживающей среде для аттенуированных стандартных штаммов вируса полиомиелита (LSc2ab, P712Ch2ab, Leon12a₁b) составляет более 10^4,0 ЦПД_50/мл, тогда как для диких стандартных штаммов вируса полиомиелита (Mahoney, Луговской, MEF-1, Смирновой, Saukett) этот показатель составляет до 10^3,0 ЦПД_50/мл включительно.

Анализ результатов, полученных при определении степени подавления репродукции томатозидом 14 изолятов вируса полиомиелита типа l, показывает, что для изолятов, сходных в антигенном отношении со штаммами Mahoney, Луговской, разница в подавлении их репродукции в культуре составляет до 3,0 lg ЦПД_50/мл включительно. Исключение составляет один изолят, сходный в антигенном отношении с промежуточным вариантом Коньков + LSc2ab. Для этого штамма отличие в титре составляет 3,5 lg ЦПД_50/мл. Остальные изоляты этого же иммунологического типа имели антигенное сходство со штаммом LSc2ab. В данном случае разница в интенсивности подавления репродукции изолятов вируса полиомиелита составляет больше 4,0 lg ЦПД_50/мл.

Подобные результаты получены при изучении влияния раствора томатозида на динамику подавления репродукции штаммов вируса полиомиелита типа II в культуре клеток. Величина разницы интенсивности подавления репродукции 7 штаммов вируса полиомиелита типа II, в антигенном отношении сходных со штаммами MEF-1 и Смирновой, составляет до 3,0 lg ЦПД_50/мл, тогда как для остальных 4 изолятов вируса полиомиелита, сходных в антигенном отношении со штаммом P712Ch2ab, эта величина составляет больше 4,0 lg ЦПД_50/мл. Такая же динамика подавления репродукции характерна и для изолятов вируса полиомиелита типа III. Отличие в интенсивности подавления репродукции 7 изолятов, сходных в антигенном отношении со штаммом Saukett, составляет до 3,0 lg ЦПД_50/мл включительно в культуре клеток НЕр-2, где процент томатозида в питательной среде составляет 0,01% по сравнению с таковой, где томатозид не добавляют. Что касается остальных 3 изолятов вируса полиомиелита типа III, в антигенном отношении сходных с вакцинным вирусом Leon12a₁b, то для них эта разница составляет 3,0 lg ЦПД_50/мл. Сходные результаты получены при изучении влияния томатозида на репродуктивную способность стандартных (музейных) штаммов вируса полиомиелита (таблица). Так, для диких штаммов вируса полиомиелита (Mahoney, Луговской, MEF-1, Смирновой, Saukett) этот показатель составляет до 3,0 lg ЦПД_50/мл включительно, а для вакцинных (LSc2ab, P713Ch2ab, Leon12a₁b) больше 4,0 lg ЦПД_50/мл.

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о полном совпадении информации, касающейся степени аттенуации вариантов вируса полиомиелита, полученной с помощью известного теста (3, 4) и предложенного нами маркера. Это позволяет рассматривать томатозид как новый маркер оценки степени аттенуации вирусов. Предложенный маркер не уступает по чувствительности известному маркеру (Ag), выявляемому в реакции диффузионной преципитации в геле, широко доступен и экономически выгоден.

Использование: медицина, медицинская вирусология, для определения степени аттенуации вируса полиомиелита. Сущность изобретения: в целях расширения ассортимента маркеров для генетической характеристики полиовируса предлагается использовать раствор томатозида - триазид-(25S) -5α-3β-22α, 26-триол-26-0-b-D-глюкопиранозид в конечной концентрации 0,01%. 1 табл.

Использование томатозида в качестве средства для определения степени аттенуации вируса полиомиелита.