СРЕДСТВО С ЛИПОСОМАМИ, СОДЕРЖАЩИМИ АЛЬБУМИН И ЭКСТРАКТ ПРОПОЛИСА, ОБЛАДАЮЩЕЕ РЕПАРАТИВНОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПРИ ГЕМОРРАГИЧЕСКИХ АНЕМИЯХ Российский патент 2016 года по МПК A61K9/127 A61K35/644 A61K35/57 A61K35/14 A61P7/06 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к фармации, и касается разработки медицинских капсул, содержащих альбумин и экстракт прополиса, и может быть использовано в комплексном лечении заболеваний, связанных с геморрагической анемией.

Известен препарат альбумин, выпускаемый под различными торговыми наименованиями - препарат «Плазбумин 20» - 20% раствор для инфузий во флаконах по 20 г в 100 мл, производимый Талекрис Биотеральютикс Инк. США.

Известны препараты альбумина Альбумин Постаб сухой, Альбумин Дессау, Альбумин донорский, Альбумин плацентарный, Альбумин человеческий, Зельнаб, Постаб, Уман альбумин в виде инфузионных растворов - 5%, 20%, 25%. Альбумин получают путем фракционирования крови, плазмы, плаценты, сыворотки крови от здоровых доноров. Терапевтическое действие альбумина обусловлено его физиологическими функциями - высокой онкотической активностью [htxp://www.piluli.com.ua/notes.php?lek=21028]. Основное активное действующее вещество - альбумин. Является плазмозаменителем, природным белком, препаратом крови. Входит в состав белковой фракции человека. В плазме крови человека в здоровом состоянии среди всех белком альбумины составляют 60%. Альбумин включает в себя 20 аминокислот. Синтезируется в печени. Основная задача альбумина - поддержание онкотического коллоидного давления крови. Растворы препарата готовят из плаценты, плазмы крови путем фракционирования. Альбумин представлен прозрачной жидкостью, цвет которой варьирует от светло-коричневого до желтого [http://medside.ru/albumin-drug].

Альбумин эффективно применяется для коррекции гипоальбуминемии различной этиологии, восстановления онкотического, коллоидного давления крови, водно-электролитного равновесия, при нарушенной гемодинамике (центральной, периферической), улучшает усвоение лекарственных препаратов, оказывает дезинтоксикационное воздействие. Альбумин транспортирует и связывает жирные кислоты, пигменты, лекарственные вещества, ионы металлов, инактивирует токсины.

Известно лекарственное средство с альбумином и экстрактом прополиса для лечения ожоговых заболеваний в виде мази, содержащей альбумин сухой и экстракт прополиса спиртовой, а в качестве мазевой основы вазелин медицинский, пентол и воду очищенную при следующем соотношении компонентов, мас.%: альбумин сухой - 10; экстракт прополиса спиртовой - 5; вазелин медицинский - 38; пентол - 2; вода очищенная до 100, дополнительно содержащей консервант (смесь нипагина и нипазола 7:3) - 0,1 [патент RU 2381804, 2010 г.].

Известно средство Ферроплекс, содержащее в качестве действующего вещества сульфат железа и аскорбиновую кислоту в количестве 50 мг и 30 мг в виде драже. Ферроплекс применяется при лечении анемии различного генеза (гипохромная анемия, хронический гастрит, состояние после резекции желудка, острые и хронические кровотечения, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки) [http://www.vidal.ru/poisk_preparatov/ferroplex_14861.htm].

Наиболее близким аналогом изобретения является раствор для внутривенного или подкожного введения Эпокрин, содержащий эпоэтин альфа (рекомбинантный эритропоэтин человека), альбумин в форме раствора альбумина для инфузий 10%, натрия цитрата пентасесквигидрат или натрия цитрата дигидрат, натрия хлорид, лимонной кислоты моногидрат и воду для инъекций [Антианемические препараты Эпокрин, раствор [Электронный ресурс] Режим доступа: https://health.mail.ru/drug/epokrin/. Дата обращения: 26.02.2015 г.].

Задачей изобретения является расширение арсенала средств, обладающих репаративным действием при анемиях различного генеза.

Технический результат - получение нового лекарственного средства перорального применения в форме твердых желатиновых капсул с липосомами, обладающего репаративной активностью при геморрагической анемии, обеспечивающего максимальное поступление действующих веществ из желудочно-кишечного тракта в кровоток, в сочетании с антиоксидантным, спазмолитическим, противовоспалительным, регенерирующим и антибактериальным действием.

Указанный технический результат достигается тем, что средство, обладающее репаративной активностью при геморрагической анемии, содержащее 10% водный раствор альбумина в качестве действующего вещества и вспомогательные вещества, согласно изобретению 10% водный раствор альбумина и 10% спиртовой экстракт прополиса включены в липосомы, полученные путем растворения яичного лецитина в смеси диэтилового эфира и хлороформа в соотношении 2:1, при температуре 37°C, с последующей отгонкой органического слоя до сухого остатка, добавления 10% водного раствора альбумина и двукратной обработки смеси ультразвуком частотой 22 кГц и мощностью 500 Вт, к образовавшейся эмульсии добавляют 10% спиртовой экстракт прополиса, причем липосомы заключены в капсулы для перорального введения, при следующем соотношении компонентов липосомы, г на 1 капсулу:

Водный раствор альбумина 10% 1,0 Экстракт прополиса спиртовой 10% 0,2 Лецитин яичный 0,22

При этом в качестве растворителя для получения 10% спиртового экстракта прополиса используют спирт этиловый 70%; используют капсулы номер 0, имеющие диаметр 7,65 мм, длину 21,7 мм, объем наполнения 0,68 мл, полученные при следующем соотношении компонентов, г на 1 капсулу:

желатин 0,0423 глицерин 0,0184 титана двуокись 0,00025 вода очищенная 0,0351

Методика получения липосом с 10% раствором альбумина и экстрактом прополиса 10% спиртовым:

5 г яичного лецитина (Лецитин яичный по ТУ 6-09-0001-87 Д) растворяют в смеси диэтилового эфира и хлороформа (2:1) при постоянном перемешивании на шейкере в течение 10 минут. Органический слой отгоняли на роторном испарителе под вакуумом на водяной бане при 37°С практически до сухого остатка и в полученную смесь вводили раствор альбумина 10% объемом 10 мл. Полученную смесь обрабатывали ультразвуком частотой 22 кГц и мощностью 500 Вт (аппарат УЗДН-2Т) в течение 30 секунд 1-5 раз (для выбора оптимального способа включения). К образовавшейся эмульсии прибавляли 2 мл экстракта прополиса и взбалтывали в течение 1 часа на шейкере (шейкер лабораторный S - 3.02L, тип движения - орбитальное вращение, скорость 300 об/мин). Колбу с эмульсией присоединяли к роторному испарителю и при вращении колбы постепенно понижали давление так, чтобы не происходило кипения органического растворителя, который полностью удаляли. Колбу снимали с испарителя и встряхивали до образования гомогенной структуры суспензии на шейкере.

Полученные липосомы заключают в капсулы для перорального введения, например, номер 0, масса 0,096 г, имеющие диаметр 7,65 мм, длину 21,7 мм, объем наполнения 0,68 мл, полученные при следующем соотношении компонентов, г на 1 капсулу:

желатин 0,0423 глицерин 0,0184 титана двуокись 0,00025 вода очищенная 0,0351

Изобретение иллюстрируется следующими материалами: на фигуре представлена диаграмма содержания церулоплазмина (ЦП) в крови крыс, где 1 - группа интактных животных; 2 - группа контрольных животных; 3 - группа животных, получавших раствор альбумина внутрибрюшинно; 4 - группа животных, получавших липосомальную лекарственную форму с альбумином перорально; 5 - группа животных, получавших липосомальную лекарственную форму с альбумином и экстрактом прополиса перорально; в таблице 1 - определение эффективности степени включения альбумина в различных концентрациях; в таблице 2 - результаты определения ТБК - продуктов; в таблице 3 показано определение уровня гемоглобина после острой геморрагической анемии.

Первым этапом исследований было изучение степени включения альбумина в липосомальную форму. Установлено, что для оптимального включения альбумина достаточно двукратной обработки ультразвуком, причем после многократной обработки альбумин разрушается (таблица 1).

В процессе хранения липосом и препаратов, полученных на их основе, наблюдается окисление липидов с образованием малонового диальдегида и гидроперекисей липидов, а также увеличивается содержание непредельных группировок в липидах. Подобные изменения напрямую отражаются на стабильности липосомальной мембраны и могут приводить к снижению времени сохранения целостности мембраны и разрушению липосомального препарата. Введение в препарат стабилизирующих добавок может как ингибировать процесс окисления, так и ускорять его. Полученные образцы инкубировались при температуре 37°С. На 1, 2, 6, 10 сутки производился забор образцов в объеме 1 мл, которые до экспериментов хранились в морозильной камере при -20°С. В образцах определяли следующие параметры: содержание ТБК-активных продуктов, содержание непредельных соединений, изменение рН внелипосомальной среды.

Определение ТБК-активных продуктов

К 50 мкл суспензии липосом добавляли 450 мкл раствора тиобарбитуровой кислоты (2,5 мг/мл) в 2% ортофосфорной кислоте. Полученный раствор инкубировался при 100°С в течение 1 часа и затем после добавления 500 мкл 96% этилового спирта регистрировался спектр в диапазоне 450-650 нм. Оптическая плотность при 460, 500 и 532 нм, которые характерны для максимумов поглощения соответствующих ТБК-КС (карбонильных соединений), таблица 2.

Определение ферроксидазной активности альбумина.

Определение проводили на белых крысах самцах массой 200 - 250 г.

В каждой группе было по 10 животных. Было проведено изучение влияния липосомальной формы с альбумином и экстрактом прополиса на купирование последствий экспериментальной геморрагической анемии у крыс. После шести кровопотерь у крыс развивалась острая анемия, выражавшаяся в снижении концентрации гемоглобина до 59,8% от исходного уровня, уровень сывороточного железа снижался в 3 раза. В течение 5 суток крысам контрольной группы внутрибрюшинно в дозе 10 мг/сутки вводился альбумин для инфузий, а экспериментальным животным - интрагастрально липосомы с таким же количеством альбумина, а также альбумина и экстракта прополиса. Определение церулоплазмина контролировали по методу Ревина в модификации Камышникова, основанному на окислении п-фенилендиамина при участии церулоплазмина [Колб В.Г., Камышников B.C. Определение активности церулоплазмина в сыворотке крови модифицированным методом Ревина. Справочник по клинической химии. - 2-е изд. - Минск, 1982. - С. 290-292].

При исследовании фармакологического эффекта липосом с альбумином и экстрактом прополиса в условиях острой геморрагической анемии установили, что, начиная с 7-х суток после введения препарата, происходит увеличение уровня гемоглобина до 89,3% (при введении инфузионного раствора) и 86,4% - при введении липосом с альбумином и 87,5% - при введении липосом с альбумином и экстрактом прополиса. В контрольной группе на 7-е сутки уровень гемоглобина составил 64,5%, а на 14 - 72,9% (таблица 3).

При определении уровня церулоплазмина установили, что ферроксидазная активность в сыворотке крови, сниженная в результате острой кровопотери, восстановилась до исходного уровня только у крыс, получавших альбумин как внутрибрюшинно, так и в форме липосом (Фигура 1). Показано эффективное применение данной лекарственной формы в условиях острой кровопотери для восстановления уровня гемоглобина и церулоплазмина.

Альбумин плацентарный сухой ВФС 42-1104-81.

Раствор альбумина 10% [ФС 42-122-04].

Прополис ТУ ГОСТ 28886-90. Введение в состав капсул с липосомами экстракта прополиса спиртового в сочетании с альбумином повышает антимикробную активность, регенерацию тканей, способствует проявлению обезболивающего, гемостатического, иммуномодулирующего, репаративного эффекта лекарственной формы.

В доступной научно-медицинской и патентной литературе сведений об известности капсул с липосомами, содержащими в качестве действующих веществ водный раствор альбумина 10% и спиртовой экстракт прополиса 10%, а в качестве вспомогательных веществ липосомальной основы яичный лецитин при определенном соотношении компонентов, не обнаружено. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «новизна».

В результате проведенных экспериментальных исследований было установлено, что предлагаемые капсулы с липосомами обладают высокой биодоступностью и целым рядом преимуществ: они имеют удовлетворительный внешний вид, однородны. Состав капсул, содержащих липосомы, способствует быстрому и далее пролонгированному высвобождению действующих веществ: альбумина и экстракта прополиса. Придание лекарственному средству формы капсул с липосомами обеспечивает удобство и гигиеничность применения, стойкость при хранении. За счет введения в состав лекарственного средства альбумина в сочетании с экстрактом прополиса капсулы с липосомами обладают широким спектром биологической и лечебной активности: оказывают репаративное, в сочетании с антиоксидантным, спазмолитическим, противовоспалительным, регенерирующим и антибактериальным действием. Кроме этого, капсулы с липосомами обладают равномерным высвобождением действующих веществ и выраженным пролонгированным действием, удобны для перорального применения больными самостоятельно. Помимо проявления известных свойств, каждый компонент заявляемого состава, в совокупности усиливает свое воздействие, что объясняется, очевидно, эффектом их синергизма. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень».

Пример 1. Капсула белого цвета (номер 0, диаметр 7,65 мм, длина 21,7 мм, объем наполнения 0,68 мл, масса 0,096 г) получена при следующем соотношении компонентов, г: желатина - 0,0423; глицерина - 0,0184; титана двуокиси - 0,00025; воды очищенной - 0,0351. Состав липосомальной лекарственной формы в одной капсуле, г: водный раствор альбумина 10% - 1,0; экстракт прополиса спиртовой 10% - 0,2; лецитин яичный - 0,22.

Методика получения липосом с альбумином и экстрактом прополиса 10% спиртовым: 5 г яичного лецитина (Лецитин яичный по ТУ 6-09-0001-87 Д) растворяют в смеси диэтилового эфира и хлороформа (2:1) при постоянном перемешивании на шейкере в течение 10 минут. Органический слой отгоняли на роторном испарителе под вакуумом на водяной бане при 37°С практически до сухого остатка и в полученную смесь вводили раствор альбумина 10% объемом 10 мл. Полученную смесь обрабатывали ультразвуком частотой 22 кГц и мощностью 500 Вт (аппарат УЗДН-2Т) в течение 30 секунд 2 раза. К образовавшейся эмульсии прибавляли 2 мл экстракта прополиса и взбалтывали в течение 1 часа на шейкере (шейкер лабораторный S - 3.02L, тип движения - орбитальное вращение, скорость 300 об/мин). Колбу с эмульсией присоединяли к роторному испарителю и при вращении колбы постепенно понижали давление так, чтобы не происходило кипения органического растворителя, который полностью удаляли. Колбу снимали с испарителя и встряхивали до образования гомогенной структуры суспензии на шейкере. Для наполнения используют капсулу белого цвета (номер 0, диаметр 7,65 мм, длина 21,7 мм, объем наполнения 0,68 мл, масса 0,096 г). Подготовленные капсулы для перорального применения наполняют липосомальной массой, после чего качество капсул с липосомами оценивают по внешнему виду, однородности, растворимости. Полученные капсулы с липосомами правильной формы, твердые и однородные. Проведено определение эффективности степени включения альбумина в различных концентрациях, количество обработок ультразвуком по 30 секунд - 2 раза, эффективность включения альбумина 91,2% (таблица 1). В таблице 2 представлены результаты определения ТБК продуктов; в таблице 3 показано определение уровня гемоглобина после острой геморрагической анемии; на фигуре 1 представлена диаграмма - содержание ЦП в крови крыс. Было установлено, что животные, получавшие альбумин внутрибрюшинно и перорально, статистически значимо восстанавливали уровень гемоглобина по сравнению с контрольной группой, не получавшей лечение. На 7-е сутки у животных, получавших альбумин как внутрибрюшинно, так и перорально, повышался уровень ЦП на 100% по сравнению с контрольной. На 14-е сутки уровень ЦП повысился более чем на 200% (по сравнению с контролем). Причем наиболее эффективное повышение наблюдалось при приеме липосомальной лекарственной формы с альбумином и экстрактом прополиса.

Пример 2. Капсула белого цвета (номер 0, диаметр 7,65 мм, длина 21,7 мм, объем наполнения 0,68 мл, масса 0,096 г) получена при следующем соотношении компонентов, г: желатина - 0,0423; глицерина - 0,0184; титана двуокиси - 0,00025; воды очищенной - 0,0351. Состав липосомальной лекарственной формы в одной капсуле, г: водный раствор альбумина 10% - 1,0; экстракт прополиса спиртовой 10% - 0,2; лецитин яичный - 0,22.

Методика получения липосом с альбумином и экстрактом прополиса 10% спиртовым: 5 г яичного лецитина (Лецитин яичный по ТУ 6-09-0001-87 Д) растворяют в смеси диэтилового эфира и хлороформа (2:1) при постоянном перемешивании на шейкере в течение 10 минут. Органический слой отгоняли на роторном испарителе под вакуумом на водяной бане при 37°С практически до сухого остатка и в полученную смесь вводили раствор альбумина 10% объемом 10 мл. Полученную смесь обрабатывали ультразвуком частотой 22 кГц и мощностью 500 Вт (аппарат УЗДН-2Т) в течение 30 секунд 1 раз. К образовавшейся эмульсии прибавляли 2 мл экстракта прополиса и взбалтывали в течение 1 часа на шейкере (шейкер лабораторный S - 3.02L, тип движения - орбитальное вращение, скорость 300 об/мин). Колбу с эмульсией присоединяли к роторному испарителю и при вращении колбы постепенно понижали давление так, чтобы не происходило кипения органического растворителя, который полностью удаляли. Колбу снимали с испарителя и встряхивали до образования гомогенной структуры суспензии на шейкере. Для наполнения используют капсулу белого цвета (номер 0, диаметр 7,65 мм, длина 21,7 мм, объем наполнения 0,68 мл, масса 0,096 г). Подготовленные капсулы для перорального применения наполняют липосомальной массой, после чего качество капсул с липосомами оценивают по внешнему виду, однородности, растворимости. Полученные капсулы с липосомами правильной формы, твердые и однородные. Проведено определение эффективности степени включения альбумина в различных концентрациях, количество обработок ультразвуком - 30 секунд 1 раз, эффективность включения альбумина 75,6% (таблица 1).

Пример 3. Капсула белого цвета (номер 0, диаметр 7,65 мм, длина 21,7 мм, объем наполнения 0,68 мл, масса 0,096 г) получена при следующем соотношении компонентов, г: желатина - 0,0423; глицерина - 0,0184; титана двуокиси - 0,00025; воды очищенной - 0,0351. Состав липосомальной лекарственной формы в одной капсуле, г: водный раствор альбумина 10% - 1,0; экстракт прополиса спиртовой 10% - 0,2; лецитин яичный - 0,22.

Методика получения липосом с альбумином и экстрактом прополиса 10% спиртовым: 5 г яичного лецитина (Лецитин яичный по ТУ 6-09-0001-87 Д) растворяют в смеси диэтилового эфира и хлороформа (2:1) при постоянном перемешивании на шейкере в течение 10 минут. Органический слой отгоняли на роторном испарителе под вакуумом на водяной бане при 37°С практически до сухого остатка и в полученную смесь вводили раствор альбумина 10% объемом 10 мл. Полученную смесь обрабатывали ультразвуком частотой 22 кГц и мощностью 500 Вт (аппарат УЗДН-2Т) в течение 30 секунд 10 раз. К образовавшейся эмульсии прибавляли 2 мл экстракта прополиса и взбалтывали в течение 1 часа на шейкере (шейкер лабораторный S - 3.02L, тип движения - орбитальное вращение, скорость 300 об/мин). Колбу с эмульсией присоединяли к роторному испарителю и при вращении колбы постепенно понижали давление так, чтобы не происходило кипения органического растворителя, который полностью удаляли. Колбу снимали с испарителя и встряхивали до образования гомогенной структуры суспензии на шейкере. Для наполнения используют капсулу белого цвета (номер 0, диаметр 7,65 мм, длина 21,7 мм, объем наполнения 0,68 мл, масса 0,096 г). Подготовленные капсулы для перорального применения наполняют липосомальной массой, после чего качество капсул с липосомами оценивают по внешнему виду, однородности, растворимости. Полученные капсулы с липосомами правильной формы, твердые и однородные.

Проводят определение степени включения альбумина (таблица 1). Было установлено, что при 10-кратной и многократной обработке ультразвуком (более 5 раз) происходит частичная денатурация белка и липосомы расслаиваются при стоянии (белок выпадает в осадок). Методом иммуноэлектрофореза определена дополнительная линия преципитации, что говорит о неоднородности альбумина.

Из приведенных примеров видно, что оптимальным с точки зрения удобства применения, высокого высвобождения действующих веществ и одновременно эффекта пролонгации является состав, описанный в примере 1.

Получение предлагаемых капсул с липосомами легко осуществимо, и при их использовании достигается указанный технический результат. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «промышленная применимость».

Клинические испытания показали, что количество высвободившихся препаратов при данном соотношении компонентов в одной капсуле с липосомами одинаково у исследуемых больных. Это дает возможность врачу в практической медицине, в зависимости от формы и тяжести заболевания, рекомендовать больным необходимое количество капсул с липосомами для самостоятельного лечения, при пероральном приеме, что делает заявляемые капсулы с липосомами перспективной лекарственной формой в комплексном лечении заболеваний, связанных с анемиями различного генеза.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к средству, обладающему репаративной активностью при геморрагической анемии. Средство, обладающее репаративной активностью при геморрагической анемии, содержащее 10% водный раствор альбумина и 10% спиртовой экстракт прополиса, включенные в липосомы, полученные путем растворения яичного лецитина в смеси диэтилового эфира и хлороформа в соотношении 2:1, при температуре 37°C, с последующей отгонкой органического слоя до сухого остатка, добавления 10% водного раствора альбумина и двукратной обработки смеси ультразвуком частотой 22 кГц и мощностью 500 Вт, к образовавшейся эмульсии добавляют 10% спиртовой экстракт прополиса, причем липосомы заключены в капсулы для перорального введения, при определенном соотношении компонентов. Вышеописанное средство обладает репаративным, антиоксидантным, спазмолитическим, противовоспалительным, регенерирующим и антибактериальным действиями, а также равномерным высвобождением действующих веществ и выраженным пролонгированным действием, удобно для применения больными самостоятельно. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл., 3 пр.

1. Средство, обладающее репаративной активностью при геморрагической анемии, содержащее 10% водный раствор альбумина в качестве действующего вещества и вспомогательные вещества, отличающееся тем, что 10% водный раствор альбумина и 10% спиртовой экстракт прополиса включены в липосомы, полученные путем растворения яичного лецитина в смеси диэтилового эфира и хлороформа в соотношении 2:1, при температуре 37°C, с последующей отгонкой органического слоя до сухого остатка, добавления 10% водного раствора альбумина и двукратной обработки смеси ультразвуком частотой 22 кГц и мощностью 500 Вт, к образовавшейся эмульсии добавляют 10% спиртовой экстракт прополиса, причем липосомы заключены в капсулы для перорального введения, при следующем соотношении компонентов липосомы, г на 1 капсулу:
Водный раствор альбумина 10% 1,0 Экстракт прополиса спиртовой 10% 0,2 Лецитин яичный 0,22

2. Средство по п. 1, отличающееся тем, что в качестве растворителя для получения 10% спиртового экстракта прополиса используют спирт этиловый 70%.

3. Средство по п. 1, отличающееся тем, что используют капсулы номер 0, имеющие диаметр 7,65 мм, длину 21,7 мм, объем наполнения 0,68 мл, полученные при следующем соотношении компонентов, г на 1 капсулу:
желатин 0,0423 глицерин 0,0184 титана двуокись 0,00025 вода очищенная 0,0351