СПОСОБ БИОИНДИКАЦИИ СОСТОЯНИЯ ДВУХСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ В УСЛОВИЯХ ТЕХНОГЕННОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/00 

Изобретение относится к биологии, экологии, экотоксикологии, в частности к исследованию особенностей развития оксидативного стресса у моллюсков, и может быть использовано для характеристики состояния популяций речных и морских моллюсков, обитающих в условиях техногенного загрязнения среды.

Наиболее близким объектом того же назначения, что и заявляемое изобретение, является известный способ оценки воздействия загрязнителей водной среды на численность популяций моллюсков, основывающийся на биологическом анализе, в ходе которого определяется соотношение малакофауны разных классов и различных групп сапробности в биотопах водоемов. Существенным недостатком прототипа является то, что изменения малакофауны не проявляются на ранних стадиях воздействия и не могут служить биомаркерами состояния моллюсков в условиях их обитания в загрязненной среде [1].

В основу изобретения поставлена задача выявить метаболические нарушения, позволяющие дифференцировать степень неблагоприятного влияния техногенного загрязнения на состояние речных и морских моллюсков на различных, в том числе и ранних, стадиях интоксикации.

Технический результат заявленного изобретения заключается в повышении чувствительности способа определения состояния моллюсков в условиях их обитания в загрязненной среде, что дает возможность дифференцировать степень нарушений и использовать его на различных, в том числе и ранних, стадиях интоксикации.

Заявленный технический результат достигается тем, что предварительно получают контрольные пробы гомогенатов гепатопанкреаса моллюсков, обитающих в условно чистых водоемах, которые гомогенизируют (на холоде) в 10-кратном объеме 50 мМ трис-буфера рН 7,8, содержащего 2 мМ этилендиаминтетроацетат (ЭДТА), проводят определение в них уровня перекисного окисления липидов (ПОЛ), затем те же самые исследования проводят с биологическим материалом, который получен из гепатопанкреаса моллюсков, взятых из загрязненной среды, выполняют сравнительный анализ, по количеству продуктов, образующихся в результате реакции малонового диальдегида (МДА) и 4-гидроксиалкенов с тиобарбитуровой кислотой или N-метил-2-фенилиндолом, оценивают степень неблагоприятного влияния техногенного загрязнения среды на состояние моллюсков.

Содержание конечных продуктов ПОЛ является одним их основных показателей генерации оксидативного стресса, возникающего под воздействием загрязнителей водной среды, который может быть локальным, умеренным и сильным, приводящим к структурно-функциональным нарушениям и к гибели клеток [2]. Определение ПОЛ проводят в гепатопанкреасе - органе с высоким индексом потребления кислорода и высокой антиоксидантной защитой, поэтому этот показатель может служить объективным биологическим маркером состояния моллюсков в условиях их обитания в загрязненной среде.

Предложенный способ поясняется рисунками:

Рис. 1 - содержание конечных продуктов ПОЛ в гепатопанкреасе черноморской мидии (Mytilus galloprovincialis) в условиях загрязнения среды обитания нефтепродуктами:

ЧА - условно чистая акватория (контрольные пробы);

НП - природная среда, загрязненная нефтепродуктами (исследуемые пробы);

** - Ρ<0,01 - достоверность разницы в сравнении с контролем.

Рис. 2 - содержание конечных продуктов ПОЛ в гепатопанкреасе речной дрейссены (Dreyssena polymorpha) в условиях моделирования загрязнения водной среды мазутом:

K - отсутствие загрязнения (контрольные пробы);

МЗ - загрязнение мазутом (исследуемые пробы);

* - Ρ<0,05 - достоверность разницы в сравнении с контролем.

Рис. 3 - содержание конечных продуктов ПОЛ в гепатопанкреасе речной дрейссены (Dreyssena polymorpha) в условиях моделирования загрязнения водной среды ионами алюминия:

K - отсутствие загрязнения (контрольные пробы);

Al - загрязнение ионами алюминия (исследуемые пробы):

* - Ρ<0,05 - достоверность разницы в сравнении с контролем.

Предложенный способ осуществляют следующим образом.

Проводят отбор особей из водной среды, содержащей загрязнители. Биологический материал получают извлечением гепатопанкреаса из тела моллюска. Извлеченный гепатопанкреас гомогенизируют (на холоду) в 10-кратном объеме 50 мМ трис-буфера рН 7,8, который содержит 2 мМ этилендиаминтетроацетат (ЭДТА). Уровень перекисного окисления липидов в гомогенатах измеряют с использованием тест-наборов (в частности, LPO-586, Oxis, Int. Inc., USA) методом, который основан на выявлении малонового диальдегида, образующегося при деградации липидов активными формами кислорода. Уровень малонового диальдегида (МДА) в гепатопанкреасе определяют по количеству образующихся тиобарбитурореактивных веществ (ТБК-активных продуктов). Обработку полученных данных проводят методом математической статистики для малых выборок. Относительное содержание ТБК-активных продуктов выражают в виде средней величины M±m, достоверность различий между группами оценивают с помощью t-критерия Стьюдента (Р<0,05) после проверки гипотез о нормальности распределения и различии между генеральными дисперсиями. По относительному содержанию ТБК-активных продуктов, выраженному в нмоль/мг ткани, судят об интенсивности перекисного окисления липидов, указывающего на степень метаболических нарушений в организме моллюсков.

Пример 1. Исследование токсических эффектов в условиях хронического загрязнения акватории Керченской бухты нефтепродуктами проводили в популяции черноморских мидий (Mytilus galloprovincialis), обитающих в природных условиях. В качестве контроля использовали особей того же вида гидробионтов из условно чистой акватории озера Донузлав, которая по результатам научных исследований является одной из самых перспективных акваторий Крыма для организации мидийных хозяйств. Пробы отбирали в сентябре 2011 г. Экспериментальная и контрольная группы мидий включали по 30 экземпляров взрослых (4 года) представителей вида Mytilus galloprovincialis.

Содержание конечных продуктов ПОЛ - одного из основных показателей генерации оксидативного стресса, было достоверно повышенным (на 74%) в гепатопанкреасе черноморских мидий, обитающих в Керченской бухте, по сравнению с моллюсками этого вида, собранными на условно чистых участках оз. Донузлав (рис. 1).

Пример 2. Исследовали эффект повышенной концентрации мазута на содержание конечных продуктов ПОЛ в гепатопанкреасе речных двухстворчатых моллюсков. В условиях моделирования хронического загрязнения мазутом использовали особей речной дрейссены (Dreyssena polymorpha) возрастом 4 года. Экспериментальная и контрольная группы моллюсков включали по 30 экземпляров Dreyssena polymorpha. Группы животных содержали в аквариумах объемом 180 литров. Присутствие мазута в среде обитания экспериментальной группы особей речной дрейссены поддерживали на уровне 50 мг/л в течение 28 дней. Подмену воды проводили 2 раза в неделю. Контрольная группа содержалась в чистой фильтрованной доочищенной воде (р. Днепр). Воздействие мазута индуцировало достоверное увеличение показателей оксидативного стресса в гепатопанкреасе особей речной дрейссены, у которых количество ТБК-активных продуктов было на 62% выше по сравнению с контрольной группой моллюсков, содержащихся в очищенной воде, что отражает активное протекание процессов биотрансформации в условиях повышенных концентраций органических ксенобиотиков (рис. 2).

Пример 3. Алюминий является наиболее распространенным металлом земной коры. Степень его аккумуляции в живых организмах ограничена водонерастворимостью большинства его естественных соединений. Однако нерастворимые соединения алюминия могут солюбилизироваться в кислой среде, и токсичные ионы Al³⁺ могут поступать в организм гидробионтов. Известно, что повышенное содержание алюминия провоцирует развитие различных патологий, вызванных, главным образом, нарушением окислительно-восстановительного баланса в тканях животных. В проведенном исследовании использовали 30 взрослых особей (4 года) речной дрейссены. Группа моллюсков содержалась в аквариуме емкостью по 180 литров. В аквариуме на протяжении 4 недель концентрация ионов Al³⁺ поддерживалась на уровне 10 мг/л путем подмены части воды, содержащей хлорид алюминия (AlCl₃). Подмену воды проводили 2 раза в неделю. Контрольная группа моллюсков того же вида содержались в аквариумах с доочищенной речной водой.

При определении конечных продуктов перекисного окисления липидов в пищеварительной железе моллюсков, обитающих в аквариуме с повышенной концентрацией ионов Αl³⁺, выявлено достоверное увеличение этих соединений на 51% по сравнению с контрольной группой (рис. 3).

Токсические эффекты различных по природе загрязнителей ассоциированы с индукцией оксидативного стресса. Оксидативный стресс является одним из наиболее распространенных метаболических нарушений при действии неблагоприятных факторов и одним из главных индукторов структурно-функциональных нарушений в клетках, поэтому окислительные повреждения могут быть одним из основных механизмов реализации токсичных эффектов.

До настоящего времени изменения содержания перекисного окисления липидов в гепатопанкреасе не использовались в качестве индикатора состояния двухстворчатых моллюсков в условиях техногенного загрязнения водной среды. Предлагаемое решение задачи дает возможность использовать содержание конечных продуктов ПОЛ в качестве чувствительного и достоверного биомаркера состояния моллюсков в условиях загрязнения водной среды ксенобиотиками на различных стадиях интоксикации.

Источники информации

1. Романова Е.М. Информативность популяционных параметров моллюсков в оценке уровня загрязнения среды обитания / Е.М. Романова, О.А. Индирякова, А.П. Куранова // Современное состояние и приоритеты развития фундаментальных наук в регионах: Тр. V Всерос. науч. конф. - T.I. - Краснодар, 2008. - С.25-28.

2. Ohkawa H. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction / H. Ohkawa, N. Ohishi, K. Yagi // Anal. Biochem - 1979. - Vol.95, №2. - P. 351-358.

Изобретение относится к экотоксикологии, а именно к исследованию особенностей развития оксидативного стресса у двухстворчатых моллюсков, и может быть использовано для выявления влияния техногенного загрязнения среды на состояние популяций речных и морских моллюсков. Для этого пробы гепатопанкреаса двухстворчатых моллюсков из загрязненных водоемов гомогенизируют в 10-кратном объеме 50 мМ трис-буфера рН 7,8, содержащего 2 мМ этилендиаминтетроацетат. Затем проводят анализ на содержание малонового диальдегида (МДА) и 4-гидроксиалкенов для определения уровня перекисного окисления липидов. Состояние моллюсков оценивают по результатам определения уровня окислительных повреждений липидов гепатопанкреаса по сравнению с контрольными образцами, взятыми из условно чистых водоемов. Изобретение обеспечивает возможность выявить на разных стадиях интоксикации нарушения метаболического баланса клеток, индуцированного действием загрязнителей водной среды. 3 ил., 3 пр.

Способ биоиндикации состояния двухстворчатых моллюсков в условиях техногенного загрязнения путем измерения содержания перекисного окисления липидов, отличающийся тем, что предварительно получают контрольные пробы гепатопанкреаса двухстворчатых моллюсков из условно чистых водоемов, которые гомогенизируют в 10-кратном объеме 50 мМ трис-буфера рН 7,8, содержащего 2 мМ этилендиаминтетроацетат, такие же пробы получают из гепатопанкреаса моллюсков, обитающих в загрязненных водоемах, проводят анализ содержания малонового диальдегида и 4-гидроксиалкенов для определения уровня перекисного окисления липидов, выполняют сравнительный анализ контрольных и экспериментальных проб, на основании которого делают выводы о наличии оксидативного стресса и степени неблагоприятного влияния загрязнителей водной среды на состояние моллюсков.