СПОСОБ ОЦЕНКИ ПЕРЕКИСНОГО ГОМЕОСТАЗА ОРГАНИЗМА КРОЛИКОВ Российский патент 2018 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицине, ветеринарии, зоотехнии и биотехнологии.

До сих пор в кролиководстве не разработано существенных способов коррекции антиоксидантной недостаточности. Одним из методов гармонизации в системе ПОЛ-АОС является возможность баланса и стабилизации системы перекисного окисления липидов (ПОЛ) - антиоксидантная система (АОС) у кроликов разного возраста и пола путем введения в рацион экзогенного (синтетического) антиоксиданта.

Недостаточно изучены первичные механизмы биологического действия синтетических антиоксидантов. Результатом воздействия синтетического антиоксиданта является изменение мембранного потенциала и перекисного окисления липидов. Установлено, что синтетические антиоксиданты повышают антиоксидантную защиту через мобилизацию эндогенных антиоксидантов, вводимых в комбикорм и поступающих вместе с ним в организм животного, что предотвращает дальнейшее развитие патологического процесса и ведет к стабилизации клеточных мембран.

Из уровня техники известно применение антиоксидантных препаратов «Агидол кормовой» в дозах 250 мг/кг корма для самцов и «Евротиокс Plus dry» в дозах 300 мг/кг корма для самок. Преимущество использования антиоксидантного препарата «Окси-Нил dry» заключается в том, что и самцам, и самкам в комбикорм включаются одинаковые дозы препарата (300 мг/кг корма).

В заявленном изобретении применяется антиоксидантная смесь «Окси-Нил драй» (бутил гидроксианизол, лимонная кислота, ортофосфорная кислота, наполнитель - известняк) производства фирмы «Nutriad International N.V.» (Бельгия). Используется в качестве антиоксиданта в витаминно-минеральных премиксах, кормах и кормовом сырье для сельскохозяйственных животных, в том числе птицы.

Целью изобретения является возможность использования показателей уровня перекисного окисления липидов и антиоксидантного статуса эритроцитов крови кроликов в качестве маркера при оценке воздействия на животных антиоксидантными препаратами в различных дозах на разных возрастных этапах развития.

Техническим результатом заявленного изобретения явилось определение баланса между суммарным накоплением продуктов свободнорадикального окисления и общей активностью ферментативных и неферментативных систем антиокислительной защиты, что способствовало улучшению физиологических параметров кроликов: качественных характеристик шкурок, среднесуточного прироста и живой массы.

Заявленный технический результат достигается за счет того, что самцам и самкам кроликов вводят антиоксидантный препарат «Окси-Нил драй» на ранних стадиях постнатального онтогенеза в одинаковых дозах по 300 мг/кг корма, готовят биологический материал для исследований общеклинических и биохимических показателей крови; в качестве маркеров определяют активность основных антиоксидантных ферментов и концентрации малонового диальдегида и диеновых конъюгатов в плазме крови, совокупно позволяющие судить о глубине активации перекисного окисления липидов.

Соответственно установлено, что добавка в комбикорм синтетического антиоксиданта позволило получить дополнительный привес у самцов и самок кроликов опытных групп главным образом за счет более интенсивного темпа роста.

Раскрытие изобретения:

Состояние здоровья животных оценивали по клиническим показателям: ректальной температуре, ЧСС, ЧД, внешнему виду, а также поведению животных (общая активность, пищевое поведение, дефекация и состояние кала, груминг, социальное взаимодействие, наличие стереотипий).

Для анализа клеточного состава крови использовали стабилизированную кровь. Подсчет клеток проводили на полуавтоматическом гематологическом анализаторе Abacus Junior Vet (использовался набор реагентов Diatron). Биохимические исследования плазмы крови проводили на автоматическом анализаторе открытого типа Labio 200 («Mindray Medical International Ltd., Китай») с фотометрическим детектированием (программное обеспечение Master Labio 200). Использовались реагенты компании «BIOCON Diagnostik GmbH» (Германия).

Примечание: *для живой массы, среднесуточного и абсолютного прироста

Содержание диеновых конъюгатов в плазме оценивали на основе классического метода Placer Z. (1968) в модификации Гаврилова В.Б. и Мишкорудной М.И. (1983). Содержание малонового диальдегида в плазме крови оценивали по методу Mihara М., Uchiyama М., Fukuzawa K. (1980).

В гемолизатах оценивали активность следующих антиокислительных ферментов: глутатионредуктазы - на основе метода Tilbotson J., Sauberlich Н. (1971) в адаптации для анализатора Labsystems FP-901 («Labsystems Diagnostics Оу», Финляндия) (Мальцев Г.Ю., Орлова Л.А., 1993); глутатионпероксидазы - согласно Mille G (1959) в модификации для анализатора FP-901 (Мальцев Г.Ю., Тышко Н.В., 2002), каталазы - по Oshino N., Chance В., Sies Н., Bucher N. (1973) в модификации Мальцева Г.Ю. и Васильева А.В. (1994) с использованием алкогольдегидрогеназной ловушки, супероксиддисмутазы - в соответствии с описанием Nishikimi М., Appaji N.A., Yagi K. (1972) в модификации для FP-901 (Мальцев Г.Ю., Васильев А.В., 1994). Концентрацию ретинола и α-токоферола. в плазме крови определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием концентрирующих патронов.

Полученные данные обрабатывали методами стандартной параметрической статистики с использованием t-критерия Стьюдента.

По балансу содержания продуктов перекисного окисления липидов -диеновых коньюгатов ПНЖК и малонового диальдегида в плазме крови и активности основных антиокислительных ферментов эритроцитов -глютатионпероксидазы, супероксиддисмутазы, глютатионредуктазы и каталазы эритроцитов может быть обеспечена оптимальная оценка антиоксидантного статуса организма. Организм находится в состоянии окислительного стресса, если суммарное накопление продуктов ПОЛ превышает общую активность ферментативного (и не ферментативного) звена, если наоборот - то в состоянии активированной компенсации. Баланс между накоплением продуктов ПОЛ и суммарной активностью ферментативных и не ферментативных механизмов является оптимальным, при этом необходимо учитывать, что свободные радикалы играют также и положительную роль в организме, в частности в образовании простагландинов, в системе антибактериальной защиты и др. (Bernabucci U. et al., 2005; Valko M. et al., 2007; Matsunami T. et al., 2010; Sharma N. etal., 2011;).

Определение активности основных антиоксидантных ферментов и количества продуктов перекисного окисления липидов в возрастной динамике может представлять определенный практический интерес для кролиководов и биологов в понимании функционирования антиоксидантной системы зашиты организма. Так, оценка баланса (дисбаланса) между уровнем накопления продуктов перекисного окисления липидов и активностью антиоксидантных ферментов (системы АОС-ПОЛ) может быть использована, в частности, в кормлении животных разных возрастных групп и пола для получения максимально возможной продуктивности.

Введение самцам кроликов препаратов антиоксиданта «Окси-Нил dry» приводило в некоторых группах к заметному увеличению активности антиоксидантных ферментов. Так, с возрастом обнаружено увеличение активности супероксиддисмутазы (СОД) - фермента первой линии защиты антиоксидантной системы во всех исследуемых опытных группах животных: установлено, что по отношению к началу опыта, в IV-й опытной группе увеличение активности СОД в конце опыта составляет 110,2% (по отношению к середине опыта увеличение составило 4% соответственно). А по отношению к контролю увеличение активности СОД в IV-й группе достоверно при Р≤0,05 составило 25,5%. Во II и III опытных группах активность СОД по отношению к контролю увеличилась на 20,4% и на 22,1% (при Р≤0,05) (Табл. 2).

Наблюдается синхронное увеличение активности каталазы по периодам опыта: по отношению к контролю увеличение концентрации фермента в конце опыта в IV-й опытной группе достоверно при Р≤0,05 составило 32,2%. Во II и III опытных группах активность каталазы по отношению к контролю увеличилась в конце опыта на 19,1% и на 23,5% соответственно (Табл. 2).

В таблицах 2, 3, 4 и 5 представлены данные исследований различных параметров антиоксидантного статуса экспериментальных животных активности ферментов антиокислительной защиты эритроцитов, продуктов ПОЛ и витаминов А и Е самцов кроликов разного возраста (из проведенных ранее исследований на самках, удалось установить, что перекисный гомеостаз самцов и самок кроликов в целом идентичен, поэтому в дальнейшем нами будут представлены в основном показатели самцов кроликов).

Примечание. Здесь и далее на рисунках и в таблицах: 1) * - различия достоверны с Р≤0,05, ** - Р≤0,01, *** - Р≤0,001 по t-критерию при сравнении с возрастом 60 дней; 2) # - то же при сравнении с контрольной группой

Учитывая то, что перекись водорода разлагается и в другой сопряженной ферментной системе - глутатионпероксидаза (ГП) и глутатионредуктаза (ГР) -можно предположить, что все указанные ферменты в эритроците должны работать в комплексе: в конце опыта в III и IV опытных группах активность ГП возросла на 10,7% и на 28,2% по отношению к началу эксперимента; и по отношению к середине (120 дней) - на 6,5% и на 17,9% соответственно. По отношению к контролю во II-й опытной группе активность фермента по сравнению с остальными опытными группами изменилась незначительно, тогда как в III и IV-й опытных группах активность ГП достоверно при Р≤0,05 повысилась на 47,1% и на 70,3% (Табл. 3).

После введения синтетических антиоксидантов в рацион кроликов -самцов, активность ГР в эритроцитах крови незначительно отличалась от контрольных показателей в середине эксперимента (возраст 120 дн.), за исключением IV-й опытной группы кроликов. Тогда как в конце опыта (возраст 180 дн.) активность ГР достоверно превышала контрольные уровни в III и IV-й опытных группах на 24,3% и на 33,5% соответственно (Табл. 3). По отношению к началу опыта (возраст 60 дн.) это повышение в отмеченных опытных группах составило 3,1% и 10,8%. Торможение ГР может оказать влияние на эффективность инактивации перекисных соединений несмотря на то, что она не является лимитирующим звеном в цепи ферментов, поддерживающих глутатиондисульфидное равновесие. Однако сведения об изменении активности глутатионредуктазы в эритроцитах кроликов при воздействии синтетическими антиоксидантами в литературе отсутствуют.

Основным параметром оценки наличия окислительного стресса является накопление первичных и вторичных продуктов свободно- радикального окисления. В силу стабильности продукты перекисного окисления полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), включая диеновые коньюгаты ПНЖК (ДК) и основной продукт реакции с тиобарбитуровой кислотой - малоновый диальдегид (МДА) являются наиболее информативными показателями наличия окислительного стресса (Табл. 4 и 5).

Выявлено значительное уменьшение уровня малонового диальдегида в эритроцитах самцов кроликов опытных групп в возрастной динамике и по отношению к контролю. В конце опыта (возраст 180 дн.) содержание МДА снизилось еще больше во всех опытных группах животных (на 10,2% - во II, достоверно при Р≤0,01 на 16,8% - в III и достоверно при Р≤0,05 на 37,6% - в IV) по отношению к началу эксперимента. По отношению к контролю, содержание МДА в середине опыта достоверно (при Р≤0,05) снизилось в IV-й опытной группе на 15,9%. В конце опыта по отношению к контрольным значениям снижение составило в IV группе самцов 11,7%.

Таким образом, действие синтетических антиоксидантов у самцов -кроликов в отношении продуктов ПОЛ почти полностью повторяет их действие у самок с той лишь разницей, что это действие более выражено по амплитуде снижения. Можно предположить, что эти различия обусловлены большей склонностью к образованию свободных радикалов у самцов более зрелого возраста (Табл. 4).

Исследование содержания альфа-токоферола и ретинола в плазме крови самцов кроликов позволяет выявить возрастную закономерность, заключающуюся в достоверном увеличении содержания α-токоферола на 21% и на 25,6% на сроках 120 и 180 дней по отношению к начальным значениям (в 60 дн.), в то время, как для ретинола таких изменений не отмечается. Эти возрастная динамика характера и для самок.

Использование синтетических антиоксидантов во всех группах привело к увеличению содержания токоферола на 180 день во всех группах относительно начальных значений: в I-й группе - на 26%, в II-й группе - на 25,6% (достоверно при Р≤0,05), в III - на 34,2% и в IV группе - на 36,3% (достоверно при Р≤0,05) по отношению к начальным значениям. Однако, что касается достоверных различий с контрольной группой, то наибольшее увеличение отмечается в IV-й группы на 10,3% (Табл. 5).

Содержание витамина А во всех опытных группах самцов кроликов в середине опыта достоверно не изменилось, однако тенденция к более существенному повышению по сравнению с начальным этапом опыта наблюдается во всех группах животных на 20%, на 22,7%, на 16,7% и на 22,7. На сроках в 180 дней изменения незначительны. В то же время по отношению к контролю увеличение содержания ретинола в IV группе на 85,7% достоверно при Р≤0,05. В других группах (II-III) значительное увеличение (в II группе на 47,6% и в III группе - на 66,7%) не является достоверным из-за высокой дисперсии данных (Табл. 5).

Таким образом, характер изменения токоферолов плазмы крови у самцов и самок кроликов почти идентичны, однако в отношении содержания ретинола имеются значительные половые различия неясной природы.

Одним из главных факторов, влияющих на основной обмен веществ организма, принадлежит антиоксидантной системе, от деятельности которой в значительной степени зависят уровень и интенсивность обмена белков, углеводов и жиров, а также минеральных веществ, воды и витаминов. Поэтому для оценки деятельности АОС-системы кроликов необходимо учитывать развитие мясных качеств, массу отдельных частей тела и органов в общем выходе мясной продукции. В задачу наших исследований входило определение эффективности применения препарата «Окси-Нил dry» для повышения продуктивности и резистентности самок кроликов, улучшения использования ими питательных веществ корма.

В связи с этим, исследовано влияния различных доз антиоксидантного препарата на живую массу самцов и самок кроликов породы советская шиншилла (Табл. 6 и 7).

Таким образом, обогащение комбикормов синтетическими антиоксидантами способствует увеличению приростов живой массы животных во все возрастные периоды опыта. Особенности технологии кормления и содержания животных положительно отразились на их выживаемости. За все время эксперимента падежа практически не было, выживаемость составила 99%. Животные всех 4-х изучаемых групп планомерно набирали в весе, были активны, обладали хорошим аппетитом. К концу опыта абсолютный прирост кроликов превышал контроль у опытных самцов на 2,2-7,4% и у самок - на 5,4-10,8% (Табл. 6 и 7).

Итоговая оценка животных по различным признакам позволяет устанавливать классную принадлежность (Табл. 8 и 9).

Самцы и самки кроликов всех изучаемых групп имели классность не ниже 1-го. Животные IV-й опытной группы по телосложению и густоте волосяного покрова оказались лучшими. Таким образом, по живой массе и воспроизводительной способности самцы кроликов всех исследуемых опытных групп отнесены к 1-му классу. Конвенциональные условия содержания кроликов в биоклинике существенного влияния на классность не оказала.

При определении сортности шкурок основным показателем является состояние волосяного покрова. Кожа у кроликов сравнительно тонкая, причем толщина ее на разных участках не одинаковая: толще на крупе (1,5 мм) и тоньше на спине, боках и особенно на брюшной стенке.

Проведенные исследования шкурок показали, что топографические области шкурки несходны между собой по товарным качествам. Наибольшей густотой волос отличаются огузок и хребет (Табл. 8 и 9). На огузке она составляет 100%, на хребте - 81, на боках - 74, на чреве - 52% у самцов и на хребте - 83, на боках - 74, на чреве - 53% у самок.

Установлено, что наибольшее количество волос на 1 см² площади шкурки у самцов и самок кроликов (на огузке, хребте и боках), получавших препарат «Окси-Нил драй» в дозах 300 мг/кг корма.

Длина волос на шкурках кроликов изменяется в зависимости от степени созревания волос и породных особенностей животных. В наших опытах у кроликов длина волосяного покрова колебалась незначительно, за исключением кроликов IV-й группы (Табл. 10 и 11).

Таким образом, шкуры IV-й опытной группы самцов и самок кроликов были отнесены к первому сорту. Шкурки остальных кроликов различались между собой незначительно. В большей мере длина волос изменяется на разных топографических участках шкурки. Самый низкий мех находился на голове и конечностях. Прочность волосяного покрова очень низка. Износостойкость составляет 5-15% износостойкости меха выдры. Разные участки кроличьей шкурки характеризуются неодинаковой устойчивостью к истиранию. По этому показателю волосяной покров огузка и загривка несколько превосходит таковой на середине хребта. Наиболее сильно истирается волосяной покров на боках и чреве.

Следовательно, введение в рацион кроликов антиоксиданта «Окси-Нил драй» компенсирует ослабление антиоксидантной защиты клеток, которое может быть вызвано недостаточным поступлением в организм не ферментативных антиоксидантов, в частности, α-токоферола и др., способствует повышению интенсивности роста и увеличению живой массы животных, что, по-видимому, связано с интенсификацией обменных процессов за счет возросшей активности антиоксидантной системы организма.

В виду физиологической и хозяйственной целесообразности рекомендуем использовать синтетические антиоксиданты, и в частности, антиоксидантный препарат «Окси-Нил dry» в дозах 300 мг/кг корма, как ингибиторы процессов перекисного окисления липидов и в качестве маркера при мониторинге и оценке развития кроликов в половозрастной динамике, разводимых в промышленных комплексах (что является необходимым условием для обеспечения сохранности поголовья и повышения продуктивности стада).

Полученные экспериментальные данные по физиологическим свойствам (в частности, системы АОС-ПОЛ, гематологическим и биохимическим показателям крови) кроликов можно использовать в ветеринарной и медицинской практике.

Изобретение относится к медицине, ветеринарии, зоотехнии и биотехнологии. Способ оценки перекисного гомеостаза организма кроликов включает введение самцам и самкам кроликов антиоксидантного препарата «Окси-Нил драй» на ранних стадиях постнатального онтогенеза в одинаковых дозах по 300 мг/кг корма, подготовку биологического материала, исследования общеклинических и биохимических показателей крови, определение физиологических параметров организма в динамике пола и возраста; в качестве маркеров определены активность основных антиоксидантных ферментов и концентрации малонового диальдегида и диеновых конъюгатов в плазме крови, совокупно позволяющие судить о глубине активации перекисного окисления липидов, при этом если суммарное накопление продуктов перикисного окисления липидов превышает общую активность ферментативного звена, то организм находится в состоянии окислительного стресса, если наоборот - то в состоянии активированной компенсации. 11 табл.

Способ оценки перекисного гомеостаза организма кроликов, включающий введение самцам и самкам кроликов антиоксидантного препарата «Окси-Нил драй» на ранних стадиях постнатального онтогенеза в одинаковых дозах по 300 мг/кг корма, подготовку биологического материала, исследования общеклинических и биохимических показателей крови, определение физиологических параметров организма в динамике пола и возраста; в качестве маркеров определены активность основных антиоксидантных ферментов и концентрации малонового диальдегида и диеновых конъюгатов в плазме крови, совокупно позволяющие судить о глубине активации перекисного окисления липидов, при этом если суммарное накопление продуктов перикисного окисления липидов превышает общую активность ферментативного звена, то организм находится в состоянии окислительного стресса, если наоборот - то в состоянии активированной компенсации.