НЕФТЕБИОСОРБЕНТ ДЛЯ ОЧИСТКИ И ВОССТАНОВЛЕНИЯ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ЗЕМЕЛЬ Российский патент 2024 года по МПК B09C1/10 B01J20/00 C12N1/20 

Изобретение относится к восстановлению загрязненных почв микробиологическими способами, в частности к применению нефтебиосорбентов для очистки и восстановления нефтезагрязненных земель.

Нефтебиосорбент для очистки и восстановления нефтезагрязненных земель, включающий получение жидкой формы биопрепарата, который иммобилизуют на сорбент-носитель, отличающийся тем, что основу биопрепарата составляет смесь углеводородокисляющих бактерий в составе: Bacillus sp. ВКМ В-2815D и Bacillus simplex ВКМ В-2817D, эффективных в широком диапазоне температур окружающей среды, от +5 до +40°С и аминокислоты частично заменимой L-АЛЬФА Аргинин в соотношении, масс. %: водный раствор аминокислоты частично заменимой L-АЛЬФА Аргинин - 1%; водная суспензия смеси углеводородокисляющих бактерий в составе: Bacillus sp. ВКМ В-2815D и Bacillus simplex ВКМ В-2817D, взятых в равных соотношениях 1:1, с концентрацией 1×10⁹ микробных клеток/см³ - 99 %, иммобилизованных на сорбент-носитель, в качестве которого выбран перегной на основе навоза крупно-рогатого скота с последующим перемешиванием, гранулированием и сушкой полученного нефтебиосорбента при комнатной температуре, при соотношении компонентов, масс.%: жидкая форма биопрепарата, полученного из аминокислоты частично заменимой L-АЛЬФА и смеси углеводородокисляющих бактерий в составе: Bacillus sp. ВКМ В-2815D и Bacillus simplex ВКМ В-2817D - 10%, сорбент-носитель - 90%, что обеспечивает нефтебиосорбенту удовлетворительную нефтеёмкость, равную 4,5 г/г нефти при использовании в широком диапазоне температур окружающей среды, от +5 до +40°С, и способность активировать процессы микробиологической активности в почвах, что является достаточным для применения нефтебиосорбента в широком диапазоне температур окружающей среды, от +5 до +40°С и перспективно для применения нефтебиосорбента для очистки и восстановления в различных природно-климатических условиях.

Нефтебиосорбент легко доступен для исполнения, не требует осуществления дорогостоящих и трудоёмких операций, обладает удовлетворительной нефтеемкостью - 4,5 г/г нефти, и способностью активировать процессы микробиологической активности в нефтезагрязненных почвах в широком диапазоне температур окружающей среды, от +5 до +40°С, что является перспективным для применения нефтебиосорбента для очистки и восстановления нефтезагрязненных земель в различных природно-климатических условиях.

Актуальность.

В настоящее время промышленность сильно зависима и сконцентрирована на добыче продуктов ископаемого топлива, особенно нефтепродуктов. Развитие промышленных объектов нефтегазовой отрасли, а также разработка новых месторождений нефти и газа потенциально опасны с точки зрения риска техногенных аварий и катастроф. Нефтяная промышленность является объектом повышенной опасности с точки зрения промышленной и экологической безопасности. Процессы добычи, подготовки и транспортировки нефти оказывают негативное воздействие на природную среду. По подсчетам ученых, при разработке нефтяных месторождений теряется до 5% добываемой нефти. Наибольшие потери нефти происходят при ее транспортировке.

Разливы нефти всегда вызывают серьезные и ужасные последствия для окружающей среды, природы и общества, на преодоление которых уходит много времени и социально-экономических ресурсов. Для снижения негативного воздействия разливов нефти на окружающую среду необходимо уделить особое внимание изучению способов ликвидации последствий аварий и разработке комплекса необходимых мероприятий.

В последнее время было разработано большое количество различных нефтесборных устройств и технологий для сбора нефти. И на данный момент одним из наиболее эффективных и распространенных методов является использование различных нефтесорбентов.

Нефтесорбенты - это материалы, которые извлекают нефть путем абсорбции или адсорбции. Они играют важную роль в ликвидации разливов нефти и используются в следующих целях: для ликвидации последних следов разливов нефти на воде или суше; в качестве средств сдерживания, таких как сорбирующие боновые заграждения; в качестве основного средства восстановления очень малых разливов; и как пассивное средство очистки. Примером такой пассивной очистки является установка сорбирующих боновых заграждений у слегка загрязненной нефтью береговой линии для поглощения любой оставшейся нефти, сбрасываемой с берега, и предотвращения дальнейшего повторного загрязнения береговой линии.

Нефтесорбенты могут быть природными или синтетическими материалами. Природные сорбенты делятся на органические материалы, такие как торф или изделия из древесины, и неорганических материалов, таких как вермикулит или глина. Нефтесорбенты доступны в рассыпчатой форме, которая включает гранулы, порошок, кусочки и кубики, часто содержащиеся в мешках или сетках. Сорбенты также доступны в виде прокладок, рулонов, одеял и подушек. Из сформированных сорбентов также изготавливают сорбирующие боны и тралы.

В настоящее время растет интерес к поиску недорогих, широко распространенных и эффективных материалов в качестве сорбентов разливов нефти в воде, уделяя особое внимание природным органическим сорбентам, в основном из сельского хозяйства. Хотя материалы на природной основе недороги, распространены, экологически безопасны и поддерживают надлежащую утилизацию отходов, эффективность их сорбции ниже, чем у некоторых синтетических материалов. Их основные недостатки связаны с плохими олеофильными/гидрофобными свойствами. Для улучшения этих характеристик сорбенты могут быть модифицированы механическими, термическими и химическими методами модификации.

Уровень техники.

Известны способы очистки почвы, загрязненной нефтью и нефтепродуктами и биопреобразования нефтяных шламов и отходов добычи и переработки нефти, включающие: внесение в почву сорбента, биопрепарата и дождевых червей; в качестве сорбента используют органоминеральный сорбент с суммарным объемом пор не менее 2,0 см³/г, средним радиусом пор 200-2000 нм, пропитывают его водным раствором биопрепарата, в качестве которого используют Байкал ЭМ-1, вносят в почву в количестве 0,1-0,2 кг на 1 кг почвы, выдерживают не менее трех недель, после чего вводят дождевых червей E. Fetida в количестве не менее 10 особей на 1 кг почвы и выдерживают в течение 20 недель при температуре не ниже 5°С, при влажности почвы не менее 60%(1. Патент RU 2594995. Способ очистки и рекультивации почвы, загрязненной нефтью и нефтепродуктами. С1, B09C1/10.Заявка: 2015134129/13, 2015.08.13. Опубликовано: 2016.08.20, Бюл. №23. Авторы: Чачина С.Б., Бакланова О.Н., Лавренов А.В., Лихолобов В.А., Кривонос О.И., Левицкий В.А. Патентообладатели: ИППУ СО РАН); для биопреобразования нефтяных шламов и отходов добычи и переработки нефти путем заселения загрязненной почвы природными черноземообразующими организмами предварительно готовят смесь со стартовым составом из 26-30% бурового шлама, 26-30% жидкого нефтяного шлама, остальное - органические бытовые отходы и/или древесные опилки, настаивают эту смесь в течении 20-24 часов при температуре 20-25°С для последующего заселения в нее дождевых червей первого поколения, выдерживают смесь 17-30 суток до появления в ней червей второго и третьего поколений, предназначенных для обработки загрязненной шламом почвы; в загрязненную почву вносят дождевых червей второго и третьего поколений, выращенных в тепличных условиях путем адаптации дождевых червей первого поколения к указанной смеси, при этом внесение в почву смеси с дождевыми червями второго и третьего поколений осуществляют при объемном соотношении почвы и смеси как 10-15:1 (2. Способ биопреобразования нефтяных шламов и отходов добычи и переработки нефти. С1, B09C1/10. Заявка: 2013102752/13, 2013.01.22. Опубликовано: 2014.07.10, Бол. №19. Авторы: Альпин М.М., Иовенко В.Т., Шилков Н.А., Липовцын Ю.Л. Патентообладатель: ООО "ХомоБиоЦикл").

Недостатками являются: сложная технология реализации способов; отсутствие данных по использованию биопрепарата Байкал ЭМ-1 для очистки мерзлотных почв от нефтезагрязнений в арктических условиях; не маловажен также вопрос этического отношения к природе,например, авторами (3. Чачина С.Б., Лапочкина А.С. Биоремедиация нефтезагрязненных почв с использованием дождевых червей Eisenia fetida и с использованием трех микробиологических препаратов [Электронный ресурс]URL: https://cyberleninka.ru/article/n/bioremediatsiya-neftezagryaznennyh-pochv-s-ispolzovaniem-dozhdevyh-chervey-eisenia-fetida-i-s-ispolzovaniem-treh-mikrobiologicheskih (дата обращения: 29.11.2022)) описан процесс биоремедиации нефтезагрязненных почв с использованием дождевых червей Eisenia fetida и трех микробиологических препаратов, при использовании одного из которых, отмечалась гибель всех червей на 6 неделе исследования.

Известен способ очистки почв от нефти и НП, в котором используют консорциум нефтеокисляющих микроорганизмов Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus sp. ПИ Kу-1, Burkholderia caryophylli Jap-3, Serratia odorifera Jap-1 при весовом соотношении от 3-12 мас. % каждого микроорганизма, при этом совместно с суспензией биопрепарата в загрязненную среду вводят ризоторфин в количестве 30-120 г/м², где ризоторфин - землеудобрительный препарат азотфиксирующих микроорганизмов (4. Патент RU 2191643. Способ очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами. С1, B09C1/10, C12N1/20, C12N1/20, C12R1:01. Заявка: 2001119562/13, 09.07.2001. Опубликовано: 27.10.2002. Заявитель: Закрытое акционерное общество "Полиинформ". Авторы: Саксон В.М., Кузнецов С.А., Бойкова И.В., Новикова И.И. Патентообладатель: Закрытое акционерное общество "Полиинформ").

Недостатком является то, что при приготовлении рабочей суспензии микроорганизмов температура поддерживается на уровне +18…+22°С, т.е. микроорганизмы, входящие в состав консорциума, неспособны утилизировать нефть в широком диапазоне температур окружающей среды, от +5…+40°С.

Известен способ очистки почв и грунтов, загрязненных нефтью и НП, с использованием ассоциации нефтеокисляющих микроорганизмов - Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 708 и Rhodococcu sruber ИЭГМ 327 и биосурфактанта - Rhodococcus, отличающийся тем, что производят первоначальную обработку сильнозагрязненной почвы/грунта до достижения уровня остаточных нефтепродуктов 5-10 вес. % и последующее добавление органического разрыхлителя, олеофильный биопрепарат вносят в количестве не менее 10 л на 0,5-1,0 м³ почвы/грунта по меньшей мере один раз в неделю в течение первого месяца и в дальнейшем по меньшей мере один раз в месяц до окончания цикла биоремедиации в сочетании с периодическим рыхлением и увлажнением и дополнительно производят фиторемедиацию - засев многолетними травами (5. Патент RU 2193464. Способ биоремедиации почв и грунтов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. С1, B09C1/10, C12N1/26, C12N1/26, C12R1:01.Заявка: 2001130686/13, 14.11.2001. Опубликовано: 27.11.2002. Заявители: Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, Общество с ограниченной ответственностью "ПермНИПИнефть". Авторы: Ившина И.Б., Костарев С.М., Куюкина М.С., Закшевская Л.В. Патентообладатели: Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, Общество с ограниченной ответственностью "ПермНИПИнефть").

Недостатком вышеописанного способа является использование твердо-жидкофазного биореактора и аэрируемых почвенных площадок в качестве первоначальной обработки сильнозагрязненной почвы, что отражается на трудоемкости и сложностях применения способа при масштабных авариях и разливах нефти и нефтепродуктов.

Известен способ очистки нефтяного дистиллята, полученного микробиологической депарафинизацией нефти от продуктов метаболизма реагентной обработкой, с использованием в качестве реагентов ионообменных высокомолекулярных соединений и дальнейшим перемешиванием в псевдосжиженном слое ферромагнитной насадки воздействием неоднородного вращающегося электромагнитного поля (6. Авторское свидетельство SU N 1474099. Способ очистки нефтяного дистиллята. А1, B03C1/00, C02F1/48, C02F103:34. Заявка: 4062401, 22.04.1986. Опубликовано: 23.04.1989. Заявитель: Всесоюзный научно-исследовательский институт белковых веществ. Авторы: Ксенофонтов Б.С., Алентьева Е. С., Шкоп Я. Я., Козлова Л.И., Твердова О.Н., Бахметьева И.И., Михайлов И.А.).

Недостатком данного способа очистки нефтяного дистиллята является применение дорогостоящих ионообменных соединений, а также сложного оборудования.

Известен способ очистки почвы, природных и сточных вод с использованием биопрепаратов, в частности лиофильно высушенного консорциума углеводородокисляющих микроорганизмов "Деворойл" (Rhodococcus maris, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas stutzeri, Yarrowia lipolytica), предусматривающий при хранении суспензии микроорганизмов использование NaCl, биологически активных веществ (витамины) и осмопротекторов (бетаин) (7. Патент RU 2114071. Способ очистки почвы, природных и сточных вод с использованием биопрепаратов. С1, C02F3/34, B09C1/10, C12N1/20, C12N1/26, C12Q1/02.Заявка: 97107716/13, 22.05.1997. Опубликовано: 27.06.1998. Заявитель: Борзенков И.А. Авторы: Борзенков И.А., Беляев С.С., Ибатуллин Р.Р., Поспелов М.Е., Свитнев А.И. Патентообладатель: Борзенков И.А.).

Недостатком является то, что, формой применения штаммов здесь является смесь лиофильно высушенных культур, что приводит к использованию энергоемких процессов изготовления биопрепарата и удорожанию процесса очистки.

Известна серия биопрепаратов под общим названием «Нафтокс» (8. Рогозина Е.А. Геохимические изменения в составе нефтей при биодеградации // Разведка и охрана недр. - 2010. - № 4. - С. 63-68), которые не предусматривают высушивания углеводородокисляющих бактерий. Лабораторные испытания штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов, входящих в состав биопрепаратов окисляли до 76% дизельного топлива. Испытания проводили на полигоне в Санкт-Петербурге.

Недостатком способа является отсутствие данных о степени деструкции нефтепродуктов в широком диапазоне температур окружающей среды, от +5…+40°С и возможности применения способа для очистки нефтезагрязненных почв в различных природно-климатических условиях.

Известен способ для очистки почвы от нефтяных загрязнений, заключающийся в обработке загрязненной почвы составом, содержащим нефтеокисляющие микроорганизмы, комплексное удобрение и адсорбент, где в качестве нефтеокисляющих микроорганизмов используют бактериальные препараты «Путидойл», «Деворойл» и «Дестройл», а в качестве адсорбента используют древесную стружку, для деструкции которой в состав вводят дополнительно целлюлозоразрушающие бактерии, а также карбонат магния или кальция для нейтрализации избыточного количества кислот, образующихся при разложении древесных стружек (9. Патент RU № 2112610. Состав для очистки почвы от нефтяных загрязнений и способ очистки почвы от нефтяных загрязнений. С1, МПК В09/С 1/10, С 02F 3/34, С12N 1/26. Заявка № 96111201/13. Заявлено: 06.06.1996. Опубликовано: 16.06.1998, Бюллетень №10. Авторы: Александров А.В., Ахметшина С.М., Гараев И.Х., Гарейшина А.З., Камардин Н.Б. Заявитель и патентообладатель: Гараев И.Х.).

Недостатком известного способа является сложность состава и отсутствие некоторых компонентов, входящих в состав, в открытой продаже, кроме того, биопрепарат «Путидойл» оказывает угнетающее действие на естественный микробный ценоз, что ограничивает известное решение для применения в условиях открытой экосистемы (10. Новиков Ю.В., Комзолова Н.В. Исследования бактериального препарата Путидойл, предназначенного для очистки водоемов от нефти. Водное хозяйство, 1992, № 2. - С. 121-123).

Известны способы очистки мерзлотных почв от нефтезагрязнений с применением углеводородокисляющих микроорганизмов, иммобилизованных на цеолит месторождения Хонгуруу (Западная Якутия) (11. Патент RU № 2565549. Биопрепарат для биоремедиациинефтезагрязненных почв для природно-климатических условий Крайнего Севера. С2, МКП B09C 1/10, B01J 20/16, C09K 17/40, C12N 11/14, C12N 1/20, C12R 1/07, C12R 1/425; 2013155969/10. Заявлено: 17.12.2013. Опубликовано: 20.10.2015, бюллетень № 29. Авторы: Ерофеевская Л.А., Глязнецова Ю.С. Патентообладатели: ООО "Транснефть-Восток", ОАО "АК "Транснефть", ООО "НИИ Транснефть» (RU); 12. Заявка на изобретение № 2013111507. Способ очистки мерзлотных почв и грунтов от загрязнений нефтью и нефтепродуктами МПК А, B09C1/10, C12N1/20 507/13(017033); заявлено14.03.2013; опубликовано 20.09.2014, бюллетень № 26. Авторы: Ерофеевская Л.А., Глязнецова Ю.С., Новгородов П.Г., Чалая О.Н., Зуева И.Н., Лифшиц С.Х., Ефимов С.Е., Александров А.Р. Заявитель: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт проблем нефти и газа Сибирского отделения Российской академии наук (RU)).

Недостатком известных решений является применение для иммобилизации микроорганизмов в качестве сорбента-носителя цеолита месторождения Хонгуруу (Западная Якутия), который имеет самую низкую нефтеемкость из всех известных российских и зарубежных аналогов нефтесорбентов.

Известен штамм бактерий Pseudomonas stutzeri MEV-S1 с помощью которого производили очистку почв, грунтовых и поверхностных вод от нефти и продуктов ее переработки (13. Патент RU № 2228952. C12N 1/20 (2000.01) C02F 3/34 (2000.01) B09C 1/10 (2000.01) C12N 1/20 (2000.01) C12R 1/38 (2000.01). Штамм бактерий Pseudomonas stutzeri MEV-S1, используемый для очистки почв, грунтовых и поверхностных вод от нефти и продуктов ее переработки. Заявка: 2002122612/13, 23.08.2002. Опубликовано: 20.05.2004 Бюл. № 14. Авторы: Марченко А.И., Воробьев А.В., Боровик Р.В., Алдобаев В.Н., Жариков Г.А., Капранов В.В. Патентообладатель: Научно-исследовательский центр токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов).

Недостатком является то, что предлагаемый штамм осуществляет деградацию нефтепродуктов только при температуре +20°С и не способен утилизировать нефть в широком диапазоне температур окружающей среды, от +5…+40°С и возможности применения способа для очистки нефтезагрязненных почв в различных природно-климатических условиях.

Известен штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes E7 (14. Патент России №2134723, кл. C 12 N 1/20. Штамм Pseudomonas alcaligenes E7, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 C12N1/20 C12R1/38. Заявка: 98105707/13, 1998.03.25. Опубликовано: 1999.08.20. Авторы: Ермоленко З.М., Холоденко В.П., Чугунов В.А. Патентообладатели: Государственный научный центр прикладной микробилогии), обладающий высокими характеристиками по биодеградации нефти и нефтепродуктов.

Недостатком этого известного штамма является то, что он утилизирует нефтепродукты при температуре +20…+28°С и не способен утилизировать нефть в широком диапазоне температур окружающей среды, от +5…+40°С и возможности применения способа для очистки нефтезагрязненных почв в различных природно-климатических условиях.

Известен способ очистки мерзлотных почв от нефти спорообразующими бактериями Bacillus subtilis, заключающийся в обработке почвы, загрязненной нефтью, суспензией штамма бактерий Bacillus subtilis «Колыма-7/2к», что позволяет за 3 месяца летнего периода снизить концентрацию нефти до 0,48% (15. Патент RU 2446900. Способ очистки мерзлотных почв от нефти спорообразующими бактериями Bacillus subtilis. С2. B09C 1/10 (2006.01). Заявка: 2010129158/13, 13.07.2010. Опубликовано: 10.04.2012. Авторы: Неустроев М.П., Тарабукина Н.П., Неустроев М.М., Сазонов Н.Н., Парникова С.И., Степанова А.М. Патентообладатель: Государственное научное учреждение Якутский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Россельхозакадемии).

Недостатком является то, что в способе отсутствует информация о том, что предлагаемый штамм способен утилизировать нефть в широком диапазоне температур окружающей среды, от +5…+40°С.

Известен способ очистки почвы от криолитозоны от нефтезагрязнений (16. Патент RU № 2755687. Способ очистки почвы от криолитозоны от нефтезагрязнений. C1 C12N1/26 B09C1/10. Номер заявки: 2020134701. Дата регистрации: 21.10.2020. Дата публикации: 20.09.2021. Авторы: Ерофеевская Л.А., Глязнецова Ю.С., Лифшиц С.Х., Чалая О.Н., Зуева И.Н. Патентообладатели: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр "Якутский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук"), включающий внесение в нефтезагрязненную почву накопительной культуры аборигенных микроорганизмов-нефтедеструкторов, предварительно выделенных из взятой с места загрязнения почвы и минуя стадию выделения чистой культуры, иммобилизуют на нефтезагрязненную мерзлотную почву, отобранную с места загрязнения, полученные гранулы вносят в нефтезагрязненную мерзлотную почву в количестве, достаточном для эффективной деградации нефтезагрязнения (17. Глязнецова Ю.С., Чалая О.Н., Лифшиц С.Х., Зуева И.Н. Мониторинг состояния нефтезагрязненных почв криолитозоны // Проблемы экологического мониторинга и моделирования экосистем. Том XXIX. - №4. - С. 111-128; 18. Зуева И.Н., Глязнецова Ю.С., Чалая О.Н., Карелина О.С., Ефимов С.Е. Оценка нефтезагрязнения почвогрунтов на территории Талаканского нефтепромысла // Наука и образование. - №2. 2007. - С. 68-72), что позволяет достичь сравнительно высокого коэффициента деструкции нефтезагрязнения в мерзлотной почве, в условиях криолитозоны.

Недостаток способа заключается в использовании накопительной культуры без стадии выделения чистой культуры, что может иметь непредсказуемые последствия для окружающей среды, поскольку в накопительной культуре могут содержаться патогенные микроорганизмы (19. Ерофеевская Л.А. Генетическая идентификация сибиреязвенного штамма выделенного из нефтезагрязненного многолетнемерзлого грунта // VI Пущинская школа-конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов»: (сборник тезисов) - Москва: Издательство Вода: химия и экология, 2019. - С. 86-88; 20. Timofeev V, Bahtejeva I, Mironova R, Titareva G, Lev I, Christiany D, et al. (2019) Insights from Bacillus anthracis strains isolated from permafrost in the tundra zone of Russia. PLoSONE 14(5): e0209140. https://doi.org/ 10.1371/journal.pone.0209140).

Известен способ биологической рекультивации нефтезагрязненной почвы (21. Патент RU № 2307869. C2 C12N1/20 B09C1/10 C12R1/85. Заявка: 2005101366/13, 21.01.2005. Опубликовано: 10.10.2007. Бюл. № 28. Авторы: Алексеев М.И., Архипченко И.А., Загвоздкин В.К., Заикин И.А., Иванов В.Г., Лукашев В.Н. Патентообладатель: ООО "ЛУКОЙЛ-Коми"), позволяющий повысить технологичность биологической рекультивации, улучшить процессы восстановления почвы и сократить сроки проведения рекультивации, использовать перспективную технологию получения сухих, сыпучих биопрепаратов-нефтедеструкторов, упростить технологию проведения биологической рекультивации, проводить очистку нефтезагрязненных почв в районах с коротким тепловым периодом.

Недостатком способа является то, что, формой применения штаммов является смесь лиофильно высушенных культур, что приводит к использованию энергоемких процессов изготовления биопрепарата и удорожанию процесса очистки, а также использование в способе штамма Bacilluscereus; штамм входит в IV группу патогенности (22. СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней" (с изменениями на 25 мая 2022 года)) и может представлять серьезную угрозу для здоровья человека; патогенез заболеваний, вызываемых Bacilluscereus, полностью опосредован действием энтеротоксина (23. Васильев Д.А., Архипова Г.Ф., Николайчук Л.Ф. Бактерии Bacilluscereus и межвидовая рекомбинация с Bacillusanthracis как угроза здоровью человека // Монография. Ульяновск. НиицмиБ, 2013. - 90 с.).

Таким образом, на основе анализа известных способов очистки почв от нефтезагрязнений следует, что недостаток предлагаемых решений заключается в том, что для их осуществления применяются либо лиофильно высушенные культуры микроорганизмов, что снижает их жизнеспособность и эффективность уже в первые несколько часов после интродукции в мерзлотные почвы; либо предлагаемые способы основаны на применении отходов различных классов опасности; либо в состав биопрепаратов входят группы микроорганизмов, не активные в широком диапазоне температур окружающей среды, от +5…+40°С, что не дает возможности их применения для очистки нефтезагрязненных почв в различных природно-климатических условиях, что экономическии экологически не выгодно.

Наиболее близким по техническому решению является способ биоремедиации нефтезагрязненных мерзлотных почв, основанный на внесении в почву помета птиц после применения птицами пробиотика из штаммов бактерий «Bacillus subtilis ТНП-3-ДЕП» и «Bacillus subtilis ТНП-5-ДЕП» (24. Патент RU 2538125. Способ биоремедиации нефтезагрязненных мерзлотных почв. С2. B09C 1/10 (2006.01). Заявка: 2013130786/13, 04.07.2013. Опубликовано: 10.01.2015 Бюл. № 1. Авторы: Неустроев М.П., Неустроев М.М., Сазонов Н.Н., Степанова А.М., Тарабукина Н.П., Парникова С.И. Патентообладатели: ГНУ ЯНИИСХ Российской академии сельскохозяйственных наук (RU), ФГАОУ ВО "Северо-Восточный федеральный университет им. М.К. Аммосова" (RU), ООО НПЦ "Хоту-Бакт" (RU)), позволяющий снизить концентрацию нефти в почве в течение 3 месяцев летнего периода.

Недостатком изобретения является сложная технология получения птичьего помета; есть и более важный аспект - использовать в чистом виде в качестве удобрения птичьи выделения нельзя, поскольку они относятся к 3 классу опасности (25. Федеральный закон от 24.06.1998 N 89-ФЗ (ред. от 14.07.2022) "Об отходах производства и потребления") и если помёт разбросать по полям, то в течение семи лет на них ничего не будет расти (26. Эпидемиологический аспект экологического преступления [Электронный ресурс]. URL: https://vecherka.su/articles/economic/48820/ (дата обращения: 29.11.2022).

Задачей настоящего изобретения является расширение номенклатуры безопасных нефтебиосорбентов для очистки и восстановления нефтезагрязненных земель, эффективных в широком диапазоне температур окружающей среды от +5 до +40°С, что позволит их применять в различных природно-климатических условиях.

Для решения поставленной задачи предлагается нефтебиосорбент для очистки и восстановления нефтезагрязненных земель, включающий получение жидкой формы биопрепарата, который иммобилизуют на сорбент-носитель, отличающийся тем, что основу биопрепарата составляет смесь углеводородокисляющих бактерий в составе: Bacillus sp. ВКМ В-2815D и Bacillus simplex ВКМ В-2817D, эффективных в широком диапазоне температур (от +5 до +40°С) и аминокислоты частично заменимой L-АЛЬФА Аргинин в соотношении, масс.%: водный раствор аминокислоты частично заменимой L-АЛЬФА Аргинин - 1%; водная суспензия смеси углеводородокисляющих бактерий в составе: Bacillus sp. ВКМ В-2815D и Bacillus simplex ВКМ В-2817D, взятых в равных соотношениях 1:1, с концентрацией 1×10⁹ микробных клеток/см³ - 99 %, иммобилизованных на сорбент-носитель, в качестве которого выбран перегной на основе навоза крупно-рогатого скота с последующим перемешиванием, гранулированием и сушкой полученного нефтебиосорбента при комнатной температуре, при соотношении компонентов, масс. %: жидкая форма биопрепарата, полученного из аминокислоты частично заменимой L-АЛЬФА и смеси углеводородокисляющих бактерий в составе: Bacillus sp. ВКМ В-2815D и Bacillus simplex ВКМ В-2817D - 10 %, сорбент-носитель - 90%, что является достаточным для применения нефтебиосорбента для очистки и восстеновления нефтезагрязненных земель.

Нефтебиосорбент легко доступен для исполнения, не требует осуществления дорогостоящих и трудоёмких операций, может быть использован в нефтяной промышленности и в сельском хозяйстве для ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций, связанных с разливом нефтепродуктов в широком диапазоне температур (от +5 до +40°С), что позволяет применять нефтебиосорбент в различных природно-климатических условиях.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Выделение штамма Bacillus sp. ВКМ В-2815D

Штамм бактерий Bacillus sp. ВКМ В-2815D (авторский номер LER-1) выделен из мерзлотного нефтезагрязненного почво-грунтa, трассы магистрального нефтепровода «Восточная Сибирь-Тихий Океан» 1351,5 км, Ленский район, Республика Саха (Якутия).

Штамм идентифицирован и депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов (ВКМ) Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) под регистрационным номером ВКМ В-2815D.

Для выделения штамма Bacillus sp. ВКМ В-2815D, соблюдая правила асептики, 1 г почвы, предварительно просеянной и освобожденной от корней и других посторонних включений, растирали в ступке и вносили в колбы ёмкостью 250 мл, с содержанием 100 мл, заранее подготовленной минеральной средой Мюнца (26. Керстен Д.К. Морфологические и культуральные свойства индикаторных микроорганизмов нефтегазовой съемки - Микробиология, 1963, №5 - С. 1024-1030) с нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, бензин, керосин авиационный) следующего состава: (масс.%) KNO₃ - 0,4; MgSO₄·7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂ HPO₄ - 0,14; KH₂ PO₄ - 0,06; вода дистиллированная - остальное, рН - 7,2 (для варианта плотной питательной среды использовали агар-агар - 2,0. В качестве единственного источника углерода и энергии использовали нефть или, в зависимости от целей исследования нефтепродукты), которую вносили в минеральную среду Мюнца в количестве 1000 мг на 1,0 дм³ среды.

Инкубацию проводили в качалочных условиях на установке «УВМТ-12-250» при 200 об/мин и температуре +20±1°С.

Рост бактерий наблюдали через 7 суток инкубации по образованию мутной эмульсии и дезинтеграции слоя нефти.

Чистая культура бактерий получена путем культивирования при вышеперечисленных условиях и многократных пересевов (более 10) накопительной культуры на чашки Петри с мясопептонным агаром (МПА) (масс.%): ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, pH 7,0-7,2.

Далее посевы инкубировали в стационарных условиях при различных температурах (+5, +10, +20, +30, +37, +40°С).

Через 72 ч при культивировании штамма на поверхности МПА наблюдали появление суховатых, матовых, крупных, непрозрачных, cероватых колоний с неровной шероховатой поверхностью и неровными краями, диаметром до 5 и более мм, которые по культурально-морфологическим и биохимическим признакам, а также ключевым фенотипическим признакам, согласно таксономическим описаниям, приведенным в Определителе Берги (27. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Book Review Int. J. of Syst. Bact; July 1985, p. 408.) идентифицирован, как бактерия Bacillus sp.

Видовая принадлежность выделенной культуры Bacillus sp. (авторский номер LER-1) идентифицирована и подтверждена результатами проведенного анализа нуклеотидных последовательностей гена 16SрРНК, выполненным и депонированным во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов (ВКМ) Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) с присвоением регистрационного номера ВКМ В-2815D

Полученный штамм Bacillus sp. ВКМ В-2815D характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: грамположительные палочки с центрально-расположенными овальными спорами.

Культуральные характеристики.

На МПА вышеописанного состава и ГРМ агаре (на основе гидролизата рыбной муки), масс.%: гидролизат рыбной муки - 1,2; пептон ферментативный - 1,2; натрий хлористый - 0,6; агар - 1,0; вода дистиллированная остальное; pH 7,1-7,5 формирует суховатые, матовые, крупные, непрозрачные, cероватые колонии с неровной шероховатой поверхностью и неровными краями, диаметром до 5 и более мм.

На среде Сабуро (состав, г/л: пептон - 10,0 мальтоза-40,0; агар - 12,0±2,0; вода очищенная до 1 л), формирует матовые, крупные, непрозрачные, cероватые колонии с неровной шероховатой поверхностью и неровными краями, диаметром до 5 и более мм. Консистенция суховатая.

На минеральной среде Мюнца вышеописанного состава растет в виде серых суховатых колоний диаметром 1-3 мм.

В мясо-пептонном бульоне (МПБ) промышленного производства образует суховатую плёнку поверх бульона.

Растет при рН 6,5-8,0 в широком диапазоне температур от +5 до +40°С.

Отношение к кислороду: облигатные аэробы.

В анаэробных условиях штамм сразу не погибает, но развивается медленнее.

Используемые источники углерода: сорбит.

Проверенные не используемые источники углерода: лактоза, глюкоза, цитрат натрия, малонат натрия.

Другие проверенные тесты: оксидаза-отрицательный, каталаза-положительный, не декарбоксилирует лизин и орнитин, не способен расщеплять фенилаланин, индолоотрицательный, сероводород не продуцирует, активен в отношении инозита, уреазаотрицательный, тест с β-галактозидазой - отрицательный.

Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный (проверка проведена на белых мышах).

Штамм не патогенен для растений (проверка на фитотоксичность проведена на семенах овса посевного (Avéna sativa) сорт «Скакун», пшеницы (Triticum) сорт «Приленская-19» и клевера лугового (Trifolium pretense).

Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 10-14 дней) на скошенном МПА или храниться в лиофилизированном состоянии в ампулах при температуре +4°С.

Штамм можно получить в ФБГУН ФИЦ «ЯНЦ СО РАН» - обособленном подразделении Институте проблем нефти и газа Сибирского отделения Российской Академии наук (ИПНГ СО РАН) в лаборатории геохимии каустобиолитов.

Пример 2. Выделение штамма Bacillus simplex ВКМ В-2817D

Штамм бактерий Bacillus simplex ВКМ В-2817D (авторский номер LER-11) выделен из мерзлотного нефтезагрязненного почво-грунта методом накопительных культур на минеральной среде с нефтью с последующим пересевом на МПА вышеописанного состава.

Штамм идентифицирован и депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов (ВКМ) Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) под регистрационным номером ВКМ В-2817D.

Для выделения штамма Bacillus simplex ВКМ В-2817D, соблюдая правила асептики, 1 г почвы, предварительно просеянной и освобожденной от корней и других посторонних включений, растирали в ступке и вносили в колбы ёмкостью 250 мл, с содержанием 100 мл, заранее подготовленной минеральной средой Мюнца вышеописанного состава.

В качестве единственного источника углерода и энергии использовали нефть, которую вносили в минеральную среду Мюнца в количестве 1000 мг на 1,0 дм³ среды.

Инкубацию проводили в качалочных условиях на установке «УВМТ-12-250» при 200 об/мин и температуре +20±1°С.

Рост бактерий наблюдали через 7 суток инкубации по образованию мутной эмульсии и дезинтеграции слоя нефти.

Чистая культура бактерий получена путем культивирования при вышеперечисленных условиях и многократных пересевов (более 10) накопительной культуры на чашки Петри с МПА вышеописанного состава.

Далее посевы инкубировали в стационарных условиях при различных температурах (+5, +10, +20, +30, +37, +40°С).

Через 72 ч при культивировании штамма на поверхности МПА наблюдали появление крупных, непрозрачных, кремовато-белых колоний диаметром до 5 мм и более, которые по культурально-морфологическим и биохимическим признакам, а также ключевым фенотипическим признакам, согласно таксономическим описаниям, приведенным в Определителе Берги (27. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Book Review Int. J. of Syst. Bact; July 1985, p. 408.) идентифицирован, как бактерия Bacillus simplex.

Видовая принадлежность выделенной культуры Bacillus simplex (авторский номер LER-11) идентифицирована и подтверждена результатами проведенного анализа нуклеотидных последовательностей гена 16SрРНК, выполненным и депонированным во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов (ВКМ) Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) с присвоением регистрационного номера ВКМ В-2817D.

Полученный штамм Bacillus simplex ВКМ В-2817D характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: грамположительные палочки с центрально-расположенными эллипсоидными спорами.

Культуральные характеристики.

На МПА вышеописанного состава формирует крупные, непрозрачные, кремовато-белые колонии диаметром до 5 мм и более. Консистенция мягкая. При посеве колонии тянутся за бактериологической петлей.

На среде Сабуро вышеописанного состава формирует непрозрачные беловато-кремовые слизистые колонии, тянущиеся за бактериологической петлей.

На агаризованной среде Мюнца вышеописанного состава растет в виде белых выпуклых колоний диаметром 1-3 мм.

В МПБ вышеописанного состава образует равномерную муть.

Растет при рН 6,5-8,0 при температуре от +5 до +40±1°С.

Отношение к кислороду: аэроб; в анаэробных условиях штамм сразу не погибает, но развивается медленнее.

В полужидком (1,5%) агаре - подвижный.

Дифференциальные свойства.

Проверенные не используемые источники углерода: лактоза, глюкоза, цитрат натрия, малонат натрия.

Другие проверенные тесты: оксидаза-отрицательный, каталаза-положительный, не декарбоксилирует лизин; декарбоксилирует орнитин, не способен расщеплять фенилаланин, индолоотрицательный, сероводород не продуцирует, не активен в отношении инозита, уреазаотрицательный, тест с β-галактозидазой - отрицательный; тест на лецитиназу отрицательный, гидролизует желатину и казеин, не гидролизует крахмал, не окисляет глицерол и гликоген, не ферментирует инулин и маннитол,использует в качестве источника углерода сорбит.

Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный (проверка проведена на белых мышах).

Штамм не патогенен для растений (проверка на фитотоксичность проведена на семенах овса посевного (Avéna sativa) сорт «Скакун», пшеницы (Triticum) сорт «Приленская-19» и клевера лугового (Trifolium pretense).

Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 10-14 дней) на скошенном МПА или храниться в лиофилизированном состоянии в ампулах при температуре +4°С.

Штамм можно получить в ФБГУН ФИЦ «ЯНЦ СО РАН» - обособленном подразделении Институте проблем нефти и газа Сибирского отделения Российской Академии наук (ИПНГ СО РАН) в лаборатории геохимии каустобиолитов.

Пример 3. Исследование нефтеокисляющей активности штаммов Bacillus sp. ВКМ В-2815D и Bacillus simplex ВКМ В-2817D

Клетки штаммов Bacillus sp. ВКМ В-2815D и Bacillus simplex ВКМ В-2817D по отдельности смывают 0,9% раствором NaCl со скошенного МПА (по примерам 1 и 2) каждый штамм в индивидуальную колбу, готовят исходные бактериальные суспензии, объемом 25 см³, с концентрацией 1×10⁹ микробных клеток/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича (28. МУК4.2.2316-08 "Методы контроля бактериологических питательных сред" (утв. Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко 18 января 2008 г.)..

Полученные бактериальные суспензии отдельно штамм Bacillus sp. ВКМ В-2815D и отдельно штамм Bacillus simplex ВКМ В-2817D культивируют минеральной среде Мюнца с нефтью (нефтепродуктами) вышеописанного состава по примеру 1.

Для этого готовят колбочки объемом 200,0 см³, куда вносят по 100,0 см³ готовой минеральной среды и 1000 мг нефти (нефтепродуктов). Затем колбы засевают клетками штаммов, используя отдельную колбу для штамма Bacillus sp. ВКМ В-2815D и отдельную колбу для штамма Bacillus simplex ВКМ В-2817D до концентрации 1×10⁹ клеток/см³.

В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, нефтью и без бактерий.

Опыт проводят в трех повторностях.

Колбы культивируют при температурах +5°С; 10°С; +20°С; +30°С; +37°С; +40°С в течение 7 суток.

Углеводородокисляющую активность изолированных штаммов Bacillus sp. ВКМ В-2815D и Bacillus simplex ВКМ В-2817D определяют визуально по эффективности их специфического действия по накоплению биомассы микробных клеток, а также по изменению агрегативного состояния сырой нефти в реакционной системе: солевая среда + бактериальные клетки в концентрации 1х10⁶ кл./см³ + сырая нефть (1% по объему).

Изменение агрегативного состояния слоя нефти и наличие изменения состояния системы является свидетельством окисления бактериальной культурой нефтяных углеводородов. Результаты оценивают по трех бальной системе, относя культуру к одному из разрядов (29. Ерофеевская Л.А. Разработка способа очистки мерзлотных почв и грунтов от нефтезагрязнений в природно-климатических условиях Якутии: диссертация…кандидата биологических наук: 03.02.08 / Ерофеевская Лариса Анатольевна: [Место защиты: ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Томский государственный университет], 2018. - 248 с. Дата публикации в реестре: 2020-03-03Т18:35:26Z):

«+++» - высокая углеводородокисляющая активность;

«++» -удовлетворительная углеводородокисляющая активность;

«+» - слабая углеводородокисляющая активность;

«-» - культура, не способная утилизировать нефтяные углеводороды.

По результатам опыта штаммы Bacillus sp. ВКМ В-2815D и Bacillus simplex ВКМ В-2817D обладают высокой углеводородокисляющей активностью (+++) при температурах температурах +5°С; 10°С; +20°С; +30°С; +37°С; +40°С (табл. 1).

Таблица 1. Углеводородокисляющая активность штаммов Bacillus sp. ВКМ В-2815D и Bacillus simplex ВКМ В-2817D при различных температурных условиях по трехбалльной системе

Температура испытаний, °С Активность испытуемого штамма Bacillus sp.
ВКМ В-2815D Bacillus simplex
ВКМ В-2817D Повторность опыта Повторность опыта 1 2 3 1 2 3 +5 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +20 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +30 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +37 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +40 +++ +++ +++ +++ +++ +++

Пример 4. Приготовление биопрепарата на основе бактериальных штаммов Bacillus sp. ВКМ В-2815D и Bacillus simplex ВКМ В-2817D

Изолированные колонии, полученные по примерам 1-3 и сохраненные на скошенном МПА, пересевают на скошенный МПА и инкубируют 48-72 часов при температуре +20±1°С. Каждый штамм пересевается в отдельную биологическую пробирку со скошенным МПА. Затем клетки смывают 0,9% раствором NaCl по отдельности в индивидуальные колбы отдельно для штамма Bacillus sp. ВКМ В-2815D и отдельно для штамма Bacillus simplex ВКМ В-2817D и готовят бактериальные суспензии с титром 1×10⁹ микробных клеток/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича для каждого штамма отдельно. Получают жидкую мутноватую смесь клеток штаммов Bacillus sp. ВКМ В-2815D и Bacillus simplex ВКМ В-2817D с титром 1-5×10⁹ клеток/см³, которые затем сливают в одну ёмкость и используют в качестве биопрепарата для иммобилизации сорбента-носителя, в качестве которого используется перегной крупно-рогатого скота.

Для повышения холодостойкости штаммов Bacillus sp. ВКМ В-2815D и Bacillus simplex ВКМ В-2817D и устойчивости к засолению в полученную полученную смесь микробных суспензий вносили водный раствор аминокислоты частично заменимой L-АЛЬФА Аргинин, предварительно приготовленного из 0,15 граммоваминокислоты частично заменимой L-АЛЬФА Аргинин, производства ООО «Творница» (Россия, https://agromarket.ru/aminokislota-arginin.html), растворенной в 100см³ воды.

Биопрепарат получали при следующем соотношении компонентов (мас.%): водный раствор аминокислоты частично заменимой L-АЛЬФА Аргинин - 1%; водная суспензия штаммов Bacillus sp. ВКМ В-2815D и Bacillus simplex ВКМ В-2817D с концентрацией 1×10⁹ микробных клеток/см³ - 99%. Полученный биопрепарат применяли для иммобилизации нефтесорбента.

Пример 5. Приготовление нефтебиосорбента для очистки и восстановления нефтезагрязненных земель.

Для приготовления нефтебиосорбента заранее готовили перегной на основе навоза крупно-рогатого скота (КРС).

Перегной на основе навоза КРС наиболее распространен, его легко достать, к тому же он содержит много микро- и макроэлементов (табл. 2), необходимых растениям в период развития и созревания. Кроме того, в незначительных количествах в перегное содержится кальций, магний, молибден, бор, цинк, медь и кобальт, гуминовые и ульминовые кислоты, а также фульвокислоты, что позволяет использовать его в качестве органического удобрения.

Таблица 2. Химический состав коровьего навоза в процентах от веса

Азот Фосфор Калий Ph C:N 0,54 0,28 0,6 8.1 19

Среди полезных свойств перегноя на основе навоза КРС выделяют: полный комплект полезных веществ для растений; на почву влияет быстро и результат получается превосходным; помогает защитить растения не только от болезней, но и от вредителей; доступность такого вида удобрения и низкая стоимость играют не последнюю роль среди важных приоритетов.

Среди недостатков считается невозможность однозначно сказать точное содержание полезных веществ в этом виде навоза.

Очень много зависит не только от питания животного, но и других параметров, таких как возраст, пол и другие (30. Какой навоз лучше для огорода: конский или коровий? [Электронный ресурс] // URL: https://pochva.net/home/kakoj-navoz-luchshe.html (дата обращения: 01.12.2023).

Для получения перегноя, свежий навоз КРС раскладывают в рыхлую кучу.

Через 3-5 дней под действием кислорода внутренние слои разогреваются до +60°С.

«Горение» вызывает гибель семян сорных растений и паразитирующих насекомых.

При этом происходит потеря связанного азота.

Чтобы ее остановить, прекращают доступ кислорода.

Для этого кучу уплотняют и накрывают пленкой.

Это так же предотвратит потерю калия.

Чтобы навоз сохранил свои ценные свойства после зимних морозов, кучу покрывают слоем земли толщиной 15 см.

Весной землю убирают, пленку оставляют и навозную кучу оставляют перепревать под пленкой ещё на 1 год.

Готовый перегной представляет собой рыхлую темную субстанцию, по сравнению со свежим сырьем масса уменьшается на 75% (31. Как приготовить удобрение из коровьего навоза [Электронный ресурс] // URL: https://ogorodishe.ru/kak-prigotovit-udobrenie-iz-korovego-navoza/ (дата обращения: 20.12.2022).

Подготовленный таким образом перегной смешивают с биопрепаратом, полученным по примеру 4, при следующем соотношении компонентов, мас.%: жидкая форма биопрепарата, полученная по примеру 4 - 10%, перегной - 90%.

Полученную смесь перемешивают в смешивающем устройстве типа БМ-205 «Вихрь» при 25-30 оборотах в минуту.

Емкость смешивающего устройства закрывают крышкой и оставляют на 24 часа для поверхностной иммобилизации биопрепарата на перегное.

Через 24 часа после смешивания и иммобилизации биопрепарата на перегное, полученный нефтебиосорбент гранулируют в универсальном грануляторетипа ZLSP 260В с производительностью 380-480 кг/ч, с диаметром матрицы 260 мм.

Полученные гранулы нефтебиосорбента сушат при комнатной температуре в течение 48 часов, после чего расфасовывают в тарные мешки, этикируют и доставляют на объект рекультивации.

Готовый продукт совмещает в себе функции нефтесорбента и нефтедеструктора.

Для сбора нефтепродуктов в прудах-отстойниках или других обводненных объектах не питьевого назначения, мешки с нефтебиосорбентом разбрасывают, не открывая в достаточном количестве для впитывания нефтепродуктов, при этом углеводородокисляющие микроорганизмы, входящие в состав нефтебиосорбента смешиваясь с водой производят в дальнейшем доочистку водного объекта после того, как мешки с нефтебиосорбентом и впитанными нефтепродуктами будут изъяты из очищаемого объекта.

Нефтебиосорбент можно подвергать регенерации с последующим применением его в качестве добавки в пеллеты для розжига.

Для очистки нефтезагрязненных земель нефтебиосорбент вносится под поверхностную обработку (перекопка, дискование) в количестве 1 кг нефтебиосорбента на 1 кв. метр почвы.

Действие нефтебиосорбента при использовании в качестве нефтедеструктора основано на адсорбции нефти (нефтепродуктов) из почвы с последующим её разложением иммобилизованными углеводородокисляющими микроорганизмами до углекислого газа и воды, после чего сам нефтебиосорбент (гранулы перегноя) утилизируются до неопасных компонентов процессами биоразложения, что позволяет использовать нефтебиосорбент для очистки нефтезагрязненных земель в различных природно-климатических условиях без передвижения почвенного слоя «in situ», что соответствует экономичности и экологичности.

При небольших площадях загрязнения нанесение нефтебиосорбента производится вручную совком.

При ветре разброс сорбента должен производиться по ветру при движении вдоль кромки разлива.

При больших площадях обрабатываемой поверхности нанесение нефтесорбента можно производить с применением разбрасывательной техники, например, при помощи навозоразбрасывателя.

Характеристики заявленного нефтебиосорбента для очистки нефтезагрязненных земель в различных природно-климатических условиях:

1. Внешний вид - гранулы темно-коричневого цвета;

2. Размер гранул - диаметр 6 мм, длина 10-20 мм;

3. Насыпная плотность - 350-400 кг на метр кубический;

4. Влажность сорбента - не более 15%;

5. Сорбционная ёмкость гранул нефтебиосорбента по воде - 3,5%;

6. Ёмкость поглощения гранул нефтебиосорбента - не менее 4,5 кг на 1 кг сорбента;

7. Рабочий диапазон температуры нефтебиосорбента - от +5°С до +40°С;

8. Рабочий диапазон pH - от 3,0 до 9,0 усл.ед.;

9. Концентрация клеток Bacillus sp. ВКМ В-2815D и Bacillus simplex ВКМ В-2817D не менее 1×10⁶ клеток/г абсолютно сухого веса сорбента-носителя (перегноя);

10. Время биоразложения нефти (нефтепродуктов) в почве при использовании нефтебиосорбента- 150 дней;

11. Плавучесть на водной поверхности с нефтяной пленкой - не менее 24 часов;

132. Возможность применения в соленой воде - до 7% солености.

13. Условия хранения - в мешках объемом 25-50 литров, в сухом проветриваемом помещении вдали от источников огня с относительной влажностью не более 85%, при температуре от +4 до 25°С на расстоянии более 1м от отопительных приборов.

14. Срок хранения - 2 года с момента изготовления.

Пример 6. Определение нефтеёмкости нефтебиосорбента

Нефтеемкость нефтебиосорбента определяли по максимальной (предельной) нефтеёмкости - в избытке нефти, и рабочей нефтеёмкости - поглощение пленки нефти на воде.

Количество поглощенной нефти определяли весовым методом, после выдержки нефтебиосорбента в нефти определенное время и стекания излишков нефти и воды с образца.

Для этого, впять больших химических стаканов (диаметр водного зеркала - 10 см) наливали по 0,5 литров воды, отстоявшейся в течение суток и по 20 мл сырой нефти Талаканского месторождения.

Взвешивали пять образцов нефтебиосорбента - по 10 г каждый.

Образцы нефтебиосорбента помещали в стаканы на поверхность нефтяной пленки.

Через 15 и 60 минут от начала опыта нефтебиосорбент собирали с поверхности воды, размещая на взвешенную фильтровальную бумагу.

После этого определяли количество поглощенной нефтебиосорбентом нефти и рассчитывали нефтеёмкость по формуле:

Н = Мкон. - Мнач., где

Н - нефтепоглощение нефтебиосорбента, г нефти/г нефтебиосорбента;

Mнач. - масса нефтебиосорбента в начале опыта (равна 10 г);

Мкон. - масса нефтебиосорбента в конце опыта, г.

Нефтебиосорбент впитывает более 6 см. куб. воды на 1 г собственного веса.

Насыщение нефтебиосорбента нефтью происходит в первые минуты.

Предельная нефтеемкость нефтебиосорбента составляет в среднем 4,5 г/г при различных температурах окружающей среды (от +5 до +40°С) (табл. 3).

Таблица 3. Предельная нефтеёмкость нефтебиосорбента при различных температурных условиях

t, n°С Предельная нефтеёмкость нефтебиосорбента, г/г Через 15 минут Через 60 минут Кратность опыта Кратность опыта 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 +5 1,11 1,13 1,13 1,12 1,13 4,3 4,5 4,7 4,4 4,6 +20 1,11 1,12 1,11 1,13 1,13 4,4 4,7 4,3 4,5 4,6 +30 1,13 1,13 1,11 1,12 1,13 4,4 4,5 4,6 4,3 4,7 +37 1,12 1,12 1,13 1,13 1,13 4,4 4,3 4,6 4,5 4,7 +40 1,13 1,13 1,13 1,13 1,13 4,5 4,5 4,6 4,4 4,5

Пример 7. Активация микробиологической активности почв под влиянием нефтебиосорбента

Способность нефтебиосорбента активировать микробиологическую активность почв в нефтезагрязненной почве продемонстрирована в опытах в лабораторных условиях при экспонировании опытов в холодильной камере при температуре +5±1°С, при комнатной температуре (+20±2°С), в контролируемых термостатных при температурах +30, +37 и + 40°С и в летний сезон в не контролируемых условиях естественной среды. Экспозиция опытов 60 суток (с 1 июня 2023 г. по 31 июля 2023 г.). Концентрация нефти в почвах модельных опытов 2%. Загрязнение искусственное. Почва среднесуглинистая.

Способность к накоплению клеток углеводородокисляющих микроорганизмов в почвах модельных опытов, обработанных нефтебиосорбентом свидетельствует о перспективности применения нефтебиосорбента в условиях широкого диапазона температур окружающей среды, от +5 до +40°С (табл. 4).

Таблица 4. Содержание в почвах микроорганизмов до и после проведения опытов, проведенных при различных температурных условиях

№
эксп Вариант опыта ОМЧ, КОЕ/г АСВ почвы УОМ, КОЕ/г АСВ почвы исходное через 60 сут. исходное через 60 сут. Лабораторные опыты при комнатной температуре (01.06-31.07.2023 г.; t+20±2°С) 1 Контроль (почва+нефть) 2,4(±0,01)•10⁵ 8,3(±0,04)•10⁴ 0,00 0,00 2 Почва+нефть+
нефтебиосорбент 4,4(±0,02)•10⁵ 4,8(±0,02)•10⁷ 0,00 3,2(±0,01)•10⁵ Лабораторные опыты в условиях холодильной камеры (01.06-31.07.2023 г.; t+5±1°С) 3 Контроль (почва+нефть) 2,8(±0,01)•10⁵ 2,0(±0,01)•10⁵ 0,00 0,00 4 Почва+нефть+
нефтебиосорбент 2,4(±0,01)•10⁵ 6,4(±0,03)•10⁶ 0,00 4,8(±0,02)•10³ Лабораторные опыты в условиях термостата (01.06-31.07.2023 г.; t+30±1°С) 5 Контроль (почва+нефть) 7,2(±0,03)•10⁵ 5,5(±0,02)•10⁵ 0,00 0,00 6 Почва+нефть+
нефтебиосорбент 6,4(±0,03)•10⁵ 3,8(±0,01)•10⁷ 0,00 2,6(±0,01)•10⁴ Лабораторные опыты в условиях термостата (01.06-31.07.2023 г.; t+37±1°С) 7 Контроль (почва+нефть) 6,0(±0,03)•10³ <10³ 0,00 0,00 8 Почва+нефть+
нефтебиосорбент 6,2(±0,03)•10³ 4,2(±0,02)•10⁴ 0,00 2,2(±0,01)•10³ Лабораторные опыты в условиях термостата (01.06-31.07.2023 г.; t+40±1°С) 9 Контроль (почва+нефть) 6,2(±0,03)•10⁶ 3,3(±0,01)•10⁴ 0,00 0,00 10 Почва+нефть+
нефтебиосорбент 5,0(±0,02)•10⁶ 2,8(±0,01)•10⁹ 0,00 6,8(±0,03)•10⁶ В условиях открытой экосистемы (01.06-31.07.2023 г.) 11 Контроль (почва+нефть) 6,2(±0,03)•10⁶ 3,3(±0,01)•10⁴ 0,00 0,00 12 Почва+нефть+
нефтебиосорбент 5,0(±0,02)•10⁶ 2,8(±0,01)•10⁹ 0,00 6,8(±0,03)•10⁶

Таким образом, показано, что заявленный нефтебиосорбент для очистки и восстановления нефтезагрязненных земель, включающий получение жидкой формы биопрепарата, который иммобилизуют на сорбент-носитель, отличающийся тем, что основу биопрепарата составляет смесь углеводородокисляющих бактерий в составе: Bacillus sp. ВКМ В-2815D и Bacillus simplex ВКМ В-2817D, эффективных в широком диапазоне температур окружающей среды, от +5 до +40°С и аминокислоты частично заменимой L-АЛЬФА Аргинин в соотношении, масс.%: водный раствор аминокислоты частично заменимой L-АЛЬФА Аргинин - 1%; водная суспензия смеси углеводородокисляющих бактерий в составе: Bacillus sp. ВКМ В-2815D и Bacillus simplex ВКМ В-2817D, взятых в равных соотношениях 1:1, с концентрацией 1×10⁹ микробных клеток/см³ - 99%, иммобилизованных на сорбент-носитель, в качестве которого выбран перегной на основе навоза крупно-рогатого скота с последующим перемешиванием, гранулированием и сушкой полученного нефтебиосорбента при комнатной температуре, при соотношении компонентов, масс.%: жидкая форма биопрепарата, полученного из аминокислоты частично заменимой L-АЛЬФА и смеси углеводородокисляющих бактерий в составе: Bacillus sp. ВКМ В-2815D и Bacillus simplex ВКМ В-2817D - 10%, сорбент-носитель - 90%, что обеспечивает нефтебиосорбенту удовлетворительную нефтеёмкость, равную 4,5 г/г нефти и способность активировать процессы микробиологической активности в почвах, что является достаточным для применения нефтебиосорбента в широком диапазоне температур окружающей среды, от +5 до +40°С и перспективно для применения нефтебиосорбента для очистки и восстановления в различных природно-климатических условиях.

Заявленный нефтебиосорбент легко доступен для исполнения, не требует осуществления дорогостоящих и трудоёмких операций, обладает удовлетворительной нефтеемкостью - 4,5 г/г нефти, и способностью активировать процессы микробиологической активности в нефтезагрязненных почвах в широком диапазоне температур окружающей среды, от +5 до +40°С, что является перспективным для применения нефтебиосорбента для очистки и восстановления нефтезагрязненных земель в различных природно-климатических условиях. 7 примеров, 2 таблицы.

Исследования выполнены в рамках Госзадания Министерства науки и высшего образования РФ №122011200369-1 с использованием научного оборудования ЦКП ФИЦ ЯНЦ СО РАН в рамках гранта №13.ЦКП.21.0016.

Изобретение относится к восстановлению загрязненных почв микробиологическими способами, в частности к применению нефтебиосорбентов для очистки и восстановления нефтезагрязненных земель. Нефтебиосорбент для очистки и восстановления нефтезагрязненных земель состоит из сорбента-носителя, на который иммобилизуют биопрепарат в жидкой форме. Основу биопрепарата составляет смесь углеводородокисляющих бактерий в составе: Bacillus sp. ВКМ В-2815D и Bacillus simplex ВКМ В-2817D, эффективных в широком диапазоне температур окружающей среды, от +5 до +40°С и аминокислоты частично заменимой L-АЛЬФА Аргинин в соотношении, мас.%: водный раствор аминокислоты частично заменимой L-АЛЬФА Аргинин - 1%; водная суспензия смеси углеводородокисляющих бактерий в составе: Bacillus sp. ВКМ В-2815D и Bacillus simplex ВКМ В-2817D, взятых в равных соотношениях 1:1, с концентрацией 1×10⁹ микробных клеток/см³ - 99%, иммобилизованных на сорбент-носитель, в качестве которого выбран перегной на основе навоза крупнорогатого скота с последующим перемешиванием, гранулированием и сушкой полученного нефтебиосорбента при комнатной температуре, при соотношении компонентов, мас.%: жидкая форма биопрепарата, полученного из аминокислоты частично заменимой L-АЛЬФА и смеси углеводородокисляющих бактерий в составе: Bacillus sp. ВКМ В-2815D и Bacillus simplex ВКМ В-2817D - 10%, сорбент-носитель - 90%, что обеспечивает нефтебиосорбенту удовлетворительную нефтеёмкость, равную 4,5 г/г нефти при использовании в широком диапазоне температур окружающей среды, от +5 до +40°С, и, способность активировать процессы микробиологической активности в почвах, что является достаточным для применения нефтебиосорбента в широком диапазоне температур окружающей среды, от +5 до +40°С и перспективно для применения нефтебиосорбента для очистки и восстановления в различных природно-климатических условиях. Нефтебиосорбент легко доступен для исполнения, не требует осуществления дорогостоящих и трудоёмких операций, обладает удовлетворительной нефтеемкостью - 4,5 г/г нефти, и способностью активировать процессы микробиологической активности в нефтезагрязненных почвах в широком диапазоне температур окружающей среды, от +5 до +40°С, что является перспективным для применения нефтебиосорбента для очистки и восстановления нефтезагрязненных земель в различных природно-климатических условиях. 7 пр., 4 табл.

Нефтебиосорбент для очистки и восстановления нефтезагрязненных земель, включающий получение жидкой формы биопрепарата, который иммобилизуют на сорбент-носитель, отличающийся тем, что основу биопрепарата составляет смесь углеводородокисляющих бактерий в составе: Bacillus sp. ВКМ В-2815D и Bacillus simplex ВКМ В-2817D, эффективных в широком диапазоне температур окружающей среды, от +5 до +40°С, и аминокислоты частично заменимой L-АЛЬФА Аргинин в соотношении, мас.%: водный раствор аминокислоты частично заменимой L-АЛЬФА Аргинин – 1%; водная суспензия смеси углеводородокисляющих бактерий в составе: Bacillus sp. ВКМ В-2815D и Bacillus simplex ВКМ В-2817D, взятых в равных соотношениях 1:1, с концентрацией 1×10⁹ микробных клеток/см³ – 99%, иммобилизованных на сорбент-носитель, в качестве которого выбран перегной на основе навоза крупно-рогатого скота с последующим перемешиванием, гранулированием и сушкой полученного нефтебиосорбента при комнатной температуре, при соотношении компонентов, мас.%: жидкая форма биопрепарата – 10% и сорбент-носитель – 90%, что обеспечивает нефтебиосорбенту удовлетворительную нефтеёмкость, равную 4,5 г/г нефти при использовании в широком диапазоне температур окружающей среды, от +5 до +40°С, и способность активировать процессы микробиологической активности в почвах, что является достаточным для применения нефтебиосорбента в широком диапазоне температур окружающей среды, от +5 до +40°С, и перспективно для применения нефтебиосорбента для очистки и восстановления в различных природно-климатических условиях.