СПОСОБЫ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ ПРОТИВ НЕ4 И СПОСОБЫ ДИАГНОСТИКИ И/ИЛИ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ СОСТОЯНИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ЭКСПРЕССИРУЮЩИМИ НЕ4 КЛЕТКАМИ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/574 

Ссылка на родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет по дате подачи предварительной заявки на выдачу патента США №61/377387, которая была подана 26 августа 2010 г. В рамках какой-либо заявки на выдачу патента США, согласно которой может испрашиваться приоритет предварительной заявки на выдачу патента США №61/377387, содержание такой ранее поданной заявки включено в настоящий документ посредством ссылки во всей ее полноте.

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к композициям и способам оценки риска, диагностики и/или прогнозирования субъектов, страдающих злокачественной опухолью, ассоциированной с экспрессирующими человеческий эпидидимальный ядерный белок с четырьмя дисульфидными связями («НЕ4») опухолями, или подверженных риску развития таковых, а также, в частности, к способам измерения содержания антител против НЕ4 для применения в качестве индикатора присутствия экспрессирующих НЕ4 клеток, таких как клетки опухоли яичника, и/или определения клинического статуса больного, получающего лечение от злокачественной опухоли, ассоциированной с одной или несколькими экспрессирующими НЕ4 опухолями.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

На Западе карцинома яичника (OvC) является вторым наиболее частым и наиболее летальным гинекологическим злокачественным новообразованием. В большинстве случаев диагностируется на поздней стадии, и это отражается в плохом прогнозе с общим пятилетним показателем выживаемости, не превышающим 35%. Карцинома яичника является чрезвычайно смертоносной, потому что симптомы являются неопределенными и неспецифичными. При злокачественных опухолях яичника малигнизированные клетки выделяются в естественную жидкость брюшной полости. Затем эти клетки имеют достаточный потенциал, чтобы плавать в этой жидкости, и часто внедряются в другие абдоминальные (брюшинные) структуры, в том числе в матку, мочевой пузырь, кишечник и выстилку стенки кишечника (сальник). Эти клетки могут дать начало формированию новых опухолей еще до того, как будет заподозрена злокачественная опухоль. Более чем у 60% больных это заболевание определяется уже на III стадии или IV стадии, когда оно уже распространилось за пределы яичников, и более 75% таких больных умирают от заболевания, несмотря на последние достижения химиотерапии злокачественных опухолей яичника. Однако если диагноз поставлен на ранней стадии заболевания, пятилетние показатели выживаемости могут достигать 90% - 98%.

Одним маркером злокачественной опухоли яичника, который используется в анализах сыворотки крови на злокачественную опухоль яичника, является СА125 (Bast, R.C., et al., Gynecol. Oncol. 22:115-120 (1985); Einhom, N., etal., Obstet. Gynaecol. 67:414-416 (1986); Einhom, et al., Obstet. Gynecol. 80:14-18 (1992); Jacobs, I.J., et al., Br. Med. J. 313:1355-1358 (1996)). Однако в то время как содержание СА125 обнаруживается повышенным при большинстве злокачественных опухолей яичника, на ранней стадии заболевания он выявляется только в половине из них (Hellstrom, I., et al., Cancer Research 63:3695-3700 (2003)). Более того, содержание СА125 также повышено при некоторых незлокачественных состояниях (Fung, M.F., et al., 3:. Obstet. Gynaecol. Can., 26:717-728 (2004); Mas, M.R., et al. Dig. Liver Dis. 32:595-597 (2000); Malkasian, G.D., et al, Am. J. Obstet. Gynecol. 159:341-346 (1988)), что может давать ложный положительный результат.

Таким образом, существует большая потребность в разработке более эффективных инструментов для обнаружения на ранней стадии потенциально излечимых злокачественных состояний, таких как карцинома яичника.

Сущность изобретения

В соответствии с вышеизложенным в одном аспекте способ предусматривает выявление присутствия экспрессирующих НЕ4 клеток у человека, включающее в себя определение присутствия или количества антител против НЕ4 в биологическом образце, полученном от человека, в котором присутствие или количество антител против НЕ4 в биологическом образце свидетельствует о присутствии экспрессирующих НЕ4 клеток у человека. В некоторых вариантах осуществления присутствие экспрессирующих НЕ4 клеток у человека свидетельствует о том, что субъект страдает злокачественной опухолью яичника или подвержен риску развития опухоли яичника.

В другом аспекте способ предусматривает контроль эффективности лечения человека со злокачественной опухолью, получающего терапевтическое лечение от экспрессирующей НЕ4 опухоли. Способ предусматривает (а) получение биологического образца от человека, получающего терапевтическое лечение от злокачественной опухоли, ассоциированной с экспрессирующими НЕ4 опухолевыми клетками; (b) определение присутствия или количества антител против НЕ4 в биологическом образце путем контактирования биологического образца с полипептидом, кодируемым полинуклеотидом, который селективно гибридизуется с последовательностью, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, содержащей по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 1; и (с) сравнение определенного присутствия или количества антител против НЕ4 с эталоном антитела, при этом количество антитела против НЕ4, превышающее эталон, свидетельствует о положительном ответе на терапевтическое лечение от злокачественной опухоли.

В другом аспекте предусматривается набор для выявления присутствия экспрессирующих НЕ4 клеток у человека, содержащий специфичные реагенты для выявления присутствия или количества антител против НЕ4 в биологическом образце, полученном от человека, и напечатанные инструкции для сравнения выявленного присутствия или количества антител против НЕ4 с эталоном.

Краткое описание графических материалов

Вышеизложенные аспекты и многие из сопутствующих преимуществ настоящего изобретения станут более понятными при обращении к следующему подробному раскрытию в сочетании с сопровождающими графическими материалами, в которых:

на фиг.1 графически показаны результаты анализа ELISA, тестирующего присутствие/количество антител против НЕ4 из образцов сыворотки крови человека, полученных от 10 пациентов со злокачественной опухолью яичника и 1 здорового контрольного субъекта; как описано в примере 2;

на фиг.2 изображены фрагменты НЕ4, экспрессируемые как слитые белки с белком оболочки pVIII с использованием показанных в таблице 1 праймеров.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Если специально не определено в настоящем документе, все термины, используемые в настоящем документе, характеризуются тем же значением, как это понимается специалистом в области, к которой принадлежит настоящее изобретение.

Термины «процентная идентичность» или «идентичный в процентном отношении», применяемые к полипептидным последовательностям, таким как полипептид НЕ4 или его часть, определяются как процентное отношение аминокислотных остатков в кандидатной белковой последовательности, которые идентичны таковым в субъектной белковой последовательности (такой как аминокислотная последовательность, изложенная в SEQ ID NO: 2, или ее часть, содержащая по меньшей мере 10 последовательных аминокислотных остатков) после выравнивания кандидатной и субъектной последовательностей для достижения максимальной процентной идентичности. Например, идентичность в процентном отношении между двумя белковыми последовательностями может быть определена путем попарного сравнения этих двух последовательностей с использованием интерфейса bl2seq на веб-сайте Национального центра биотехнологической информации (NCBI), U.S. National Library of Medicine, 8600 Rockville Pike, Bethesda, Maryland 20894, U.S.A. Интерфейс bl2seq позволяет выравнивать последовательности с использованием инструмента BLAST, описанного в Tatiana, A., et al, "Blast 2 Sequences--А New Tool for Comparing Protein and Nucleotide Sequences," FEMS Microbiol. Lett. 174:247-250 (1999). Используются следующие параметры выравнивания: матрица=BLOSUM62; штраф за открытие гэпа=11; штраф за продолжение гэпа=1; гэп x_dropff=50; ожидание=10,0; длина слова=3; и фильтр=выключен.

Применяемые для молекул нуклеиновых кислот термины «процентная идентичность» или «идентичный в процентном отношении» означают процентное отношение нуклеотидов в кандидатной последовательности нуклеиновой кислоты, которые идентичны таковым в субъектной последовательности молекулы нуклеиновой кислоты (такой как последовательность молекулы нуклеиновой кислоты, изложенная в SEQ ID NO: 1, или ее часть, содержащая по меньшей мере 20 последовательных нуклеотидов) после выравнивания последовательностей для достижения максимальной процентной идентичности, без учета каких-либо замен остатков нуклеиновой кислоты как части идентичности последовательностей. Гэпы не вводятся в кандидатную последовательность нуклеиновой кислоты для достижения лучшего выравнивания. Идентичность последовательностей нуклеиновой кислоты может быть определена следующим образом. Субъектная последовательность молекулы полинуклеотида используется для поиска в базе данных последовательностей нуклеиновых кислот, такой как база данных Genbank, с использованием версии 2.1 программы BLASTN (на основе Altschul, etal., Nucleic Acids Research 25:3389-3402 (1997)). Программа используется в режиме без гэпов. Фильтрование по умолчанию используется для удаления гомологии последовательностей за счет участков низкой сложности, как определено в Wootton, J.C., and S. Federhen, Methods in Enzymology 266:554-571 (1996). Используются параметры по умолчанию BLASTN.

Используемый в настоящем документе термин «здоровый человек» означает индивидуума, который, как известно, не страдает злокачественной опухолью, такие сведения основываются на клинических данных индивидуума, включая без ограничения другой анализ на злокачественные опухоли, помимо описанного в настоящем документе. Также у здорового индивидуума предпочтительно не проявляются ранние симптомы, ассоциированные с экспрессирующими НЕ4 опухолями, такими как злокачественная опухоль яичника, которые включают в себя, например, внутрипрямокишечное давление, вздутие живота и вспучивание; а также предпочтительно не проявляются симптомы других заболеваний или состояний репродуктивной системы.

Используемый в настоящем документе термин «экспрессирующая НЕ4 опухоль» означает любой тип раковых клеток и/или опухолей, которые идентифицируются как характеризующиеся неопластическим состоянием, ассоциированным с повышенной экспрессией НЕ4, при этом НЕ4 означает по меньшей мере одну из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и их гомологов у млекопитающих, или их фрагмент, содержащий по меньшей мере десять последовательных остатков белка (SEQ ID NO: 2) или по меньшей мере 20 последовательных нуклеотидов кДНК (SEQ ID NO: 1), по сравнению с нормальными тканями, в том числе без ограничения злокачественную опухоль яичника, аденокарциному легкого (Bingle et al., Respiratory Research 7:61-80 (2006) и опухоли слюнных желез.

Используемый в настоящем документе термин «злокачественная опухоль яичника» означает любой тип злокачественной опухоли яичника, в том числе без ограничения серозную злокачественную опухоль яичника, неинвазивную злокачественную опухоль яичника, злокачественную опухоль яичника смешанного фенотипа, муцинозную злокачественную опухоль яичника, эндометриоидную злокачественную опухоль яичника, светлоклеточную злокачественную опухоль яичника, папиллярную серозную злокачественную опухоль яичника, опухоль Бреннера и недифференцированную аденокарциному.

Используемый в настоящем документе термин «рецидив экспрессирующей НЕ4 опухоли» означает клиническое проявление злокачественной опухоли, связанной с экспрессирующими НЕ4 клетками, например, злокачественной опухоли яичника, или опухолевыми клетками, полученными из них, основанное на клинических данных индивидуума, включая без ограничения другой анализ на злокачественные опухоли, помимо описанного в настоящем документе.

Используемый в настоящем документе термин «хороший прогноз» в контексте злокачественной опухоли, ассоциированной с одной или несколькими экспрессирующими НЕ4 опухолями (например, злокачественная опухоль яичника), относится к пациентам, которые, вероятно, излечатся от своего заболевания, или по меньшей мере характеризуются пятилетним периодом выживания без опухоли после первоначального диагноза.

Используемый в настоящем документе термин «плохой прогноз» в контексте злокачественной опухоли, ассоциированной с одной или несколькими экспрессирующими НЕ4 опухолями (например, злокачественная опухоль яичника), относится к пациентам, которые, вероятно, умрут от их заболевания в течение периода пяти лет после первоначального диагноза.

Человеческий эпидидимальный ядерный белок с четырьмя дисульфидными связями («НЕ4») (SEQ ID NO: 2) кодируется последовательностью мРНК, изложенной как SEQ ID NO: 1 (которой соответствует № доступа в Genbank AY212888). Сначала кДНК НЕ4 была выделена из эпидидимиса человека (Kirchhoff et al., 1991), а позже кДНК НЕ4 была выявлена с высокой частотой в библиотеках кДНК, построенных из карцином яичника (Wang etal., Gene 229:101 (1999)). Белок НЕ4 принадлежит к семейству «ядерных с четырьмя дисульфидными связями» белков, которые содержат гетерогенную группу низкомолекулярной кислоты и термостабильных молекул с различной функцией, названных «растворимыми родственными НЕ4 пептидами» (SHRP) (Kirehhoff, et al., Biol. Reprod. 45:350-357 (1991). Консервативный промежуток из восьми ядерных цистеиновых остатков в аминокислотных последовательностях полипептидов-членов ядерного семейства с четырьмя дисульфидными связями (аа участки 32-73 и 76-123 из SEQ ID NO: 2), как полагают, управляет укладкой этих молекул в компактную и стабильную структуру. Многие члены ядерного семейства с четырьмя дисульфидными связями являются ингибиторами протеазы; однако для некоторых членов семейства, включая НЕ4, функция еще не идентифицирована.

Используемый в настоящем документе термин белок «НЕ4» охватывает природный белок НЕ4, который выделяется из биологического образца, полученного от человека, а также белок НЕ4, выделенный из культивируемых клеток, образующих НЕ4 (например, культивируемых клеток карциномы яичника), или полученный технологией рекомбинантной ДНК (например, в эукариотических системах экспрессии (например, в клетках COS)), в дрожжах, млекопитающем или в бактериальных системах экспрессии.

В соответствии с вышеизложенным авторы настоящего изобретения создали воспроизводимый анализ для выявления антител против нативного белка НЕ4 (SEQ ID NO: 2) в биологическом образце (например, в плазме или сыворотке крови), как описано в примере 2. Как далее описано в примерах 2-3, авторы настоящего изобретения использовали этот анализ для выявления присутствия антител против НЕ4 у людей и обнаружили, что у субъектов, клинически идентифицированных как страдающие злокачественной опухолью яичника, наблюдалось значительно более высокое количество антител против НЕ4 по сравнению с нормальными здоровыми женщинами.

В соответствии с вышеизложенным, в одном аспекте способ предусматривает выявление присутствия экспрессирующих НЕ4 клеток у человека. Способ предусматривает определение присутствия или количества антител против НЕ4 в биологическом образце, полученном от человека, в котором присутствие или количество антител против НЕ4 в биологическом образце свидетельствует о присутствии экспрессирующих НЕ4 клеток у человека. В одном варианте осуществления присутствие или количество антител против НЕ4 в биологическом образце выявляется путем контактирования биологического образца с полипептидом, кодируемым полинуклеотидом, который селективно гибридизуется с последовательностью, по меньшей мере на 80% идентичной или по меньшей мере на 90% идентичной, или по меньшей мере на 95% идентичной, или по меньшей мере на 98% идентичной, или по меньшей мере на 99% идентичной последовательности, содержащей по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах присутствие или количество антитела против НЕ4 в биологическом образце определяют путем контактирования биологического образца с полипептидом, содержащим последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную или по меньшей мере на 90% идентичную, или по меньшей мере на 95% идентичную, или по меньшей мере на 98% идентичную, или по меньшей мере на 99% идентичную последовательности, содержащей по меньшей мере 10 смежных аминокислот из SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления присутствие или количество антител против НЕ4 по сравнению с эталоном (например, отрицательным контролем) свидетельствует о присутствии экспрессирующих НЕ4 клеток, таких как опухолевые клетки, у человека. В другом варианте осуществления количество антител против НЕ4, превышающее предварительно определенное пороговое количество, свидетельствует о присутствии экспрессирующих НЕ4 клеток у человека. В некоторых вариантах осуществления способа присутствие экспрессирующих НЕ4 клеток у человека свидетельствует о том, что субъект страдает злокачественной опухолью яичника или подвержен риску развития такового.

В способах в соответствии с настоящим изобретением может быть использован широкий ряд биологических образцов, в том числе биологические жидкости. Неограничивающие примеры биологических жидкостей включают в себя кровь, плазму, сыворотку крови, асцитическую жидкость, мочу, слюну, слезы, плевральную жидкость, мокроту, влагалищную жидкость (выделенную) и промывки, полученные в ходе медицинской процедуры (например, тазовые или другие промывки, полученные в ходе биопсии, эндоскопии или хирургического вмешательства).

Способы в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения могут быть использованы как диагностический инструмент для отличия субъекта, страдающего заболеванием или состоянием, ассоциированным с экспрессией НЕ4, от такового с заболеванием или состоянием, не ассоциированным с экспрессией НЕ4. В одном варианте осуществления способа биологический образец получен от человека, страдающего по меньшей мере одним симптомом, ассоциированным со злокачественной опухолью яичника. Симптомы, ассоциированные со злокачественной опухолью яичника, известны специалистам в области медицины. Неограничивающие примеры таких симптомов включают в себя вспучивание/вздутие живота, абдоминальную/тазовую боль или давление, желудочно-кишечные симптомы (например, газ, расстройство пищеварения, тошнота или изменения стула), вагинальное кровотечение или выделение, проблемы мочевыводящих путей (например, позыв, жжение или спазмы), утомляемость, лихорадка, боль в спине и затрудненное дыхание.

В некоторых вариантах осуществления способы в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения, кроме того, предусматривают выполнение по меньшей мере одного дополнительного диагностического анализа для определения того, имеется ли у субъекта с антителами против НЕ4 опухоль яичника. В некоторых вариантах осуществления способы в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения дополнительно предусматривают выполнение по меньшей мере одного дополнительного диагностического анализа на злокачественную опухоль яичника у субъекта, такого как, например, выявление присутствия СА125 в биологическом образце, ультразвуковое обследование, КТ-сканирование, МРТ-сканирование, биопсия, аспирирование и т.п.

Как описано более подробно в настоящем документе, в некоторых вариантах осуществления способы в соответствии с настоящим изобретением, которые предусматривают выявление антител против нативного НЕ4, могут быть использованы и необязательно комбинированы с анализом выявления антигена SHRP для определения присутствия экспрессирующих НЕ4 опухолевых клеток, для выявления наличия или вероятности рецидива злокачественной опухоли, ассоциированной с экспрессирующей НЕ4 опухолью, такой как злокачественная опухоль яичника, для оценки клинического статуса и/или прогноза больного, страдающего злокачественной опухолью, ассоциированной с экспрессирующими НЕ4 опухолями, и/или для контроля эффективности лечения злокачественной опухоли у пациента. Количество антигена SHRP, выявленного в биологическом образце, можно сравнить с эталоном, таким как эталонное значение антигена, при этом выявление повышенного количества антигена SHRP в образце по сравнению с эталоном свидетельствует о присутствии экспрессирующих НЕ4 опухолевых клеток у человека.

В другом варианте осуществления способ предусматривает контроль эффективности лечения человека со злокачественной опухолью, получающего терапевтическое лечение от экспрессирующей НЕ4 опухоли. Способ предусматривает (а) получение биологического образца от человека, получающего терапевтическое лечение от злокачественной опухоли, ассоциированной с экспрессирующей НЕ4 опухолью; (b) определение присутствия или количества антител против НЕ4 в биологическом образце путем контактирования биологического образца с полипептидом, кодируемым полинуклеотидом, который селективно гибридизуется с последовательностью, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, содержащей по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 1; и (с) сравнение определенного присутствия или количества антител против НЕ4 с эталонным значением антитела, при этом количество антитела против НЕ4, превышающее эталонное значение антитела, свидетельствует о положительном ответе на терапевтическое лечение от злокачественной опухоли.

В другом варианте осуществления способ предусматривает выявление вероятности рецидива экспрессирующей НЕ4 опухоли у человека, получающего терапевтическое лечение от злокачественной опухоли, ассоциированной с экспрессирующей НЕ4 опухолью. Способ предусматривает (а) получение биологического образца от человека, получающего терапевтическое лечение от злокачественной опухоли, ассоциированной с экспрессирующей НЕ4 опухолью;

(b) определение присутствия или количества антител против НЕ4 в биологическом образце путем контактирования биологического образца с полипептидом, кодируемым полинуклеотидом, который селективно гибридизуется с последовательностью, по меньшей мере на 80%, например, по меньшей мере на 90%, идентичной последовательности, содержащей по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 1; и (с) сравнение присутствия или количества антител против НЕ4, определенного на этапе (b), с эталонным значением антитела, при этом количество антитела против НЕ4, превышающее эталонное значение антитела, свидетельствует о более низком риске рецидива экспрессирующей НЕ4 опухоли, и при этом количество антитела против НЕ4, ниже эталонного значения, свидетельствует о более высоком риске рецидива экспрессирующей НЕ4 опухоли у больного.

Согласно одному варианту осуществления способов в соответствии с настоящим изобретением человек, получающий терапевтическое лечение от злокачественной опухоли, ассоциированной с экспрессирующей НЕ4 опухолью, оценивается по его клиническому статусу и вероятности рецидива злокачественной опухоли. Способы в соответствии с этим вариантом осуществления могут практиковаться для пациентов, у которых предварительно диагностировали и лечили экспрессирующую НЕ4 опухоль, такую как злокачественная опухоль яичника, аденокарциному легкого или опухоль слюнных желез, (например, которых лечили путем хирургического вмешательства и/или которые ранее получали или на данный момент получают терапевтическое лечение, такое как химиотерапия, лучевая терапия, белковые терапевтические средства, в том числе антитела, генная терапия, терапия вакциной от злокачественной опухоли, трансплантация стволовых клеток или другой тип терапии). Рецидивом злокачественной опухоли яичника является клинический рецидив, определенный наличием одного или нескольких клинических симптомов злокачественной опухоли яичника, таких как, например, метастазы, или, в качестве альтернативы, определенный при биохимическом тесте, иммунологическом тесте или серологическом тесте, таком как, например, перекрестная реактивность в биологическом образце с антителом СА125, или при другом диагностическом тесте. Предпочтительно рецидив злокачественной опухоли яичника может выявляться по меньшей мере через приблизительно 2 года после лечения, более предпочтительно через приблизительно 2-3 года после лечения и еще более предпочтительно через приблизительно 4 или 5, или 10 лет после лечения.

Система стадирования 1-4 используется для описания злокачественной опухоли яичника, как изложено в системе стадирования Международной федерации гинекологии и акушерства («FIGO»), в которой используется информация, полученная после хирургического вмешательства. Хирургические вмешательства могут включать в себя общую абдоминальную гистерэктомию, удаление одного или обоих яичников и фаллопиевых труб, сальника и/или тазовые промывки для цитологии.

I Стадия - ограничена одним или обоими яичниками:

IA - охватывает один яичник; капсула не повреждена; опухоль отсутствует на поверхности яичника; малигнизированные клетки отсутствуют в асцитах или в перитонеальных промывках;

IB - охватывает оба яичника; капсула не повреждена; опухоль отсутствует на поверхности яичника; отрицательные промывки;

IC - опухоль ограничена яичниками с чем-либо из следующего: капсула повреждена, опухоль на поверхности яичника, положительные промывки.

II стадия - тазовые распространение или внедрения

IIA - распространение или внедрения в матку или фаллопиеву трубу;

отрицательные промывки;

IIB - распространение или внедрения в другие тазовые структуры;

отрицательные промывки;

IIC - тазовое распространение или внедрения с положительными перитонеальными промывками.

III стадия - микроскопические перитонеальные внедрения за пределами таза; или ограничены тазом с распространением на тонкий кишечник или сальник:

IIIA - микроскопические перитонеальные метастазы вне таза;

IIIB - макроскопические перитонеальные метастазы вне таза размером менее 2 см;

IIIC - перитонеальные метастазы вне таза > 2 см или метастазы лимфатических узлов, примечание: метастазы парааортальных лимфатических узлов считаются регионарными лимфатическими узлами.

IV стадия - отдаленные метастазы в печени или вне перитонеальной полости.

В соответствии с некоторым вариантами осуществления настоящего изобретения биологический образец получают от человека (у которого предварительно диагностировали злокачественную опухоль яичника и которого предварительно лечили от злокачественной опухоли яичника, или который в настоящее время получает лечение от злокачественной опухоли яичника) и анализируют присутствие или концентрацию антител против НЕ4. Биологические образцы для применения в способах в соответствии с настоящим изобретением включают в себя биологические жидкости. Неограничивающие примеры биологических жидкостей включают в себя кровь, плазму, сыворотку крови, асцитическую жидкость, мочу, слюну, слезы, плевральную жидкость, мокроту, влагалищную жидкость (выделение) и промывки, полученные в ходе медицинской процедуры (например, тазовые или другие промывки, полученные в ходе биопсии, эндоскопии или хирургического вмешательства). Возможность применения образца биологической жидкости для оценки клинического статуса субъекта в отношении экспрессирующей НЕ4 опухоли (такой как злокачественная опухоль яичника или другие экспрессирующие НЕ4 опухоли) обеспечивает относительное удобство по сравнению с получением образцом тканевой биопсии опухоли. Более того, это обеспечивает осуществление контроля пациента в ходе и/или после лечения и, главное, обеспечивает более раннее выявление рецидива и/или развития злокачественной опухоли яичника (или других экспрессирующих НЕ4 опухолей).

Согласно способам в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения концентрация антитела против НЕ4 измеряется в биологическом образце, полученном от человека. Для измерения концентрации антитела против НЕ4 может быть использован любой иммуноанализ, например, иммуносорбентные анализы с иммобилизированными ферментами (ELISA) и радиоиммуноанализы (RIA), вестрен-блоттинг, анализ FACS и т.п.Более предпочтительно с помощью анализа можно будет получать количественные результаты. Биологический образец может быть разбавлен в приемлемом буфере перед анализом, например, образец может быть разбавлен фактором по меньшей мере 1:2, 1:5, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:80, 1:100, 1:200 или более.

В одном варианте осуществления присутствие или количество антитела против НЕ4 в биологическом образце определяют путем контактирования биологического образца с полипептидом НЕ4, кодируемым полинуклеотидом, который селективно гибридизуется с последовательностью, по меньшей мере на 80% идентичной (например, по меньшей мере на 85% идентичной или по меньшей мере на 90% идентичной, или по меньшей мере на 95% идентичной, или по меньшей мере на 99% идентичной) SEQ ID NO: 1, или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере 20 последовательных нуклеотидов (или по меньшей мере 25 или 30, или по меньшей мере 40, 60 или 80 последовательных нуклеотидов) из SEQ ID NO: 1.

В другом варианте осуществления присутствие или количество антитела против НЕ4 в биологическом образце определяют путем контактирования биологического образца с полипептидом НЕ4, по меньшей мере на 80% идентичным (например, по меньшей мере ан 85% идентичным или по меньшей мере на 90% идентичным, или по меньшей мере на 95% идентичным, или по меньшей мере на 99% идентичным) растворимому родственному НЕ4 белку человека, представленному SEQ ID NO: 2, или его фрагменту, содержащему по меньшей мере 10 последовательных аминокислотных остатков (или по меньшей мере 20, или по меньшей мере 30, например, по меньшей мере 50 последовательных аминокислотных остатков) из SEQ ID NO: 2.

Фрагмент полипептида НЕ4 характеризуется аминокислотной последовательностью, содержащей меньше аминокислот, чем полноразмерная аминокислотная последовательность НЕ4, изложенная в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления фрагмент может содержать N-концевой домен - N-WFDC. Как показано на фиг. 2, N-WFDC (SEQ ID NO: 5) простирается от аминокислоты 31 до аминокислоты 75 из SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления фрагмент может включать в себя С-концевой домен - C-WFDC. Как показано на фиг. 2, C-WFDC (SEQ ID NO: 6) простирается от аминокислоты 76 до аминокислоты 124 из SEQ ID NO: 2. Другие типичные фрагменты НЕ4 могут включать в себя полипептиды, характеризующиеся аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности, простирающейся от положения 31 до 52 (SEQ ID NO: 7); от положения 42 до 63 (SEQ ID NO: 8); от положения 53 до 75 (SEQ ID NO: 9); от положения 76 до 100 (SEQ ID NO: 10); от положения 89 до 102 (SEQ ID NO: 11); от положения 89 до 112 (SEQ ID NO: 12) или от положения 101 до 124 (SEQ ID NO: 13) из SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления фрагменты НЕ4 могут охватывать домены N-WFDC и C-WFDC. Типичные фрагменты включают в себя полипептиды, характеризующиеся аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности, простирающейся от положения 53 до 100 (SEQ ID NO: 4) из SEQ ID NO: 2. Фрагментом, содержащим по меньшей мере 20 последовательных нуклеотидов (или по меньшей мере 25, или 30, или по меньшей мере 40, 60 или 80 последовательных нуклеотидов) из SEQ ID NO: 1, может быть, например, фрагмент из SEQ ID NO: 1, который кодирует SEQ ID NO: 5-13.

Антитела против НЕ4 в соответствии с настоящим изобретением специфично связываются с эпитопом на полипептиде НЕ4. Эпитоп означает антигенную детерминанту на мишени, которая специфично связана с помощью паратопа, т.е. связывающего сайта антитела. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи Сахаров, и, как правило, обладают специфичными трехмерными структурными характеристиками, а также специфичными зарядными характеристиками. Эпитопы обычно содержат от приблизительно 4 до приблизительно 10 смежных аминокислот (непрерывный эпитоп) или в качестве альтернативы могут быть совокупностью из несмежных аминокислот, которые определяют особенную структуру (например, конформационный эпитоп). Таким образом, эпитоп может состоять по меньшей мере из 4, по меньшей мере 6, по меньшей мере 8, по меньшей мере 10 и по меньшей мере 12 таких аминокислот. Способы выявления пространственной конформации аминокислот известны в уровне техники и включают в себя, например, рентгеновскую кристаллографию и 2-мерный ядерный магнитный резонанс.

Связывание антител против НЕ4 может быть проанализировано с использованием стандартных способов. Способ картирования эпитопов хорошо известен в уровне техники. Тип эпитопов, т.е. линейные или конформационно-зависимые эпитопы, может быть определен путем сравнения реакционной способности антител по отношению к денатурированному и редуцированному НЕ4 с таковой антител против НЕ4, который не был денатурирован и редуцирован. Реакционная способность антител против НЕ4 по отношению к фаговым слитым белкам может быть использована для идентификации связывания со специфичными фрагментами НЕ4. Такие способы описаны в примере 4 и в PCT/US11/25321, которая включена в настоящий документ полностью посредством ссылки.

Специфично связывающимися антителами могут быть антитела, которые 1) проявляют пороговый уровень активности связывания и/или 2) главным образом не вступают в перекрестные реакции с известными родственными полипептидными молекулами. Рядовой специалист в данной области легко определит аффинность связывания антитела, например, с помощью анализа Скэтчарда (Scatchard, Ann. NYAcad, Sci. 51:660-672, 1949).

В некоторых вариантах осуществления антитела против НЕ4 могут связываться больше по меньшей мере в 1,5 раза, 2 раза, 5 раз, 10 раз, 100 раз, 10³ раз, 10⁴ раз, 10⁵ раз, 10⁶ раз или более с мишеневыми эпитопами или имитационными ловушками НЕ4, чем с другими белками, предположительно обладающими некоторой гомологией с НЕ4.

В некоторых вариантах осуществления антитела против НЕ4 связываются с высокой аффинностью 10^-4 М или менее, 10^-7 М или менее, 10^-9 М или менее или с субнаномолярной аффинностью (0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 нМ или даже меньше). В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания антител составляет по меньшей мере 1×10⁶ Ka, по меньшей мере 5×10⁶ Ka, по меньшей мере 1×10⁷ Ka, по меньшей мере 2×10⁷ Ka, по меньшей мере 1×10⁸ Ka или больше. Антитела также могут быть описаны или определены на основе их аффинности связывания с НЕ4. В некоторых вариантах осуществления аффинности связывания включают в себя таковые с Kd менее чем 5×10^-2 М, 10^-2 М, 5×10^-3 М, 10^-3 М, 5×10^-3 М, 10^-4 М, 5×10^-5 М, 10^-5 М, 5×10^-6 М, 10^-6 М, 5×10^-7 М, 10^-7 М, 5×10^-8 М, 10^-8 М, 5×10^-9 М, 5×10^-10 М, 10^-10 М, 5×10^-11 М, 10^-11 М, 5×10^-12 М, 10^-12 М, 5×10^-13 М, 10^-13 M, 5×10^-14 М, 10^-14 М, 5×10^-15 М или 10^-15 М, или меньше.

В одном варианте осуществления присутствие или количество антитела против НЕ4 измеряется в биологическом образце путем применения анализа ELISA. Стандартные форматы твердофазного ELISA особенно применимы при выявлении концентрации белка или антитела из ряда биологических образцов, таких как сыворотка крови. В одной форме такой анализ включает в себя иммобилизирование полипептида НЕ4 или его фрагмента на твердой матрице, такой как, например, полистирольная или поликарбонатная микролунка или индикаторная полоска, мембрана или стеклянная подложка (например, предметное стекло). Может быть использована, например, покрытая НЕ4 лунка планшета для ELISA. Биологический образец приводится в контакт с покрытой НЕ4 лункой, и антитело против НЕ4 в образце связывается и захватывается. После связывания и промывки для удаления неспецифично связанных иммунных комплексов выявляется комплекс антитело-антиген. Выявление может быть выполнено любым приемлемым способом, таким как добавление второго антитела, связанного с меткой.

Согласно различным вариантам осуществления способов в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения эталонное значение антитела против НЕ4 может быть получено из контрольной группы очевидно здоровых субъектов, например, как описано в примерах 2 и 3. В некоторых вариантах осуществления эталонное значение антитела выявляется в анализе ELISA с использованием полученной от здоровых субъектов сыворотки крови, разбавленной по меньшей мере 1:20. В одном варианте осуществления эталонное значение антитела выявляется с использованием сыворотки крови, полученной от пациентов, у которых диагностировали злокачественную опухоль, предусматривающую экспрессирующие НЕ4 опухолевые клетки, и/или которых ранее лечили от такового. Типичный анализ ELISA для выявления содержаний антител против НЕ4 в образах крови описывается в примере 2.

Согласно прогностическим применениям в соответствии с настоящим изобретением в одном варианте осуществления содержание антитела против НЕ4 в биологическом образце, полученном от пациента со злокачественной опухолью яичника, затем сравнивается с эталонным значением антитела. Если концентрация антител у тестируемого пациента выше эталонного значения, например, по меньшей мере в 1,5 раза, более предпочтительно по меньшей мере в два раза или выше, со значением Р менее 0,05, и пациент ранее получал лечение от злокачественной опухоли яичника, тогда пациент характеризуется пониженной вероятностью рецидива злокачественной опухоли яичника. Если концентрация антител у пациента со злокачественной опухолью яичника ниже эталонного значения, например, по меньшей мере в 1,5 раза или в два раза или ниже, со значением Р менее 0,05, и пациент ранее получал лечение от злокачественной опухоли яичника, тогда пациент характеризуется повышенной вероятностью рецидива злокачественной опухоли яичника. В другом варианте осуществления присутствие антитела против НЕ4 выявляется путем сравнения с отрицательным контрольным образцом антитела, а также необязательно с положительным контрольным образцом антитела.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к способу оценивания прогноза человека со злокачественной опухолью, страдающего от экспрессирующей НЕ4 опухоли. Способ предусматривает (а) определение присутствия или количества антител против НЕ4 в биологическом образце от человека, страдающего экспрессирующей НЕ4 опухолью, путем контактирования биологического образца с полипептидом, кодируемым полинуклеотидом, который селективно гибридизуется с последовательностью, по меньшей мере на 80% идентичной, например, по меньшей мере на 90% идентичной, последовательности, содержащей по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 1; (b) определение присутствия или количества растворимых родственных НЕ4 пептидов (SHRP), кодируемых полинуклеотидом, который селективно гибридизуется с последовательностью, по меньшей мере на 80%, например, по меньшей мере на 90%, идентичной последовательности, содержащей по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 1, в биологическом образце от человека, тестируемого на этапе (а); и (с) сравнение количества антител против НЕ4, определенных на этапе (а), с эталонным содержанием антител и сравнение количества SHRP, определенного на этапе (b), с эталонным содержанием антител, при этом выявление SHRP в образце в количестве, ниже эталонного содержания антител, в комбинации с выявлением антител против НЕ4 в образце в количестве, выше эталонного содержания антител, свидетельствует о благоприятном прогнозе для пациента.

В соответствии с этим аспектом настоящего изобретения способ предусматривает этап определения присутствия и/или количества SHRP в биологическом образце, полученном от пациента, страдающего экспрессирующей НЕ4 опухолью, например, от пациента со злокачественной опухолью яичника. Как описано выше, SHRP является растворимым белком, который был обнаружен в кровотоке и здоровых, и больных злокачественной опухолью. Присутствие или количество SHRP может быть определено с использованием любого анализа, с помощью которого возможно выявление и/или измерение количества полипептида SHRP.

В соответствии с одним вариантом осуществления в биологическом образце измеряется концентрация полипептида SHRP, кодируемого полинуклеотидом, который селективно гибридизуется с последовательностью, по меньшей мере на 80% идентичной (например, по меньшей мере на 85% идентичной или по меньшей мере на 90% идентичной, или по меньшей мере на 95% идентичной, или по меньшей мере на 99% идентичной) SEQ ID NO: 1, или ее фрагментом, содержащим по меньшей мере 20 последовательных нуклеотидов (или по меньшей мере 25, или 30, или по меньшей мере 40, 60 или 80 последовательных нуклеотидов) из SEQ ID NO: 1.

В другом варианте осуществления в биологическом образце измеряется количество полипептида SHRP, по меньшей мере на 80% идентичного (например, по меньшей мере на 85% идентичного или по меньшей мере на 90% идентичного, или по меньшей мере на 95% идентичного, или по меньшей мере на 99% идентичного) растворимому родственному НЕ4 белку человека, представленному как SEQ ID NO: 2, или его фрагменту, содержащему по меньшей мере 10 последовательных аминокислотных остатков (или по меньшей мере 20, или по меньшей мере 30, например, по меньшей мере 50 последовательных аминокислотных остатков) из SEQ ID NO: 2.

Концентрация и/или относительное количество, или присутствие растворимого родственного НЕ4 белка (SHRP) в образце биологической жидкости могут быть определены с использованием любого подходящего способа измерения SHRP, в том числе без ограничения ELISA, радиоиммуноанализа, хемилюминесцентного анализа, иммунофлуоресцентного окрашивания и т.п., который учитывает антитело, специфично связывающееся с SHRP. Для измерения SHRP также могут быть использованы другие способы выявления белка, в том числе масс-спектроскопия, вестерн-блоттинг, FACS и т.п.Приемлемые биологические образцы включают в себя биологическую жидкость, выбранную из группы, состоящей из крови, плазмы, сыворотки крови, асцитической жидкости и мочи.

Специфичные антитела, в том числе моноклональные антитела, направленные против SHRP, и их варианты, могут быть легко получены с использованием стандартных методик и могут быть использованы в таких способах. Например, для выявления SHRP в сыворотке крови может быть использован анализ двойной детерминантный («сэндвич») ELISA с использованием двух MAb - 2Н5 и 3D8 (которые распознают два разных эпитопа на одном и том же антигене), как описано в Hellstrom, I., et al., Cancer Research 63:3695-3700 (2003). Для выявления одного или нескольких вариантов НЕ4 могут быть использованы другие анализы ELISA с использованием описанных выше антител или других антител против НЕ4.

Согласно различным вариантам осуществления способов в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения эталонное значение антигена SHRP может быть получено от контрольной группы явно здоровых субъектов; например, как описано в примере 3. В некоторых вариантах осуществления эталонное значение антигена выявляется анализом ELISA с использованием сыворотки крови, полученной от здоровых субъектов. Например, в образце сыворотки крови сыворотка крови может быть разбавлена до 1:100 и измерена анализом ELISA, при этом отрицательный контроль, полученный от здорового субъекта, дает значение поглощения<0,2, а положительный контроль, полученный от больной злокачественной опухолью яичника, дает значение поглощения > 0,2. См. Hellstrom, I., et al., Cancer Research 63:3695-3700 (2003). Значения поглощения могут быть определены любым способом, известным в уровне техники. Как правило, используется, например, поглощение света при 450 нанометрах, часто называемое оптической плотностью (OD). В одном варианте осуществления эталонное значение антигена выявляется с использованием сыворотки крови, полученной от пациентов, у которых диагностирована злокачественная опухоль, характеризующаяся экспрессирующими НЕ4 опухолевыми клетками, и/или которых ранее лечили от таковой.

В некоторых вариантах осуществления способы в соответствии с настоящим изобретением дополнительно предусматривают этап определения уровней другого маркера злокачественной опухоли яичника, такого как интегрин-связанная киназа (INK), CA125, TADG-12, калликреин 10, простазин, остеопонтин, креатин-киназа-бета, серотрансферрин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов липокалин (NGAL), CD 163 или Gc-глобулин, в биологическом образце, полученном от субъекта. Второй маркер может быть выявлен на уровне ДНК, РНК или белка с использованием традиционных способов, известных в уровне техники.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к способу контроля эффективности лечения человека с диагнозом экспрессирующей НЕ4 опухоли. Способ предусматривает (а) определение первой концентрации антител против НЕ4-мезотелина в первом биологическом образце, взятом от человека с диагнозом экспрессирующей НЕ4 опухоли до начала лечения от злокачественной опухоли; (b) определение второй концентрации антител против НЕ4 во втором биологическом образце от пациента, взятом после начала лечения от злокачественной опухоли; и (с) сравнение первой и второй концентраций антител против НЕ4, при этом увеличение второй концентрации антител против НЕ4 по сравнению с первой концентрацией антител против НЕ4, измеренной в первом биологическом образце, показывает положительный ответ на лечение от злокачественной опухоли.

Согласно способу в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения первый биологический образец забирается от пациента со злокачественной опухолью перед началом лечения, а второй биологический образец забирается от пациента по меньшей мере один раз после начала лечения. В некоторых вариантах осуществления у субъекта (например, субъекта на доклиническом испытании) забирается несколько опытных биологических образцов с периодическими временными интервалами после начала лечения.

Используемый в настоящем документе термин «лечение» означает хирургическое вмешательство или введение одного или нескольких средств, ингибирующих злокачественную опухоль, для облегчения симптомов, ассоциированных со злокачественной опухолью, или для остановки следующего развития или ухудшения симптомов. Например, успешное лечение может включать в себя устранение опухоли, такой как экспрессирующая НЕ4 опухоль; облегчение симптомов или остановку развития заболевания, как измерено снижением скорости роста опухоли; остановку роста опухоли; снижение размера опухоли; частичную или полную ремиссию злокачественной опухоли, или повышенную выживаемость, или клиническую пользу. Например, лечение субъекта, страдающего экспрессирующей НЕ4 опухолью, может предусматривать одно или несколько из следующего:

хирургическое вмешательство для удаления одной или нескольких опухолей и/или применение терапевтического средства, такого как химиотерапия, лучевая терапия, белковые терапевтические средства (например, антитела, генная терапия, терапия вакциной от злокачественной опухоли, трансплантация стволовых клеток или другой тип терапии).

Например, по отношению к лечению от злокачественной опухоли яичника хирургическое вмешательство является предпочтительным лечением. Тип хирургического вмешательства зависит от того, насколько широко было распространена злокачественная опухоль при диагностировании (стадия злокачественной опухоли), а также от типа и степени злокачественной опухоли. Хирург может удалить один (односторонняя овариэктомия) или оба яичника (двусторонняя овариэктомия), фаллопиевы трубы (сальпингэктомия) и матку (гистерэктомия). При некоторых очень ранних опухолях (стадия 1, низкая степень или низкий риск заболевания) будет удален только затронутый яичник и фаллопиева труба (так называемая «односторонняя сальпинго-овариэктомия» или «USO»), особенно у молодых женщин, которые желают сохранить свою фертильность. На поздних стадиях заболевания опухоль насколько возможно удаляется (циторедуктивное хирургическое вмешательство). В случаях, когда этот тип хирургического вмешательства успешный, прогноз улучшается по сравнению с больными, у которых оставлены большие массы опухоли (более 1 см в диаметре). Химиотерапия, как правило, используется после хирургического вмешательства для лечения какого-либо остаточного заболевания. Химиотерапевтические средства, такие как производные платины (например, таксан), могут быть введены системно или могут быть введены внутриперитонеально путем прямой инфузии в брюшную полость. Другие примеры терапевтических средств для применения при лечении злокачественной опухоли яичника включают в себя без ограничения белковые терапевтические средства (например, антитела), генную терапию, терапию вакциной от злокачественной опухоли и трансплантации стволовых клеток. Способы в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения также могут быть использованы для измерения эффективности кандидатных терапевтических средств для лечения злокачественной опухоли яичника.

Способы в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения также могут быть использованы для определения клинического статуса пациента после проведения лечения, такого как хирургическое вмешательство для удаления опухоли. В соответствии с этим вариантом осуществления содержание антитела против НЕ4 в биологическом образце, полученном от пациента со злокачественной опухолью, который получил лечение от экспрессирующей НЕ4 опухоли, затем сравнивается с эталонным значением антитела. Если концентрация антител у тестируемого пациента выше эталонного значения, например, по меньшей мере в 1,5 раза, более предпочтительно по меньшей мере в два раза или больше, со значением Р менее 0,05, то ожидается, что клинический статус пациента улучшится при лечении (т.е. у пациента снижена вероятность рецидива злокачественной опухоли яичника). Если концентрация антитела у получавшего лечение пациента со злокачественной опухолью ниже эталонного значения, например, по меньшей мере в 1,5 раза, более предпочтительно по меньшей мере в два раза или ниже, со значением Р менее 0,05, то ожидается, что клинический статус пациента не улучшится при лечении (т.е. у пациента повышена вероятность рецидива злокачественной опухоли яичника).

В соответствии с другим аспектом представлен набор для выявления присутствия экспрессирующих НЕ4 клеток у человека. Набор содержит специфичные реагенты для выявления антител против НЕ4 в биологическом образце, полученном от человека, и напечатанные инструкции для сравнения выявленного присутствия или количества антител против НЕ4 с эталоном. Описанные в настоящем документе способы выявления антител против НЕ4 могут быть выполнены с использованием наборов в соответствии с настоящим изобретением. В одном варианте осуществления набор содержит проявляющий реагент для выявления антител против НЕ4, содержащий полипептид НЕ4, кодированный полинуклеотидом, селективно гибридизующимся с последовательностью, которая по меньшей мере на 80% идентична, или по меньшей мере на 90% идентична или по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% идентична последовательности, содержащей по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления набор содержит проявляющий реагент для выявления антител против НЕ4, содержащий полипептид НЕ4, который по меньшей мере на 80% идентичен или по меньшей мере на 90% идентичен, или по меньшей мере на 95% идентичен, или по меньшей мере на 98% идентичен, или по меньшей мере на 99% идентичен аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере 10 смежных аминокислот из SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления набор содержит полипептид НЕ4 или его фрагмент, который иммобилизирован на твердой матрице, такой как, например, полистирольная или поликарбонатная микролунка или индикаторная полоска, мембрана или стеклянная подложка (например, предметное стекло). Например, может быть использована покрытая НЕ4 лунка планшета для ELISA, в которой биологический образец приводится в контакт с покрытой НЕ4 лункой, и антитело против НЕ4 в образце связывается и захватывается.

В некоторых вариантах осуществления набор, кроме того, содержит эталон, выбранный из группы, состоящей из специфичного цифрового порога, образца отрицательного контроля для конкурентной оценки или статистической информации, соотносящей выявленное количество антител против НЕ4 с вероятностью присутствия экспрессирующих НЕ4 раковых клеток у субъекта. В некоторых вариантах осуществления эталоном является образец отрицательного контроля, и при этом в набор включен образец отрицательного контроля.

В предпочтительных вариантах осуществления способы и наборы в соответствии с настоящим изобретением можно применять в месте оказания медицинской помощи, таком как медицинская клиника (например, врачебный кабинет) или госпиталь, для быстрого получения результатов теста. Тестирование в месте оказания медицинской помощи (РОСТ) предполагает выполнение сотрудником любого госпиталя или медицинской клиники (врачебного кабинета) какого-либо типа лабораторного теста за пределами центральной лаборатории. РОСТ радикально изменило континуум оказания медицинской помощи пациенту путем предоставления эффективных результатов лабораторных исследований у постели пациента для различных тестов, таких как тестирование на ВИЧ, тест-полоска для анализа мочи и т.п. Например, были разработаны экспресс-тесты для выявления антител против ВИЧ, которые демонстрируют чувствительность и специфичность, сравнимые с таковыми иммуноферментных анализов, без необходимости сложного лабораторного оборудования и высококвалифицированных специалистов. РОСТ может быть использован с образцами необработанной цельной крови или оральной жидкости. См. Branson, B.M., J. Lab. Medicine 27(7/8):288-295 (2003). Анализы РОСТ могут представлять собой анализы любого формата, который обеспечивает экспресс-тестирование, такое как агглютинация частиц, иммуноконцентрация и иммунохроматография.

Например, анализы РОСТ агглютинации частиц для выявления антител против НЕ4 могут быть выполнены путем смешивания образца пациента, содержащего антитела против НЕ4, с латексными частицами, покрытыми полипептидом НЕ4 (антигеном), и если антитело против НЕ4 присутствует, происходит сшивание за 10-60 минут, что приводит к агглютинации с результатами, интерпретируемыми визуально.

В другом примере формата анализа РОСТ для выявления антител против НЕ4 может быть использовано устройство для иммуноконцентрации (проточное), в котором применяется технология твердофазного захвата, которая предусматривает иммобилизацию полипептидов НЕ4 (антигенов) на пористой мембране. Образец больного протекает сквозь мембрану и абсорбируется на абсорбентной прокладке. Если в образце присутствуют антитела против НЕ4, на мембране заметно образование точки или линии при проявлении с индикаторным реагентом (например, коллоидным золотом или конъюгатом селена). В мембрану также может быть включен процедурный контроль.

В еще одном примере формата анализа РОСТ для выявления антител против НЕ4 могут быть использованы иммунохроматографические (растекание в радиальном направлении) полоски, которые включают и антиген (НЕ4), и индикаторный реагент на нитроцеллюлозной полоске. Образец больного наносится на абсорбентную прокладку, или образец может быть разбавлен в емкости с буфером, в который погружается тестовое устройство. Образец перемещается по полоске и смешивается с индикаторным реагентом. Положительная реакция дает в результате визуальную линию на мембране, куда был нанесен антиген НЕ4. Кроме линии антигена НЕ4 на полоску может быть нанесена линия процедурного контроля.

Следующие примеры лишь иллюстрируют лучший способ, предусмотренный для осуществления настоящего изобретения, но не должны рассматриваться как ограничение настоящего изобретения.

Пример 1

В этом примере описывается получение и очистка рекомбинантного белка эпидидимуса человека 4 (НЕ4) в клетках яичника китайского хомячка (СНО).

Способы

Конструкция плазмиды HE4-CIHDpa

Рекомбинантный белок НЕ4 (SEQ ID NO: 2) получали следующим образом.

Фрагмент кДНК, кодирующий белок эпидидимуса человека 4 (НЕ4) (SEQ ID NO: 2), амплифицировали с помощью высоко точной полимеразной цепной реакции с использованием следующих праймеров.

Прямой смысловой праймер

5'-AAAAACCGGTATGCCTGCTTGTCGCCTAGG-3' (SEQ ID NO: 3) конструировали для введения сайта распознавания фермента рестрикции Age 1 на 5'-конце подходящего для клонирования гена.

Обратный антисмысловой праймер

5'-AAAACCTGCAGGTCAGAAATTGGGAGTGACAC-3', (SEQ ID NO: 4) конструировали для введения сайта распознавания фермента рестрикции Sbf I на 3'-конце подходящего для клонирования гена.

Амплифицированный фрагмент ДНК, содержащий кДНК НЕ4, расщепляли с Age I и SbfI и клонировали в вектор экспрессии млекопитающего CIHDpa (путем замены на фрагмент НЕ4). Вектор CIHDpa, предоставленный Dr. Say Kong Ng Национального университета Сингапура, использует дестабилизирование последовательностей на маркере отбора для улучшенного продуцирования рекомбинантного белка в клетках CHO-DB44, как описано в Ng et al., Metab Eng 9:304 (2007)), включенной в настоящий документ посредством ссылки. Вкратце, вектор экспрессии CIHDpa содержит стандартный промотор цитомегаловируса (CMV) в3'-5'-направлении сайта вставки кДНК. Промотор тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV-th) расположен в 3'-5'-направлении гена дигидрофолатредуктазы (dhfr), который служит маркером отбора для успешных трансфектантов (т.е. для выживания лишенных dhfr клеток требуются добавки гипоксантина и тимидина). Непосредственно в 5'-3'-направлении после маркера dhfr следует участок орнитиндекарбоксилазы мышевидных PEST (MODC PEST) и ряды богатых AU элементов (ARE), которые экспрессируются как слитые компоненты на карбокси-конце белка dhfr. Пептид MODC PEST служит сигналом деградации, приводящим к нестабильности маркерного белка. Участок ARE служит для дестабилизации мРНК, кодирующей маркерный белок. С маркером dhfr, дестабилизированным на уровнях транскрипция и трансляции, будут выживать только трансфицированные клетки, которые характеризуются высоко эффективным продуцированном кодируемых плазмидой белков, что, таким образом, приводит к улучшенному продуцированию рекомбинантного белка НЕ4 после отбора.

Полученный в результате вектор экспрессии, содержащий НЕ4, обозначенный «HE4-CIHDpa», подтверждали анализом ферментов рестрикции, а также подтверждали вставленную кДНК НЕ4 с помощью секвенирования полной вставки кДНК.

Трансфекция плазмиды HE4-CIHDpa в клетки яичника китайского хомячка (СНО)

Лишенные дигидрофолатредуктазы (DHFR-) клетки яичника китайского хомячка (CHO-DG44) выращивали на не содержащей сыворотку крови среде СНО (Hyclone, Logan, Utah; SH30333) при 37°C, 5% CO₂. Высевали 0,5 миллиона или 1 миллион клеток CHO-DG44 в каждую лунку 24-луночного планшета с 500 мкл не содержащей сыворотку крови среды на лунку и инкубировали в течение ночи при описанных выше условиях. Комбинировали 1 мкг или 5 мкг не содержащей эндотоксин плазмиды HE4-CIHDpa с 2 мкл Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen) в 100 мкл не содержащей сыворотку крови среды Opti-MEM. После инкубации в течение 20 минут добавляли комплекс ДНК-Lipofectamine™ в каждую лунку, содержащую клетки CHO-DG44. Затем клетки переносили на гипоксантин и тимидин («НТ») - дополненную НТ среду HyQ PF-CHO - и обеспечивали восстановление в течение 2 суток перед перенесением на среду HyQ PF-CHO без добавки НТ для отбора трансфектантов. Через 28 суток на селективной среде 1 миллион клеток трансфицировали 1 мкг плазмиды, наращивали и извлекали с жизнеспособностью клеток>95%.

Получение и очистка белка НЕ4 с помощью трансфицированных клеток СНО

Получение белка НЕ4 в культуральных супернатантах из трансфицированных плазмидой HE4-CIHDpa клеток СНО оценивали с использованием коммерчески доступного набора, продаваемого фирмой Fujirebio Diagnostics, Inc., который основан на анализе двойного детерминантного («сэндвич») ELISA, как описано в Hellstrom I., et al., Cancer Research 63:3695-3700 (2003), включенном в настоящий документ посредством ссылки.

Как описано у Hellstrom et al. (2003), моноклональным Ab 3D8 (специфичным для одного эпитопа на НЕ4) покрывали в течение ночи лунки аналитического планшета, после чего в клетки добавляли 100 мкл супернатанта из трансфицированной плазмидой HE4-CIHDpa культуры СНО в клетки и инкубировали в течение 1 часа. Затем аналитический планшет инкубировали с биотинилированным вторым моноклональным АЬ против НЕ4 - 2Н5 (специфичным для другого эпитопа НЕ4) в течение 1 часа.

Добавляли ТМВ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин), хромогенный субстрат для пероксидазы (KPL, Gaithersburg, MD), и обеспечивали инкубирование в течение 15 минут. Считывания оптической плотности (OD) осуществляли при 450 нм. OD450 супернатанта СНО составляла 3,1 по сравнению с 0,078 для среды отдельно, что показывает высокую экспрессию белка НЕ4 клетками СНО и секретирование его в культуральную среду.

Очистка рекомбинантного белка НЕ4 с помощью аффинной хроматографии

Рекомбинантный белок НЕ4 очищали из высоко продуцирующих линий трансфицированных плазмидой HE4-CIHDpa клеток СНО с помощью аффинной хроматографии, как изложено ниже.

Моноклональные Ab против НЕ4 3D8 и 2Н5 соединяли с активированной N-гидроксисукцинимидным эфиром 6-аминогексановой кислоты сефарозой 4 В (Sigma, St. Louis, Missouri; #A9019). Вкратце, 0,5 г порошка размачивали в 1 мМ HCl в течение 15 минут. Гранулы сушили и повторно суспендировали в 3 мг моноклонального Ab против НЕ4 в 1 мл раствора 0,5 М NaCl/0,1 M NaHCOa (pH 8,3). Колонку хранили при 4°C в течение ночи. На следующий день смолу блокировали с помощью 1 М трис-HCl в течение 2 часов. Несвязанное моноклональное Ab против НЕ4 удаляли промывкой смолы фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). Собирали супернатант крупномасштабных культур трансфицированных плазмидой HE4-CIHDpa клеток СНО и pH регулировали с помощью NaHCO₃ до pH 8,0. Отрегулированный клеточный супернатант наносили на колонку, связанный белок НЕ4 элюировали 0,1 М глицин-HCl (pH 2,7) и нейтрализовали с помощью 200 мкл 2 М трис-HCl. Элюированный белок НЕ4 концентрировали с помощью 10 кДа центрифужной фильтровальной пробирки (Millipore, Billerica, MA). Очищенный в колонке рекомбинантный белок НЕ4 анализировали с помощью сэндвич-ELISA, который выполняли, как описано выше. Результаты анализов ELISA показаны ниже в таблице 1.

Таблица 1 Присутствие белка НЕ4, определяемое с помощью сэндвич-ELISA Образцы Фактор разбавления OD450 Неочищенный супернатант СНО (т.е. перед очисткой с помощью колонки) неразбавленный 2,832 Контроль - среда СНО неразбавленный 0,110 Очищенный с помощью колонки белок НЕ4 (0,1 мкг) неразбавленный 3,432

Очищенный с помощью колонки рекомбинантный белок НЕ4 человека, полученный из клеток СНО, получали, как описано выше, и объединяли для применения в разработке анализа ELISA для выявления антитела против НЕ4 в образцах больного, как описано в примере 2. Рекомбинантный белок НЕ4 человека также тестировали в анализах ELISA на связывание с антителами мыши против НЕ4 и выявили, что антитела мыши против НЕ4 распознавали и нативный, и рекомбинантный белок НЕ4 человека (данные не показаны).

Заключение

Эти результаты показывают успешное клонирование, экспрессию и очистку рекомбинантного белка НЕ4 человека из клеток СНО.

Пример 2

В этом примере описывается успешная разработка анализа ELISA, допускающего выявление человеческих антител против НЕ4 природного происхождения в сыворотке крови человека.

Способы

Разработка анализа ELISA для выявления антител против НЕ4

Разрабатывали анализ ELISA для выявления/измерения количества антител против НЕ4 в сыворотке крови, как описано ниже. Лунки планшета для анализа ELISA покрывали 0,6 мкг/мл очищенного рекомбинантного белка НЕ4 человека (полученного, как описано в примере 1) в течение ночи. Парные лунки оставляли непокрытыми в качестве контролей для фона. После блокирования в течение 2 часов с 3% BSA/PBS, во все лунки планшета для анализа ELISA добавляли сыворотку крови или плазму человека при разведениях 1:20 и 1:40 (полученных, как описано ниже). Все разведения и образцов, и реагентов выполняли в 3% BSA/PBS.

После инкубирования с конъюгированным с HRP антителом мыши против IgG человека и субстратом ТМВ аналитический планшет сканировали на устройстве для считывания планшетов Dynatech MR 5000 при 450 нм. Фоновый контроль (адгезивность из-за природной способности IgG неспецифично прилипать к контрольным лункам планшета для анализа ELISA) измеряли как OD450 в параллельных контрольных лунках (к которым антиген не присоединялся) и значения фонового контроля вычитали из данных считывания покрытых лунок с получением окончательного содержания IgG.

Образцы плазмы, полученные от пациентов со злокачественной опухолью яичника

Выполняли предварительное исследование, для которого образцы плазмы получали от десяти пациентов со злокачественной опухолью яичника, у большинства из которых заболевание было запущенным (стадия III-IV), и от одной здоровой женщины, проводили тестирование на антитела против НЕ4 с помощью анализа ELISA для определения присутствия антител против НЕ4 природного происхождения. В каждую лунку планшета для ELISA добавляли образцы плазмы человека при разведениях 1:20 и 1:40 и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Лунки промывали с помощью PBS-Tween 20, а затем в каждую лунку добавляли разведенное 1:1000 конъюгированное с HRP антитело мыши против IgG человека (Invitrogen, Carlsbad, California) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После этого опять промывали с помощью PBS-Tween 20, в каждую лунку добавляли пероксидазный субстрат SureBlue™ ТМВ Microwell (KPL) и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре, после чего взаимодействие останавливали добавлением стоп-реагента ТМВ (KPL). Оптическую плотность (OD) при 450 нанометрах измеряли с помощью устройства для считывания планшетов DynaTech MR 5000 (DynaTech Laboratories, Inc.).

Результаты

Результаты тестирования с помощью анализа ELISA присутствия/количества антител против НЕ4 из образцов сыворотки крови человека представлены на фиг.1. Как показано на фиг.1, у одного из десяти пациентов с карциномой яичника (субъект Не213) наблюдалась OD450≥1,0 при обоих разведениях, что, таким образом, показывает присутствие антител против НЕ4. Следует отметить, что плазма от пациента Не213 (с плазмой, которая была положительной по антителам против НЕ4), была отрицательной по отношению к присутствию антигена НЕ4, как выявили с использованием анализа на определение присутствия антигена НЕ4, как описано в патенте США №7270960, включенном в настоящий документ посредством ссылки (данные не показаны). Однако культивируемые опухолевые клетки, полученный из опухоли пациента Не213, как показали, экспрессировали антиген НЕ4 (данные не показаны).

Заключение

Описанные в этом примере результаты демонстрируют успешную разработку анализа ELISA, с помощью которого возможно выявление человеческих антител против НЕ4 натурального происхождения в сыворотке крови человека. Результаты также демонстрируют присутствие антител против НЕ4 у субъекта со злокачественной опухолью яичника. На основании предыдущего исследования антител к мезотелину в соответствии с настоящим изобретением (см. Hellstrom I. et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 17(6): 1520-1526 (2008)) ожидается, что повышение титра или присутствие антител против НЕ4, идентифицированного у пациентов со злокачественной опухолью яичника, которые получают или получали лечение (путем хирургического вмешательства, химиотерапии, облучения и/или иммунотерапии) либо отдельно, либо в комбинации с выявлением пониженного количества антигена НЕ4 (по сравнению с исходным количеством в начале лечения), или с отсутствием циркулирующего антигена НЕ4, будет указывать на эффективность терапии против злокачественной опухоли в разрушении опухоли. Кроме того, ожидается, что понижение титра антител против НЕ4 или отсутствие выявляемых антител против НЕ4 у пациентов со злокачественной опухолью яичника, получающих лечение либо отдельно, либо в комбинации с повышенным количеством циркулирующего антигена НЕ4, (по сравнению с исходным количеством в начале лечения) будет указывать на неэффективность терапии против злокачественной опухоли в разрушении опухоли и/или будет указывать на рецидив.

Пример 3

В этом примере описывается исследование, в котором разработанный для выявления присутствия/количества антител против НЕ4 анализ ELISA (описанный в примере 2) использовали для определения титра антитела против НЕ4, присутствующего в сыворотке крови от 3 пациентов с карциномой яичника и 20 здоровых контрольных женщин.

Способы

Образцы сыворотки крови, полученные от пациентов со злокачественной опухолью яичника

Как показано в таблице 2 ниже, в Онкологическом научном центре Fred Hutchinson (Seattle, Washington) получали образцы сыворотки крови от трех пациентов с карциномой яичника на ранней стадии (1/11) и 20 здоровых женщин, 4 из которых показаны в таблице 2 ниже. Сыворотку крови забирали у субъектов и анализировали с использованием способов, описанных в примере 2.

Результаты

Сыворотку крови, полученную, как описано выше, анализировали при разведениях 1:20 и 1:40 с использованием способа ELISA, описанного в примере 2. Результаты приведены в таблице 2 ниже.

Таблица 2 Результаты анализа антитела против НЕ4 в сыворотке крови от трех пациентов со злокачественной опухолью яичника и 4 здоровых контролей с использованием анализа ELISA на выявление/измерение антител против НЕ4 Код пациентки Клиническое заболевание/состояние OD450>0,500(по меньшей мере в разведении 1:20) 100С17 Карцинома яичника + 206241 Карцинома яичника + 208448 Карцинома яичника + 1 Контроль - здоровая женщина - 2 Контроль - здоровая женщина - 3 Контроль - здоровая женщина - 4 Контроль - здоровая женщина - 5-24 (общей сложностью из 24 здоровых контролей - женщин) Контроль - здоровая женщина 3 положительных/21 отрицательных (из 24 протестированных общей сложностью)

Как показано в таблице 2, все три образца сыворотки крови от пациентов с карциномой яичника и три из 24 образцов сыворотки крови от здоровых женщин характеризовались OD450>0,5 при разведении 1:20. Как показано в таблице 2, у всех из трех пациентов со злокачественной опухолью яичника имелись антитела против НЕ4 в их сыворотки крови, как показано с помощью OD450≥0,5 при разведении 1:20. Эти результаты согласуются с результатами, приведенными в примере 2, и дополнительно демонстрируют успешность разработки анализа ELISA, с помощью которого возможно выявление человеческих антител против НЕ4 натурального происхождения в сыворотке крови человека. Результаты также демонстрируют присутствие антител против НЕ4 у субъектов со злокачественной опухолью яичника и ранней, и поздней стадии.

Пример 4

Реакционная способность фрагментов НЕ4, показанных как фаговые слитые белки

Специфичность эпитопа антител против НЕ4 человека определяли путем тестирования реакционной способности образцов человека, которые проявляли реакционную способность против НЕ4 по отношению к фрагментам НЕ4, экспрессированным как слитые белки с фаговым белком оболочки pVIII в фаговом ELISA.

Клонирование фрагментов НЕ4 в f88-4

Полученная из мРНК, выделенной из клеток OvCar-3, кДНК служила матрицей для ПЦР-амплификции частей генов, кодирующих домены НЕ4, для клонирования в вектор f88-4 для фагового дисплея. Конструировали пары праймеров ПЦР, приведенные в таблице 3, для амплификации кодирующих участков, обозначенных на фиг. х. На 5′-концах находились сайты рестрикции для HindIII и PstI, вставленные для клонирования в слиянии с сигнальным пептидом pVIII и зрелым белком оболочки pVIII.

Фрагменты НЕ4 отдельно амплифицировали из 0,5 мкл кДНК в реакционной смеси, содержащей 1 мкМ каждого прямого и обратного праймеров, 75 мМ трис-HCl (рН 8,8 при 25°C), 20 мМ (NH₄)₂SO₄, 0,1% (объем/объем) Tween 20, 2 мМ MgCl₂, 0,02 единицы/мкл Taq-полимеразы (Abgene, Surrey, UK) и 0,1 мМ каждого дезоксинуклеотида в окончательном объеме 25 мкл, со следующим температурным циклом, повторяющимся 30 раз: 30 секунд инкубации при 95°С, 50°C и 72°С.

Продукты ПЦР и f88-4, расщепленные с помощью HindIII и PstI, связывали вместе и трансфицировали в JM109 Е. coli, где клоны затем отбирали на планшетах с LB с тетрациклином. Два клона из каждого конструкта амплифицировали в JM109 Е. coli и получали двухцепочечную ДНК для секвенирования ДНК. Секвенирование ДНК выполняли с использованием набора для циклического секвенирования BigDye terminator v1.1 и специфичного праймера вектора f88-4. Реакции секвенирования направляли в CyberGene AB (Huddinge, Sweden) для анализа. Первоначальные данные о последовательностях анализировали с использованием версии v1.45 свободного программного обеспечения Chromas (Technelysium Pty Ltd., Australia). Нуклеотидным секвенированием подтверждали вставку в рамку с лидерным пептидом и зрелым фаговым белком оболочки pVIII. Вставки НЕ4 демонстрировали идентичность с ожидаемыми последовательностями фрагмента НЕ4 (номер доступа AY212888). На фиг.2 показаны положения фрагментов НЕ4, экспрессированных как слитые белки с белком оболочки pVIII с использованием праймеров, показанных в таблице 1. Номера аминокислот относятся к положениям аминокислотной последовательности НЕ4, изложенной в SEQ ID NO: 2.

Фаговый ELISA

Фаговые клоны с подтвержденной последовательностью амплифицировали, очищали, концентрировали с PEG/NaCl и разбавляли в PBS для применения в качестве покрывающего антигена в прямом фаговом анализе ELISA или, в качестве альтернативы, в 1% BSA в PBS в качестве антигена в фаговом сэндвич-ELISA.

При прямом фаговом ELISA фаги фрагментов НЕ4 разбавляли в карбонатном буфере, рН 9,2, и наносили на лунки микротитровального планшета. Связывание человеческих антител против НЕ4 определяли после разбавления сыворотки крови больного в PBS-1% BSA и инкубации в планшетах, покрытых фагом НЕ4. Связанный hIg определяли путем инкубации с HRP-антителом против hIg.

При фаговом НЕ4 сэндвич-ELISA образцы пациентов разбавляли PBS-1% BSA и инкубировали в микротитровальных планшетах, покрытых антителом против IgG человека, для адсорбции hIgG. Покрытые планшеты инкубировали с различными фаговыми частицами pVIII НЕ4, добавленными в объеме 100 мкл/лунка. Через два часа инкубации лунки промывали и добавляли антитело кролика против М13 (установленное на месте). После инкубации и промывки добавляли меченное HRP антитело свиньи против иммуноглобулина кролика (Dako). После окончательного промывания добавляли субстрат ТМВ и планшет измеряли при 620 нм через 5 минут инкубации. В качестве отрицательного контроля в обоих анализах ELISA использовали фаг М-13 дикого типа.

Несмотря на то что был проиллюстрирован и описан предпочтительный вариант осуществления в соответствии с настоящим изобретением, будет понятно, что в нем могут быть выполнены различные изменения без отступления от идеи и объема настоящего изобретения.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использована для выявления риска развития стадии I/II карциномы яичника. Для этого способ предусматривает определение присутствия или количества человеческих антител против НЕ4 в биологическом образце, полученном от человека. При этом присутствие или количество антител против НЕ4 в биологическом образце свидетельствует о том, что субъект подвержен риску развития стадии I/II карциномы яичника. Группа изобретений относится также к способу контроля эффективности лечения человека со злокачественной опухолью, получающего терапевтическое лечение от экспрессирующей НЕ4 опухоли, и набору для выявления присутствия экспрессирующих НЕ4 клеток у субъекта человека. Использование данной группы изобретений позволяет обнаружить раннюю стадию I/II карциномы яичника путем обнаружения экспрессии антител против НЕ4, а также проводить контроль эффективности противораковой терапии, где увеличение уровня аутоантител против НЕ4 служит индикатором ответа на лечение пациента со злокачественной опухолью яичника.3 н. и 21 з.п. ф-лы, 4 пр., 2 ил., 3 табл.

1. Способ определения того, подвержен ли субъект человек риску развития стадии I/II карциномы яичника, при этом способ предусматривает определение присутствия или количества человеческих антител против НЕ4 в биологическом образце, полученном от человека, в котором присутствие или количество антител против НЕ4 в биологическом образце свидетельствует о том, что субъект подвержен риску развития стадии I/II карциномы яичника.

2. Способ по п. 1, в котором присутствие или количество антител против НЕ4 в биологическом образце определяют путем контактирования биологического образца с полипептидом, кодируемым полинуклеотидом, который селективно гибридизуется с последовательностью, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, содержащей по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 1.

3. Способ по п. 1, дополнительно предусматривающий сравнение определенного количества антител против НЕ4 с эталоном, в котором выявленное количество антитела против НЕ4, превышающее эталон, свидетельствует о присутствии экспрессирующих НЕ4 клеток у человека.

4. Способ по п. 1, дополнительно предусматривающий выполнение по меньшей мере одного дополнительного диагностического анализа для определения наличия у субъекта с антителами против НЕ4 риска развития стадии I/II злокачественной опухоли яичника.

5. Способ по п. 1, в котором связывание полипептида с антителом против НЕ4 предусматривает выявление сигнала, выбранного из группы, состоящей из радионуклида, флуорофора, явления связывания между молекулой авидина и молекулой биотина, явления связывания между молекулой стрептавидина и молекулой биотина, а также продукта ферментативной реакции.

6. Способ по п. 2, в котором количество антител против НЕ4 в биологическом образце определяют с использованием анализа ELISA.

7. Способ по п. 1, в котором биологическим образцом является биологическая жидкость, выбранная из группы, состоящей из крови, плазмы, сыворотки крови, асцитической жидкости, мочи, слюны, слез, плевральной жидкости, мокроты, влагалищной жидкости и промывок, полученных в ходе медицинской процедуры.

8. Способ по п. 1, дополнительно предусматривающий определение присутствия или количества растворимых родственных НЕ4 пептидов (SHRP) в биологическом образце, в котором присутствие или количество антител против НЕ4 в биологическом образце в комбинации с присутствием или количеством растворимых родственных НЕ4 пептидов свидетельствует о присутствии экспрессирующих НЕ4 клеток у человека.

9. Способ по п. 1, в котором биологическим образцом является сыворотка крови.

10. Способ контроля эффективности лечения пациента, представляющего собой человека, со злокачественной опухолью, получающего терапевтическое лечение от экспрессирующей НЕ4 опухоли, предусматривающий:
(a) определение присутствия или количества антител против НЕ4 в биологическом образце, полученном от пациента человека, получающего терапевтическое лечение от злокачественной опухоли, ассоциированной с экспрессирующими НЕ4 опухолевыми клетками, путем контактирования биологического образца с полипептидом, кодируемым полинуклеотидом, который селективно гибридизуется с последовательностью, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности, содержащей по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 1; и
(b) сравнение определенного присутствия или количества антител против НЕ4 с эталоном антитела, при котором эталон определяют из биологического образца, полученного от здоровых контрольных субъектов или пациента до лечения от злокачественной опухоли, при этом количество антитела против НЕ4, превышающее эталон, свидетельствует о положительном ответе на терапевтическое лечение от злокачественной опухоли.

11. Способ по п. 10, в котором антитело специфично связывается с полипептидом, содержащим последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности, содержащей по меньшей мере 10 смежных аминокислот из SEQ ID NO: 2.

12. Способ по п. 10, в котором биологическим образцом является биологическая жидкость, выбранная из группы, состоящей из крови, плазмы, сыворотки крови, асцитической жидкости, мочи, слюны, слез, плевральной жидкости, мокроты, влагалищной жидкости и промывок, полученных в ходе медицинской процедуры.

13. Способ по п. 10, в котором количество антител против НЕ4 определяют с использованием анализа ELISA.

14. Способ по п. 10, дополнительно предусматривающий определение присутствия или количества растворимых родственных НЕ4 пептидов (SHRP) в биологическом образце, в котором присутствие или количество антител против НЕ4 в биологическом образце в комбинации с присутствием или количеством растворимых родственных НЕ4 пептидов свидетельствует о присутствии экспрессирующих НЕ4 клеток у субъекта человека.

15. Способ по п. 10, в котором биологическим образцом является сыворотка крови.

16. Способ по п. 10, в котором лечение включает введение по меньшей мере одного химиотерапевтического средства, лучевую терапию, терапию антителами, терапию вакциной от злокачественной опухоли, генную терапию или трансплантацию стволовых клеток.

17. Способ по п. 10, в котором лечение включает хирургическое вмешательство для удаления по меньшей мере части экспрессирующей НЕ4 опухоли.

18. Набор для выявления присутствия экспрессирующих НЕ4 клеток у субъекта человека, содержащий:
(a) НЕ4 полипептид, содержащий последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности, содержащей по меньшей мере 10 смежных аминокислот из SEQ ID NO: 2, при этом полипептид формирует комплекс с человеческим антителом против НЕ4 в биологическом образце, полученном от субъекта человека, определяя таким образом человеческое антитело против НЕ4 в биологическом образце, при этом присутствие человеческих антител против НЕ4 в образце свидетельствует о наличии экспрессирующих НЕ4 клеток у субъекта человека;
(b) антитело против IgG человека; и
(c) напечатанные инструкции для сравнения выявленного присутствия или количества антител против НЕ4 с эталоном.

19. Набор по п. 18, в котором эталон выбран из группы, состоящей из специфичного цифрового порога, образца отрицательного контроля для конкурентной оценки и статистической информации, соотносящей количество выявленных антител против НЕ4 с вероятностью присутствия экспрессирующих НЕ4 клеток у субъекта.

20. Набор по п. 18, в котором полипептид представляет собой полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который селективно гибридизуется с последовательностью, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности, содержащей по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 1.

21. Набор по п. 18, в котором НЕ4 полипептид иммобилизован на твердой матрице.

22. Набор по п. 21, в котором твердая матрица выбрана из группы, состоящей из микролунки, индикаторной полоски, мембраны и стеклянной подложки.

23. Набор по п. 18, в котором антитело против IgG человека содержит детектируемую метку.

24. Набор по п. 23, в котором детектируемая метка содержит фермент или флуорофор.