16α,17α-ЦИКЛОГЕКСА-17β-(2'-ГИДРОКСИЭТИЛ)-13β-МЕТИЛГОНА-1,3,5(10)-ТРИЕН-3-ОЛ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2016 года по МПК C07J53/00 A61K31/56 A61P35/00 

Изобретение относится к области химии природных и физиологически активных веществ, а именно к области стероидных гормонов - к новым незамещенным в стероидном ядре пентациклическим стероидам, содержащим 16α,17α-циклогексановое кольцо, конкретно к 16α,17α-циклогекса-17β-(2′-гидроксиэтил)-13β-метилгона-1,3,5(10)-триен-3-олу (I) формулы:

и способу его получения. 16α,17α-Циклогекса-17β-(2′-гидроксиэтил)-13β-метилгона-1,3,5(10)-триен-3-ол (I) может найти применение в медицине для создания противоопухолевых средств.

Современной терапии гормонозависимых опухолей нужны препараты, останавливающие неконтролируемую пролиферацию (рост) злокачественных клеток. Для этой цели широко используются представители различных классов стероидов и нестероидных соединений. Эффективность существующих лекарств ограничена возможной резистентностью и различными побочными действиями. Поэтому поиск новых противоопухолевых препаратов является актуальной задачей. Рак молочной железы (РМЖ) - одно из наиболее распространенных злокачественных новообразований у женщин. Заболеваемость РМЖ неуклонно растет и является одной из главных причин смертности женщин среднего возраста в экономически развитых странах. В России РМЖ занимает 1-е место в структуре онкологической заболеваемости у женщин, причем отмечается увеличение заболеваемости и смертности в трудоспособном возрасте.

В ряду пентациклических стероидов (прегна-D′₆-пентаранов) [А.В. Камерницкий, И.С. Левина. Прегна-D′-пентараны. Прогестины и антипрогестины. Биоорган. химия, 2005, Т. 31, С. 115 и 227] известны соединения, проявляющие в зависимости от особенностей структуры широкий спектр биологического действия, включающий цитотоксическую активность. Так, в частности, в литературе описан близкий по структуре 16α,17α-циклогексано-5αН-прегнан-3,20-дион (II), обладающий цитотоксическими свойствами по отношению к клеточной линии карциномы молочной железы [А.В. Семейкин, И.С. Левина, Л.Е. Куликова и др. Изучение влияния новых прогестинов ряда пентаранов на жизнеспособность, экспрессию рецептора эпидермального фактора роста и апоптоз клеточных культур HeLa и MCF-7. Хим.-фарм. ж., 2008, Т. 42, С. 27] формулы:

Известное соединение II в дозах 10^-5-10^-7 М ингибирует рост клеток MCF-7 рака молочной железы на 16-18%.

Но среди описанных стероидов не известны незамещенные в стероидном ядре пентараны, содержащие совместно шестичленный карбоцикл D′ в 16α,17α-положениях и ароматическое (фенольное) кольцо А.

Задачей настоящего изобретения является создание нового стероида в ряду незамещенных в стероидном ядре пентаранов, обладающего высокой цитотоксической активностью.

Поставленная задача достигается новым 16α,17α-циклогекса-17β-(2′-гидроксиэтил)-13β-метилгона-1,3,5(10)-триен-3-олом формулы I, содержащим шестичленный карбоцикл D′ в 16α, 17α - положениях и фенольное кольцо А, и способом его получения..

Техническим результатом является новое соединение формулы I, обладающее высокой цитотоксической активностью, т.е. способностью ингибировать рост злокачественных клеток, и способ его получения. Соединение I способно ингибировать рецептор эстрогенов и транскрипционный фактор NF-κВ. При этом соединение формулы I обладает абсолютно новыми структурными свойствами.

Предложенное соединение формулы I получают в две стадии путем расщепления 3-метоксильной группы в 16α,17α-циклогекса-3-метокси-17β-ацетил-13β-метилгона-1,3,5(10)-триене (1) [DD 254143; С.А. 1988, 109, 73751z] действием 48%-ной бромистоводородной кислоты в лед. уксусной кислоте и образующийся при этом новый 16α,17α-циклогекса-17β-ацетил-13β-метилгона-1,3,5(10)-триен-3-ол (2) восстанавливают алюмогидридом лития в тетрагидрофуране с образованием 16α,17α-циклогекса-17β(2′-гидроксиэтил)-13β-метилгона-1,3,5(10)-триен-3-ола I. Процесс осуществляют по приведенной ниже схеме:

а) HBr, АсОН, кипяч.; b) LiAlH₄, THF

Структуры полученных новых соединений подтверждены данными физико-химического анализа. Выход целевого продукта в пересчете на исходный 1 составляет 37%.

Способ получения заявляемого соединения I в литературе не описан и является новым.

16α,17α-Циклогекса-17β-(2′-гидроксиэтил)-13β-метилгона-1,3,5(10)-триен-3-ол I отличается новой структурой, включающей в одной молекуле ароматическое кольцо А, фенольный гидроксил и 2′-гидроксильную группу в 17β-боковой цепи вблизи кольца D. Совокупность этих признаков и наличие двух гидроксильных групп, из которых одна является фенольной, дает возможность этому стероиду проявить высокую цитотоксическую активность. Наличие в заявляемом соединении I еще и гидрофобного кольца D′ также дает дополнительный положительный вклад в активность.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Смесь 0,36 г (1 ммоль) соединения 1, 0,15 г (1 ммоль) иодида натрия, 5 мл ледяной уксусной кислоты и 3 мл конц. бромистоводородной кислоты кипятят в течение 3,5 часов, после чего выливают в холодную воду. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают дистиллированной водой, сушат на фильтре и перекристаллизовывают из этанола. Получают 0,27 г (77%) 16α,17α-циклогекса-17β-ацетил-13β-метилгона-1,3,5(10)-триен-3-ола 2 в виде белых игольчатых кристаллов с т.пл. 239-240°С (этанол). Масс-спектр, m/z=353.2475 [М+Н]⁺. С₂₄Н₃₂О₂. Вычислено: М=352.2402. Спектр ЯМР ¹Н (300 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): 0.72 (с, 3Н; 18-Ме), 2.17 (с, 3Н; 21-Ме), 2.26-2.39 (м, 1Н), 2.82 (м, 2Н), 3.01 (м, 1Н), 4.73 (уш.с, 1Н; 3-ОН), 6.57 (с, 1Н; 4-Н), 6.63 (уш.д, 1Н, J=8.8 Гц; 2-Н), 7.13 (д, 1H, J=8.1 Гц; 1-Н).

К раствору 0,25 г (0,71 ммоля) соединения 2 в 15 мл абс. тетрагидрофурана при комнатной температуре осторожно добавляют 0,07 г (1,8 ммоля) алюмогидрида лития и оставляют перемешиваться на магнитной мешалке в течение 48 часов. Затем по каплям при интенсивном перемешивании добавляют 5 мл метанола, 10 мл насыщенного раствора хлорида аммония и 2 мл концентрированной соляной кислоты. Органический слой отделяют, водный экстрагируют сначала 2 раза по 10 мл тетрагидрофурана, затем 2 раза по 10 мл хлороформа. Органические фазы по отдельности промывают насыщенным раствором хлорида аммония, затем объединяют, высушивают безводным сульфатом натрия и упаривают. Полученное масло хроматографируют на колонке с силикагелем (элюирование смесью хлористый метилен - ацетон 20:1). Получают 0,12 г (48%) диола I в виде белого порошка с т.пл. 196-197°С (ацетонитрил). Найдено: m/z=355.2632 [М+Н]⁺. С₂₄Н₃₄О₂. Вычислено: М=354.2559. Спектр ЯМР ¹Н (300 МГц, ДМСО-d₆, δ, м.д.): 0.86 (с, 3Н; 18-Ме), 1.14 (д, 3Н, J=5.8 Гц; 21-Me), 1.27 (м, 6Н), 1.38-1.68 (м, 7Н), 1.71-1.86 (м, 2Н), 1.95-2.17 (м, 3Н), 2.63-2.76 (м, 2Н), 3.82 (м, 1Н; 20-Н), 4.12 (д, 1Н; 20-ОН), 6.42 (с, 1Н; 4-Н), 6.48 (уш.д, 1Н, J=8.1 Гц; 2-Н), 7.00 (д, 1Н, J=8.1 Гц; 1-Н). 8.95 (уш.с, 1H; 3-ОН).

Пример 2. Цитотоксическая активность заявляемого соединения I оценивалась на культурах клеток рака молочной железы человека MCF-7 и SKBR3 с помощью теста МТТ. МТТ тест основан на утилизации живыми клетками МТТ-реагента (3-[4,5-диметилтиазол-2]-2,5-дифенилтетразол бромида) с образованием фиолетовых кристаллов формазана, нерастворимых в культуральной среде. Клеточные линии MCF-7 и SKBR3 получены из коллекции АТСС (США) и до проведения анализов хранились в криобанке РОНЦ им. Н.Н. Блохина. In vitro культивирование клеток проводили в стандартной среде DMEM (Биолот, Россия) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки телят (HyClone, США) и гентамицина (50 ед./мл.) (ПанЭко, Россия); инкубацию проводили при 37°С, 5%-ном СО₂ и относительной влажности 80-90%. В работе с опухолевыми клетками использовали клеточный инкубатор NuAir (США). Для проведения биологических испытаний соединение I растворяли в ДМСО (диметилсульфоксид) в концентрации 10 мМ и хранили при +4°С до проведения исследования. Клетки MCF-7 и SKBR3 рассевали на плато (Corning, США) и через 24 ч вносили соединение I в интервале доз от 2,5 до 40 мкМ. В качестве препарата сравнения в клетках MCF-7, экспрессирующих рецептор эстрогенов (ERα), использовали тамоксифен (в интервале доз от 2,5 до 20 мкМ) - антиэстроген, успешно применяемый в гормонотерапии РМЖ [Rao R.D. и Cobleigh M.A. Adjuvant endocrine therapy for breast cancer. Oncology, 2012, T. 26, №6, C. 541-547]. К контрольным клеткам добавляли соответствующий объем растворителя, при этом его конечная концентрация (ДМСО - для соединения I, этилового спирта - для тамоксифена) в среде не превышала 0,2%. Через 72 часа роста с соединениями среду удаляли и вносили к клеткам МТТ реагент (AppliChem, США) на 2 ч. После окончания инкубации клетки лизировали в 100% ДМСО (AppliChem, США); встряхивали плато для растворение образовавшихся кристаллов формазана и оптическую плотность (ОП) полученных растворов анализировали на спектрофотометре MultiScan FC (ThermoFisher, США) при 571 нм. Далее из значений ОП вычитали ОП в лунках, не содержащих клеток; за 100% принимали ОП растворов, полученных в контрольных образцах. Значение IC₅₀ рассчитывали как концентрацию соединения, при которой ОП раствора составляла 50% от контрольного образца. Эксперимент повторяли три раза.

Таблица. IC₅₀ соединения I и препарата сравнения (антиэстрогена тамоксифена); инкубацию с соединениями проводили 72 ч.

Данные, представленные в таблице, свидетельствуют, что соединение I оказывает цитотоксическое действие на клетки рака молочной железы в концентрациях, характерных для антиэстрогена тамоксифена (1-10 мкМ). Значения IС₅₀ для соединения I в клетках MCF-7 и SKBR3 не превышали уровня 10 мкМ, что указывает на высокую активность заявленного вещества в отношении РМЖ. Сравнение действия соединения I на линии SKBR3 (экспрессия рецептора эстрогенов α не обнаружена) и MCF-7 (содержат рецептор эстрогенов) выявляет более высокую активность в клетках, содержащих рецептор эстрогенов. Рецептор эстрогенов рассматривается как молекулярная мишень для соединение I в клетках MCF-7.

Пример 3. Анализ активности рецептора эстрогенов (ERα) в клетках MCF-7 проводили с помощью репортерного анализа. Для этого использовали трансфекцию плазмиды, содержащей ген-репортер люциферазы под контролем ERE (эстроген-чувствительных элементов) [Reid G., Hubner M.R., Metivier R. et al. Cyclic, proteasome-mediated turnover of unliganded and liganded ERalpha on responsive promoters is an integral feature of estrogen signaling. 2003, Mol Cell, T. 11, №3, C. 695-707]; для нормирования результатов и оценки потенциальной токсичности процедур проводили трансфекцию клеток плазмидой, содержащей ген β-галактозидазы. Трансфекцию выполняли по протоколу Biontex Laboratories с помощью реактива Metafectene Pro. После трансфекции клетки обрабатывали заявленным соединением I (10 мкМ), инкубировали в течение 16 ч и затем вносили 17β-эстрадиол (как индуктор активности рецептора эстрогенов) в концентрации 10 нМ на 6 часов.

Определение активности люциферазы проводили на планшетном люминометре "TECAN Infinite М200Рrо" согласно рекомендациям производителя люциферазного реагента (Promega); уровень β-галактозидазы определяли по стандартному протоколу на анализаторе MultiScan FC (ThermoScientific). Активность рецептора эстрогенов рассчитывали относительно внутриклеточного уровня β-галактозидазы. Эксперимент повторяли три раза.

Рис. 1. Влияние соединения I на активность рецептора эстрогенов в клетках рака молочной железы MCF-7. За 100% принимали уровень активности рецептора эстрогенов в клетках, обработанных 10 нМ 17β-эстрадиолом (Е2). Из рис. 1 видно, что соединение I ингибирует активность рецептора эстрогенов, индуцированную естественным (физиологическим) лигандом (17β-эстрадиолом). Соединение I проявляет свойства антиэстрогена. Транскрипционный фактор NF-κВ рассмотрен как вторая молекулярная мишень заявленного соединения I в клетках РМЖ. NF-κВ регулирует пролиферацию клеток и определяет устойчивость к стрессорным воздействиям. Ингибирование NF-κВ является одной из причин гибели опухолевых клеток.

Для определения транскрипционной активности NF-κВ клетки MCF-7 трансфицировали плазмидой, содержащей репортерный ген люциферазы под контролем NF-κВ-чувствительного промотора [Gasparian A.V., Yao Y.J., Kowalczyk D. и др. The role of IKK in constitutive activation of NF-kappaB transcription factor in prostate carcinoma cells. 2002, J Cell Sci, T. 115, C. 141-151]. Далее использовали протокол, разработанный для анализа активности рецептора эстрогенов.

Клетки MCF-7 обрабатывали соединением I (10 мкМ), через 2 часа добавляли индуктор NF-κВ (форболовый эфир) и инкубировали 6 часов.

На Рис. 2 представлены результаты анализа активности люциферазы, выполненного по стандартному протоколу Promega (США).

На Рис. 2. показано влияние соединения I на индуцированную активность транскрипционного фактора NF-κВ в клетках рака молочной железы MCF-7. За 100% принимали уровень активности рецептора эстрогенов в клетках, обработанных 0,2 мкг/мл форболового эфира (ФЭ).

Анализ показал, что соединение I на 30% снижает индуцированную активность NF-κВ в клетках РМЖ MCF-7.

Выполненное исследование демонстрирует, что заявленное соединение I оказывает высокое цитотоксическое (антипролиферативное) действие на клетки рака молочной железы. Соединение I проявляет свойства антиэстрогена, а также ингибирует транскрипционный фактор NF-κB, отвечающий за выживаемость опухолевых клеток. В сравнении с известным соединением II соединение I в приведенных выше концентрациях (2,5 до 40 мкМ) оказывает цитотоксическое действие на клетки рака молочной железы, более чем в 5 раз превышающие действие соединения II. В связи с большой социально-экономической значимостью проблемы лечения злокачественного роста создание новых соединений представляет собой актуальную проблему как экспериментальной, так и клинической медицины. Заявленное соединение I показало высокую активность в тестах in vitro и рекомендовано для дальнейшего исследования на моделях опухолей у животных. Высокий уровень ответа ожидается получить в терапии гормонозависимого рака молочной железы.

Изобретение относится к 16α,17α-циклогекса-17β-(2′-гидроксиэтил)-13β-метилгона-1,3,5(10)-триен-3-олу (I) формулы (I), обладающему свойствами ингибитора эстрогенов и транскрипционного фактора NF-kB и цитотоксической активностью, и способу его получения. Соединение I может найти применение в медицине для создания противоопухолевых средств. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 ил., 2 пр.

1. 16α,17α-циклогекса-17β-(2′-гидроксиэтил)-13β-метилгона-1,3,5(10)-триен-3-ол (I) структурной формулы

2. Соединение по п. 1, обладающее цитотоксической активностью.

3. Соединение по п. 1, способное ингибировать рецептор эстрогенов и транскрипционный фактор NF-κB.

4. Способ получения соединения по п. 1, заключающийся в том, что 16α,17α-циклогекса-3-метокси-17β-ацетил-13β-метилгона-1,3,5(10)-триен подвергают действию 48%-ной бромистоводородной кислоты в ледяной уксусной кислоте и образующийся при этом 16α,17α-циклогекса-17β-ацетил-13β-метилгона-1,3,5(10)-триен-3-ол восстанавливают алюмогидридом лития в тетрагидрофуране с образованием 16α,17α-циклогекса-17β-(2′-гидроксиэтил)-13β-метилгона-1,3,5(10)-триен-3-ола.