БИОМАРКЕРЫ ДЛЯ ТЕРАПИИ НА ОСНОВЕ ИНГИБИТОРА HEDGEHOG Российский патент 2016 года по МПК G01N33/574 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к способу персонифицированной терапии.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Известно, что сигнальный путь Hedgehog регулирует многообразный диапазон биологических процессов, таких как клеточная пролиферация, дифференциация и формирование органов, тканеспецифическим и дозозависимым образом. Обычно сигнальный путь Hedgehog строго контролируется в процессе клеточной пролиферации, дифференциации и формирования эмбрионального профиля. Однако аберрантная активность сигнального пути Hedgehog, вызванная мутациями, которые конститутивно активируют данный путь, например, может иметь патологические последствия. В качестве примера, мутации с потерей функции белка Patched обнаруживают при синдроме Горлина (наследственный синдром с высоким риском возникновения рака кожи и мозга, также известный как синдром базальноклеточного невуса (СБКН)); и мутации Smo и Gli, приводящие к появлению патологических функций, связывают с базальноклеточной карциномой и глиобластомой. Базальноклеточная карцинома (БКК) представляет собой самый распространенный тип рака кожи, поражающий более 90000 американцев каждый год.

Было обнаружено, что конститутивная активация сигнального пути Hedgehog способствует онкогенезу при БКК, медуллобластоме (самой распространенной опухоли мозга у детей), рабдомиосаркоме, раке поджелудочной железы, мелкоклеточном раке легкого, раке предстательной железы и раке молочной железы. Помимо функций в онкогенезе, сигнальный путь Hedgehog также вовлечен в процесс метастазирования рака предстательной железы. Сигнальный путь Hedgehog может быть задействован при многих других типах опухолей, и ожидается, что обнаружение подобных связей будет продолжаться; данная область является областью активного исследования во многих онкоцентрах во всем мире.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на открытии, что конкретные биомаркеры могут применяться для отбора отдельных пациентов, страдающих раком, которые, по-видимому, отвечают на лечение ингибитором сигнального пути Hedgehog. В частности, было обнаружено, что уровень экспрессии биомаркера, приведенного в таблице 1, например уровень экспрессии мРНК биомаркера, приведенного в таблице 1, и/или повышенное содержание или уменьшение количества белкового продукта, кодируемого биомаркером, приведенным в таблице 1, в образце пациента, страдающего раком, по сравнению с контрольным образцом можно применять для прогнозирования того, будет ли данный пациент отвечать на лечение ингибитором сигнального пути Hedgehog.

В одном аспекте данное изобретение включает способ отбора пациента, страдающего раком, для лечения ингибитором сигнального пути Hedgehog, при этом данный способ включает определение уровня экспрессии по меньшей мере одного биомаркера, приведенного в таблице 1, такого как SHROOM 2 или SPHK1, в биологическом образце, полученном от пациента, чтобы, таким образом, прогнозировать повышенную вероятность ответа на ингибитор сигнального пути Hedgehog. В одном варианте осуществления данное изобретение включает отбор по меньшей мере двух, по меньшей мере трех, по меньшей мере четырех, по меньшей мере пяти, по меньшей мере шести, по меньшей мере семи или по меньшей мере восьми биомаркеров из таблицы 1. В способе данного изобретения ингибитор сигнального пути Hedgehog представляет собой циклопамин, Йервин, GANT61, пурморфамин, SAG, SANT-2, томатидин, зерумбон, GDC-0449; XL139, IPI926, IPI609 (IPI269609) или BMS-833923/XL139, или их производные. В одном варианте осуществления ингибитор сигнального пути Hedgehog представляет собой [6-(цис-2,6-диметилморфолин-4-ил)-пиридин-3-ил]-амид метил-4'-трифторметоксибифенил-3-карбоновой кислоты (Соединение I) или 2-[(R)-4-(6-бензил-4,5-диметилпиридазин-3-ил)-2-метил-3,4,5,6-тетрагидро-2H-[1,2']бипиразинил-5'-ил]-пропан-2-ол (Соединение II). В способе данного изобретения рак может представлять собой БКК, хроническую миелоидную лейкемию (ХМЛ), саркому кости, саркому мягкой ткани, медуллобластому, рабдомиосаркому, рак поджелудочной железы, мелкоклеточный рак легких, рак предстательной железы, синдром Горлина, рак желудочно-кишечного тракта, миелопролиферативную неоплазию и острые лейкемии или рак молочной железы. В одном варианте осуществления биологический образец представляет собой образец опухолевой ткани, такой как свежезамороженный образец или зафиксированный в формалине заключенный в парафин образец ткани.

В другом аспекте данное изобретение включает способ отбора пациента, страдающего раком, для лечения ингибитором сигнального пути Hedgehog, при этом данный способ включает определение уровня экспрессии по меньшей мере одного биомаркера, приведенного в таблице 1, в биологическом образце, полученном от пациента, страдающего медуллобластомой, чтобы, таким образом, прогнозировать повышенную вероятность ответа на [6-(цис-2,6-диметилморфолин-4-ил)-пиридин-3-ил]-амид метил-4'-трифторметоксибифенил-3-карбоновой кислоты.

Определение уровня экспрессии с помощью способов данного изобретения может включать определение уровня экспрессии мРНК или определение уровня белка.

В другом аспекте данное изобретение включает способ отбора пациента, страдающего раком, для лечения ингибитором сигнального пути Hedgehog, при этом данный способ включает определение уровня экспрессии биомаркера сигнального пути Hedgehog, приведенного в таблице 1, в биологическом образце, полученном от пациента, страдающего раком; определение уровня мРНК одного или более референсных/нормировочных генов, приведенных в таблице 2; и нормировку уровня экспрессии биомаркера сигнального пути Hedgehog по референсному гену.

В другом аспекте данное изобретение включает набор для определения того, чувствительна ли опухоль к лечению ингибитором сигнального пути Hedgehog, включающий два зонда или праймера для определения уровня экспрессии по меньшей мере одного, по меньшей мере двух, по меньшей мере трех, по меньшей мере четырех, по меньшей мере пяти, по меньшей мере шести, по меньшей мере семи или по меньшей мере восьми биомаркеров, приведенных в таблице 1. Набор данного изобретения может включать множество агентов для определения уровня одного или более биомаркеров, приведенных в таблице 1, и необязательно также включает агенты для определения уровня экспрессии одного или более биомаркеров, приведенных в таблице 2 и инструкции по применению.

В одном аспекте набор данного изобретения может представлять собой набор для прогнозирования того, получит ли пациент, страдающий раком, положительный результат при лечении ингибитором сигнального пути Hedgehog, при этом данный набор включает: множество агентов для определения уровня экспрессии мРНК одного или более биомаркеров, определенных в таблице 1; и средства для анализа экспрессии и получения показателя для прогнозирования того, получит ли пациент положительный результат при лечении ингибитором сигнального пути Hedgehog. Агенты для определения экспрессии мРНК могут включать набор полинуклеотидов, комплементарных одному или более биомаркерам, определенным в таблице 1. Агенты для измерения экспрессии мРНК включают множество ПЦР зондов и/или праймеров для кРВ-ПЦР.

Еще в одном аспекте данное изобретение может включать микрочип, содержащий полинуклеотидные зонды, комплементарные или гибридизуемые, по меньшей мере с одним биомаркером, приведенным в таблице 1.

Еще в одном аспекте данное изобретение может включать композицию, содержащую множество отдельных последовательностей нуклеиновых кислот, где каждая отдельная последовательность нуклеиновой кислоты гибридизуется по меньшей мере с одним из РНК продуктов, выбранных из приведенных далее генов GLI-1, OTX-2, SHROOM2, PDLIM3, SPHK1, SFRP1, APBA2 и SPATA20, когда композиция применяется для измерения уровня экспрессии мРНК данных генов.

Еще в одном аспекте данное изобретение может включать программное обеспечение для отбора пациента, страдающего или с подозрением на медуллобластому, для лечения препаратом-ингибитором SMO: способы получения данных, соответствующих уровню экспрессии по меньшей мере одного гена, приведенного в таблице 1, в образце от пациента; способы получения значения экспрессии для каждого гена; и способы получения показателя на основании введения значения уровня экспрессии в базу данных, включающую в себя референсный профиль экспрессии, связанной с отбором, при этом данный показатель прогнозирует, получит ли пациент положительный результат при лечении ингибитором SMO. Данное программное обеспечение может применяться в любом из способов, описанных выше.

«Биомаркер» представляет собой молекулу, которую применяют в качестве индикатора биологического состояния пациента. Что касается настоящего объекта изобретения, биомаркеры, раскрытые в контексте данного описания, могут представлять собой молекулы, которые показывают изменение в экспрессии для прогнозирования того, получит ли пациент положительный результат после получения лечения ингибитором сигнального пути Hedgehog, например ингибитором SMO.

«Hedgehog» по природе относится к любым из гомологов млекопитающих, белку hedgehog мухи Drosophila, и включает по меньшей мере Sonic hedgehog (SHedgehog), Desert hedgehog (DHedgehog) и Indian hedgehog (Hedgehog).

Термин «сигнальный путь Hedgehog», применяемый в контексте данного описания, относится к сигнальному каскаду, опосредованному (или регулируемому) белками hedgehog и его рецепторами, который приводит к изменениям экспрессии генов и другим фенотипическим изменениям, характерным для активности hedgehog. Активация сигнального пути может осуществляться с помощью компонента сигнального пути Hedgehog, который положительным образом влияет на передачу Hedgehog сигнала, т.е. стимулирует последующие биологические события при наличии Hedgehog. Примерами таких компонентов являются Hedgehog, Ptch, Smo и Gli. Hedgehog положительные (Hh+) опухоли представляют собой такие опухоли, которые обладают генетическими изменениями, что приводит к конститутивной активации пути hedgehog, и такая активация Hedgehog, оказывается, является главной движущей силой образования и роста опухоли.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Существует постоянно увеличивающаяся база доказательств, которые показывают, что генетический профиль пациента может быть решающим фактором для восприимчивости пациента к терапевтическому лечению. Принимая во внимание многочисленные типы терапий, доступных для лечения рака, определение генетических факторов, которые влияют, например, на ответ на конкретный препарат, можно было бы применять для обеспечения пациенту персонифицированного режима лечения. Подобные персонифицированные режимы лечения обеспечивают возможности для максимизации терапевтического эффекта у пациента, тогда как сопутствующие побочные эффекты, которые могут быть связаны с альтернативными режимами лечения, минимизируются. Таким образом, существует потребность в определении факторов, которые можно применять для прогнозирования того, будет ли пациент с большой вероятностью реагировать на конкретный вид терапии.

Для максимизации возможного клинического эффекта у пациента, получающего ингибитор сигнального пути Hedgehog, важна способность выбора тех пациентов, которые имеют опухоли с активированным сигнальным путем Hedgehog. Способы, описанные в контексте данного описания, основаны отчасти на определении одного или множества биомаркеров, приведенных в таблице 1, которые можно применять для определения вероятности получения положительного результата у пациента при лечении ингибитором сигнального пути Hedgehog, таким как ингибитор SMO.

Биомаркеры данного изобретения были целенаправленно оптимизированы для применения в зафиксированных в формалине, заключенных в парафин (ЗФЗП) образцах тканей, чтобы сделать их пригодными для применения в повседневных клинических исследованиях.

Ингибиторы сигнального пути Hedgehog

Ингибиторы сигнального пути Hedgehog, применяемые в настоящем изобретении, представляют собой агенты, известные ингибированием сигнального пути Hedgehog. Подобные агенты могут представлять собой агенты, которые ингибируют аберрантные стадии развития, обусловленные фенотипами, такие как мутации с потерей функций в Ptch или Sufu или мутации с приобретением патологических функций в Hedgehog, Smoothened или Gli. Ингибиторы Hedgehog известны в данной области техники и включают, например, низкомолекулярные соединения, короткие пептиды, антитела, антисмысловые олигонуклеотиды, короткие интерферирующие РНК и тому подобное.

В некоторых вариантах осуществления ингибитор сигнального пути Hedgehog представляет собой низкомолекулярное соединение. В некоторых вариантах осуществления ингибитор сигнального пути Hedgehog представляет собой циклопамин или его производное. В некоторых вариантах осуществления ингибитор сигнального пути Hedgehog представляет собой Йервин, GANT61, пурморфамин, SAG, SANT-2, томатидин, зерумбон или их производные. В некоторых вариантах осуществления ингибитор сигнального пути Hedgehog представляет собой GDC-0449 (доступен от компании Genentech и/или Curis); XL139, IPI926 (доступны от компании Infinity Pharmaceuticals), IPI609 (IPI269609), BMS-833923/XL139 (доступны от компании Bristol-Myers Squibb и/или Exelixis), TAK-441 (Millennium) или PF-04449913 (Pfizer).

Дополнительные ингибиторы сигнального пути Hedgehog представлены в PCT/US2010/038568, PCT/US2010/044168, PCT/US2009/061573, PCT/US2009/063696, PCT/US2009/039065, которые все полностью включены в контексте данного описания путем ссылки.

Ингибиторы сигнального пути Hedgehog, описанные в контексте данного описания, могут представлять собой сами агенты, их фармацевтически приемлемые соли, их фармацевтически приемлемые эфиры, а также стереоизомеры, энантиомеры, рацемические смеси и тому подобное. В одном варианте осуществления ингибитор сигнального пути Hedgehog представляет собой ингибитор SMO, такой как [6-(цис-2,6-диметилморфолин-4-ил)-пиридин-3-ил]-амид 2-метил-4'-трифторметоксибифенил-3-карбоновой кислоты, также известный как N-[6-(цис-2,6-диметилморфолин-4-ил)пиридин-3-ил]-2-метил-4'-(трифторметокси)[1,1'-бифенил]-3-карбоксамид, который раскрыт в международных патентных заявках № WO 2007/131201 и WO 2008/154259, которые все полностью включены в контекст данного описания путем ссылки. В другом варианте осуществления ингибитор сигнального пути Hedgehog представляет собой 2-[(R)-4-(6-бензил-4,5-диметилпиридазин-3-ил)-2-метил-3,4,5,6-тетрагидро-2H-[1,2']бипиразинил-5'-ил]-пропан-2-ол, раскрытый в WO 2010/007120, который полностью включен в контекст данного описания путем ссылки.

Ингибиторы сигнального пути Hedgehog включают соединение формулы I:

,

в которой

Y выбран из N и CR₁₀; где R₁₀ выбран из водорода, галогена, C_1-6алкила, галогензамещенного С_1-6алкила, С_1-6алкоксильной группы, галогензамещенной С_1-6алкоксильной группы и -OXNR_10aR_10b; где R_10a и R_10b независимо выбраны из водорода и С_1-6алкила;

R₁ выбран из цианогруппы, галогена, С_1-6алкила, галогензамещенного С_1-6алкила, С_1-6алкоксильной группы, галогензамещенной С_1-6алкоксильной группы, C_6-10арила, диметиламиногруппы, C_1-6алкил-сульфанила и C_3-8гетероциклоалкила, необязательно замещенного до 2 С_1-6алкильными радикалами;

R₂ и R₅ независимо выбраны из водорода, цианогруппы, галогена, С_1-6алкила, галогензамещенного С_1-6алкила, С_1-6алкоксильной группы, галогензамещенной С_1-6алкоксильной группы и диметиламиногруппы;

R₃ и R₄ независимо выбраны из водорода, галогена, цианогруппы, С_1-6алкила, галогензамещенного С_1-6алкила, С_1-6алкоксильной группы и галогензамещенной С_1-6алкоксильной группы; или либо R₁ и R₂ или R₁ и R₅ вместе с фенильной группой, к которой они оба присоединены, образуют C_5-10гетероарил;

R₆ и R₇ независимо выбраны из водорода, С_1-6алкила, галогензамещенного С_1-6алкила, С_1-6алкоксильной группы и галогензамещенной С_1-6алкоксильной группы; с условием, что R₆ и R₇ оба не являются водородом;

R₈ выбран из водорода, галогена, С_1-6алкила, галогензамещенного С_1-6алкила, С_1-6алкоксильной группы и галогензамещенной С_1-6алкоксильной группы;

R₉ выбран из -S(O)₂R₁₁ и -R₁₁; где R₁₁ выбран из арила, гетероарила, циклоалкила и гетероциклоалкила;

где указанный арил, гетероарил, циклоалкил и гетероциклоалкил R₉ может быть необязательно замещен от 1 до 3 радикалами, независимо выбранными из C_1-6алкила, галогензамещенного C_1-6алкила, C_1-6алкоксильной группы, галогензамещенной C_1-6алкоксильной группы, C_6-10арил-C_0-4алкила, С_5-10гетероарил-С_0-4алкила, C_3-12циклоалкила и C_3-8гетероциклоалкила;

где указанный арилалкильный заместитель R₉ необязательно замещен от 1 до 3 радикалами, независимо выбранными из галогена, C_1-6алкила, галогензамещенного C_1-6алкила, C_1-6алкоксильной группы, галогензамещенной C_1-6алкоксильной группы и метилпиперазинила; и их фармацевтически приемлемых солей.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение включает ингибиторы сигнального пути Hedgehog формулы I(a):

или их фармацевтически приемлемые соли, где

R11 представляет собой C_1-8алкил, C_2-8алкенил, C_3-14циклоалкил, C_6-14арильную группу, 5-14-членную гетероарильную группу, 3-14-членную циклогетероалкильную группу, C_1-8алкоксильную группу, галоген, NR13R14, C(O)OR13, C(O)NR13R14, C_1-8галогеналкил, формил, карбалкоксильную группу, C_1-8алкилОН, C(O)R13, SO₂R13, C(O)NHC_1-8алкилR13, NR13R14, SO₂NR13R14, OCF₃, NHC(O)R13, CH₂OC(O)NR13R14, CH₂NR13R14, NHC(O)OR13, NHC(O)NR13R14, CH₂NHSO₂R13, CH₂NHC(O)OR13, OC(O)R13 или NHC(O)R13, которые могут быть замещенными или незамещенными;

R12 представляет собой H, C_1-8алкил, C_6-14арильную группу, C_1-8галогеналкил, C_1-8алкосильную группу, галоген, NH₂, CN, OCF₃, OH, C(O)NR13R14, C(O)R13, NR13R14, NHC(O)R13, SO₂R13, SO₂NR13R14;

R13 и R14 независимо представляют собой H, C_1-8алкил, C_2-8алкенил, C_3-14циклоалкил, C_6-14арильную группу, 5-14-членную гетероарильную группу, 3-14-членную циклогетероалкильную группу, C_1-8галогеналкил, C_1-8алкилОН, C_1-8алкоксильную группу, или R13 и R14 на одном атоме могут образовывать кольцо, содержащее гетероатом; и

где R11, R13 и R14 могут быть незамещенными или замещенными одним или более C_1-8алкилом, C_3-14циклоалкилом, C_6-14 арильной группой, 5-14-членной гетероарильной группой, 3-14-членной циклогетероалкильной группой, C_1-8алкилОН, OH, оксогруппой, C_1-8галогеналкилом, карбоксС_1-8алкилом или SO₂C_1-8алкилом, галогеном, -OCH₃, -OCF₃, -OH, -NH₂.

Биомаркер

Биомаркер(ы) данного изобретения включает один или более генов, приведенных в таблице 1, или продукты этих генов. Анализируя уровень экспрессии одного или более биомаркеров, определенных в таблице 1, можно выбрать людей, страдающих раком, у которых путь hedgehog активирован и которые, таким образом, с высокой вероятностью ответят на лечение ингибитором сигнального пути Hedgehog, например антагонистом Smoothened (SMO).

Биомаркеры данного изобретения включают GLI-1, OTX-2, SHROOM2, PDLIM3, SPHK1, SFRP1, APBA2 и SPATA20. GLI-1, SHROOM2, PDLIM3, SPHK1, SFRP1 и APBA2 активируются (увеличение экспрессии мРНК), в то время как OTX-2 и SPATA20 подавляются (уменьшение экспрессии мРНК). В одном примере профиль экспрессии может представлять собой набор значений, представляющих уровни мРНК одного или более из приведенных далее генов GLI-1, OTX-2, SHROOM2, PDLIM3, SPHK1, SFRP1, APBA2 и SPATA20. В другом примере профиль экспрессии может представлять собой набор значений, представляющих уровни мРНК одного или более из приведенных далее генов GLI-1, OTX-2, SHROOM2, PDLIM3 и SPHK1. Еще в одном примере профиль экспрессии может включать набор значений, представляющих уровни одного или более белков или полипептидов, которые кодируются GLI-1, OTX-2, SHROOM2, PDLIM3, SPHK1, SFRP1, APBA2 и SPATA20. Фраза «экспрессия мРНК» может означать увеличение или уменьшение величины экспрессии мРНК в образце пациента, страдающего раком, по сравнению с контрольным образцом. Обычно под увеличением или уменьшением экспрессии мРНК подразумевается изменение экспрессии в 1,5 раза или более (как, например, в 2, 3, 4 или 5 раз) по сравнению с контролем (например, нормальным уровнем, определенным в контрольном образце).

Подготовка образцов

Можно применять любой подходящий исследуемый образец клеток, взятый у пациента, имеющего пролиферативное заболевание. Обычно исследуемый образец клеток или образец ткани получают от пациента, страдающего раком, проводя биопсию или хирургическое удаление. Образец клеток, ткани или жидкости может быть взят при помощи пункционной биопсии. Для этого хирургической тонкой иглой, надетой на шприц, проникают через кожу и в соответствующую ткань. Иглу обычно направляют в нужную область при помощи визуализации методом ультразвуковой или компьютерной томографии (КТ). Как только игла введена в ткань, шприцом создают вакуум таким образом, что клетки или жидкость можно засосать через иглу и набрать в шприц. Образец клеток или ткани также может быть отделен эксцизионной или толстоигольной биопсией. Для этого конусовидный, цилиндрический или небольшой кусочек ткани отделяют из нужной области. Для проведения данного типа биопсии обычно применяют КТ визуализацию, ультразвук или эндоскоп. Конкретнее, весь опухолевый участок может быть удален при помощи эксцизионной биопсии или хирургического удаления. В настоящем изобретении исследуемый образец обычно представляет собой образец клеток, выделенный в ходе хирургического удаления.

Исследуемый образец, например ткани, можно также хранить, например, в растворе RNAlater (Ambion; Austin Tex.) или быстро заморозить и хранить при -80°C для последующего применения. Образец ткани после биопсии можно также фиксировать при помощи фиксатора, такого как формальдегид, параформальдегид или смесь уксусная кислота/этанол. Образец фиксированной ткани может быть заключен в воск (парафин) или пластичный полимер. Заключенный образец ткани (или замороженный образец ткани) можно нарезать на тонкие срезы. РНК или белок также можно выделить из фиксированного или заключенного в воск образца ткани или замороженного образца ткани. Как только образец клеток или образец ткани удаляют у пациента, страдающего раком, его можно подвергать обработке с целью выделения РНК или белка при помощи методик, которые хорошо известны в данной области техники и которые описаны ниже.

Пример выделения РНК из биопсии, взятой у пациента, страдающего раком, может включать, например, лизис при помощи гуанидина тиоцианата с последующим центрифугированием в CsCl (Chirgwin, et al., Biochemistry 18:5294-5299, 1979). РНК из отдельных клеток можно получить, как описано в способах подготовки кДНК библиотек для отдельных клеток (см., например, Dulac, Curr. Top. Dev. Biol. 36:245, 1998; Jena, et al., J. Immunol. Methods 190:199, 1996). В одном варианте осуществления РНК популяция может быть обогащена нужными последовательностями, как указано в таблицах 1 и 2. Обогащение можно провести, например, синтезом кДНК с применением случайных гексамеров и синтезом кДНК с применением специфических праймеров, или множественными циклами линейной амплификации на основании кДНК синтеза и матричной in vitro транскрипции (см., например, Wang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9717, 1989; Dulac, et al., выше; Jena, et al., выше). Другие способы выделения РНК из образца также известны в данной области техники и включают Trizol (Invitrogen), гуанидина тиоцианат-фенол-хлороформную экстракцию, PureLink Micro-to-Midi Total RNA Purification System (invitrogen), RNeasy kit (Qiagen), Oligotex kit (Qiagen), PureYield™ RNA Midiprep (Promega), PolyATtract System 1000 (Promega), Maxwell(R) 16 System (Promega), SV Total RNA Isolation (Promega), ToTALLY RNA™ Kit (Ambion), Poiy(A)Purist™ Kit (Ambion) и любые другие способы. Способы выделения и анализа РНК образца раскрыты в Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook and Russell (ed.), 3rd edition (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA.

Профиль экспрессии Hedgehog может быть определен по биопсии, взятой у пациента, такой как свежая ткань, замороженная ткань, ткань, обработанная формалином (ЗФЗП) иди другими фиксаторами. В частности, если образец представляет собой образец ЗФЗП, то РНК выделяют из ЗФЗП срезов при помощи набора для выделения ЗФЗП Qiagen RNeasy (Qiagen) и обратно транскрибируют в кДНК при помощи случайных гексамеров и набора ABI's High Capacity cDNA archive kit (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Пациент, страдающий раком или имеющий опухоль, обычно представляет собой млекопитающее, такое как примат. В примерном варианте осуществления пациентом является человек. Применяемые в контексте данного описания термины пациент и субъект являются синонимами.

Любой вид рака или опухоли можно проверить в соответствии со способами данного изобретения, и они включают, но не ограничиваются ими, рак прямой кишки, рак легких, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак предстательной железы и гепатоцеллюлярную карциному, базальноклеточную карциному, рак молочной железы, саркому кости, саркому мягких тканей, хроническую миелоидную лейкемию, острый миелолейкоз, гемобластоз, медуллобластому, рабдомиосаркому, нейробластому, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, менингиому, глиобластому, астроцитому, меланому, рак желудка, рак пищевода, рак желчных протоков, рак предстательной железы, мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, рак глиальных клеток, множественную миелому, рак прямой кишки, нейроэктодермальную опухоль, нейроэндокринную опухоль, мастоцитому и синдром Горлина, глиому, рак толстой и прямой кишки, стомальные опухоли желудочно-кишечного тракта, рак желудка и пищевода, миелопролиферативную неоплазию и острый лейкоз.

Определение экспрессии биомаркера

В одном примере способ включает определение экспрессии одного или более генов GLI-1, OTX-2, SHROOM2, PDLIM3, SPHK1, SFRP1, APBA2 и SPATA20. Нужные последовательности генов можно обнаруживать при помощи агентов, которые можно применять для специфического определения конкретного гена, например, РНК, транскрибируемой с гена, или полипептидов, кодируемых данным геном.

В одном варианте осуществления способ включает: обеспечение зонда на основе нуклеиновой кислоты, содержащего нуклеотидную последовательность, например, по меньшей мере 10, 15, 25 или 40 нуклеотидов, и всю или почти всю кодирующую последовательность, которая комплементарна части кодирующей последовательности нуклеотидной последовательности генов GLI-1, OTX-2, SHROOM2, PDLIM3, SPHK1, SFRP1, APBA2 и SPATA20; получение образца ткани из млекопитающего, имеющего раковые клетки; введение в контакт в жестких условиях зонда на основе нуклеиновой кислоты и РНК, полученной из биопсии, взятой у пациента с медуллобластомой (например, в Нозерн-блоттинге, гибридизации in situ, ПЦР и т.д.); и определение количества гибридизованного зонда с РНК. Нуклеиновые кислоты могут быть помечены в течение или после процесса обогащения и/или амплификации РНК.

Подразумевается, что биомаркеры GLI-1, OTX-2, SHROOM2, PDLIM3, SPHK1, SFRP1, APBA2 и SPATA20 должны также включать естественные последовательности, включая аллельные варианты, и другие члены семейства. Биомаркеры данного изобретения также включают последовательности, которые комплементарны тем перечисленным последовательностям, которые получены в результате вырожденности кода, а также последовательности, которые являются достаточно гомологичными, и последовательности, которые гибридизуются в жестких условиях с генами данного изобретения.

Условия гибридизации известны специалистам в данной области техники, и их можно найти в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Предпочтительным неограничивающим примером крайне жестких условий гибридизации является гибридизация в 6 X растворе натрия хлорида/натрия цитрата (SSC) при около 45 градусах по Цельсию с последующим одним или более промываниями в 0,2 X растворе SSC, 0,1-процентном растворе SDS при 50-65 градусах по Цельсию. Под термином «достаточно гомологичный» подразумевается аминокислотная или нуклеотидная последовательность биомаркера, которая содержит достаточное или минимальное число одинаковых или эквивалентных (например, аминокислотный остаток, который имеет схожую боковую цепь) аминокислотных остатков или нуклеотидов со второй аминокислотной или нуклеотидной последовательностью так, что первая или вторая аминокислотные или нуклеотидные последовательности имеют общие структурные домены или мотивы и/или общую функциональную активность. Например, аминокислотные или нуклеотидные последовательности, которые имеют общие структурные домены, обладающие по меньшей мере около 50-процентной гомологией, по меньшей мере около 60-процентной гомологией, по меньшей мере около 70-процентной гомологией, по меньшей мере около 80-процентной гомологией, по меньшей мере около 90-95-процентной гомологией в целом по аминокислотным последовательностям доменов, определены в контексте данного описания как достаточно гомологичные. Более того, аминокислотные или нуклеотидные последовательности, которые обладают по меньшей мере около 50-процентной гомологией, по меньшей мере около 60-70-процентной, по меньшей мере около 70-80-процентной, по меньшей мере около 80-90-процентной и по меньшей мере около 90-95-процентной гомологией и имеют общую функциональную активность, определены в данном документе как достаточно гомологичные.

Сравнение последовательностей и определение гомологии в процентах между двумя последовательностями можно выполнить при помощи математического алгоритма. Предпочтительный неограничивающий пример математического алгоритма, применяемого для сравнения последовательностей, представляет собой алгоритм Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, модифицированный согласно Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77. Подобный алгоритм введен в NBLAST и XBLAST программы (version 2.0) Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Нуклеотидные поиски BLAST можно производить при помощи программы NBLAST, значение=100, длина слова=12, для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных TRL молекулам нуклеиновых кислот данного изобретения. Белковые BLAST поиски можно производить при помощи программы XBLAST, значение=50, длина слова=3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных белковым последовательностям, кодируемым генами/олигонуклеотидами, приведенным в таблице 1, 2 и/или таблице 3. Для получения выравниваний с разрывами для целей сравнения можно применять программу Gapped BLAST, как описано в Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Research 25(17):3389-3402. При применении программ BLAST и Gapped BLAST можно применять параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). См. http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Другой предпочтительный неограничивающий пример математического алгоритма, применяемого для сравнения последовательностей, представляет собой алгоритм ALIGN Myers и Miller, CABIOS (1989). При применении программы ALIGN для сравнения аминокислотных последовательностей можно применять матрицу PAM1 20 массовых остатков, штраф за удлинение пропуска в последовательности 12 и штраф за пропуск в последовательности 4.

Настоящее изобретение включает измерение экспрессии одного или более генов GLI-1, OTX-2, SHROOM2, PDLIM3, SPHK1, SFRP1, APBA2 и SPATA20 в образце из биопсии опухоли, взятой у пациента, страдающего раком, вследствие активации пути hedgehog. Уровни экспрессии можно проанализировать и применять для получения показателя, который можно применять для дифференциации тех пациентов, которые имеют опухоль, показывающую активацию пути hedgehog, от тех пациентов, у которых такой опухоли нет.

В одном варианте осуществления способ данного изобретения включает измерение любого из GLI-1, OTX-2, SHROOM2, PDLIM3, SPHK1, SFRP1, APBA2 и SPATA20, приведенных в таблице 1. В другом варианте осуществления способ данного изобретения включает измерение по меньшей мере двух, по меньшей мере трех, по меньшей мере четырех, по меньшей мере пяти, по меньшей мере шести, по меньшей мере семи или по меньшей мере восьми генов из таблицы 1.

В одном примере измеряют уровень экспрессии одного гена, например GLI-1 из таблицы 1. В другом примере измеряют уровень экспрессии двух генов, например GLI-1, OTX-2 из таблицы 1. Еще в одном примере измеряют уровень экспрессии трех генов GLI-1, OTX-2 и SHROOM2 из таблицы 1. Еще в одном примере измеряют уровень экспрессии четырех генов GLI-1, OTX-2, SHROOM2 или PDLIM3 из таблицы 1. Еще в одном примере измеряют уровень экспрессии пяти генов GLI-1, OTX-2, SHROOM2, PDLIM3 и SPHK1 из таблицы 1.

Таблица 1 Название гена Номер доступа Uni Gene ID GLI-1 UGID:2139596 OTX-2 UGID:178376 SHROOM2 UGID:1782725 PDLIM3 UGID:237739 SPHK1 UGID:139253 SFRP1 UGID:164788 APBA2 UGID:2087123 SPATA20 UGID:143131

Биомаркеры данного изобретения также включают любую комбинацию генов, определенных в таблице 1, уровень экспрессии или генный продукт которых служит в качестве прогностического биомаркера. Биомаркеры данного изобретения, включая их генную последовательность, известны в данной области техники (как приведено выше) или, например, для GLI-1 (GLI семейство цинковых пальцев 1; Nature 332:371-374(1988)), для OTX-2 (ортодентический гомеобокс 2; EBO J. 12:2735-2747(1993)), для SHROOM2 (член семейства Shroom 2; Hum. Mol. Genet. 4:373-382(1995)), для PDLIM3 (PDZ и LIM домен 3; J. Cell Biol. 139:507-515(1997)), для SPHK1 (сфингозинкиназа 1; Gene 251:19-26(2000)), для SFRP1 (секретируемый связанный с ожогом белок 1; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:6770-6775(1997)), для APBA2 (бета амилоид (A4) связывающий белок-предшественник, семейство A; J. Biol. Chem. 272:31459-31464(1997)), для SPATA20 (сперматогенез связанный 20; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26), 16899-16903 (2002)). В способе данного изобретения измеряют, анализируют и сравнивают с контролем уровень экспрессии одного или более генов, описанных в таблице 1. Контроль для сравнения может быть определен специалистом в данной области техники. В одном примере контроль определяют выбором значения, которое служит в качестве предельного значения. Например, значение может представлять собой значение, которое разделяет, например, те исследуемые образцы, в которых есть активация hedgehog (hedgehog+), и те образцы, которые не проявляют активации hedgehog (hedgehog-). В другом примере профиль генной экспрессии биомаркера данного изобретения сравнивают с контролем (наличие экспрессии биомаркера в образце, взятом у здорового человека, или из опухоли, в которой активирован hedgehog).

В конкретном варианте осуществления данного изобретения контроль предварительно определен и вычислен показатель, который можно применять для отбора пациентов, имеющих опухоль, опосредованную активацией пути hedgehog. Порог экспрессии можно применять для отбора для тех пациентов, которые будут отвечать на ингибитор сигнального пути Hedgehog.

В другом примере контроль может включать один или более нормировочных генов (таких как описанные ниже), которые являются генами, которые проявляют относительно постоянный уровень генной экспрессии. Нормировочные гены корректируют (нормируют) как для различия в количестве исследуемой РНК, так и вариативности качества применяемой РНК. Следовательно, данный анализ обычно измеряет и включает экспрессию нескольких нормировочных генов, таких как нормировочные гены, показанные в таблице 2.

Таблица 2 Название гена Номер доступа HUWE1 UGID: 150675 LARP1 UGID: 179374 SOD1 UGID: 238951 YME1L1 UGID: 714304

В одном из способов данного изобретения измеряют экспрессию одного или более генов таблицы 1 (например, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи или восьми генов) и обычно конвертируют данные в величину экспрессии после нормировки на уровень экспрессии одного контрольного гена или среднего значения 4 или 3 или 2 контрольных генов, описанных в таблице 2. Полученные величины экспрессии затем применяют для определения показателя, который затем сравнивают с предельным значением для того, чтобы выбрать пациентов, которые имеют Hedgehog-активированную опухоль и, следовательно, с высокой вероятностью получат положительный результат при лечении ингибитором сигнального пути Hedgehog. В одном примере измеряют уровень мРНК по меньшей мере двух, трех, четырех или всех пяти генов GLI-1, OTX-2, SHROOM2, PDLIM3 и SPHK1 и значения мРНК конвертируют в величину экспрессии после нормировки на уровень экспрессии контрольного гена или среднего значения для 4 или 3 или 2 контрольных генов, описанных в таблице 2. Нормировочные гены данного изобретения, UBA и WWE домен содержащий 1 (HUWEI), La семейство доменов рибонуклеопротеинов, член 1 (LARP1), супероксиддисмутаза 1, растворимый (SOD1), данного изобретения, YME1-like 1 (YME1L1), включая их генную последовательность, известны в данной области техники, например номера доступов генной последовательности, предоставленные NCBI, приведены выше.

Биомаркеры данного изобретения можно измерять любым способом, известным в данной области техники, таким как обратно-транскриптазная ПЦР (ОТ-ПЦР). Данный способ включает выделение мРНК при помощи методики, известной в данной области техники и описанной выше, например при помощи набора для очистки, набора буферов и протеазы от коммерческих производителей, таких как Qiagen. Стадию обратной транскрипции обычно запускают при помощи специфических праймеров, случайных гексамеров или олиго-dT праймеров, в зависимости от обстоятельств и цели анализа профиля экспрессии, и полученную кДНК затем можно применять в качестве матрицы для последующей ПЦР реакции. Затем можно проводить TaqMan(R) ОТ-ПЦР, например, при помощи коммерчески доступного оборудования.

Выделенную мРНК затем можно дополнительно анализировать любым способом, известным в данной области техники, таким как микрочип-анализ, количественная («в реальном времени») ПЦР, норзерн-блоттинг и анализ с защитой от нуклеаз. В одном примере применяют количественную ПЦР в реальном времени, которая измеряет накопление ПЦР продукта при помощи двойного мечения флуоресцирующим зондом (например, при помощи зонда TaqMan(R)). ПЦР в реальном времени сочетается как с количественной конкурентной ПЦР, в которой для нормировки применяется внутренний конкурент для каждой последовательности-мишени, так и с количественной сравнительной ПЦР с применением нормировочного гена, содержащегося в образце, или гена «домашнего хозяйства» для РВ-ПЦР. Дополнительную информацию см., например, Held et al., Genome Research 6:986-994 (1996). В анализе ПЦР в реальном времени положительная реакция детектируется по накоплению флуоресцентного сигнала. Ct (порог числа циклов) определяют как число циклов, необходимое для накопления флуоресцентного сигнала выше порогового значения (т.е. превышение уровня фона). Уровни Ct обратно пропорциональны количеству целевой нуклеиновой кислоты в образце (т.е., чем меньше уровень Ct, тем выше уровень целевой нуклеиновой кислоты в образце). Большинство анализов в реальном времени проходят за 40 циклов амплификации.

В другом примере применяют микрочипы, которые включают один или более зондов, соответствующих одному или более генам GLI-1, OTX-2, SHROOM2, PDLIM3, SPHK1, SFRP1, APBA2 и SPATA20. Применение микрочипа приводит к получению гибридизационных картин меченых целевых нуклеиновых кислот на поверхности чипа. Полученные гибридизационные картины можно визуализировать или определить различными способами, при этом конкретный способ детекции выбирают на основании конкретной метки целевой нуклеиновой кислоты. Типичные способы детекции включают измерение активности сцинтилляционным методом, авторадиографию, флуоресцентное измерение, калориметрическое измерение, измерение излучения света, светорассеяние и тому подобное.

В другом примере может применяться микрочип TaqMan® Low Density Array (TLDA), который может включать один или более зондов, соответствующих одному или более генам GLI-1, OTX-2, SHROOM2, PDLIM3, SPHK1, SFRP1, APBA2 и SPATA20. Данный способ применяет микрожидкостный чип, который осуществляет одновременные ПЦР реакции в реальном времени.

В одном примере способ определения применяет сканнер микрочипов, который является коммерчески доступным (Affymetrix, Santa Clara, Calif), например, 417.TM. Arrayer, 418.TM. Array Scanner или Agilent GeneArray.TM. Scanner. Подобный сканнер контролируется системным компьютером с интерфейсом и простыми в применении инструментами программного обеспечения. Выходной сигнал может быть напрямую передан в или напрямую прочитан при помощи множества программных приложений. Сканирующие устройства описаны, например, в патентах США №№ 5143854 и 5424186.

Определение экспрессии продукта биомаркерного гена

Определение наличия белкового продукта, кодируемого одним или более GLI-1, OTX-2, SHROOM2, PDLIM3, SPHK1, SFRP1, APBA2 и SPATA20, можно проводить при помощи любого подходящего способа, известного в данной области техники. Например, нужный агент можно применять для детектирования конкретного нужного белка, например при помощи антитела. Данный способ получения поликлональных и/или моноклональных антител, которые специфически взаимодействуют с полипептидами, применяемый в данном изобретении, известен специалистам в данной области техники, и его можно найти, например, в Dymecki, et al. (J. Biol. Chem. 267:4815, 1992); Boersma and Van Leeuwen (J. Neurosci. Methods 51:317, 1994); Green, et al. (Cell 28:477, 1982); и Arnheiter, et al. (Nature 294:278, 1981). В одном варианте осуществления для количественного определения уровней белков в клеточных образцах можно применять иммуноанализ. Данное изобретение не ограничено конкретной аналитической методикой, и, следовательно, подразумевается, что оно включает как гомогенные, так и гетерогенные методики.

Примерные иммуноанализы, которые могут быть проведены в соответствии с данным изобретением, включают флуоресцентный поляризационный иммуноанализ (ФПИА), флуоресцентный иммуноанализ (ФИА), иммуноферментный анализ (ИФА), ингибирующий нефелометрический иммуноанализ (НИА), твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА) и радиоиммуноанализ (РИА). Индикаторная часть или группа метки может быть присоединена к антителам пациента и выбирается таким образом, чтобы удовлетворить требованиям различных применений данного способа, которые часто продиктованы доступностью оборудования для анализа и совместимыми иммуноаналитическими процедурами. Обычные методики, применяемые при проведении различных иммуноанализов, указанные выше, известны средним специалистам в данной области техники.

В качестве альтернативы можно применять другие способы, такие как анализ вестерн-блоттинг, который включает электрофоретическое разделение белков на полиакриламидном геле, и после окрашивания разделенных белков может быть рассчитано относительное количество каждого белка по оценке его оптической плотности. В качестве альтернативы можно применять другие способы, такие как дот-блоттинг, флуоресцентная сортировка клеток FACS или иммуногистохимия.

Обычно для визуализации наличия исследуемого белка можно применять антитела, выработанные против биомаркеров данного изобретения, которые могут быть мечеными, например, при помощи репортерной молекулы, такой как флуорофоры, ферменты, биотин, хемилюминесцентные молекулы, биолюминесцентные молекулы, дигоксигенин, авидин, стрептавидин или радиоизотопы.

В еще одном варианте осуществления данное изобретение предполагает применение группы антител, которые выработаны против маркерных полипептидов данного изобретения.

Анализ данных

Для облегчения процесса обработки данных анализа образца данные, полученные считывающим устройством прибора, можно проанализировать при помощи цифрового компьютера. Обычно компьютер программируют надлежащим образом для получения и хранения данных с прибора, а также для анализа и составления отчета по собранным данным, например для вычитания фона, подтверждения, что контроли проведены должным образом, нормировки сигналов, интерпретации данных флуоресценции для определения количества гибридизованной мишени, нормировки фона и тому подобного.

Наборы

Данное изобретение также предоставляет наборы для определения уровня экспрессии биомаркеров, описанных в контексте данного описания. Наборы можно применять для определения того, кто получит положительный результат при лечении ингибитором сигнального пути Hedgehog. Набор может включать зонды генов, определенных в таблице 1, и может применяться для измерения генной экспрессии исследуемого образца. В одном варианте осуществления набор включает машиночитаемый носитель, который включает программное обеспечение для анализа профиля экспрессии, которое может быть загружено в память компьютерной системы и которое может конвертировать измеренные уровни экспрессии в показатель риска. Набор может также включать контроли на основе нуклеиновых кислот, буферы и инструкции по применению.

Введение

Ингибиторы сигнального пути Hedgehog, описанные в контексте данного описания, можно селективно вводить в терапевтически эффективных количествах любым из общепринятых и приемлемых способов, известных в данной области техники, как отдельно, так и в комбинации с одним или более терапевтическими агентами, в зависимости от пациента, у которого обнаружили активированный сигнальный путь Hedgehog, как описано в контексте данного описания. Терапевтически эффективное количество может широко варьироваться в зависимости от тяжести заболевания, возраста и относительного здоровья пациента, активности применяемого соединения и других факторов.

Специалист в данной области техники знает много способов и веществ, схожих или эквивалентных тем способам и веществам, которые описаны в контексте данного описания, которые можно было бы применить в практике настоящего изобретения. Действительно настоящее изобретение никаким образом не ограничено описанными способами и веществами. Для целей настоящего изобретения ниже определены следующие термины.

Примеры

Пример 1

Мультигенная сигнатура Hedgehog была первоначально обнаружена при анализе 40 ЗФЗП образцов медуллобластомы (МБ). Соответствующие свежезамороженные образцы с такими же характеристиками были предварительно профилированы, как описано Y-J Cho и коллегами (Y-J Cho et al, JCO, 2010), и каждый индивидуальный случай определяли либо как Hedgehog-активированный, либо Hedgehog-неактивированный, на основании его профиля генной экспрессии. Выборка из 32 кандидатных генов, которые характерно экспрессировались в hedgehog положительных (Hh+) в сравнении с hedgehog отрицательными (Hh-) опухолями, и еще 22 потенциальных нормировочных гена были отобраны из объединенной базы данных доступных исследований по профилированию. Все кандидатные гены, которые показали характерную экспрессию Hh+ в сравнении Hh-, совпадали во всех проведенных исследованиях по профилированию. РВ-ПЦР анализы для данных кандидатных генов были проведены и оптимизированы для применения в ЗФЗП образцах. Кандидатные гены, которые не показали устойчивой экспрессии в ЗФЗП типах образцов, были удалены из дальнейшего исследования. Анализы с устойчивыми характеристиками в ЗФЗП для 10 активированных и 8 подавленных генов в Hedgehog+ в сравнении с Hedgehog- опухолями плюс 5 контрольных генов были впоследствии отобраны и нанесены на микрочип TLDA, который обеспечивает более экономный расход ткани по сравнению с режимом одиночных исследований. Данную выборку из 23 кандидатных генов затем проанализировали в 40 ЗФЗП образцах с известным Hedgehog активационным статусом.

При помощи метода эластичной сети была отобрана оптимальная модель, которая имеет минимальную ошибку прогнозирования Hedgehog активационного статуса и включает наименьшее число генов (J. Friedman, T. Hastie, and R. Tibshirani, J. of Statistical Software, 2008). Две оптимальные модели, одна с 5-генной сигнатурой и другая с 8-генной сигнатурой, показали схожие характеристики при 5-кратной перекрестной проверке. Данные модели позволяют вычисление показателя вероятности наличия Hedgehog+ для данного образца на основании уровней экспрессии или 5, или 8 генов соответственно. На основании данного показателя вероятности было установлено предельное значение для осуществления определения Hedgehog+ по сравнению с Hedgehog- статуса для исследуемых образцов.

Кроме того, было исследовано применение только одного гена (SPHK1, OTX2, SFRP1, PDLIM3 или SHROOM2) для прогнозирования Hedgehog активационного статуса, и при помощи этого набора из 40 медуллобластомных опухолей было установлено предельное значение для каждого из данных генов, чтобы сделать выводы о Hedgehog+ по сравнению с Hedgehog-.

Как 5-, так и 8-генные модели, также как и одногенная модель, затем были внешним образом проверены в независимом наборе образцов из 25 медуллобластомных опухолей. Все 25 пациентов имели патологически подтвержденный диагноз, включая 13 с классической гистологией, 9 с узелковой/десмопластической гистологией и 2 с крупноклеточной/анапластической гистологией. Среди 25 пациентов 13 были мужчинами и 12 женщинами. Образцы тканей у 24 пациентов были отобраны при диагностике, и у одного пациента отобран после лечения химиотерапией. Средний возраст данных 25 пациентов на момент диагностики составляет 3 года в диапазоне от 6 месяцев до 16 лет. ЗФЗП образцы этих 25 случаев медуллобластомы были проанализированы при помощи способа данного изобретения для определения Hedgehog активационного статуса при помощи 5-генной и 8-генной моделей. Соответствующие свежезамороженные образцы опухолевых тканей от тех же 25 пациентов, отобранные в одни и те же временные промежутки, в виде ЗФЗП образцов были подвергнуты профилированию генной экспрессии при помощи чипа GeneChip human genome U133 Plus 2.0 (Affymetric, Santa Clara, CA). 25 пациентов были классифицированы по опухолям на субгруппу c3 (Hedgehog активированный субкласс) или не субгруппу c3 на основании молекулярной субклассификации медуллобластом по генному профилю, как описано Y-J Cho и его коллегами (YJ Cho et al. JCO, 2010).

Было определено, что восемь из 25 пациентов имели субгруппу c3, Hedgehog-активированную опухоль, в то время как 17 с Hedgehog-неактивированными опухолями. Данная молекулярная классификация 25 пациентов с медуллобластомой была проведена до анализа ЗФЗП образцов опухолей при помощи способа данного изобретения. Следовательно, ЗФЗП образцы, которые анализировали при помощи способа данного изобретения, считали образцами с известным Hedgehog активационным статусом. На основе уровней экспрессии 8 генов (GLI-1, OTX-2, SHROOM2, PDLIM3, SPHK1, SFRP1, APBA2 и SPATA20) была применена прогностическая модель для расчета показателя вероятности Hedgehog+ статуса (0-100%) для данного образца. На основании предварительно установленного предельного значения вероятности каждый образец был определен либо как Hedgehog-активированный, либо Hedgehog-неактивированный. Восемь образцов были определены как Hedgehog-активированные, а оставшиеся 17 были определены как Hedgehog-неактивированные, показывая 100% совпадение с известным Hedgehog активационным статусом данных образцов. Кроме того, среднее значение показателя вероятности для 17 Hedgehog-неактивированных опухолей составляет 0,9% в диапазоне от 0,2% до 3,1%. Средний показатель вероятности для 8 Hedgehog-активированных опухолей составляет 87,0% в диапазоне от 70,9% до 96,6%. Существенное различие в среднем показателе вероятности между отрицательными и положительными случаями подтвердило устойчивость определения Hedgehog+ по сравнению с Hedgehog- при помощи 8-генной модели.

На основании уровней экспрессии 5 генов (GLI-1, OTX-2, SHROOM2, PDLIM3, SPHK1) и связанной прогностической модели рассчитывали показатель вероятности для каждого из 25 образцов и сравнивали с предварительно установленным предельным значением. Затем для каждой опухоли определяли Hedgehog активационный статус, также со 100% совпадением с известным Hedgehog активационным статусом. Средний показатель вероятности для 17 Hedgehog-неактивированных опухолей составляет 0,7% в диапазоне от 0,1% до 3,0% и для 8 Hedgehog-активированных опухолей 87,9% в диапазоне от 69,1% до 97,6%, показывая схожую устойчивость определения Hedgehog статуса, как и 5-генная модель.

На основании уровня экспрессии одного гена, SPHK1, OTX2, SFRP1, PDLIM3 или SHROOM2, было проведено определение Hedgehog+ или Hedgehog- статусов для 25 случаев медуллобластомы относительно предварительно определенного предельного значения для каждого из генов. Hedgehog статусы, определенные при помощи SPHK1, OTX2 или SFRP1, для каждой из 25 опухолей полностью соответствовали известному Hedgehog активационному статусу в 8 Hedgehog+ случаях и 17 Hedgehog- случаях. При помощи PDLIM3 было определено 24/25 правильных статуса. Одна Hedgehog+ опухоль была неверно определена как Hedgehog-, что приводит к 87,5% чувствительности и 100% специфичности прогноза. Прогноз, сделанный на основе SHROOM2, показал 75% чувствительность и 94% специфичность с 22/25 правильными статусами. Две Hedgehog+ опухоли были неверно определены как Hedgehog-, и одна Hedgehog- опухоль была определена как Hedgehog+. Следовательно, в дополнение к мультигенной модели, которая опирается на сложные измерения связанных генов, отдельные гены в мультигенной Hedgehog сигнатуре сами по себе показали значительную прогностическую способность при определении Hedgehog активационного статуса для медуллобластомы. Настоящее исследование предоставляет проверку того, что каждый из этих генов в способе настоящего изобретения можно применять для определения Hedgehog активационного статуса в медуллобластоме.

Контрольные гены HUWE1, LAPR1, SOD1 и YME1L1 были выбраны для нормировки экспрессии генов, которые классифицировали медуллобластомные (МБ) опухоли на основании hedgehog активационного статуса. В идеале контрольный ген должен экспрессироваться стабильно и на одинаковом уровне во всех опухолевых тканях, которые исследуются. Несколько исследований предполагали, что даже широко применяемые контрольные гены, такие как β-актин и GAPDH, непригодны в ряде случаев. Кроме того, в объединенной базе данных из доступных внешних исследований по профилированию свежезамороженных образцов МБ опухолей данные широко применяемые контрольные гены показали очень высокие уровни экспрессии более чем lg2>11 по сравнению с генами hedgehog пути с уровнями экспрессии около lg2>8. Таким образом, были выбраны контрольные гены со схожими уровнями экспрессии, такими как у генов пути hedgehog. В нашем исследовании при помощи РВ-ПЦР анализа не было результативно определено ни одного набора зондов, который имел уровень экспрессии lg2<8.

Важный критерий для отбора контролей главным образом основан на неизменности генов во всех проанализированных наборах данных. Было установлено, что процентный коэффициент изменчивости составляет менее 4 процентов. Нормировочные гены дополнительно отбирали, исходя из того, возможно ли было создать метод анализа с размером ампликона <80 п.о., и затем могла ли быть показана устойчивая экспрессия в ЗФЗП образцах при помощи оптимизированного метода анализа.

Доступные примерные зонды показаны в таблице 3.

Таблица 3 Ген Идентификационный номер анализа ABI Требуемая последовательность Граница сплайсинга Функция в сигнатуре GLI1 Hs00171790_m1 NM_005269.2 11 и 12 Активация PDLIM3 Hs01062534_m1 NM_014476.3 6 и 7 Активация SHROOM2 Hs01113636_m1 NM_001649.2 9 и 10 Активация SPHK1 Hs00184211_m1 NM_182965.2 5 и 6 Активация OTX2 Hs00222238_m1 NM_021728.2 4 и 5 Подавление APBA2 Hs01125385_m1 NM_005503.3 8 и 9 Активация HUWE1 Hs00948075_m1 NM_031407.4 67 и 68 Контроль YME1L1 Hs00204609_m1 NM_139312.1 1 и 2 Контроль SOD1 Hs00533490_m1 NM_000454.4 1 и 2 Контроль LARP1 Hs00391726_m1 NM_015315.3 3 и 4 Контроль

Примерные зонды для SFRP1 включают прямой праймер 5'-CCAATGCCACCGAAGCC-3' (SEQ ID NO:1) и обратный праймер 5-TCACAGGGAGGACACACCG-3' (SEQ ID NO:2) и FAM.

Примерные зонды для SPATA20 включают прямой праймер 5'-CAAGGCCAGGAAGGAAAACA-3' (SEQ ID NO:3) и обратный праймер 5'-CACCAGTGGCAGGTGGAGTA3' (SEQ ID NO:4) и FAM.

Пример 2

Взрослые пациенты, страдающие раком, включая пациентов с медуллобластомой, были зарегистрированы для текущей фазы I, исследования с эскалацией дозы [6-(цис-2,6-диметилморфолин-4-ил)-пиридин-3-ил]-амида метил-4'-трифторметоксибифенил-3-карбоновой кислоты для оценки безопасности и переносимости [6-(цис-2,6-диметилморфолин-4-ил)-пиридин-3-ил]-амида метил-4'-трифторметоксибифенил-3-карбоновой кислоты и определения максимально переносимой дозы [6-(цис-2,6-диметилморфолин-4-ил)-пиридин-3-ил]-амида метил-4'-трифторметоксибифенил-3-карбоновой кислоты для взрослых пациентов. Архивные ЗФЗП образцы опухолей, отобранные до начала испытания, доступны для анализа при помощи способа настоящего изобретения от 3 зарегистрированных пациентов с медуллобластомой. Один пациент, которого лечили дневной дозой 200 мг [6-(цис-2,6-диметилморфолин-4-ил)-пиридин-3-ил]-амида метил-4'-трифторметоксибифенил-3-карбоновой кислоты, проявил частичный ответ (ЧО) по критериям RECIST (Критерии оценки ответа солидных опухолей) после 2 месяцев лечения, и ответ сохранялся в течение 4 месяцев до прогрессирования заболевания. Другого пациента с метастазирующей медуллобластомой без измеримых образований лечили дневной дозой 1500 мг, и он показал метаболический частичный ответ, измеренный позитронной эмиссионной томографией (ПЭТ), который длился в течение 7 месяцев до возврата болезни. 3-ий пациент быстро прогрессировал всего после 52 дней лечения [6-(цис-2,6-диметилморфолин-4-ил)-пиридин-3-ил]-амидом метил-4'-трифторметоксибифенил-3-карбоновой кислоты при дневной дозе 200 мг.

На основании 8-генной и 5-генной прогностической модели для определения Hedgehog активационного статуса в опухоли для этих 3 пациентов применяли способ данного изобретения. У двух пациентов, ответивших на лечение, было определено наличие Hedgehog-активированной опухоли, в то время как опухоль у не ответившего на лечение пациента была определена как Hedgehog-неактивированная опухоль. Кроме того, отдельные гены, SPHK1, OTX2, SFRP1, PDLIM3 или SHROOM2, каждый применяли для определения Hedgehog активационного статуса относительно предварительно установленного предельного значения для каждого из генов. При помощи каждого отдельного гена были проведены такие же исследования по установлению Hedgehog-активированных и Hedgehog-неактивированных статусов для двух ответивших на лечение пациентов и одного не ответившего на лечение пациента соответственно. Среди 3 пациентов только один пациент имел подходящие образцы опухолевой ткани, доступные для дополнительного мутационного анализа генов PTCH1 и SMO. Было обнаружено, что данный пациент, который проявил метаболический частичный ответ и получил статус Hedgehog+ при помощи способа данного изобретения, имеет соматическую мутацию в гене PTCH1. Инактивация мутаций PTCH1 была идентифицирована как главный механизм конститутивной активации сигнального пути Hedgehog при медуллобластоме. Следовательно, идентификация такой PTCH1 мутации обеспечивает основу механизма активации сигнального пути Hedgehog и наблюдаемой клинической эффективности в ответ на ингибитор сигнального пути Hedgehog у этого пациента и дополнительно валидирует полученные данные при помощи способа данного изобретения.

Пример 3

Способ данного изобретения применяли для верификации Hedgehog активационного статуса в другой выборке из 40 медуллобластом с патологически подтвержденным диагнозом. Среди всех 40 случаев 26 имели классическую медуллобластомную гистологию, 12 узелковую/десмопластическую гистологию и 1 крупноклеточную/анапластическую гистологию. Другие демографические данные, связанные с данными случаями, были недоступны. Hedgehog активационный статус данных опухолей был предварительно охарактеризован при помощи способа аффиметрического профилирования генной экспрессии, как описано Y-J Cho и его коллегами (YJ Cho et al. JCO, 2010). Hedgehog-активированный статус в 15 случаях и Hedgehog-неактивированный статус в оставшихся 25 случаях были подтверждены в ЗФЗП образцах опухолей при помощи способа данного изобретения на основе 8-генной модели, 5-генной модели и каждого из отдельных генов SPHK1, OTX2, SFRP1, PDLIM3 или SHROOM2.

Пример 4

В дополнении к Hedgehog-активированной медуллобластоме, базальноклеточная карцинома (БКК) является еще одним типом рака, который наиболее часто запускается мутациями или генетическими нарушениям в генах пути Hedgehog, что приводит к конститутивной активации пути Hedgehog. Было обнаружено, что более 90% пациентов с БКК, самым распространенным раком кожи, либо имеют инактивирующие мутации в гене PTCH1, либо реже генетические нарушения других генов пути Hedgehog, таких как активирующие мутации SMO. В текущей фазе I исследования с эскалацией дозы [6-(цис-2,6-диметилморфолин-4-ил)-пиридин-3-ил]-амида метил-4'-трифторметоксибифенил-3-карбоновой кислоты, ингибитора сигнального пути Hedgehog, подавляющего SMO, взрослые пациенты с БКК были зарегистрированы среди пациентов с другими солидными опухолями. Провели мутационный анализ PTCH1 и SMO непосредственным секвенированием архивных образцов опухолей, отобранных у зарегистрированных пациентов с БКК во время диагностики. Было обнаружено, что шесть пациентов с БКК имеют мутации либо в PTCH, либо в SMO, включая двух пациентов с синдромом Горлина, у которых была идентифицирована генеративная мутация в PTCH1. Для определения Hedgehog активационного статуса БКК опухолей у данных пациентов применяли способ данного изобретения. При помощи как 5-генной, так и 8-генной моделей показатель вероятности всех 6 случаев был выше предварительно установленного предельного значения, и, следовательно, все они были определены как Hedgehog-активированные. Среди этих 6 пациентов 2 проявили подтвержденный частичный ответ на лечение [6-(цис-2,6-диметилморфолин-4-ил)-пиридин-3-ил]-амидом метил-4'-трифторметоксибифенил-3-карбоновой кислоты, 2 имели стабильное состояние болезни в течение более 6 месяцев, и другие 2 пациента перестали принимать [6-(цис-2,6-диметилморфолин-4-ил)-пиридин-3-ил]-амид метил-4'-трифторметоксибифенил-3-карбоновой кислоты из-за побочных эффектов после менее 2 месяцев терапии, что могло быть слишком коротким сроком для наблюдения клинической эффективности. Постоянство, показанное в результатах по положительным мутациям в PTCH1/SMO и Hedgehog+ статусам, полученных при помощи способа данного изобретения, несмотря на другой тип рака, дополнительно валидирует способ данного изобретения. Способ данного изобретения может применяться для идентификации других типов опухолей с такой же этиологией, в основе которой лежит Hedgehog-мутация, которые преимущественно могли бы получить положительный результат при терапии ингибитором сигнального пути Hedgehog.

Пример 5

Иммуногистохимический (ИГХ) анализ экспрессии GLI-1 и SFRP-1 на белковом уровне был описан в PA Northcott et al., JCO, 2010). Было сделано предположение, что наличие положительного ИГХ окрашивания данных двух белковых маркеров можно было бы применять в качестве способа идентификации Hh+ медуллобластомы. GLI-1 и SFRP-1 оба представляют собой отдельные гены, описанные в данном способе изобретения. 40 медуллобластомных ЗФЗП образцов тканей с определенным при помощи данного способа изобретения Hh активационным статусом подвергались ИГХ анализу с применением антител против белкового продукта GLI-1 (Cell Signaling, Beverly, MA) и SFRP-1 (Abcam, Cambridge, MA). Образцы с любыми уровнями или ядерного окрашивания Gli-1, или цитоплазматического окрашивания SFRP-1 внутри содержимого опухоли на срезах определялись как Hh положительные. Образцы без какого-либо окрашивания двух маркеров в соответствующем месте клетки определялись как Hh отрицательные. Hh активационный статус, определенный при помощи ИГХ способа и при помощи способа данного изобретения, согласовывался во всех исследуемых случаях, давая в результате 100% сходимость между двумя способами. Кроме того, наблюдалась высокая степень сходимости между ИГХ окрашиванием Gli-1 и SFRP-1. Эти данные не только дополнительно валидировали данный способ изобретения, но также подтверждают, что отдельные маркеры, описанные в способе данного изобретения, могут экспрессироваться не только на уровне транскрипции, но также и на белковом уровне.

Группа изобретений относится к медицине и касается способа анализа биологического образца пациента, страдающего медуллобластомой, включающего определение уровня экспрессии пяти биомаркеров GLI-1, ОТХ-2, SHROOM2, PDLIM3 и SPHK1 в биологическом образце, взятом у пациента, где увеличенный уровень экспрессии биомаркеров GLI-1, SHROOM2, PDLIM3 и SPHK1 и сниженный уровень экспрессии биомаркера ОТХ-2 по сравнению с контролем служит диагностическим индикатором того, имеет ли пациент повышенную вероятность ответа на [6-(цис-2,6-диметилморфолин-4-ил)-пиридин-3-ил]-амид метил-4′-трифторметоксибифенил-3-карбоновой кислоты. Группа изобретений также касается способа отбора пациента, страдающего медуллобластомой, для лечения ингибитором сигнального пути Hedgehog; набора для определения того, чувствительна ли медуллобластомная опухоль к лечению ингибитором сигнального пути Hedgehog; способа лечения медуллобластомы у пациента, который в этом нуждается. Группа изобретений обеспечивает предсказание ответа пациентов с медуллобластомой на лечение с использованием ингибитора сигнального пути Hedgehog. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 5 пр., 3 табл.

1. Способ анализа биологического образца пациента, страдающего медуллобластомой, включающий определение уровня экспрессии пяти биомаркеров GLI-1, ОТХ-2, SHROOM2, PDLIM3 и SPHK1 в биологическом образце, взятом у пациента, где увеличенный уровень экспрессии биомаркеров GLI-1, SHROOM2, PDLIM3 и SPHK1 и сниженный уровень экспрессии биомаркера ОТХ-2 по сравнению с контролем служит диагностическим индикатором того, имеет ли пациент повышенную вероятность ответа на [6-(цис-2,6-диметилморфолин-4-ил)-пиридин-3-ил]-амид метил-4′-трифторметоксибифенил-3-карбоновой кислоты.

2. Способ отбора пациента, страдающего медуллобластомой, для лечения ингибитором сигнального пути Hedgehog [6-(цис-2,6-диметилморфолин-4-ил)-пиридин-3-ил]-амидом метил-4′-трифторметоксибифенил-3-карбоновой кислоты, при этом данный способ включает определение уровня экспрессии по меньшей мере трех биомаркеров, выбранных из группы, состоящей из GLI-1, ОТХ-2, SHROOM2, PDLIM3 и SPHK1, в биологическом образце, полученном от пациента, чтобы, таким образом, прогнозировать повышенную вероятность ответа на ингибитор сигнального пути Hedgehog [6-(цис-2,6-диметилморфолин-4-ил)-пиридин-3-ил]-амид метил-4′-трифторметоксибифенил-3-карбоновой кислоты, где увеличенный уровень экспрессии биомаркеров GLI-1, SHROOM2, PDLIM3 или SPHK1 и сниженный уровень экспрессии биомаркера ОТХ-2 по сравнению с контролем предсказывают повышенную вероятность ответа на ингибитор сигнального пути Hedgehog [6-(цис-2,6-диметилморфолин-4-ил)-пиридин-3-ил]-амид метил-4′-трифторметоксибифенил-3-карбоновой кислоты.

3. Способ по п. 2, включающий определение уровня по меньшей мере четырех биомаркеров.

4. Способ по п. 2, включающий определение уровня по меньшей мере пяти биомаркеров.

5. Способ по любому из пп. 1-4, в котором определяющим является уровень экспрессии мРНК.

6. Набор для определения того, чувствительна ли медуллобластомная опухоль к лечению ингибитором сигнального пути Hedgehog [6-(цис-2,6-диметилморфолин-4-ил)-пиридин-3-ил]-амидом метил-4′-трифторметоксибифенил-3-карбоновой кислоты, включающий обеспечение одного или более зондов или праймеров для определения уровня экспрессии биомаркеров, приведенных в п. 1 или 2, в образце и инструкции по применению.

7. Способ лечения медуллобластомы у пациента, который в этом нуждается, включающий выборочное введение ингибитора сигнального пути Hedgehog [6-(цис-2,6-диметилморфолин-4-ил)-пиридин-3-ил]-амида метил-4′-трифторметоксибифенил-3-карбоновой кислоты пациенту, исходя из того, что пациент имеет повышенный уровень экспрессии биомаркеров GLI-1, SHROOM2, PDLIM3 и SPHK1 и пониженный уровень экспрессии биомаркера ОТХ-2.

8. Способ по п. 7, в котором образец пациента исследуют на предмет экспрессии биомаркеров и образец представляет собой зафиксированную в формалине заключенную в парафин ткань (ЗФЗП).