Способ диагностики врожденных аномалий сердца у детей в условиях избыточной контаминации никелем Российский патент 2025 года по МПК G01N33/58 G01N33/52 G01N30/72 C12Q1/6806 C12Q1/6827 C12Q1/686 C12Q1/6876 C12Q1/6883 

Изобретение относится к области медицины и биологии, в частности к исследованиям ксенобиотиков, а именно никеля, вызывающего нарушение состояния сердечно-сосудистой системы у детей, проживающих в районах экологического неблагополучия, и может быть использовано для ранней диагностики и прогнозирования токсического действия никеля на реализацию врожденных аномалий сердца у детей (малые аномалии развития сердца – далее «МАРС»).

Изобретение может быть использовано для постановки предварительного диагноза как в специализированных клиниках при обследовании пациентов, так и в обычных учреждениях здравоохранения. Результаты указанных обследования необходимы для разработки индивидуальных программ наблюдения и лечения в зависимости от тяжести нарушения функции сердца ребенка, а, кроме того, могут быть использованы при формировании санитарно-гигиенических мероприятий по предупреждению и устранению воздействия вредных химических веществ, обуславливающих формирование врожденных аномалий сердца у детей.

В настоящее время в атмосферном воздухе промышленных центров присутствует смесь химических загрязнителей от предприятий и автотранспорта. Выявлено, что повышенная концентрация в среде обитания техногенных химических факторов, тропных к сердечно-сосудистой системе, создает риск развития ранних проявлений врожденных аномалий сердца у детей.

Детские болезни сердца характеризуются задержкой диагностирования, поскольку некоторые из них протекают бессимптомно.

Последнее десятилетие приобретает актуальность, но остается до конца не решенным вопрос возможного влияния токсичных и потенциально токсичных химических элементов (ХЭ) на возникновение и прогрессирование кардиоваскулярных заболеваний.

Современные научные изыскания не в полной мере освещают вопросы аддитивности компонентов средовой химической нагрузки и условий декомпенсации слабых генетически наследуемых компартментов регуляторных систем и обмена организма, лежащих в основе формирования патологии сердечно-сосудистой системы. Состояние окружающей среды всегда являлось одним из наиболее важных факторов, влияющих на жизнедеятельность человека и общества в целом. Тяжелые металлы занимают второе место по токсичности среди всех веществ, загрязняющих окружающую среду, превышение их содержания приводит к развитию множества заболеваний. Так повышенные уровни аэрогенной экспозиции никеля и меди, обусловленные деятельностью человека, наиболее часто обнаруживаются вблизи литейных заводов и электростанций. Никель влияет на уровень кровяного давления, конкурентно воздействует на баланс макро- и микроэлементов, моделирует и формирует особенности нервной и иммунной регуляции состояния сосудов и сердца.

Вред никеля состоит не только в том, что его количество в значительной степени превышает необходимые и очень малые дозировки. Его токсичность связана с попаданием в организм, прежде всего, его свободных ионов, имеющих положительную валентность (Ni²⁺). Они в более высокой степени связываются тканями организма, и проявляют более высокую токсичность и канцерогенность, чем его молекулярные и комплексные соединения.

Для задач ранней диагностики нарушений здоровья детей, а также для оценки эффективности профилактики и лечения актуальным является выделение маркерных показателей генетического статуса, обеспечивающих функционирование сердечно-сосудистой системы, которые можно использовать в качестве дополнительных диагностических критериев, характеризующих ответ организма на специфическое средовое окружение.

Врожденные пороки сердца (ВПС) – это большая группа разнообразных по формированию и анатомии аномалий внутриутробного развития сердца и крупных сосудов, впадающих в его полости или выходящих из них. Несмотря на то, что современные способы и технические возможности ультразвукового исследования (эхокардиографии) позволят обнаружить ВПС у плода начиная с 12-14 недели беременности с высокой долей вероятности (до 96%), тем не менее, регистрируются случаи позднего выявления этой патологии, как среди детей, так и среди взрослого контингента. Среди наиболее вероятных причин формирования ВПС приводятся генетические и хромосомные аберрации, вирусные инфекции матери в период беременности, хронические эндокринные заболевания и болезни обмена веществ, вредные привычки, тератогенные и мутагенные неблагоприятные факторы внешней среды.

Наблюдаемые у ребенка отклонения в функционировании сердца характеризуются рядом клинических состояний, к которым относятся малые аномалии развития сердца (МАРС), под которым понимают анатомическое изменение сердца и магистральных сосудов, не приводящие к грубым нарушениям функций сердечно-сосудистой системы. МАРС – многочисленная группа заболеваний сердца, возникающих в результате неправильного развития соединительной ткани. Так причиной дополнительной хорды в сердечном желудочке является генетическая предрасположенность.

В настоящее время хорошо изучены факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний, к которым относятся высокий уровень артериального давления крови, избыток массы тела, сахарный диабет и др. Разработаны клинические и биохимические маркеры повышенного риска сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ): высокий уровень общего холестерина и холестерина липопротеидов низкой плотности, низкий уровень холестерина липопротеидов высокой плотности, высокий уровень глюкозы сыворотки крови и др.

В настоящее время риск ССЗ оценивается по данным клинико-инструментальных методов (измерение уровня артериального давления крови, эхо- и электрокардиография, ангиография и т.д.), биохимических показателей (липидный спектр крови, уровень глюкозы крови), с учетом воздействия вредных внешне-средовых факторов, а также используют генетические маркеры для диагностирования ССЗ.

Из патента РФ № 2444297 известен способ оценки риска развития неблагоприятных сердечно-сосудистых событий у больных ишемической болезнью сердца, подвергшихся эндоваскулярной реваскуляризации миокарда в течение одного года после вмешательства. Для оценки риска развития неблагоприятных сердечно-сосудистых событий проводят оценку уровня провоспалительных цитокинов ИЛ-6 и FNOα, холестерина липопротеинов низкой плотности плазмы крови, триглицеридов, холестерина липопротеинов высокой плотности, учитывают факт табакокурения и неприема статинов. При наличии более четырех учитываемых факторов: исходный уровень провоспалительных цитокинов ИЛ-6 более 5 нг/мл и FNOα, более 50 нг/мл, холестерина липопротеинов низкой плотности более 2,5 ммоль/л, холестерина липопротеинов высокой плотности менее 1,0 ммоль/л, триглицеридов более 1,7 ммоль/л, курение, неприем статинов, больных относят к категории высокого риска наступления неблагоприятных сердечно-сосудистых событий. Способ позволяет прогнозировать наступление неблагоприятных сердечно-сосудистых событий у больных ишемической болезнью сердца в течение 1 года после эндоваскулярной реваскуляризации миокарда путем количественной оценки наиболее чувствительных факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний. Недостатком этого способа является то, что не позволяет оценить риск формирования ССЗ именно у детей, так как составляющие критерии заявки – липопротеины высокой плотности, факт табакокурения и неприем статинов – это факторы развития ССЗ у взрослых.

Из патента РФ № 2453606 известен способ расширенного скрининга предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям и биочип для осуществления этого способа. Способ включает стадию выделения геномной ДНК из клинического образца, амплификацию участков генов АСЕ, АРОА4, АРОА5, АРОВ, EDN1, MEF2A, FGA, ADRB1, TNBS4, АРОЕ, FBN1, AGXT, MTHFR, CCR2, F5, F2, F7, АВСА1, ITGB3, AGTR2, B2R, DES, TLR4, NOS3, KDR, MMP9, THBS2, LPL, МРО, содержащих последовательности полиморфных локусов, перечисленные в SEQ ID 1-672 и получение одноцепочечного флюоресцентно меченого продукта методом ник-трансляции и рестрикции. Приготавливают биочип для скрининга предрасположенности к заболеваниям сердечно-сосудистой системы, содержащий набор иммобилизованных олигонуклеотидов SEQ ID 1-672. Осуществляют гибридизацию меченого амплифицированного продукта на указанном биочипе. Регистрируют результаты при длине волны 635 нм и 532 нм для красителей Cy5 и Cy3 соответственно. Интерпретируют результаты гибридизации путем сравнения интенсивности флюоресцентных сигналов, полученных при совершенной и несовершенной гибридизации. Предложенное изобретение позволяет получить комплексную оценку генетических предрасположенностей пациента к сердечно-сосудистым заболеваниям и оценить риски развития сердечно-сосудистых заболеваний.

Однако его недостатком является то, что в биочип не включен участок гена IL-6 G174C (rs1800795), а значит не оценивался риск токсического воздействия на сердечно-сосудистую систему никельсодержащих соединений.

Из уровня техники известно, что в настоящее время большинство способов диагностики нарушений сосудисто-сердечной системы основано на использовании в качестве маркеров показателей крови и генетические критерии. Причем известно, что при этом в качестве маркерного показателя используют ген MTHFR C677T.

Из уровня техники (Патент РФ № 2376372) известен способ генетической диагностики подверженности к сердечно-сосудистым заболеваниям. Способ может быть использовано для диагностики наследственной предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям у человека и основан на определении генотипов по полиморфным вариантам Al166C гена AGTR1, А-240Т и A2350G гена АСЕ, С677Т гена MTHFR, T174M гена AGT, C825T гена GNB3, VNTR4a/b и G894T гена NOS3, G1691А гена F5, PLA1/A2 гена ITGB3, G20210A гена F2 и оценке риска путем суммирования количества баллов, присвоенных каждому генотипу. При этом генотипам «низкого» риска сердечно-сосудистой патологии присваивается 0 баллов, к ним относятся генотипы 1166АА гена AGTR1, -240АА, 2350АА гена АСЕ, 677СС гена MTHFR , 174TT гена AGT, 825CC гена GNB3, VNTR4bb и 894GG гена NOS3, 1691GG гена F5, PLA1/A1 гена ITGB3, 20210GG гена F2. Генотипам «среднего» риска присваивается 0,5 баллов, к ним относятся генотипы 1166АС гена AGTR1, -240АТ и 2350AG гена АСЕ, 677СТ гена MTHFR , 174TM гена AGT, 825CT гена GNB3, VNTR4ab и 894GT гена NOS3. Генотипам «высокого» риска присваивается 1 балл, к ним относятся генотипы 1166СС гена AGTR1, -240ТТ и 2350GG гена АСЕ, 677ТТ гена MTHFR , 174MM гена AGT, 825TT гена GNB3, VNTR4aa и 894GT гена NOS3, 1691GA и 1691АА гена F5, PLA1/A2 и PLA2/A2 гена ITGB3, 20210GA и 20210АА гена F2. Риск сердечно-сосудистых болезней считается «низким» при сумме баллов от 0 до 3, средним - от 3,5 до 6, высоким - от 6,5 до 11 баллов.

Недостатком указанного способа является то, что он не позволяет ответить на вопрос о реализации заявленного риска (уровне экспрессируемых геном белков, например, гомоцистеина) и не отвечает на вопрос о факторе, который мог бы вызвать сердечно-сосудистую патологию (инфекционный, химический агент).

Кроме того, существует количественный метод использования полимеразной цепной реакции для выявления экспрессии генов интерлейкина-4 в периферической крови при физиологическом состоянии у взрослых Реферат CN 1629316 (А) - 20050622 (Fluorogenic quantitative PCR method for detecting interleukin 4 gene expression in peripheralblood under physiological state, inventor(s): Chen Peijie; Dong Qianggang; Wang ru [cn] Applicant(s): shanghai physical education in (Shanghai Physical education institute). Авторами предлагается количественный способ определения иммунохимического маркера - цитокина-4 в периферической крови, а также метод может применяться для специфического выявления экспрессии гена цитокина – интерлейкина 4 для определения ранней стадии усталости и предотвращения снижения иммунологической реактивности, вызванного избыточной физической нагрузкой.

Недостатками данного способа являются:

- для прогнозирования риска развития приобретенной кардиомиопатии у детей, длительно занимающихся спортом, недостаточно использовать один показатель;

- концентрация интерлейкина-4 отражает активность противовоспалительных процессов в организме, в тоже время состояние провоспалительных процессов остается не оцененным;

- повышение концентрации интерлейкина-4 может быть связано с различными процессами в организме ребенка, а не только с гемодинамическими нарушениями, сопровождающими приобретенную кардиомиопатию. Можно обратить внимание и на то, что он не отражает состояние сердечной мышцы, поэтому использование его для прогнозирования проявлений врожденных аномалий сердца у детей не целесообразно.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является Способ выявления у детей ранних нарушений физиологической функции сердца в условиях контаминации токсикантом - фенолом (Патент РФ № 2657821). Способ включает отбор пробы крови у ребенка и определение в пробе содержания токсиканта - фенола, отбор пробы буккального эпителия и осуществление выделения из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), генотипирование полиморфизма двух генов MTHFR и SULTIAI, исследование генотипов гена MTHFR С677Т (rs1801133) и гена SULTIAI G2663A (rs9282861), при одновременном выполнении следующих условий: наличие вариантного гомозиготного или гетерозиготного генотипов гена MTHFR С677Т (rs1801133) и гена SULTIAI G2663A (rs9282861), и при превышении концентрации фенола в крови выше фонового уровня более чем в 1,5 раза, диагностируют у ребенка наличие ранних нарушений физиологической функции сердца в виде функциональной кардиопатии, связанной с контаминацией фенолом.

Недостатком указанного способа является то, что он не позволяет оценить формирование ранних проявлений врожденных аномалий сердца у детей, а также участие в их реализации иммунного механизма, в виде генетического фактора - полиморфизма гена провоспалительного цитокина IL-6 G174C (rs1800795) и экспрессии фактора апоптоза Annexin V-FITC+7AAD. Кроме того не оценивается в качестве токсического воздействие кардиотропных тяжелых металлов – никеля, а анализируются эффекты органического токсиканта – фенола, имеющего иной механизм действия.

Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в обеспечении точности оценки влияния никеля на наличие нарушения функции сердца в виде проявлений врожденных аномалий сердца у детей при избыточной контаминации никелем с обеспечением возможности в последующем судить о развитии таких состояний у детей на ранних стадиях их формирования.

Указанный технический результат достигается предлагаемым Способом диагностики врожденных аномалий сердца у детей в условиях избыточной контаминации никелем, включающим определение в крови ребенка содержания никеля, уровня креатинфосфокиназы (КФК) и содержания Annexin V-FITC+ 7AAD- , исследование генотипов генов MTHFR и IL-6 при помощи метода полимеразной цепной реакции, и при одновременном выполнении следующих условий: при содержании никеля в крови ребенка выше на 20% и более по сравнению с верхней границей референтного уровня, равного 7,5 мкг/дм³, при уровне КФК в крови 239 Ед/л и более, при содержании Annexin V-FITC+ 7AAD- 11,8% и более, а также при наличии дикого гомозиготного генотипа СС гена MTHFR C677T (rs1801133) и вариантного гомозиготного генотипа СС гена IL-6 G174C (rs1800795), диагностируют у ребенка врожденные аномалии сердца в условиях избыточной контаминации никелем.

В качестве метода полимеразной цепной реакции используют метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Поставленный технический результат достигается за счет следующего.

Следует пояснить, что заболевания сердца, в том числе врожденного генеза, относятся к числу ведущих патологий, на формирование которых существенное влияние оказывают социально-экономические условия жизни человека, медико-биологические факторы, вредные привычки, неблагоприятная наследственность, неполноценное питание, загрязнение окружающей среды.

Под действием токсикантов в организме происходит структурный сбой, когда образуются новые взаимосвязи с микроэлементами и «полезный микроэлемент заменяется на вредный», в результате чего образуются микроэлементозы (недостаток, избыток или дисбаланс микроэлементов), который сам по себе патологически влияет на систему «мать — плацента — плод», приводя к необратимым последствиям, реализация которых после рождения ребенка фенотипически может протекать в виде аномалий сердца. Поддержание стабильного уровня внутриклеточных микроэлементов является необходимым, поскольку с этим связаны процессы апоптоза, регенерации, митоза, выживаемости клеток.

Дети составляют группу риска, при этом дисбаланс элементарного гомеостаза не просто сопровождает, а провоцирует развитие различных заболеваний в зависимости от отягощенности, генетической информации, преморбидного фона.

Гены MTHFR C677T (rs1801133) и IL-6 G174C (rs1800795) и их полиморфные варианты ассоциированы не только с формированием патологии сердечно-сосудистой системы, но и экспрессией метионина, участвующего в процессах детоксикации. Тестирование генетических аллельных маркеров и возможная фенотипическая корректировка их функций в детском возрасте может значительно снизить контингент, который подвержен развитию многофакторных заболеваний (атеросклероз, диабет 2 типа, инфаркт миокарда, гипертония и т.д.). Предварительную идентификацию контингента с высоким риском развития многофакторной патологии и её первичная и вторичная профилактика являются основными задачами прогнозирования и предупреждения заболеваний.

Согласно данным ряда исследований функциональное состояние сердечно-сосудистой системы объективно отражает уровень адаптированности организма к факторам среды обитания. Присутствие техногенных химических веществ в организме приводит к развитию нарушений в сосудах и сердце, которые обуславливают развитие преморбидных состояний и способствуют прогрессированию хронических заболеваний.

Установлено, что хроническое ингаляционное воздействие никеля формирует опасность развития нарушений со стороны сердечно-сосудистой системы (ССС) (суммарный индекс опасности (THI) соответствует уровню неприемлемого риска со стороны ССС: THI=2,09).

Одной из причин формирования у ребенка патологии ССС, в т.ч. проявлений врожденной аномалии сердца, являются замены в гене метилентетрагидрофолатредуктазы - MTHFR, как в промоторной, так и в экзонных областях гена. Функция белкового продукта гена метилентетрагидрофолатредуктаза (MTHFR С677Т) является основным ферментом метаболизма гомоцистеина.

Гомоцистеин — продукт метаболизма метионина — одной из 8 незаменимых аминокислот организма. В норме он не накапливается. Обладает выраженным токсическим действием на клетку. Циркулируя в крови, повышенный гомоцистеин повреждает сосуды, тем самым повышая свертываемость крови и образование микротромбов в сосудах.

Снижение активности метилентетрагидрофолатредуктазы — одна из важных причин накопления гомоцистеина в крови и избыточного синтеза метионина.

Дефекты в данном гене часто приводят к совершенно различным заболеваниям с широким спектром клинических симптомов: умственное и физическое отставание в развитии, перинатальная смерть, васкулярные и нейродегенеративные заболевания, диабет, рак и другие.

Функция гена IL-6 G174C (rs1800795). Интерлейкин-6 — интерлейкин, который может действовать как провоспалительный цитокин. Синтезируется активированными макрофагами и T-клетками и стимулирует иммунный ответ. Особенно его роль велика при травматическом поражении ткани, ожогах и других повреждениях, ведущих к воспалению. В мышечной ткани интерлейкин-6 может действовать как защитный антивоспалительный миокин. В мышцах вырабатывается в ответ на мышечные сокращения, где он действует как миокин, увеличивая доставку субстрата к мышечным клеткам. Механизм действия интерлейкина-6 в мышечных клетках отличаются от большинства других клеток, в которых он действует через фактор транскрипции NF-κB, и включают сигнальные пути Ca2+/NFAT и гликоген/p38 MAPK. При этом он, видимо, функционирует как антивоспалительный миокин.

Интерлейкин-6 (ИЛ-6) активирует продукцию белков острой фазы воспаления, участвуя в иммунной защите организма, влияет на эндокринную систему, стимулируя секрецию вазопрессина, соматотропного гормона, активируя гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую систему и подавляя функцию щитовидной железы, оказывает термогенное действие (локально повышая температуру), а также участвует в дифференцировке нервных клеток, стимуляции гепатоцитов, пролиферации и дифференцировке В- и Т-клеток. Играет существенную роль в патогенезе остеопороза, ревматоидного артрита, онкологических и других заболеваний (Dandan Wang¹, Jian Fang, Ruigeng Wang, Dongming Sun, Kun Xia, Wei Yin, Sai Zhang, Liqun Sun Elevated serum ghrelin, tumor necrosis factor-α and interleukin-6 in congenital heart disease /Pediatr Int . 2016 Apr;58(4):259-64. doi: 10.1111/ped.12773).

Было выявлено, что полиморфизм IL-6 G174C (rs1800795) в промоторной области гена IL-6 влияет на транскрипцию генов и, соответственно, экспрессию этого цитокина, который в конечном итоге контролирует уровень интерлейкина-6, циркулируя в крови. Наблюдаемые при этом повышенные уровни IL-6 связаны с развитием и тяжестью коронарной болезни, формированием атеросклеротических бляшек.

Для сведения указываем, что из уровня техники (Патент РФ № 2611358) известно использование генетических маркеров MTHFR и IL-6 для целей прогнозирования высокого риска репродуктивных потерь в первом триместре беременности, при котором из периферической венозной крови женщин выделяют ДНК с последующей амплификацией полиморфных вариантов A66G гена MTRR, -31С-Т (rs1143627) IL-1β, -174G-C (rs1800795) IL-6 и С677Т (rs1801133) MTHFR. При выявлении одного из четырех генотипов: -31СТ IL-1β / -174GG IL-6 / 677СТ MTHFR / 66GG MTRR; -31СТ IL-1β / -174СС IL-6 / 677СС MTHFR / 66AG MTRR; -31CC IL-1β / -174CC IL-6 / 677CC MTHFR/ 66AG MTRR; -31CC IL-1β / -174GC IL-6 / 677CT MTHFR/ 66AG MTRR, прогнозируют высокий риск репродуктивных потерь в первом триместре беременности.

Однако из уровня техники неизвестны технические решения для прогнозирования риска ССЗ и проявлений врожденной аномалии сердца с использованием совместно двух указанных генетических маркеров.

Активность креатинфосфокиназы (далее - КФК) и процент КФК были аномально повышены у детей с цианотическими врожденными пороками сердца. У 282 детей, госпитализированных для катетеризации сердца и оценки врожденных пороков сердца, были проспективно определены общая креатинфосфокиназа и активность изофермента креатинфосфокиназы в миокарде и проведено сравнение с госпитализированной контрольной группой детей без таких аномалий (Р. Дж. Бучек-младший, Кассельберг А. Г., Р. К. Бурт, М. Д. Пэрриш, Т. П. Грэм-младший Myocardial injury in infants with congenital heart disease: evaluation by creatine kinase MB isoenzyme analysisAm J Cardiol. 1982; 50(1): 129-35. doi: 10.1016/0002-9149(82)90018-2).

Annexin V – это клеточный белок из группы аннексинов. В проточной цитометрии аннексин V обычно используется для обнаружения апоптотических клеток по его способности связываться с фосфатидилсерином, маркером апоптоза, когда он находится на внешней створке плазматической мембраны.

В качестве критерия ранней диагностики сердечно-сосудистой патологии с ранними проявлениями врожденной аномалии сердца в условиях контаминации никелем рекомендуется использовать дикий генотип СС гена фермента метилентетрагидрофолатредуктазы MTHFR C677T (rs1801133), отвечающего за экспрессию гомоцистеина и синтез аминокислоты метионина, обладающего свойством избирательно накапливаться в формирующейся ткани сердечно-сосудистого эндотелия развивающегося организма, что приводит к повреждению тканей и клеток, в том числе чувствительных миокардитоцитов, отвечающих за уровень никеля благодаря тиоловой группе и способности аккумулировать гаптенные химические соединения; и использовать измененный генотип гена IL-6 G174C (rs1800795), ассоциированный с минимальной экспрессией интерлейкина-6 фибробластами, что формирует физиологический дефицит ненаивных Т-лимфоцитов у детей в возрасте до 4-6 лет, и в свою очередь дефицит ИЛ-6, который в мышечной ткани действует как защитный антивоспалительный миокин, отменяет экспрессию цитокина и его защитные эффекты, что ведет к неконтролируемому повреждению и апоптозу кардиомиоцитов. Реализующим процесс сосудистых нарушений и функциональной кардиопатии (малых аномалий развития сердца) служит экспозиция никеля, превышающая верхнюю границу референтного уровня в крови (референтный уровень никеля в крови 0,6-7,5 мкг/дм³). Подтверждающим фактором повреждения кардиомиоцитов служит нарастание апоптотических изменений по критерию содержания креатинфосфокиназы (повышение) и уровня Annexin V-FITC+7AAD- (повышение), что характеризует вероятность возникновения ранних проявлений врожденной аномалии сердца.

Благодаря тому, что в заявляемом способе в качестве диагностических критериев предлагается использовать именно полиморфизм гена MTHFR C677T (rs1801133) и гена IL-6 G174C (rs1800795), обеспечивается точность исследования, т.к. у ребенка учитывается детерминация вероятных нарушений функции сердечно-сосудистой системы - ранних проявлений врожденных аномалий сердца, ассоциированная с диким генотипом СС гена MTHFR C677T (rs1801133) - избыточная экспрессия гомоцистеина с образованием аминокислоты метионина, как агрессивной обменстимулирующей серосодержащей аминокислоты, что приводит к повреждению тканей и клеток, в том числе чувствительных миокардитоцитов. Кроме того метионин обладает свойством в результате деметилитрования запускать процесс апоптоза, а также благодаря тиоловой группе накапливать тяжелые металлы - кардитропного токсиканта никеля, усугубляющие особенности полиморфизма гена метилентетрагидрофолатредуктазы, что формирует условия избыточной гибели кардиомиоцитов, и редким генотипом гена IL-6 G174C (rs1800795), ассоциированным с формированием апоптопических, гиперэргических иммунных процессов, отражением которых является накопление фосфатидилсерина в клеточной мембране, фенотипически проявляющегося избыточным содержанием аннексиннегативных клеток (Annexin V-FITC+7AAD-).

Поэтому по этим показателям можно судить о генетически детерминированном характере нарушений сердечно-сосудистой системы - ранних проявлений врожденных аномалий сердца, и разрабатывать для ребенка индивидуальные программы диагностики и коррекции.

Благодаря использованию в качестве исследуемого материала пробы крови, а также стандартных методик изучения иммунологических параметров, обеспечивается простота, надежность и доступность исследований, а также получение результатов нужной информативности.

Установление содержания химического контаминанта – никеля, именно в крови обусловлено тем, что кровь является самой гомеостатичной средой (управляемость и регулируемость концентраций составляющих ее компонентов), имеющей реферируемые (фоновые) уровни в отношении техногенных химических веществ.

Благодаря использованию в качестве исследуемого материала буккального эпителия (пробы биологического материала со слизистой щеки), обеспечивается простота и надежность исследований, а также получение нужной информативности в плане выделения из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) проведение генотипирования полиморфизма указанных генов MTHFR и IL-6. При этом предлагается использовать в качестве праймера участок ДНК гена MTHFR C677T (rs1801133) и гена IL-6 G174C (rs1800795), устанавливая при этом для каждого гена одно из следующих его состояний: гетерозиготное, или нормальное гомозиготное, или вариантное гомозиготное.

У гена MTHFR C677T 2 аллеля (1 пара аллелей), С и Т (С - дикий или нормальный, Т - мутантный или вариантный), причем CC – дикий гомозиготный генотип; CT - гетерозиготный гомозиготный генотип; TT - вариантный генотип.

У гена IL-6 G174C также 2 аллеля (1 пара аллелей) G и С, причем GG – дикий гомозиготный генотип; GC – гетерозиготный генотип; CC – вариантный гомозиготный генотип.

СС - дикий гомозиготный генотип гена метилентетрагидрофолатредуктазы MTHFR C677T (rs1801133), отвечающего за процессы метилирования гомоцистеина с образованием аминокислоты метионина, обладающего свойством избирательно накапливаться в формирующейся ткани развивающегося организма, избыточность которого, как агрессивной обменстимулирующей серосодержащей аминокислоты, приводит к повреждению тканей и клеток, в том числе чувствительных миокардитоцитов.

Кроме того, метионин обладает свойством в результате деметилитрования запускать процесс апоптоза, а также благодаря тиоловой группе – аккумулировать гаптенные химические соединения; клеточной гибели, механизм которой регулирует количество иммунокомпетентных клеток, когда избыточность экспрессии рецептора клеточной смерти (FAS-рецептора) создаются условия для формирования дефицита иммуноцитов как количественного, так и качественного, создает условия для компенсаторной экспрессии картированного на мембране рецептора CD127+ - антагониста регуляторных Т-лимфоцитов, а также гиперпродукции витального белка (Annexin V-FITC+7AAD-), указывающей на ускорение клеточной гибели. А выступающий в качестве адъюванта никель служит катализатором, ускоряющим процессы клеточной гибели, способствующим переключению (инверсии) Th1 ответа на Th2 – с компенсаторным, но не эффективным в отношении противовирусного иммунитета антителообразованием.

А измененный генотип гена интерлейкина-6 IL-6 G174C (rs1800795) ассоциирован с минимальной экспрессией интерлейкина-6 фибробластами, а физиологический дефицит ненаивных Т-лимфоцитов у детей в возрасте до 4-6 лет, формирует в свою очередь дефицит ИЛ-6, который в мышечной ткани действует как защитный антивоспалительный миокин. Сопряженный с С-аллелем полиморфный вариант гена IL-6 G174C (rs1800795) отменяет экспрессию цитокина и его защитные эффекты, что ведет к неконтролируемому повреждению и апоптозу кардиомиоцитов, ассоциированному с редким генотипом гена IL-6 G174C (rs1800795), формированию атопических, гиперэргических иммунных процессов, отражением которых является накопление фосфатидилсерина в клеточной мембране, фенотипически проявляющегося избыточным содержанием аннексиннегативных клеток (Annexin V-FITC+7AAD-).

Одновременное присутствие в биологических средах кардиотропного металла никеля приводит к реализации предрасположенности к развитию альтерационных процессов в ткани сердца, что характеризует феномен негативной гаптенной активации, и отражается повышением экспрессии специфического реагина – иммуноглобулина Е (IgЕ) к никелю.

Подтверждающим фактором кардитропных нарушений служит повышение активности фермента креатинфосфокиназы, свидетельствующее о разрушении кардиомиоцитов, а также гиперпродукция витального белка (Annexin V-FITC+7AAD-), указывающая на ускорение клеточной гибели.

Усугубляющим и реализующим фактором процесса клеточной гибели и апоптотического повреждения ткани служит избыточная контаминация биосред никелем, превышающая референтную концентрацию.

Таким образом, при оценке влияния никеля на нарушение сердечно-сосудистой системы в предлагаемом способе рекомендуется использовать следующие критерии: содержание никеля в крови ребенка выше на 20% и более по сравнению с верхней границей референтного уровня, равного 7,5 мкг/дм³; при уровне КФК в крови 239 Ед/л и более; при содержании Annexin V-FITC+7AAD- 11,8% и более; а также при наличии дикого гомозиготного генотипа СС гена MTHFR C677T (rs1801133) и вариантного гомозиготного генотипа СС гена IL-6 G174C (rs1800795).

Именно благодаря расширению информационных показателей, связанных с полиморфными вариантами генов, ассоциированных с тропными к ССС аминокислотами гомоцистеином и метионином, связывающим никель, а также с кардиопротективным цитокином интерлейкином-6 и одновременно с количеством химического токсиканта – никеля в крови, и будет обеспечена точность оценки модифицирующего влияния никеля на нарушение функции сердца, выраженной в ранних проявлениях врожденных аномалий сердца у детей в условиях избыточной контаминации крови ребенка никелем.

Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод, что поставленный технический результат обеспечивается за счет совокупности операций предлагаемого способа, их последовательности и режимов его реализации.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

1. Выбирают территорию экологического риска, характеризующуюся наличием химических токсикантов, обусловленных экологической средой обитания. Исследования были проведены на территории, характеризующейся наличием в атмосферном воздухе повышенных концентраций никеля (в 1,2 раз и более ПДК м.р.)

2. На указанной территории производят отбор группы детей одной этнической популяции. Затем производят отбор пробы крови у обследуемых детей в специальные пробирки с антикоагулянтом ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) (0,05М раствор ЭДТА в соотношении 500 мкл крови на 50 мкл антикоагулянта) – для определения содержания никеля. При этом определение никеля в крови проводят методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой на масс-спектрометре Agilent 7500сх («Agilent Technologies Inc.», США) в соответствии c методическими указаниями МУК 4.1.3230–14 и устанавливают, имеется ли превышение концентрации этого контаминанта в пробе крови над его референтным уровнем (в примере конкретного осуществления на исследуемой территории референтным значением по никелю был показатель равный 0,6 - 7,5 мкг/дм³).

Методом прямым спектрофотометрическим определяют в крови ребенка содержание креатинфосфокиназы (КФК) на полуавтоматическом биохимическом анализаторе Hymalyzer 2000 («Human» Германия).

Методом проточной цитофлюориметрии на приборе FACSCalibur «Becton Dickinson», USA определяют в крови ребенка содержание Annexin V-FITC+7AAD-.

Методом аллергосорбентного тестирования с ферментной меткой определяют в крови ребенка уровень IgE к никелю.

3. Также у указанного ребенка отбирают пробу буккального эпителия (в виде мазка со слизистой оболочки щеки), причем забор осуществляют сухими стерильными зондами с ватными тампонами вращательными движениями без травматизации после предварительного полоскания полости рта водой. После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную пробирку типа «Эппендорф» с 500 мкл транспортной среды (стерильный 0,9 %-й раствор NaCl). Конец зонда отламывают или отрезают, с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть крышку пробирки. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают.

Далее производят выделение ДНК из пробы. Для этого пробы в количестве 100 мкл лизируют 300 мкл лизирующего раствора, представляющего собой 0,5 %-й раствор саркозила и протеиназы К (20 мг/мл) в ацетатном буфере (рН 7,5). Затем добавляют сорбент (каолин) и последовательными процедурами промывки отмывают фосфатно-солевым буфером (рН 7,2) пробы от белков и смесью изопропиловый спирт: ацетон от липидов. Нуклеиновые кислоты остаются при этом на сорбенте. Далее адсорбированные на сорбенте ДНК из пробы экстрагируют ТЕ-буфером, представляющим собой смесь 10 мМ трис-HCl и 1 мМ ЭДТА (рН 8,0). Экстракт подвергают центрифугированию. После центрифугирования пробирки надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК.

Полученный материал готов к постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полимеразную цепную реакцию проводят на детектирующем амплификаторе с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» с использованием готовых наборов праймеров и зондов производства ЗАО «Синтол», Россия, в котором в качестве праймеров использовались участки ДНК генов MTHFR C677T (rs1801133) и IL-6 G174C (rs1800795).

Проводят реакцию амплификации, это достигается тем, что для исследования аллельного состояния каждого гена у отдельного ребенка готовят свою реакционную смесь. В каждую пробирку вносят 0,1 мкл готовой смеси праймеров (принятый в генетике термин, обозначающий конечные нуклеотиды с меткой, ограничивающие (отрезающие) амплифицируемую цепочку нуклеотидов гена) и зондов для выбранных генов MTHFR C677T (rs1801133) и IL-6 G174C (rs1800795) (использованы Наборы реагентов для определения полиморфизма MTHFR C677T (rs1801133) и полиморфизма гена IL-6  G174C (rs1800795) ЗАО «Синтол», Россия). В каждую пробирку добавляют остальные компоненты необходимые для осуществления ПЦР: нуклеотиды (дезоксинуклеозидтрифосфаты: по 10 мМ дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), буфера (100 мМ трис-HCl-буфера, 500 мМ KCl, 40 мМ MgCl₂) и Tag F-полимеразы. Вносят пробу в количестве 10 мкл. Таким образом, общий объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Каждая пробирка плотно закрывается пробкой и устанавливается в амплификатор.

При проведении ПЦР амплификацию и детекцию проводят на детектирующем амплификаторе CFX96 фирмы Bio-Rad.

Используется универсальная программа амплификации, подобранная производителем реактивов. Она включает в себя несколько этапов: 1 этап – активация TaqF-полимеразы (режим «горячего старта») продолжается 15 мин при 95 °C; 2 этап – установочные циклы амплификации без измерения флуоресценции (5 циклов); 3 этап – рабочие циклы амплификации с измерением флюоресценции (40 циклов).

Каждый цикл амплификации включает в себя денатурацию ДНК (5 с при 95 °С), отжиг праймеров (20 с при 60 °С) и саму реакцию полимеризации ДНК (15 с при 72 °С).

Регистрация сигнала флюоресценции, возникающего при накоплении продуктов амплификации участков ДНК проводится в режиме «реального времени» после стадии отжига праймеров для выбранных генов по каналу VIC – для детекции одного из аллельных вариантов генов, и по каналу FAM – для альтернативного варианта.

Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флюоресценции с установленной на заданном уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла (N) в соответствующей графе в таблице результатов, отображаемой в программном обеспечении для амплификатора CFX96.

По соотношению пороговых циклов, полученных по двум каналам детекции, определяют состояние гена MTHFR в исследуемом участке ДНК C677T (rs1801133), а также гена IL-6 в исследуемом участке ДНК G174C (rs1800795) (метод аллельной дискриминации). Возможных вариантов состояния гена было два: гомозиготное – в случае, когда одно из значений порогового цикла не определяется (ниже пороговой линии) и гетерозиготное – в случае, когда получено два значения пороговых циклов и по этим каналам получены параболические кривые флюоресценции. В зависимости от того, накопление какого продукта амплификации происходит в реакции, устанавливается гетерозиготное, или нормальное гомозиготное, или вариантное гомозиготное состояние генов MTHFR C677T (rs1801133) и IL-6 G174C (rs1800795).

4. И при выполнении следующих условий: при содержании никеля в крови ребенка выше на 20% и более по сравнению с верхней границей референтного уровня, равного 7,5 мкг/дм³, при уровне КФК в крови 239 Ед/л и более; при содержании Annexin V-FITC+7AAD- 11,8% и более; а также при наличии дикого гомозиготного генотипа СС гена MTHFR C677T (rs1801133) и вариантного гомозиготного генотипа СС гена IL-6 G174C (rs1800795), диагностируют у ребенка развитие врожденных аномалий сердца под воздействием избыточной контаминации никелем.

При проведении испытаний по реализации предлагаемого способа выполнено исследование детского населения, проживающего в различных по содержанию никеля условиях среды обитания.

Были сформированы две группы: группа наблюдения, дети которой проживали на неблагополучной в отношении никеля территории, и группа сравнения, проживающая в условиях санитарно-гигиенического благополучия.

В группу наблюдения вошли 45 детей (средний возраст 4,7±0,12 года; 22 мальчика и 23 девочки). В группу сравнения вошли 52 ребенка (средний возраст 4,8±0,08 года; 24 мальчика и 28 девочек). Группы были сопоставимы по гендерному, возрастному и социальным критериям.

На территориях проживания детей группы наблюдения отмечено превышение содержания никеля до 1,2 ПДК м.р.

На территориях проживания детей группы сравнения превышение содержания никеля выше ПДК (предельно допустимой концентрации) не установлено.

Оценка риска здоровью детей показала, что распространенность в выборке детей группы наблюдения С аллеля гена IL-6 G174C rs1800795 (RR = 1,62; 95 % CI = 1,01–2,59) и С аллеля гена MTHFR C677T rs1801133 (RR = 1,39; 95 % CI = 1,07–1,79) повышают относительный риск формирования патологии сердечно-сосудистой системы в 1,6 и 1,4 раза соответственно.

Оценка риска развития заболеваний осуществлялась по стандартизованной методике в соответствии с «Руководством по оценке риска для здоровья населения при воздействии химических веществ, загрязняющих окружающую среду» (Р 2.1.10.1920-04).

Установлено, что хроническое ингаляционное воздействие никеля формирует опасность развития нарушений со стороны органов дыхания (индекс опасности HI – до 3,73), центральной нервной системы (HI – до 2,33) и сердечно-сосудистой системы (HI – до 2,31).

Заболевание сердца у детей группы наблюдения определяли по результатам клинического обследования и инструментального обследования. При этом определяли параметры частоты сердечных сокращений (ЧСС), электрокардиографии и ультразвукового исследования (УЗИ) сердца.

Исследование состояния сердечно-сосудистой системы показало, что относительный риск нарушений сердечно-сосудистой системы (адаптационного резерва) у детей группы наблюдения был в 7,0 раза выше (отношение шансов ОR=6,03; доверительный интервал DI=1,05-30,17; вероятность р=0,05), чем в группе сравнения.

Установлена корреляционная зависимость между частотой сердечных сокращений и уровнем никеля в крови (r=0,49, р=0,0008), то есть при повышении концентрации никеля отмечается тахикардия (учащение частоты сердечных сокращений).

Сравнительный анализ среднегрупповых показателей электрокардиограммы у обследованных детей показал, что параметры временных критериев зубца P, интервалов (PQ и QT) и положения электрической оси сердца находились в пределах нормальных физиологических значений, однако интервал сегмента QRS – 0,0753±0,0023 оставался достоверно ниже показателя в группе наблюдения - 0,0714±0,0017, р=0,009, что является патогномоничным для проявлений врожденных пороков сердца.

У детей группы наблюдения ЧСС была достоверно ниже группы сравнения аналогичной возрастной категории (75±3,3 уд. в мин и 89,56±3,3 уд. в мин соответственно, р=0,006).

У детей группы наблюдения установлены нарушения процессов возбудимости в виде синусовой тахиаритмии (44,5%), которая встречалась достоверно чаще в 3,0 раза, чем в группе сравнения (14,8%, р=0,001).

В то же время, синусовая аритмия регистрировалась в 10,9 раза чаще у детей группы наблюдения по сравнению с группой сравнения (12,0% против 1,1% соответственно, р=0,029).

По результатам выполнения УЗИ сердца у всех детей группы наблюдения в отличие от детей группы сравнения, обнаружены «малые аномалии развития сердца» (МАРС) - дефекты перегородок, пролапсы клапанов, дополнительные хорды левого желудочка, открытое овальное окно, удлиненный евстахиев клапан.

Таким образом, было доказано влияние никеля на возникновение нарушений у детей со стороны ССС в виде развития врожденных аномалий сердца при избыточной контаминации токсикантом - никелем.

У детей отбирали пробу крови для химико-аналитического анализа на содержание никеля в крови, а также пробы венозной крови для определения содержания КФК и на содержание Annexinа V-FITC+7AAD-; а также отбирали буккальный эпителий для генотипирования полиморфизма указанных генов на амплификаторе CFX96 методом полимеразной цепной реакцией (ПЦР) в режиме реального времени.

В таблице 1 приведены данные по содержанию никеля в крови детей в различных группах.

Данные, приведенные в таблице 1, показывают, что детей группы наблюдения значимо повышено содержание никеля в крови более, чем в 3,0 раза относительно группы сравнения (р=0,001).

В таблице 2 приведены данные по установлению критериев диагностики сердечно-сосудистой патологии в виде развития ранних проявлений врожденных аномалий сердца у детей в условиях влияния никеля предлагаемым способом у обследованных групп детей.

Данные, приведенные в таблице 2, показывают, что у пациентов, которым поставлен диагноз по МКБ-10: Q24.8 «Другие уточненные врожденные аномалии сердца» (примеры 1-7), выявлены одновременно следующие обстоятельства:  содержание никеля в крови ребенка выше на 20% и более по сравнению с верхней границей референтного уровня, равного 7,5 мкг/дм³ (9,06-11,6 мкг/дм³); содержание КФК в крови 239 Ед/л и более (239-322Ед/л); содержание Annexin V-FITC+7AAD- 11,8% и более (11,8-15,2%); наличии комбинации дикого гомозиготного генотипа СС гена MTHFR C677T (rs1801133) и вариантного гомозиготного генотипа СС гена IL-6 G174C (rs1800795). Содержание IgE к никелю близко к верхней границе нормы, а также превышает ее.

У пациентов, у которых отсутствует совокупность указанных диагностических критериев (примеры 8-13), не выявлено заболевание по классу Q24.8 «Другие уточненные врожденные аномалии сердца».

По результатам сравнительной оценки иммунологических показателей у детей, страдающих патологией сердечно-сосудистой системы «Другие уточненные врожденные аномалии сердца», выявлено достоверное повышение маркера позднего клеточного апоптоза Annexinа V-FITC+7AAD+ позитивных клеток в 4,5 раза, и в 1,5 раза для Annexin V негативных клеток (ранний апоптоз) относительно группы сравнения. Частота гиперэкспрессии фосфатидилсерина (Annexinа V-FITC+7AAD-) в группе наблюдения у детей составила 95,8% по сравнению с нормой.

По результатам сравнительного анализа полиморфизмов кандидатных генов между исследуемыми группами установлены статистически значимые различия полиморфности кандидатных генов и их плюс-аллелей С метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR C677T rs1801133) (OR=2,43; CI=1,06-5,55; p=0,03) и аллеля С интерлейкина-6 (IL-6 G174C rs1800795) (OR=3,30; CI=1,07-5,57; p=0,02) (таблица 2).

Распространенность в выборке детей группы наблюдения С аллеля гена IL-6 G174C (rs1800795) (RR = 1,62; 95 % CI = 1,01–2,59) и С аллеля гена MTHFR C677T (rs1801133) (RR = 1,39; 95 % CI = 1,07–1,79) повышают относительный риск формирования патологии ССС в 1,6 и 1,4 раза соответственно.

Для иллюстрации реализации предлагаемого способа приведены два примера по конкретным пациентам.

Пример 1. Пациент, 5 лет, русский, диагноз: Q24.8 «Другие уточненные врожденные аномалии сердца». Жалобы на периодическую одышку при физическом напряжении и неприятные ощущения в области сердца. Бледность, синюшность кожных покровов. Аускультируются шумы сердца, на ЭКГ изменение зубца QRS (уменьшение интервала сегмента) и нарушение ритма сердца. УЗИ сердца показало дополнительные хорды левого желудочка, открытое овальное окно. Определяется высокий уровень никеля в крови – 9,72 мкг/дм³ (референтный диапазон – 0,6-7,5 мкг/дм³). Определяется наличие СС гомозиготы гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR C677T rs1801133) и СС гомозиготы гена интерлейкина-6 (IL-6 G174C rs1800795). Значение содержания IgЕ к никелю: 0,14 у.е., т.е. в 1,4 раза выше верхней границы нормы. Содержание маркера раннего апоптоза Annexin V-FITC+7AAD- – 14,0%, т.е. выше верхней границы диапазона нормы (7,0-11,0 %) в 1,27 раза; повышено содержание креатинфосфокиназы (КФК), свидетельствующей о повреждении кардиомиоцитов, - 259 ЕД/л (норма 25-220 ЕД/л). Таким образом, установлены высокие значения уровня IgЕ к никелю, уровня КФК и маркера раннего апоптоза Annexin V-FITC+7AAD- на фоне повышенного по отношению к референтному уровню содержания никеля в крови, а также наличие дикой гомозиготы СС гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR C677T rs1801133) и вариантной гомозиготы СС гена интерлейкина-6 (IL-6 G174C rs1800795), кодирующих белки ответственные за экспрессию ассоциированных с тропными к ССС аминокислотами гомоцистеином и метионином, отвечающим детоксикацию и конъюгацию неорганических поллютантов (никель), связывающими никель, а также с кардиопротективным цитокином интерлейкином-6, что указывает на развитие ранних проявлений врожденных аномалий сердца, реализацию геноопосредованных органических и функциональных нарушений, ассоциированных с воздействием никеля, и фенотипически проявляющихся состоянием «Q24.8 Другие уточненные врожденные аномалии сердца».

Пример 2. Пациент, 5 лет, русский, здоров. Уровень никеля в крови 5,9 мкг/дм³ (референтный диапазон – 0,6-7,5 мкг/дм³) соответствует референтному диапазону. Определяется наличие СТ гетерозиготы гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR C677T rs1801133) и GG гомозиготы гена интерлейкина-6 (IL-6 G174C rs1800795). Значение содержания IgЕ к никелю: 0,08 у.е., т.е. ниже верхней границы нормы (отсутствие сенсибилизации к никелю). Содержание Annexin V-FITC+7AAD- – 8,2%, соответствует диапазону нормы (7,0-11,0%), содержание креатинфосфокиназы (КФК) – 202 ЕД/л соответствует диапазону нормы (норма 25-220 ЕД/л). Таким образом, отсутствие дикой гомозиготы СС гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR C677T rs1801133) (наличие его полиморфного СТ генотипа), отсутствие мутантной гомозиготы СС гена интерлейкина-6 (IL-6 G174C rs1800795) (наличие нормальной гомозиготы GG), позволяет минимизировать повреждающий (альтерационный) эффект активных групп тиоловых аминокислот и накопление экзогенного кардиотропного фактора (никеля), а также обеспечить наличие миопротекторного цитокина интерлейкина-6, что не приводит к повреждению кардиомиоцитов (нормализация апоптоза клеток по критерию Annexin V-FITC+7AAD-) и повышению уровня креатинфосфокиназы, свидетельствующего о разрушении клеточной мембраны, а также уровня IgЕ к никелю, что на фоне референтного содержания никеля в крови, не приводит к развитию кардиотоксических эффектов и не формирует у данного пациента, ассоциированное с действием никеля, развития врожденных аномалий сердца, в том числе, с фенотипическими проявлениями.

Таким образом, приведенные данные показывают, что при реализации предлагаемого способа с использованием заявляемых диагностических критериев обеспечивается его назначение.

Предлагаемый способ позволит установить наличие сердечно-сосудистой патологии у детей в виде развития врожденных аномалий сердца, ассоциированной с контаминацией биосред никелем, что в свою очередь позволит проводить своевременную диагностику и оптимизировать мероприятия по коррекции данного состояния у детей.

Таблица 1

Группы Группа наблюдения (n=45) Группа сравнения (n=52) р Содержание никеля в крови, мкг/дм³ 7,4±1,6 2,02±0,23 0,001

n – количество детей; p – достоверность.

Таблица 2

Пациент Содержание никеля в крови, мкг/л (референтный диапазон 0,6 - 7,5 мкг/дм³) Генотип гена MTHFR C677T (rs1801133), определенного в пробе буккального эпителия Генотип гена IL-6 G174C (rs1800795), определенного в пробе буккального эпителия Уровень IgE к никелю, у.е (Норма 0-0,10 у.е.) Содержание Annexin V-FITC+7AAD-, % (Норма 7,0-11,0%) Содержание КФК (Норма 25,0-220,0 Ед/л) Дети с диагнозом патологии сердца - развитие ранних проявлений врожденных аномалий сердца (группа наблюдения) 1. (4 лет) 9,06 СС СС 0,15 13,6 245 2. (5 лет) 9,72 СС СС 0,14 14,0 259 3. (4 лет) 10,75 СС СС 0,12 12,9 301 4. (6 лет) 10,22 СС СС 0,17 11,8 298 5. (5 лет) 9,38 СС СС 0,16 12,0 316 6. (4 лет) 11,6 СС СС 0,15 15,2 239 7. (5 лет) 9,77 СС СС 0,12 14,7 322 Дети группы сравнения 8. (6 лет) 7,5 СС CG 0,075 8,3 134 9. (4 лет) 6,8 CT СС 0,10 9,6 158 10. (5 лет) 5,9 CT GG 0,08 8,2 202 11. (4 лет) 6,1 TT CC 0,12 10,5 189 12. (5 лет) 5,85 TT CG 0,11 7,95 177 13. (6лет) 7,0 СT CG 0,095 8,45 150

Примечание: 1. CC – дикий гомозиготный генотип гена MTHFR C677T (rs1801133); CT - гетерозиготный гомозиготный генотип гена MTHFR C677T rs1801133); TT - вариантный генотип гена MTHFR C677T (rs1801133);

2. GG- дикий гомозиготный генотип гена IL-6 G174C (rs1800795); GC – гетерозиготный генотип гена IL-6 G174C (rs1800795); CC – вариантный гомозиготный генотип гена IL-6 G174C (rs1800795);

3. Зависимость уровня IgЕ к никелю и содержания Annexin V-FITC+7AAD-, от концентрации никеля в крови (мг/л) достоверна (R² = 0,79-0.95; p<0,05), где R² – коэффициент детерминации; р – вероятность.

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано для диагностики врожденных аномалий сердца у детей в условиях избыточной контаминации никелем. В крови ребенка определяют содержание никеля, уровень креатинфосфокиназы (КФК) и Annexin V-FITC+7AAD-. При помощи полимеразной цепной реакции исследуют генотипы генов MTHFR и IL-6. При содержании никеля выше на 20% и более по сравнению с верхней границей референтного уровня, равного 7,5 мкг/дм³, при уровне КФК 239 Ед/л и более, при содержании Annexin V-FITC+7AAD- 11,8% и более, при наличии генотипа СС гена MTHFR C677T (rs1801133) и генотипа СС гена IL-6 G174C (rs1800795) диагностируют у ребенка врожденные аномалии сердца в условиях избыточной контаминации никелем. Способ обеспечивает точность оценки влияния никеля на проявление врожденных аномалий сердца у детей при избыточной контаминации никелем за счет определения в крови ребенка содержания никеля, уровня КФК, Annexin V-FITC+7AAD- и генотипов генов MTHFR и IL-6. 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.

1. Способ диагностики врожденных аномалий сердца у детей в условиях избыточной контаминации никелем, включающий определение в крови ребенка содержания никеля, уровня креатинфосфокиназы (КФК) и содержания Annexin V-FITC+7AAD-, исследование генотипов генов MTHFR и IL-6 при помощи метода полимеразной цепной реакции, и при одновременном выполнении следующих условий: при содержании никеля в крови ребенка выше на 20% и более по сравнению с верхней границей референтного уровня, равного 7,5 мкг/дм³, при уровне КФК в крови 239 Ед/л и более, при содержании Annexin V-FITC+7AAD- 11,8% и более, а также при наличии дикого гомозиготного генотипа СС гена MTHFR C677T (rs1801133) и вариантного гомозиготного генотипа СС гена IL-6 G174C (rs1800795) диагностируют у ребенка врожденные аномалии сердца в условиях избыточной контаминации никелем.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве метода полимеразной цепной реакции используют метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.