МИКРОФЛЮИДНАЯ СИСТЕМА ДЛЯ КОНТРОЛЯ КОНЦЕНТРАЦИЙ МОЛЕКУЛ ДЛЯ СТИМУЛИРОВАНИЯ КЛЕТКИ-МИШЕНИ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/50 B01L3/00 B81B1/00 G01N21/63 C12M3/06 

Настоящее изобретение относится к области микрофлюидов.

Микрофлюид применяют в системах микрометрических размеров, величина которых в основном составляет от нескольких десятков до нескольких сотен микрон.

Эти системы находят свое применение в многочисленных областях, таких как испытания клеточной диагностики, разработка медикаментов, фундаментальная биология или косметология.

В этих областях существует все возрастающий запрос на микрофлюидные системы для количественного определения отклика живых клеток на определенные молекулы и, в частности, отклика на карту концентраций, контролируемую в пространстве и во времени.

Например, речь может идти об измерении отклика раковых клеток на молекулы, используемые для химиотерапии. Для точного определения этого отклика необходимо осуществлять контроль за применением молекул, которые будут порождать этот отклик. Этот контроль может относиться к количеству молекул, взаимодействующих с раковыми клетками, карте концентраций молекул которых раковые клетки подчиняются, к изменению во времени количества этих молекул и/или к карте концентраций этих молекул, применяемых для раковых клеток, и т.д.

В области косметологии микрофлюидные системы могут служить для испытаний на токсичность определенных молекул на живых клетках и/или на клеточных тканях. Контроль количества молекул, в известных случаях токсичных, вводимых в клетки, и способа, посредством которого эти молекулы вводят, необходим для определения порога токсичности.

Пример микрофлюидной системы, широко используемой для стимулирования живых клеток, представлен в документе US 7374906. Эта микрофлюидная система позволяет в значительной мере подчинить живые клетки градиенту концентраций молекул, карта которых здесь представляет собой линейный профиль, стабильный во времени. Большое неудобство этого типа микрофлюидной системы состоит в том, что живые клетки подчинены потоку, порождающему усилия искаженной деформации сдвига. Этот эффект деформации сдвига, в частности, создает помехи при попытке исследования хемотаксического отклика на конус роста нервных клеток. На самом деле, поток порождает напряжения, вызываемые деформацией сдвига, которые модифицируют отклик клеток-мишеней в лучших случаях, которые даже провоцируют гибель или отрывание клеток.

Физиологическое поведение живых клеток, исследуемых указанным образом, при использовании системы, изложенные в настоящем документе, было искажено.

Решения, которые, таким образом, были предложены для подчинения живых клеток карте концентраций молекул и/или сочетаниям нескольких карт концентраций для различных молекул так, чтобы они не были искажены потоком.

Одна такая микрофлюидная система, например, представлена в статье «Microfluidic device for the combinatorial application and maintenance of dynamically imposed diffusional gradients», R.L. Smith & al., (2010) 9: 613-622 («Микрофлюидное устройство для комбинаторного применения динамически налагаемых диффузионных градиентов», Р.Л. Смит и др. (2010), 9, стр. 613-622). Эта микрофлюидная система включает микрофлюидное устройство 100 и средства (не представленные) для снабжения устройства текучими средами.

Микрофлюидное устройство 100, раскрытое в настоящем документе, представлено на Фигуре 1, в виде перспективного изображения в разобранном виде.

Оно включает структуру, изготовленную из полидиметилсилоксана, в которой сформировано множество каналов снабжения текучей средой 130а, 130b, 130с, 130d, независимых друг от друга.

Самая верхняя стенка 120 каждого из этих каналов 130а, 130b, 130с, 130d содержит одно или несколько отверстий 110, пересекающих эту стенку. Со стороны стенки 120, противоположной микрофлюидным каналам, расположена культивационная камера 140, предназначенная для живых клеток, заполненная средой культуры 150, представленной в форме геля, такого как агароза. Таким образом, стенка 120 образует мембрану в той мере, в какой она позволяет разделять две среды, а именно микрофлюидные каналы 130а, 130b, 130с, 130d, по которым текучая среда должна циркулировать, а также культивационную камеру 140.

Стеклянная пластинка 160 позволяет закрывать культивационную камеру 140 в ее верхней части.

Средства снабжения текучими средами не представлены. Однако следует отметить, что в каждый из каналов 130а, 130b, 130с, 130d может быть введена одна или несколько текучих сред, причем эти текучие среды содержат молекулы, предназначенные для стимулирования живых клеток, таким образом, чтобы они проходили через стенки 120, образованные из PDMS, через отверстия для диффузии 110.

Для контроля культивирования живых клеток в пространстве можно с помощью микрофлюидного устройства 100 выбрать каналы, в которые можно отправлять текучую среду, содержащую стимулирующие молекулы живых клеток. Можно также точно выбирать отверстия 110, при прохождении которых эти молекулы будут диффундировать в культивационную камеру 140.

Наряду с этим, для контроля культивирования живых клеток во времени можно развести во времени снабжение текучей средой различных каналов 130а, 130b, 130с, 130d.

Устройство 100 также предоставляет возможность большой гибкости в выборе стимулирующих молекул, которые могут быть использованы в той мере, в какой в каждом из каналов снабжения текучей средой 130а, 130b, 130с, 130d предусмотрено средство снабжения, которое для него подходит.

Однако эта микрофлюидная система представляет некоторые неудобства. Необходимо использовать культивационную камеру 140, содержащую культурную среду 150 в форме геля, для предотвращения протекания текучей среды из каналов снабжения текучей средой в культивационную камеру.

В особых случаях в эффективно изготовленном и протестированном устройстве представлены квадратные отверстия размером 20 мкм × 20 мкм. Эти размеры являются достаточно важными и благоприятствуют прохождению текучей среды к культивационной камере 140.

Авторы уточняют, что могут быть воплощены квадратные отверстия 110 с меньшими размерами, например 4 мкм × 4 мкм. Тем не менее, используемая технология изготовления (DRIE, Deep Reactive Ion Etching, глубокое реактивное ионное травление (англ.)) предназначена для того, чтобы не допускать образования отверстий ниже максимального соотношения размеров, как правило, 1:20, причем это соотношение размеров определяется здесь соотношением между размерами со стороны отверстия на глубину этого отверстия. Для размеров, заданных со стороны отверстие 110, это максимальное соотношение размеров ограничивает глубину отверстия и, следовательно, гидравлическое сопротивление, которое может быть придано этому отверстию. Таким образом, повышается риск прохождения текучей среды из канала 130а, 130b, 130с, 130d к культивационной камере 140.

Что касается размеров отверстий, предполагается, таким образом, что текучая среда будет проходить к культивационной камере 140 в отсутствие культурной среды 150, имеющей форму геля.

Наряду с этим следует отметить, что необходимое присутствие геля привносит неудобства в функционирование микрофлюидного устройства 100.

На самом деле, гель замедляет диффузию стимулирующих молекул к живым клеткам-мишеням. Также стабилизация карты концентраций этих стимулирующих молекул внутри культивационной камеры 140 становится медленной.

Кроме того, следует отметить, что стимулирующие молекулы диффундируют в гель по всем направлениям.

Соответственно для каждого отверстия 110, взятого независимо от других, стимулирующие молекулы распределяются на уровне клетки-мишени, расположенной в геле, по поверхности, большей, чем поверхность канала отверстия 110, расположенного в стенке 120. Стимулирование клетки-мишени специфическими молекулами, таким образом, является менее точным, чем оно было теоретически установлено путем предварительного выбора для определения размеров отверстий. На уровне клетки-мишени, таким образом, теряется пространственное разрешение относительно пространственного разрешения, теоретически обеспечиваемого размерами отверстия. С другой стороны, следует отметить, что отверстия для диффузии 110 представляют определенную поверхностную плотность по поверхности стенки 120, которую с трудом можно повысить. В особых случаях расстояние между двумя смежными отверстиями, созданными в стенке 120 согласно PDMS, составляет 300-400 мкм.

С другой стороны, плотность отверстий 110, которые можно получать с помощью способа изготовления, используемого в настоящей работе, является ограниченной. На самом деле, способ DRIE, используемый в настоящей работе для изготовления микрофлюидного устройства, устанавливает пределы, относящиеся к плотности микрофлюидных каналов, которые могут быть получены. Каждый из этих микрофлюидных каналов согласно концепции выходит наружу, оканчиваясь единичным отверстием 110, в результате чего поверхностная плотность отверстий 110, таким образом, становится также ограниченной.

Это неудобство добавляется к тому факту, что точность стимулирования клетки-мишени теоретически определяется размерами отверстия, что отличается от точности, достигаемой в реальности на уровне клетки-мишени.

Целью изобретения является ослабление по меньшей мере одного из этих неудобств.

Для достижения этой цели в изобретении предложена микрофлюидная система для управления картой концентраций молекул, пригодных для стимулирования клетки-мишени, например, образованной за счет образования скопления живых клеток, характеризующаяся тем, что система включает:

- микрофлюидное устройство, содержащее:

n_c≥1 микрофлюидных каналов, причем один или каждый из каналов снабжен по меньшей мере одним входным отверстием по меньшей мере для одной текучей среды и по меньшей мере одним выходным отверстием для этой текучей среды;

n₀≥2 отверстий, образованных в микрофлюидном канале или распределенных по нескольким микрофлюидным каналам, причем упомянутые отверстия расположены в одной и той же плоскости таким образом, что они образуют сеть в этой плоскости, причем количества n_c микрофлюидных каналов и n₀ отверстий связаны соотношением , где 1≤i≤n_c, a n₀/c_i - количество отверстий на канал C_i (термин Σ соответствует оператору «сумма»);

по меньшей мере одну микропористую мембрану, покрывающую сеть отверстий, причем клетка-мишень должна быть расположена со стороны мембраны, которая расположена напротив микрофлюидного (микрофлюидных) канала (каналов);

- одно или несколько средств снабжения текучей средой для снабжения одного или каждого микрофлюидного канала текучей средой, причем по меньшей мере одна из этих текучих сред содержит стимулирующие молекулы клетки-мишени.

Таким образом, когда средство снабжения подает в микрофлюидный канал или в каждый из микрофлюидных каналов по меньшей мере одну из указанных текучих сред, молекулы, пригодные для стимулирования клеток-мишеней, после прохождения по меньшей мере одной микропористой мембраны диффундируют через камеру или упомянутый дополнительный микрофлюидный канал, в результате чего можно контролировать карту концентраций молекул, пригодных для стимулирования клеток-мишеней в указанной камере или в указанном дополнительном микрофлюидном канале.

В системе могут быть предусмотрены и другие характерные технологии, взятые по отдельности или в сочетании друг с другом:

- микропористая мембрана снабжена порами, гидравлический диаметр которых составляет 0,05-12 мкм, предпочтительно 0,05-3 мкм;

- поверхностная плотность пор микропористой мембраны составляет 10³-10¹⁰ пор/см²;

- микропористая мембрана выполнена из материала, выбранного из: стекла, поликарбоната, сложного полиэфира, полиэтилентерефталата, кварца, кремния, кремнезема или карбида кремния;

- предусмотрена крышка для микрофлюидных каналов, причем упомянутая крышка выполнена из материала, выбранного из: стекла или кремния, неэластомерного полимера с поперечными связями, образованными под действием облучения, металла, электропроводящего или полупроводникового сплава, керамики, кварца, сапфира, эластомера;

- в крышке образовано упомянутое по меньшей мере одно входное отверстие и упомянутое по меньшей мере одно выходное отверстие для текучих сред;

- каждый из микрофлюидных каналов содержит, по меньшей мере, стенку из фотоотверждаемой и/или термоотверждаемой смолы;

- предусмотрена закрытая культивационная камера для упомянутой клетки-мишени или микрофлюидный канал, расположенный со стороны микропористой мембраны, которая расположена напротив микрофлюидного (микрофлюидных) канала (каналов), причем клетка-мишень также находится в камере или в упомянутом другом микрофлюидном канале;

- камера или микрофлюидный канал включает основание, выполненное из оптически прозрачного материала, причем это основание расположено с другой стороны камеры или микрофлюидного канала относительно микропористой мембраны;

- камера или микрофлюидный канал включает боковые стенки из фотоотверждаемой и/или термоотверждаемой смолы;

- предусмотрено множество средств снабжения микрофлюидных каналов, причем каждое этих средств снабжения снабжает один из микрофлюидных каналов;

- предусмотрено средство оптической визуализации;

- в средстве оптической визуализации воплощена технология микроскопии локализации, осуществляемая за счет фотоактивации, или технология истощения носителями зарядов, осуществляемая за счет вынужденного излучения;

- отверстия образуют двумерную сеть в плоскости, которой они принадлежат;

- соответствующие центры двух смежных отверстий расположены друг от друга на расстоянии, составляющем 10-250 мкм.

Другие характеристики, цели и преимущества изобретения станут ясными из подробного описания, приведенного ниже со ссылкой на следующие Фигуры:

- Фигура 2 представляет собой схему микрофлюидного устройства, соответствующего изобретению, в виде частичного разреза перспективного изображения;

- Фигуры 3(a)-3(d) представляют собой, в зависимости от каждого конкретного случая, этапы процедуры изготовления микрофлюидного устройства, представленного на Фигуре 2, или промежуточные структуры, полученные по окончанию определенных этапов этой процедуры;

- Фигуры 4(а)-4(с) представляют собой промежуточные структуры, полученные в ходе изготовления комплекта, образованного основанием и боковыми стенками устройства, причем упомянутый комплект предназначен для образования части микрофлюидного устройства согласно Фигуре 2;

- Фигура 5(a) представляет собой текучие среды, текущие по микрофлюидным каналам микрофлюидного устройства согласно изобретению, представленному на Фигуре 2, причем одна из этих текучих сред содержит стимулирующие молекулы, предназначенные для клеток-мишеней, а Фигура 5(b) представляет собой профиль концентраций стимулирующих молекул в камере устройства согласно Фигуре 2;

- Фигура 6 представляет собой другое микрофлюидное устройство согласно изобретению, представленное в виде разреза;

- Фигуры 7(a), 7(b), 7′(а), 7′(b) и 7(с)-7(f) представляют собой этапы изготовления микрофлюидного устройства согласно Фигуре 6 или промежуточные структуры, полученные при изготовлении этого микрофлюидного устройства;

- Фигура 8 представляет собой схему, отображающую микрофлюидное устройство согласно Фигуре 6, представленную как частичный вид снизу;

- Фигура 9 представляет собой перспективное изображение микрофлюидных каналов микрофлюидного устройства согласно Фигуре 6, которые расположены таким образом, что каждый микрофлюидный канал содержит несколько отверстий;

- Фигура 10 представляет собой вид сверху микрофлюидных каналов микрофлюидного устройства согласно варианту Фигуры 6, причем эти каналы расположены таким образом, что каждый микрофлюидный канал содержит отверстие, выходящее на микропористую мембрану этого устройства;

- Фигура 11 представляет собой этап изготовления устройства, представленного на Фигуре 10;

- Фигуры 12(a)-12(d) представляют собой, в зависимости от каждого конкретного случая, этапы процедуры изготовления в соответствии с вариантом воплощения микрофлюидного устройства согласно изобретению или промежуточные структуры, полученные по окончанию определенных этапов этой процедуры.

Для начала мы представляем микрофлюидное устройство 1 на основе Фигуры 2 согласно изобретению, содержащее два микрофлюидных канала, где каждый из этих каналов снабжен отверстиями, выходящими на мембрану, а также процедуру его изготовления согласно Фигурам 3(a)-3(d) и 4(а)-4(с).

Это микрофлюидное устройство 1 включает крышку 2, благоприятно жесткую, снабженную отверстиями 21, 22 для осуществления циркуляции текучих сред по микрофлюидным каналам, боковую стенку 3 и центральную стенку 30, обе из которых успешно выполнены из фотоотверждаемой и/или термоотверждаемой смолы. В частности, боковая стенка 3 устройства 1 установлена в единственном слое фотоотверждаемой и/или термоотверждаемой смолы.

Микрофлюидное устройство 1 включает также в своей нижней части два отверстия 47, 470, перекрытых микропористой мембраной 5, простирающейся перпендикулярно к основанию боковой стенки 3 и центральной стенки 30. Посредством отверстия 47, 470 можно достичь периферийной поверхности канала, который простирается между стенками устройства и который должен быть перекрыт мембраной 5. Отверстия 47, 470 расположены в одной и той же плоскости и могут быть включены в сеть отверстий, в данном случае по одному направлению в этой плоскости. В рамках изобретения термин «сеть» отверстий просто означает, что существует несколько отверстий, без необходимости в наличии связи между этими отверстиями и/или специального расположения этих отверстий в плоскости, которой они принадлежат.

Например, на Фигуре 1 отверстия 47, 470 обеспечены двумя различными микрофлюидными каналы и обязательно расположены в ряд в одной и той же плоскости. Напротив, в других вариантах воплощения, которые будут описаны ниже, определенные отверстия могут быть обеспечены одним и тем же каналом, и при этом отверстия расположены по двум направлениям в одной и той же плоскости.

Стенки 3, 30 и крышка 2 позволяют определить два микрофлюидных канала 4, 40, закрытых на уровне их соответствующих отверстий 47, 470 микропористой мембраной 5. Входы для текучей среды в каждом из этих каналов 4, 40 принадлежат соответственно отверстию 21 или 22. Выходы для текучей среды для этих микрофлюидных каналов не представлены.

Микропористая мембрана 5 разделяет две среды, а именно микрофлюидный канал и внешнюю среду этого канала, причем эта внешняя среда образована, например, в культивационной камере 8, в которой должна быть расположена клетка-мишень, которую необходимо стимулировать. С этой точки зрения следует отметить, что гель, используемый в статье Смита и др., не представляет собой мембрану, поскольку он не разделяет микрофлюидный канал и культивационную камеру, но напротив, образует культурную среду, заполняющую культивационную камеру.

Кроме того, микропористая мембрана 5 мешает текучей среде, которая должна течь по микрофлюидным каналам 4, 40, проходить с другой стороны от этой мембраны, однако, эта последняя допускает диффузию молекул, пригодных для стимулирования клеток-мишеней, пригодных для переноса текучей средой по меньшей мере в один из микрофлюидных каналов 4, 40, как это будет подробно разъяснено в описании в дальнейшем. Устройство 1 согласно изобретению не требует обязательного присутствия геля в культивационной камере 8. Микрофлюидное устройство 1 также включает основание 6, предпочтительно жесткое и прозрачное, и боковые стенки 7а, 7b, предпочтительно выполненные из фотоотверждаемой и/или термоотверждаемой смолы. Эти боковые стенки 7а, 7b, основание 6 и микропористая мембрана позволяют формировать камеру 8. Для образования камеры 8 предусмотрены четыре боковые стенки, причем эти стенки на самом деле могут быть включены в единый контур, поскольку процедура изготовления успешно позволяет создавать эти стенки как единое целое.

Дно камеры 8 образовано верхней поверхностью 61 основания 6, которое предназначено для приема клетки-мишени, например, образованной из живых клеток. В этом случае живые клетки должны быть расположены на расстоянии от микропористой мембраны 5 на основании 6 камеры 8. Их можно также культивировать в стандартных условиях, отдельно от микрофлюидного устройства 1.

Микрофлюидные каналы 4, 40 дают возможность заставить циркулировать текучую среду, содержащую молекулы, пригодные для стимулирования клеток-мишеней. Это осуществляется, как это будет более подробно разъяснено в дальнейшем описании, за счет диффузии через микропористую мембрану 5 по направлению к камере 8, затем за счет диффузии через камеру 8 (культивационную камеру) ко дну, где находятся, например, живые клетки (ЖК), которые исследуются на предмет их стимулирования.

Основание 6 успешно выполнено из оптически прозрачного материала, например стекла. Это представляет интерес, поскольку в таком случае можно разместить средство оптической визуализации 18 снаружи относительно устройства, например, для визуализации отклика на стимулирование живых клеток, расположенных на дне камеры 8. Крышка 2 может быть выполнена из материала, выбранного из: стекла или кремния, неэластомерного полимера с поперечными связями, образованными под действием облучения, металла, электропроводящего или полупроводникового сплава, керамики, кварца, сапфира, эластомера.

Микропористую мембрану 5 выбирают для предотвращения утечки текучей среды между микрофлюидными каналами 4, 40 и камерой 8. На самом деле, микропористая мембрана 5 не может быть полностью непроницаемой для прохождения текучей среды. Также можно считать, что клетки, находящиеся в камере 8, не подвержены влиянию никакого потока, если скорость прохождения текучей среды через микропористую мембрану 5 находится ниже предельного значения.

Можно, например, считать, что эта ограниченная скорость составляет порядка 1 мкм/с. В этом случае ограничения по деформации сдвига, налагаемые на клетки, являются незначительными.

Наряду с этим скорость в каждом микрофлюидном канале 4, 40 может составлять 100-10000 мкм/с и даже превышать 10000 мкм/с. Также для получения предельного значения 1 мкм/с, гидравлическое сопротивление R_{h,мембрана} микропористой мембраны 5 должно быть в зависимости от скорости текучей среды в канале 4, 40 в 100-10000 раз выше, чем гидравлическое сопротивление R_h,канал микрофлюидного канала 4, 40.

Например, если скорость течения текучей среды по микрофлюидному каналу 4, 40 составляет 10000 мкм/с, то должно соблюдаться неравенство:

для подтверждения того, что скорость текучей среды через мембрану 5 существенно ниже, чем предельное значение, считающееся равным 1 мкм/с.

Наряду с этим, если мы рассматриваем микрофлюидный канал 4, 40 как прямоугольный, с высотой h, шириной w и длиной L, а микропористую мембрану 5 с толщиной е, в которой имеются идентичные и цилиндрические поры с радиусом r_поры, с поверхностной плотностью пор ρ, то соотношение (R1) будет записано следующим образом:

таким образом:

Для микрофлюидного канала 4, 40 с высотой h=100 мкм, шириной w=1000 и длиной L=1000 мкм величина θ должна быть ниже 10^-10 м для соответствия соотношению (R3). Кроме того, если считать поры цилиндрическими, с радиусом 1 мкм, а толщину мембраны - 10 мкм, то поверхностная плотность пор ρ должна быть ниже величины 10⁵ пор/см². Соотношение (R3), разумеется, может быть обобщено в виде функции рассматриваемой величины ограниченной скорости текучей среды, проходящей через микропористую мембрану 5, с одной стороны, и скорости течения этой текучей среды по микрофлюидному каналу 4, 40, - с другой.

В микропористой мембране 5 могут присутствовать поры, гидравлический диаметр которых составляет 0,05-12 мкм. В частности, если пора является цилиндрической, то гидравлический диаметр поры соответствует ее диаметру.

Однако является предпочтительным, чтобы этот гидравлический диаметр составлял 0,05-3 мкм. На самом деле, следует отметить, что использование мембраны, имеющей поры, гидравлический диаметр которых составляет менее 3 мкм, позволяет избежать утечки потока в камеру 8 для большинства условий использования, которые могут встретиться. В настоящее время изготовители мембран предлагают на рынке мембраны, гидравлический диаметр которых пор обычно составляет более 0,2 мкм. В рамках изобретения в порах, таким образом, могут быть представлены поры с гидравлическими диаметрами, составляющими предпочтительно 0,2-3 мкм. Однако теоретически нижнего предела для гидравлического диаметра пор не существует и этим объясняется, почему может быть реальным воплощение на практике пор, гидравлический диаметр которых достигает 0,05 мкм.

При использовании пор, гидравлический диаметр которых превышает 3 мкм, использование микрофлюидного устройства априори является более тонким способом (например, при выборе расходов течения в микрофлюидном канале 4, 40), чтобы убедиться в том, что текучая среда не проходит через микропористую мембрану 5. Однако следует отметить, что повышение этого гидравлического диаметра сопровождается уменьшением количества пор мембраны, связанной с каждым из отверстий 47, 470, перекрытых мембраной 5. Или же это уменьшение количества пор в мембране, приходящейся на отверстие, благоприятствует повышению гидравлического сопротивления через каждое отверстие микрофлюидного устройства.

По этой причине представляется реальным использование пор, гидравлический диаметр которых будет превышать 3 мкм, ограничивая предусматриваемый диапазон расходов текучей среды по микрофлюидным каналам.

В устройстве согласно Смиту и др. отверстие обязательно соответствует одному и единственному диффузионному отверстию, поскольку отсутствует какая-либо мембрана, точно соответствующая той, какая предложена в изобретении. Следовательно, гидравлическое сопротивление зависит от диаметра самого отверстия в устройстве согласно Смиту и др.

Воплощение микропористой мембраны 5 представляется, таким образом, реально выгодным, поскольку она позволяет обойтись без геля и без неудобств, которые этот гель вызывает.

Что касается плотности пор микропористой мембраны 5, то она может составлять 10³-10¹⁰ пор/см². Высота пор может составлять 50 нм и 100 мкм.

Наряду с этим микропористая мембрана 5 может быть выполнена из различных материалов, таких как: стекло, кварц, кремний, кремнезем или карбид кремния, а также из полимеров, имеющих ту же природу, что и полимеры, пригодные для использования для остальной части микрофлюидного устройства. Можно также использовать поликарбонат, полиэстер или полиэтилентерефталат.

Согласно первому примеру можно предусмотреть наличие микропористой мембраны 5, изготовленной из поликарбоната, диаметр пор которой составляет 0,2-1 мкм, например, типа циклопоры, изготавливаемой компанией Ватман (Whatman Cyclopore™). Согласно второму примеру можно предусмотреть наличие микропористой мембраны 5, изготовленной из полиэстера, диаметр пор которой составляет 0,4-3 мкм, например типа пор Трансвелла, изготавливаемых компанией Корнинг (Corning^® Transwell^®). Согласно третьему примеру можно предусмотреть наличие микропористой мембраны 5, изготовленной из полиэтилентерефталата, диаметр пор которой составляет 0,4-8 мкм, например, типа «трековых» мембран, изготавливаемых компанией Бектон Диккинсон.

Эти микропористые мембраны демонстрируют преимущество, состоящее в том, что они совместимы с процедурой изготовления микрофлюидного устройства 1, которое будет описано ниже со ссылкой на Фигуры 3(a)-3(d). Они также демонстрируют преимущество, состоящее в том, что они являются биосовместимыми и функционально пригодными для того, чтобы быть проницаемыми специально для различных молекул. Под функциональной пригодностью понимается, что микропористую мембрану 5 можно химически модифицировать таким образом, чтобы она исполняла определенную функцию (сдерживания определенных веществ, химических реакций и т.д.).

В общем виде, устройство может иметь следующие размеры. Высота h микрофлюидного канала может составлять 1-1000 мкм, предпочтительно 10-200 мкм. Его ширина (не представлена) может составлять 10-2 мм. Высота h′ камеры 8 может составлять 10-1000 мкм, предпочтительно 50-200 мкм. Наряду с этим, расстояние между входом Е и выходом S составляет несколько сантиметров.

С микрофлюидным устройством может быть связано одно средство оптической визуализации 18, как было указано ранее. Это средство оптической визуализации 18 позволяет распознавать карту концентраций стимулирующих молекул, применяемых для клеток-мишеней. Оно позволяет также осуществлять функциональное формирование изображения биологического отклика клеток на стимулирующие молекулы. Таким образом, оно является намного более удобным для экспериментального осуществления корреляций между наблюдаемым поведением клеток-мишеней и картой концентраций, которые для них применяются.

Эта наблюдение можно осуществлять при высоком пространственном разрешении, поскольку основание из оптически прозрачного материала может быть очень тонким. Например, можно осуществлять микроскопию флуоресценции при высоком разрешении и даже при сверхвысоком разрешении с помощью таких технологий, как микроскопия локализации, осуществляемой за счет фотоактивации (PALM, «Photo-Activated Localized Microscopy», микроскопия фотоактивационной локализации согласно англосаксонской терминологии), или технология истощения носителями зарядов, осуществляемая за счет вынужденного излучения (STED, «Stimulated-Emission-Depletion», микроскопия на основе подавления спонтанного испускания), при использовании, например, основания, образованного из тонкой пластинки стекла толщиной 150 мкм.

Примером процедуры изготовления микрофлюидного устройства 1 согласно изобретению является процедура, которая содержит, по меньшей мере, этапы, состоящие в:

(a) использовании штемпеля 1′, изготовленного из эластомерного материала для вдавливания фотоотверждаемой и/или термоотверждаемой жидкости, расположенной на опоре 2′, снабженной микропористой мембраной 5;

(b) фотооблучении и/или нагреве жидкости для формирования, с одной стороны, первой боковой стенки 3, прикрытой у ее основания микропористой мембраной 5, а с другой стороны, центральной стенки 30, находящейся в контакте с мембраной 5;

(c) приклеивании крышки 2, снабженной отверстиями (не представлены), к первой боковой стенке 3 и к центральной стенке 30, со стороны, противоположной опоре 2′, для формирования микрофлюидных каналов 4, 40, по каждому из которых может циркулировать текучая среда;

(d) после извлечения опоры 2′ наклеивании на высвободившиеся части первой боковой стенки 3 и центральной стенки 30, досягаемые для опоры 2′ на углублении, комплекта, содержащего, по меньшей мере, основание 6 и упомянутые по меньшей мере две вторые боковые стенки 7а, 7b из фотоотверждаемой и/или термоотверждаемой смолы для образования камеры 8.

Эта технология основана на технологии, раскрытой в документе WO 2008/009803.

Эффективное функционирование в ходе этапа (а) представлено на Фигуре 3(a).

Штемпель 1′, используемый в ходе этапа (а), может быть изготовлен из эластомерного материала, такого как полидиметилсилоксан. Он содержит профиль, используемый как матрицу, дополнительную к матрице микрофлюидного устройства 1, которую требуется создать. Штемпель 1′ содержит также выступ 1′а, снабженный вертикальной прорезью 1′с для образования центральной стенки 30 микрофлюидного устройства 1, которую требуется получить. Он также содержит полую зону 1′b, окружающую выступ 1′а, зона в котором предназначена для формирования упомянутой первой боковой стенки 3 микрофлюидного устройства 1. Опора 2′ также может быть выполнена из полидиметилсилоксана и представляет собой плоскость профиля.

Микропористую мембрану 5 предварительно устанавливают на опоре 2′, затем штемпель 1′ прижимают к опоре 2′. Штемпель 1′ прижимают к мембране 5, так же как и к опоре 2′, через прокладку выступа а. Затем заполняют объем, расположенный между штемпелем 1′ и опорой 2′, в требуемых количествах, а именно в полой зоне 1′b штемпеля 1′ и в прорези, созданной в выступе а, например, с использованием фотосшиваемой и/или фотополимеризуемой смолы в форме жидкой смолы ЖС. Это заполнение не изменяет положения микропористой мембраны 5, поскольку последняя зажата между штемпелем 1′ и опорой 2′.

Фотосшиваемая и/или фотополимеризуемая смола представляет собой раствор или дисперсию на основе мономеров и/или предполимеров. В способе согласно изобретению используют фотосшиваемые и/или фотополимеризуемые смолы, обычно используемые в качестве адгезивов, клеев или облицовочных материалов для поверхности. Является предпочтительным, чтобы были выбраны адгезивы, клеи или облицовочные материалы для поверхности, используемые, как правило, в области оптики. Такие смолы, когда их подвергают облучению и фотосшиванию и/или фотополимеризации, становятся твердыми. Является предпочтительным, чтобы твердое тело, образованное указанным способом, было прозрачным и лишенным пузырьков или любых других дефектов.

Такие смолы обычно созданы на основе мономеров/сомономеров/предполимеров типа эпоксидной смолы, эпоксисилана, акрилата, метакрилата, акриловой кислоты, метакриловой кислоты, но также можно еще упомянуть тиоленовые, полиуретановые, уретан-акрилатные смолы. Смолы могут быть заменены фотосшиваемыми водными гелями, такими как гели полиакриламида, и они выбраны, поскольку они являются жидкими при комнатной температуре. Смолы также могут быть заменены полидиметилсилоксаном.

Среди фотосшиваемых смол, используемых в настоящем изобретении, можно упомянуть продукцию, выпускаемую компанией Norland Optics под маркой NOA® Norland Optical Adhesives (оптические адгезивы компании Норланд), такие как, например, продукты NOA81 и NOA60, продукты, выпускаемые компанией Dymax под маркой «Dymax Adhesive and light curing Systems» («адгезивы компании Димакс и светоотверждающие системы»), продукты, выпускаемые компанией Bohle под маркой «UV adhesives» («ультрафиолетовые адгезивы»), продукты, выпускаемые компанией Sartomer под коммерческими номерами SR492 и SR499. Полимеризацию и/или поперечное сшивание этих смол осуществляют путем фотоактивации с помощью любых подходящих средств, таких как облучение рентгеновским, ультрафиолетовым, видимым, инфракрасным излучением.

Преимущественно выбирают смолу, которая, будучи полимеризованной и/или поперечно-сшитой, является жесткой и непластичной, поскольку эластомерные смолы имеют тенденцию к деформации, когда она заставляет циркулировать текучие среды по микрофлюидному устройству 1 под давлением. Тем не менее, для определенных применений, таких как исследование эластичности живых клеток, использование фотосшиваемых эластомерных смол не исключается.

После заполнения объема, расположенного между штемпелем 1′ и опорой 2′ жидкой смолой (ЖС), применяют приложение давления Р к штемпелю 1′, для удаления случайных излишков смолы. На Фигуре 2 выступающие части, а именно выступ 1′а штемпеля 1′, созданного из эластомера, находятся в контакте с опорой 2′. Жидкая смола принимает форму полых зон штемпеля 1′.

Структура, полученная по завершению этапа (b), представлена на Фигуре 3(b).

В ходе этапа (b) облучение смолы осуществляют по оси, перпендикулярной к основанию устройства, проходящей сквозь штемпель 1′. Облучение должно быть дозированным таким образом, чтобы по желанию можно было бы оставлять на поверхности первой боковой стенки 3 и центральной стенки 30, изготовленных из смол, активные участки для полимеризации и/или для поперечного сшивания. Затем штемпель 1′ снимают с устройства. На Фигуре 3(b) можно наблюдать первую боковую стенку 3, изготовленную из смолы, подвергнутой фотополимеризации и/или фотосшиванию, с профилем, дополняющим профиль полых зон штемпеля 1′. На той же самой Фигуре можно наблюдать также центральную стенку 30, которая позволяет разделять микрофлюидные каналы 4, 40.

Отпечаток, сделанный с помощью штемпеля 1′, изготовленного из эластомера, в смоле в жидком состоянии позволяет получить структуры очень маленьких размеров, с очень хорошим разрешением.

Затем в ходе этапа (с) крышку 2, содержащую отверстия для циркуляции текучей среды по микрофлюидным каналам 4, 40, закрепляют со стороны упомянутой первой боковой стенки 3, находившейся ранее в контакте со штемпелем 1′. Опору 2′ также можно удалить. Структура, полученная по завершению этапа (с), представлена на Фигуре 3(c), без отверстий в крышке, которые расположены в другой плоскости.

Удаление опоры 2′ осуществляют таким образом, чтобы микропористая мембрана не отклеивалась от смолы, подвергнутой фотополимеризации и/или фотосшиванию, и таким образом, чтобы она не отрывалась или частично разрывалась.

Крышка 2 может быть реализована с помощью стекла, кремния, пленки из твердого полимера, металла, электропроводящего или полупроводникового сплава, керамики, кварца, сапфира, эластомера. Является предпочтительным, чтобы была выбрана стеклянная пластинка, полимерная пленка или кремниевая пластинка. Материалы, используемые для создания крышки 2, выбирают исходя из применения, которое будет осуществлено с использованием микрофлюидного устройства 1.

Также крышка 2 из оптически прозрачного материала, как стекло, является наиболее подходящей для облегчения наблюдения и оптического детектирования (прозрачности). Другим преимуществом стекла является его очень хорошая теплопроводность, которая позволяет осуществлять равномерный нагрев устройств.

Следует отметить, что размещение микропористой мембраны 5 в нижней части микрофлюидного канала 4 делает ее использование совместимым со стандартными протоколами культивирования живых клеток. На самом деле, также можно предусмотреть, чтобы основание 6 представляло собой стеклянную пластинку, на которой помещают культуру живых клеток, причем эту пластинку затем закрепляют на структуре, полученной по завершению этапа (с), с образованием камеры 8 (культивационной камеры), как это будет разъяснено в продолжении описания.

Следует отметить, что технология изготовления, описанная ранее, может позволить изготавливать отверстия, размеры которых достигают 5 мкм, с шагом (расстоянием между центрами, соответствующим двум смежным отверстиям) между двумя смежными отверстиями, которые также могут составлять более 10 мкм, и, в частности, находятся между 10 мкм и значениями, не превышающими 300 мкм, как это было упомянуто в статье Смита и др. В частности, шаг может составлять 10-250 мкм. Комплект, содержащий основание 6 и две вторые боковые стенки 7а, 7b, может быть реализован, начиная со следующих этапов технологии:

(e₁) использования открытой матрицы 3′, изготовленной из эластомерного материала, представляющей переднюю поверхность опоры 3′а, и полость 3′b, предназначенную для приема фотоотверждаемой и/или термоотверждаемой жидкой смолы ЖС;

(e₁) размещения основания 6 на передней поверхности опоры 3′а матрицы 3′;

(е₃) размещения маски 4′ на основании 6, с последующим фотооблучением или нагревом, для образования упомянутых вторых боковых стенок 7а, 7b.

Структура, полученная по завершению этапов (e₁)-(e₃), представлена на Фигуре 4(a), в случае, когда этап (е₃) состоит в фотооблучении жидкой смолы.

Матрица 3′, как и штемпель 1′ и опора 2′, может быть изготовлена из эластомера, такого как PDMS.

Фотоотверждаемая и/или термоотверждаемая жидкая смола, используемая для этих этапов, может быть выбрана из вариантов, уже описанных для жидкой смолы, используемой на этапе (а). Является предпочтительным, чтобы жидкие смолы, используемые на этапах (а) и (e₁)-(e₃), были одинаковыми. В качестве варианта можно использовать водные фотосшиваемые гели, такие как гели, описанные ранее, или полидиметилсилоксан.

Основание 6 может быть выбрано из материалов, используемых для крышки. Является предпочтительным, чтобы можно было использовать оптически прозрачный материал для облегчения оптической визуализации с помощью специального устройства. Этот оптически прозрачный материал, в частности, может представлять собой стекло, причем основание 6 образует также стеклянную крышку, используемую, как правило, для культивирования живых клеток ЖК. Использование стекла позволяет, помимо этого, выгодно использовать химическую и биологическую обработки поверхностей, применяемые для этой подложки. В маске 4′ могут присутствовать отверстия 4′а, 4′b, позволяющие осуществлять фотооблучение определенных зон жидкой смолы, с целью формирования упомянутых вторых боковых стенок 7а, 7b микрофлюидного устройства.

Как только этап (е₃) завершен, остается только удалить маску 4′ и матрицу 3′, на время осуществления этапа (е₄), оставляя только комплект, образованный упомянутыми вторыми боковыми стенками 7а, 7b и основанием 6. Этот комплект представлен на Фигуре 4(b).

Как правило, тогда осуществляют этап (e₅), который состоит в промывке упомянутого комплекта, например, смесью этанол/ацетон, в объемных соотношениях 90/10. Эта промывка позволяет удалить всю смолу, не подвергшуюся фотооблучению или нагреву, которая могла остаться на основании 6.

Затем используют культуру живых клеток до того, как этот комплект ne не будет иметь структуру, полученную по завершению этапа (с), и пока не будет начат этап (d).

Для этого этот комплект должен быть биосовместимым.

Для осуществления этого можно подвергнуть этот комплект сильному фотооблучению, например ультрафиолетовым излучением, с последующим осуществлением его энергичной промывке в нейтральном растворе, таком как вода, в течение нескольких часов.

В качестве варианта можно изготавливать камеры или, в более общем виде, различные элементы устройства с использованием биосовместимых материалов.

Наконец, культура живых клеток также может быть использована на самой верхней поверхности 61 основания 6, как представлено на Фигуре 4(c). Эту культуру используют в стандартных условиях. В частности, эту культуру можно использовать на поверхности основания 6, представленного в форме классической стеклянной пластинки.

Как только работа с этой культурой завершена, можно приступить к этапу (d).

Операция, осуществляемая в ходе этапа (d), представлена на Фигуре 3(d).

Как только этап (d) завершен, микрофлюидное устройство 1 готово к использованию. Он включает, в частности, живые клетки, расположенные на верхней поверхности 61 основания 6, противоположной микропористой мембране 5 внутри камеры 8 (культивационной камеры).

Чтобы заставить функционировать микрофлюидное устройство 1, его соединяют внутри микрофлюидной системы, по меньшей мере, со средством для снабжения по меньшей мере одного из микрофлюидных каналов 4, 40 текучей средой, содержащей молекулы, пригодные для стимулирования клеток-мишеней, таких как живые клетки.

Например, можно предусмотреть наличие двух независимых резервуаров текучей среды: одного - для снабжения микрофлюидного канала 4 текучей средой F₁, содержащей стимулирующие молекулы клетки-мишени, другого - для снабжения второго микрофлюидного канала 40 нейтральной текучей средой F₂.

Пример микрофлюидных каналов 4, 40, пригодных для использования с этими резервуарами, схематично представлен на Фигуре 5(a) в виде вида сверху.

Текучую среду F₁ вводят в микрофлюидный канал 4 через вход Е₄, а выводят из этого канал 4 через выход S₄. Что касается текучей среды F₂, то ее вводят в микрофлюидный канал 40 через вход Е₄₀, а выводят из этого канала 40 через выход S₄₀. Два микрофлюидных канала 4, 40, как хорошо понятно, разделены центральной стенкой 30 микрофлюидного устройства 1.

Эффективное разделение посредством центральной стенки 30 позволяет осуществлять рециркуляцию текучих сред, циркулирующих по каждому из микрофлюидных каналов 4, 40, поскольку между этими текучими средами не может происходить никакого смешивания. Кроме того, благодаря этому разделению-, скорости течения текучих сред могут находиться в широком диапазоне значений, например-, 100-10000 мкм/с, и даже без риска гидродинамического перемешивания двух текучих сред под действием сил поперечного сдвига. С другой стороны, разница скоростей циркуляции текучих сред по различным каналам может быть предусмотрена без того, чтобы это порождало какие-либо проблемы, связанные с функционированием устройства.

Текучие среды F₁, F₂ различаются только по наличию в одной из двух текучих сред и в слабой концентрации стимулирующих молекул клеток-мишеней.

Следует отметить, что входы Е₄, Е₄₀ находятся близко к входным отверстиям 21, 22, представленным на Фигуре 2.

На Фигуре 5(b) схематично показано течение текучих сред F₁, F₂ по различным частям микрофлюидного устройства, которое схематически представлено в виде вертикального разреза.

Каждая текучая среда F₁, F₂, таким образом, должна течь по одному из микрофлюидных каналов 4, 40 микрофлюидного устройства 1, оба из которых находятся в контакте с микропористой мембраной 5, но не в камере 8 (в камере для культуры). Карта концентраций этих молекул в каналах 4, 40 представлена кривой С1, в виде лестницы.

Перенос молекул (содержащихся в текучей среде F₁), пригодных для стимулирования живых клеток, между микрофлюидным каналом 4 и упомянутыми клетками, помещенными на основании 6 камеры 8, осуществляется в таком случае за счет диффузии в камере 8, через микропористую мембрану 5.

Точнее говоря, перенос этих молекул происходит сначала за счет диффузии через микропористую мембрану 5, затем за счет диффузии через камеру 8, и тогда они, наконец, достигают верхней поверхности 61 основания 6 камеры 8, т.е. поверхности 61, на которой находятся живые клетки.

Карта концентраций, таким образом, должна стабилизироваться в камере 8. В частности, на уровне основания 6 камеры 8, период стабилизации t_стаб составляет порядка h′²/D, где h′ - это высота камеры 8, a D - коэффициент диффузии молекул, предназначенных для стимулирования клеток-мишеней в камере 8. Следует отметить, что во избежание слишком высоких периодов стабилизации высота камеры должна быть, как правило, ограничена 500 мкм.

Карта концентраций, которая также стабилизируется в камере 8, представлена кривой С2, которая имеет форму кривой, отображающую функцию типа «erf» («error function», функция ошибок). Путем этого снабжения микрофлюидных каналов, таким образом, можно получить карту концентраций, в частности, для основания камеры 8 и, следовательно, для живых клеток, которые исследуются на предмет их стимулирования. Снабжение, описанное ниже применительно к Фигурам 5(a) и 5(b), - это всего лишь пример, приведенный в иллюстративных целях. Также снабжение текучей средой микрофлюидных каналов может быть осуществлено по-разному, для получения других типов карт концентраций, предназначенных для клеток-мишеней.

Также, согласно другому примеру может быть предусмотрено средство снабжения, позволяющее снабжать каждый из двух микрофлюидных каналов 4, 40 текучими средами F₁ и F₂ для получения более сложных карт концентраций, чем карты концентраций для камеры 8.

Закрытая камера 8 может быть заменена микрофлюидным каналом, содержащим отверстия, предпочтительно боковые, хотя никакая текучая среда не должна течь в этот микрофлюидный канал в ходе проводящегося испытания. Тем не менее, можно соединить каналы с боковыми отверстиями для извлечения секреции живых клеток в целях их химического анализа. Наряду с этим между двумя испытаниями может быть также предусмотрена быстрая промывка или замена культурной среды.

Наряду с этим следует отметить, что можно также размещать клетки-мишени не на поверхности основания камеры 8 или микрофлюидного канала, а на самой микропористой мембране 5. В таком случае карта концентрации, полученная на уровне клеток-мишеней, соответствует карте концентраций, созданной для микрофлюидных каналов 4, 40. На самом деле, в этом случае клетки-мишени находятся со стороны мембраны 5, которая установлена напротив, контактируя с текучими средами, которые текут по микрофлюидным каналам 4, 40.

Наряду с этим можно даже изготовить микрофлюидное устройство 1 без камеры или без микрофлюидного канала, где клетки-мишени размещены непосредственно на микропористой мембране 5. В этом случае следует понимать, что этапы (е₁)-(е₃), описанные ранее, непригодны для изготовления устройства.

Теперь мы можем описать другое микрофлюидное устройство согласно изобретению, применительно к Фигурам 6 и 8, а также способ изготовления этого устройства применительно к Фигурам 7(a), 7(b), 7′(а), 7′(b) и 7(c)-7(f).

Микрофлюидное устройство 101, представленное на Фигуре 6, включает несколько микрофлюидных каналов 401, 402, каждый из которых содержит несколько отверстий 401′, 402′ с одной стороны и 403′, 404′ с другой стороны, которые выходят на микропористую мембрану 500. В этом случае предусмотрено два микрофлюидных канала, снабжаемых: для одного канала 401 - через шесть отверстий, показанных белым цветом на Фигуре 8, и для другого канала 402, - через шесть отверстий, показанных на этой Фигуре 8 черным цветом. Эти отверстия 401′, 402′, 403′, 404′ расположены в одной и той же плоскости Р в виде сети отверстий, которые имеют два размера в этой плоскости. Плоскость Р представлена на Фигуре 6 так же, как и на Фигуре 8, причем на этой последней упомянутые отверстия представлены на виде снизу, на уровне этой плоскости Р.

Микропористая мембрана 500 простирается перпендикулярно относительно боковых стенок различных микрофлюидных каналов таким образом, что она перекрывает различные каналы в их нижние части и, таким образом, перекрывает различные отверстия.

Является предпочтительным, чтобы микропористая мембрана 500 перекрывала комплект упомянутых отверстий 401′, 402′, 403′, 404′ микрофлюидных каналов 401, 402. Это позволяет перекрывать различные отверстия одной мембраной, что является особо целесообразным при плотной сети отверстий. Обычно способ согласно изобретению может позволить создавать отверстия величиной 5 мкм, которые отстоят друг от друга на шаг 10 мкм. Шаг здесь задан как расстояние, разделяющее соответствующие центры двух смежных отверстий.

Микропористая мембрана 500 снабжена порами. Характеристики этой мембраны 500 могут быть даже теми же, что и для мембраны 5 микрофлюидного устройства 1, описанного ранее применительно к Фигурам 2, 3(a)-3(d) и 4(а)-4(с).

Микрофлюидное устройство 101 включает также крышку 200 для микрофлюидных каналов. Эта крышка 200 может быть реализована из материала, выбранного из: стекла или кремния, неэластомерного полимера с поперечными связями, образованными под действием облучения, металла, электропроводящего или полупроводникового сплава, керамики, кварца, сапфира, эластомера.

Входные и выходные отверстия для текучих сред, которые должны циркулировать по микрофлюидным каналам 401, 402, могут быть образованы в крышке 200 (не представлены).

Гидравлический диаметр пор микропористой мембраны 500 мешает текучим средам течь по микрофлюидным каналам 401, 402, пересекая мембрану 500, которую пересекают только молекулы, пригодные для стимулирования клеток-мишеней. С этой точки зрения следует вернуться к соотношениям (R1)-(R3), представленным ранее, и к выбору ограниченной скорости, ниже которой считается, что мембрана не пропускает текучую среду течь по микрофлюидным каналам 401, 402. Карту концентраций этих стимулирующих молекул, таким образом, создают, выбирая снабжение текучей средой для каждого из различных микрофлюидных каналов 401, 402. Как можно утверждать применительно к Фигуре 8 (микропористая мембрана 500 не представлена), отверстия 401′, 402′, 403′, 404′, выходящие на микропористую мембрану 500, образуют диффузионные зоны для стимулирующих молекул, которые можно уподобить пикселям, предоставляющим химическую информацию клетке-мишени.

Является предпочтительным, чтобы в микрофлюидном устройстве 101 была предусмотрена культивационная камера 8, закрытая для упомянутой клетки-мишени. Эта камера должна быть также расположена со стороны микропористой мембраны 500, которая расположена напротив первых микрофлюидных каналов 401, 402. Камера должна обладать характеристиками, аналогичными характеристикам камеры 8 микрофлюидного устройства 1, описанным ранее, однако, ее размеры должны быть адаптированы.

Также микропористая мембрана 500 простирается перпендикулярно между боковыми стенками камеры, чтобы закрывать упомянутую камеру в ее верхней части.

Клетка-мишень может быть расположена на поверхности основания 61 камеры 8, причем основание 61 расположено с другой стороны камеры 8 относительно микропористой мембраны 500.

В качестве варианта может быть воплощено размещение клетки-мишени в камере 8, непосредственно на микропористой мембране 500, и даже размещение клетки-мишени непосредственно на микропористой мембране при отсутствии всей остальной камеры.

Кроме того, культивационная камера 8 может быть заменена микрофлюидным каналом, содержащим отверстия, предпочтительно боковые, однако, никакая текучая среда не должна течь в этот канал. Средство оптической визуализации, такое как средство 18, описанное ранее и представленное на Фигуре 2, также может быть связано с микрофлюидным устройством 101, в частности, если основание камеры 8 или микрофлюидного канала является оптически прозрачным. Способ изготовления микрофлюидного устройства 101 состоит из адаптированных этапов, аналогичных этапам (а)-(d), описанным ранее для микрофлюидного устройства, представленного на Фигуре 2. Этапы (а) и (b) также осуществляют для выполнения структуры 200, представленной на Фигуре 7(b). В ходе этапа (а), таким образом, используют штемпель 10′, изготовленный из эластомерного материала для создания оттиска на жидкой фотоотверждаемой и/или термоотверждаемой смоле ЖС, помещенной на опору 20′, снабженную микропористой мембраной 500 (Фигура 7(a)). Затем в ходе этапа (b) осуществляют фотооблучение и/или нагрев жидкости для формирования нескольких стенок с микропористой мембраной 500.

Аналогично этапы (а) и (b) осуществляют для выполнения другой структуры 200′, представленной на Фигуре 7′(b). Точнее говоря, в ходе этапа (а) используют штемпель 10″, изготовленный из эластомерного материала для создания оттиска на жидкой фотоотверждаемой и/или термоотверждаемой смоле ЖС, помещенной на опору 20″, в отсутствие всей микропористой мембраны (Фигура 7′(а)). Затем в ходе этапа (b) осуществляют фотооблучение и/или нагрев du жидкости для формирования нескольких стенок.

Затем структуры 200′, 200″, которые были выполнены независимо друг от друга, компонуют друг с другом, с использованием нового фотооблучения или нового нагрева. Это позволяет создавать постоянную связь между жидкими смолами структур 200′ и 200″ (Фигура 7(c)). Как только компоновка осуществлена, следует удалить одну 20″ из опор 20′, 20″ для появления новой структуры 200″, образованной путем компоновки структур 200, 200′. Затем осуществляют этап, повторяющий этап (с), описанный ранее. Иными словами, также приклеивают крышку 200, снабженную отверстиями (не представленными), к различным стенкам 3′, 30′ структуры 200″, со стороны, противоположной микропористой мембране 500, с образованием микрофлюидных каналов 401, 402.

Затем удаляют опору 20′, контактирующую с микропористой мембраной 500 (Фигура 7(e)). На этой Фигуре 7(e) появляются микрофлюидные каналы 401, 402. Следует отметить, что микрофлюидный канал 401 с одной стороны и микрофлюидный канал 402 с другой имеют различные глубины, что позволяет совмещать каналы в плоскости, как это может быть отображено на Фигуре 9.

Затем, в соответствии с этапом (d), описанным ранее, на мембрану 500 наклеивают комплект, содержащий, по меньшей мере, основание 6 и упомянутые по меньшей мере две вторые боковые стенки 7а, 7b из фотоотверждаемой и/или термоотверждаемой смолы, с образованием камеры 8. Что касается этого комплекта, его создают с использованием процедуры, повторяющей этапы (e₁)-(е₃), описанные ранее применительно к Фигурам 4(а)-4(с).

Следует отметить, что стенки микрофлюидных каналов 401, 402 микрофлюидного устройства 101, полученные так же, как и стенки камеры 8 этого устройства, могут быть выполнены с помощью таких смол, какие были описаны ранее, или в качестве вариант, с помощью водных фотосшиваемых гелей, таких как гели из полиакриламида, выбранных таким образом, чтобы они были жидкими при комнатной температуре. Смолы также могут быть заменены полидиметилсилоксаном.

Чтобы заставить функционировать микрофлюидное устройство 101 согласно Фигуре 6, она должна быть связана внутри микрофлюидной системы, по меньшей мере, со средством для снабжения по меньшей мере одного из микрофлюидных каналов 401, 402, с текучей средой, содержащей молекулы, пригодные для стимулирования клеток-мишеней, таких как живые клетки.

Например, можно предусмотреть надлежащее средство снабжения (не представленное), такое как резервуар текучей среды для каждого микрофлюидного канала 401, 402. Сообщение между резервуаром и связанным с ним микрофлюидным каналом может осуществляется посредством капилляра.

Микрофлюидные каналы 401, 402, схематизированные на Фигуре 9, представляющей собой частичное перспективное изображение, представляют собой только каналы 401, 402, снабжающие отверстия 401′, 402′, 403′, 404′ согласно разрезу А-А на Фигуре 8, причем этот разрез соответствует также изображению, выбранному для описания процедуры изготовления применительно к Фигурам 7(a)-7(f), 7′(а) и 7′(b).

Расположение, представленное на Фигуре 9, позволяет провести корреляцию между экспериментами и степенью снижения электрических соединений в той мере, в какой снабжение будет позволять снабжать несколько отверстий.

Тем не менее, расположение микрофлюидных каналов может быть различным при сохранении сети отверстий с двумя размерами, такими как представлены на Фигуре 8.

Также считать, что каждый канал содержит только одно отверстие, если предположить, что существует столько каналов, сколько имеется отверстий. Такой случай представлен на Фигуре 10, которая представляет собой только четыре канала 4010, 4020, 4030, 4040 (связанных соответственно с отверстием 4010′, 4020′, 4030′, 4040′) из двенадцати микрофлюидных каналов, связанных с двенадцатью отверстиями согласно Фигуре 8. На этой Фигуре 10 каждый микрофлюидный канал может снабжаться соответствующей текучей средой, которая может, в частности, содержать стимулирующие молекулы для клетки-мишени.

Снабжение каждого канала также является независимым. Наряду с этим оно также может быть смоделировано на входе с помощью клапанов, позволяющих пропускать последовательно по меньшей мере две текучие среды в канал.

Следовательно, микрофлюидное устройство, созданное указанным образом, представляет собой устройство, сопоставимое с устройством, описанным на основе Фигура 2. Однако оно содержит более двух микрофлюидных каналов.

В этих условиях следует понимать, что в способе изготовления такого устройства будут повторяться этапы изготовления, описанные применительно к Фигурам 3(a)-3(c), и при случае этапы, описанные применительно к Фигурам 3(d), 4(а)-4(с), для создания камеры или другого микрофлюидного канала.

Однако для этого эффекта необходимо видоизменить форму штемпеля 1′, для того чтобы выступ 1′а вместо вертикальной прорези 1′с содержал полую зону в форме решетки, пригодной для формирования стенок, отделяющей микрофлюидные каналы друг от друга, для получения, в конце концов, сети отверстий согласно Фигуре 8. На Фигуре 11 также представлен модифицированный штемпель 11′, содержащий эту полую зону в форме решетки 11′с, на выступе с опорой 2'', создаваемый в ходе этапа, соответствующего этапу, представленному на Фигуре 3(a). Это дает многочисленные возможности.

На самом деле, можно выбрать микрофлюидные каналы, снабжаемые текучей средой, исходя из желаемой карты концентраций молекул, пригодных для стимулирования клеток-мишеней.

Также возможно снабжение микрофлюидных каналов различными типами молекул, стимулирующих клетку-мишень. Под этим углом зрения можно осуществлять точный контроль и пространственное изменение культивирования живых клеток.

Например, возможно снабжение микрофлюидного канала текучей средой, содержащей стимулирующие молекулы, а другого микрофлюидного канала, например, непосредственно прилегающего к первому микрофлюидному каналу, - текучей средой, содержащей нейтральную среду. Текучие среды тогда смешиваются в камере 8, с образованием карты концентраций, в частности, на уровне основания камеры, когда клетки-мишени находятся на этом основании.

Также возможно стимулирование клетки-мишени через желаемое отверстие 401′, 402′, 403′, 404′, со смещением во времени между одним микрофлюидным каналом 401, 402, 403, 404 и другим. Другие отверстия, представленные на Фигуре 8, могут снабжаться таким же образом. Другое предполагаемое расположение микрофлюидных каналов может быть следующим.

На самом деле, может быть предусмотрен только один микрофлюидный канал, по которому циркулирует текучая среда, содержащая стимулирующие молекул для клетки-мишени, причем этот канал содержит несколько отверстий.

Например, может быть изготовлено устройство, содержащее канал с четырьмя отверстиями, и, таким образом, микрофлюидный канал будет снабжать текучей средой эти четыре отверстия.

Процедура изготовления такого устройство представлена применительно к Фигурам 12(а)-12(d), в случае, когда наряду с этим предусмотрена камера 8 (Фигура 12(d)).

Может быть выполнен штемпель 101′, изготовленный из эластомерного материала, такого как PDMS. Он содержит профиль, используемый в качестве матрицы, дополнительной к матрице микрофлюидного устройства, которое надлежит изготовить. Штемпель 101′ содержит также выступ 101′а, снабженный несколькими вертикальными прорезями 101′с, для формирования различных стенок 301′ микрофлюидного устройства. Он содержит также полую зону 101′b, окружающую выступ 101′а, т.е. зону, в которой должна быть сформирована боковая стенка 300′ микрофлюидного устройства. Опора 201′ также может быть выполнена из полидиметилсилоксана и она имеет плоский профиль. Микропористую мембрану 500′ предварительно помещают на опору 201′, а затем к опоре 201′ прижимают штемпель 101′.

Затем в надлежащем количестве заполняют объем, расположенный между штемпелем 101′ и опорой 201′, например фотосшиваемой и/или фотополимеризуемой смолой в форме жидкой смолы ЖС. После заполнения объема, расположенного между штемпелем 101′ и опорой 201,′ жидкой смолой ЖС к штемпелю 101′ прикладывают давление Р для удаления случайных излишков смолы.

Структура, полученная по завершению этапа (b), представлена на Фигуре 3(b).

Смолу облучают поперек штемпеля 101′. Затем штемпель 101′ снимают с устройства. На Фигуре 12(b) можно наблюдать стенки 300′, 301′, изготовленная из смолы, подвергнутой фотополимеризации и/или поперечному фотосшиванию, с профилями, дополнительными к полым зонам штемпеля 101′.

Затем со стороны упомянутой первой боковой стенки 300′, находившейся ранее в контакте со штемпелем 101′, закрепляют крышку 2 00′. Затем может быть удалена опора 201′. Структура, полученная по завершению этого этапа, представлена на Фигуре 12(c).

Камеру 8 изготавливают согласно процедуре, ранее описанной применительно к Фигурам 4(а)-4(с), затем компонуют со структурой, представленной на Фигуре 12(с). Эта операция сборки представлена на Фигуре 12(d).

Направление движения текучей среды в канале обозначено как F на Фигуре 12(d). Следует отметить, что она снабжает последовательно различные отверстия, выходящие на мембрану 500′. Кроме того, могут быть воплощены различные материалы, уже представленные ранее. Наличие камеры 8 не является обязательным, канал, в частности, может быть предусмотрен вместо этой камеры 8. Мембрана 500′ будет демонстрировать те же характеристики, что и мембраны 5, 500, описанные ранее.

В изобретении также воплощена мембрана, гидравлический диаметр пор которых разумно выбран таким образом, чтобы можно было избежать протекание текучей среды за микрофлюидные каналы, в сторону, противоположную мембране, содержащую, например, камеру или другой микрофлюидный канал. Гидравлический диаметр пор может в то же время находиться в широком диапазоне величин.

Таким образом, для предотвращения протекания текучей среды за микрофлюидные каналы по направлению к камере или к этому другому микрофлюидному каналу изобретение не требует наличия какой-либо культурной среды в форме геля.

Диффузия в культивационной камере осуществляется, таким образом, в жидкой культурной среде, такой как вода. Эта диффузия в камере, таким образом, происходит быстрее, чем в культурной среде, выполненной при наличии геля. Это позволяет осуществлять испытание быстрее, а также быстрее координировать различные испытания. Между прочим, точность, с которой стимулирующие молекулы достигают клетки-мишени, полученной с помощью устройства согласно изобретению, является исключительной и намного лучшей, чем точность с использованием известных устройств.

Это, в частности, связано с отсутствием геля в камере, что ограничивает разнонаправленную диффузию стимулирующих молекул, установленную при наличии этого геля.

Кроме того, способ согласно изобретению позволяет изготавливать сеть отверстий с мелкими размерами, с повышенной поверхностной плотностью. Как правило, размер отверстий может достигать 5 мкм, а расстояние между соответствующими центрами двух смежных отверстий может достигать 10 мкм.

Наконец, определение размеров отверстий полностью не зависит от гидравлического диаметра пор микропористой мембраны. Также можно изготавливать микрофлюидное устройство с небольшими отверстиями (например, с размером 30 мк или менее), связанными с микропористой мембраной, в которой имеются крупные поры (например, размером 3 мк). Также может быть изготовлено микрофлюидное устройство с крупными отверстиями (например, с размером 2000 мк), связанными с микропористой мембраной 500, в которой имеются мелкие поры (например, размером 0,2 мкм).

Это предоставляет большую свободу выбора при определении размеров микрофлюидного устройства исходя из воплощаемого применения.

Изобретение, в частности, находит применение в области биологии, для культивирования, наблюдения и исследования живых клеток. В частности, можно определить хемотаксический отклик нервных клеток на определенные молекулы, например, для разработки нейронных сетей. В частности, также можно измерять отклик раковых клеток на молекулы, используемые для химиотерапии. Можно также использовать микрофлюидную систему для изготовления биочипов или для стимулирования тканей, в частности, для изготовления искусственных тканей.

Преимущества, связанные с изобретением, могут представлять интерес для других областей применения, например для определения уровней токсичности определенных молекул в косметологии.

Изобретение относится к микрофлюидной системе и может быть использовано для количественного определения отклика живых клеток на определенные молекулы. Микрофлюидная система для управления картой концентраций молекул, пригодных для возбуждения клеток-мишеней, включает: микрофлюидное устройство (1); камеру (8) или дополнительный микрофлюидный канал, содержащий основание (6), предназначенное для приема клетки-мишени; микропористую мембрану (5), покрывающую сеть отверстий (47, 470); одно или несколько средств снабжения для снабжения одного или каждого из микрофлюидных каналов текучей средой, причем по меньшей мере одна из этих текучих сред содержит стимулирующие молекулы клетки-мишени. При этом микрофлюидное устройство содержит n_c≥1 микрофлюидных каналов, снабженных по меньшей мере одним входным отверстием (21, 22) для текучей среды и по меньшей мере одним выходным отверстием для текучей среды; а также n₀≥2 отверстий (47, 470) в микрофлюидном канале (4, 40) или распределенных по нескольким микрофлюидным каналам. При этом количества n_c микрофлюидных каналов и n₀ отверстий связаны соотношением , где 1<i<n_c, a n₀/c_i - количество отверстий на канал C_i. Изобретение позволяет повысить точность анализов и сократить время проведения анализа. 14 з.п. ф-лы, 12 ил.

1. Микрофлюидная система для управления картой концентраций молекул, пригодных для возбуждения клеток-мишеней, отличающаяся тем, что система включает:
микрофлюидное устройство (1, 101), содержащее:
n_c≥1 микрофлюидных каналов (4, 40, 401, 402, 4010, 4020, 4030, 4040), причем один или каждый микрофлюидный канал(4, 40, 401, 402, 4010, 4020, 4030, 4040) снабжен по меньшей мере одним входным отверстием (21, 22) по меньшей мере для одной текучей среды и по меньшей мере одним выходным отверстием для по меньшей мере одной текучей среды;
n₀≥2 отверстий (47, 470, 401′, 402′, 403′, 404′, 4010′, 4020′, 4030′, 4040′), образованных в микрофлюидном канале (4, 40, 401, 402, 4010, 4020, 4030, 4040) или распределенных по нескольким микрофлюидным каналам (4, 40, 401, 402, 4010, 4020, 4030, 4040), причем упомянутые отверстия (47, 470, 401′, 402′, 403′, 404′, 4010′, 4020′, 4030′, 4040′) расположены в одной и той же плоскости, таким образом, что отверстия 47, 470, 401′, 402′, 403′, 404′, 4010′, 4020′, 4030′, 4040′) образуют сеть в указанной плоскости,
причем количества n_c микрофлюидных каналов (4, 40, 401, 402, 4010, 4020, 4030, 4040) и n₀ отверстий (47, 470, 401′, 402′, 403′, 404′, 4010′, 4020′, 4030′, 4040′) связаны соотношением , где 1<i<n_c, a n₀/c_i - количество отверстий (47, 470, 401′, 402′, 403′, 404′, 4010′, 4020′, 4030′, 4040′) на канал C_i;
камеру (8) или дополнительный микрофлюидный канал, содержащий основание (6), предназначенное для приема клетки-мишени;
по меньшей мере одну микропористую мембрану (5, 500, 500′), покрывающую сеть отверстий (47, 470, 401′, 402′, 403′, 404′, 4010′, 4020′, 4030′, 4040′), причем основание (6), предназначенное для приема клетки-мишени, расположено с другой стороны камеры (8) или дополнительного микрофлюидного канала относительно микропористой мембраны;
- одно или несколько средств снабжения для снабжения одного или каждого микрофлюидного канала (4, 40, 401, 402, 4010, 4020, 4030, 4040) текучей средой (F₁, F₂), причем по меньшей мере одна из указанных текучих сред (F₁, F₂) содержит стимулирующие молекулы для клетки-мишени;
таким образом, что когда средство снабжения подает в микрофлюидный канал или в каждый из микрофлюидных каналов (4, 40, 401, 402, 4010, 4020, 4030, 4040) по меньшей мере одну из указанных текучих сред (F₁, F₂), молекулы, пригодные для стимулирования клеток-мишеней, после прохождения по меньшей мере одной микропористой мембраны (5, 500, 500′) диффундируют через камеру (8) или упомянутый дополнительный микрофлюидный канал, в результате чего можно контролировать карту концентраций молекул, пригодных для стимулирования клеток-мишеней в указанной камере (8) или в указанном дополнительном микрофлюидном канале.

2. Микрофлюидная система по п. 1, в которой клетки-мишени образованы за счет скопления живых клеток.

3. Микрофлюидная система по п. 1 или 2, в которой по меньшей мере одна микропористая мембрана (5, 500, 500′) снабжена порами, гидравлический диаметр которых составляет 0,05-12 мкм, предпочтительно 0,05-3 мкм.

4. Микрофлюидная система по п. 3, в которой поверхностная плотность пор по меньшей мере одной микропористой мембраны (5, 500, 500′) составляет 10³-10¹⁰ пор/см².

5. Микрофлюидная система по п. 1 или 2, в которой микропористая мембрана (5, 500, 500′) выполнена из материала, выбранного из: стекла, поликарбоната, сложного полиэфира, полиэтилентерефталата, кварца, кремния, кремнезема или карбида кремния.

6. Микрофлюидная система по п. 1 или 2 дополнительно содержит крышку (2, 200) для микрофлюидных каналов (4, 40, 401, 402, 4010, 4020, 4030, 4040), причем упомянутая крышка (2, 200) выполнена из материала, выбранного из: стекла или кремния, неэластомерного полимера с поперечными связями, образованными под действием облучения, металла, электропроводящего или полупроводникового сплава, керамики, кварца, сапфира или эластомера.

7. Микрофлюидная система по п. 6, в которой упомянутое по меньшей мере одно входное отверстие (21, 22) и упомянутое по меньшей мере одно выходное отверстие для по меньшей мере одной текучей среды сформировано в крышке (2, 200).

8. Микрофлюидная система по п. 1 или 2, в которой каждый из микрофлюидных каналов (4, 40, 401, 402, 4010, 4020, 4030, 4040) содержит, по меньшей мере, стенку (3, 30, 3′, 30′, 300′, 301′) из фотоотверждаемой и/или термоотверждаемой смолы.

9. Микрофлюидная система по п. 8, в которой основание (6) камеры (8) или дополнительного микрофлюидного канала выполнено из оптически прозрачного материала.

10. Микрофлюидная система по п. 8, в которой камера (8) или дополнительный микрофлюидный канал содержит боковые стенки (7а, 7b) из фотоотверждаемой и/или термоотверждаемой смолы.

11. Микрофлюидная система по п. 1 или 2, которая содержит множество средств снабжения.

12. Микрофлюидная система по п. 1 или п. 2, дополнительно содержащая средство оптической визуализации (18).

13. Микрофлюидная система по п. 12, в которой средство оптической визуализации (18) воплощает технологию микроскопии локализации за счет фотоактивации или технологию истощения носителями зарядов за счет вынужденного излучения.

14. Микрофлюидная система по п. 1 или 2, в которой отверстия (47′, 470′, 401′, 402′, 403′, 404′) образуют двумерную сеть в плоскости, которой принадлежат отверстия (47′, 470′, 401′, 402′, 403′, 404′).

15. Микрофлюидная система по п. 1 или 2, в которой соответствующие центры, двух смежных отверстий (47, 470, 401′, 402′, 403′, 404′, 4010′, 4020′, 4030′, 4040′) расположены друг от друга на расстоянии, составляющем 10-250 мкм.