СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ГЕПАТОПРОТЕКТОРНЫМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2016 года по МПК A61K36/07 B01D11/00 A61P1/16 

Изобретение относится к области фармации и может быть использовано для получения средства, обладающего гепатопротекторным действием.

Фармакотерапия заболеваний органов гепатобилиарной системы использует различные группы лекарств («Гептрал», «Легалон» и др.), однако особое место среди них занимают лекарственные средства, различные по структуре и механизму действия, но обладающие избирательным действием в отношении печени - гепатопротекторы. Действие последних направлено на нормализацию обменных процессов и гомеостаза в печени, повышение устойчивости гепатоцитов к патогенным воздействиям, стимуляцию регенеративных процессов, восстановление паренхимы печени и нормализацию ее физиологических функций [Агаркова Е.В. Применение Эссливера форте в комплексной терапии заболеваний гепатобилиарной зоны // Болезни органов пищеварения, 2008, №2. С. 68-70]. Несмотря на фундаментальные открытия последних лет в области гепатологии многие аспекты проблемы лечения и профилактики заболеваний печени остаются неизученными. Поэтому сегодня актуальным является разработка новых препаратов растительного происхождения для лечения и профилактики заболеваний печени на основе сырья, произрастающего на территории России.

Известен способ получения средства, обладающего гепатопротекторным действием, а именно полиоксифенилхроманов (флаволигнанов) путем экстракции плодов расторопши спиртом этиловым 80% дважды в течение 2-3 ч при 35-37°C с последующим упариванием, очисткой спиртом этиловым 50%, обезжириванием четыреххлористым углеродом, извлечением биологически активных веществ (БАВ) хлороформ-спиртовой смесью, упариванием, растворением в спирте этиловом, концентрированием, сушкой и измельчением (Патент №2038091).

Недостатками известного способа являются многостадийность и, как следствие, трудоемкость, а также использование в процессе изготовления токсичных растворителей.

Наиболее близким по достигаемому результату, прототипом, является способ получения средства, обладающего противовоспалительным действием путем экстракции плодового тела трутовика лиственничного водой в соотношении 1:10 (Белозерцева Е.И., Зяблова О.Н., Заловкина А.Г., Лепилов А.В. и др. Влияние отвара Fomitopsis officinalis на течение экспериментального острого токсического гепатита // Актуальные проблемы фармакологии и фармации. Вып. VII. - Барнаул, 2010. - С. 23-29). При этом выявлено, что наиболее оптимальным является использование спирта этилового 70%, при применении которого экстракт характеризуется повышенным содержанием экстрактивных веществ.

Недостатками известного способа являются: некомпактность и невозможность дальнейшего использования в производстве других технологически более совершенных лекарственных форм, таких как капсулы, таблетки.

Авторы предлагают способ получения средства, обладающего гепатопротекторным действием, позволяющий расширить ассортимент препаратов гепатопротекторного действия и создать технологически более совершенную форму экстракционного препарата (сухой экстракт) из данного вида сырья.

Техническим результатом заявляемого изобретения является расширение ассортимента растительных гепатопротекторов и создание более стабильной формы экстракционного препарата (сухого экстракта), гепатозащитного действия из трутовика лиственничного плодового тела, который не содержит фармакологически индифферентный растворитель (спирт этиловый) и удобен для последующего изготовления на его основе дозированных пероральных твердых лекарственных форм.

Технический результат достигается тем, что трутовика лиственничного плодовое тело измельченностью 7-10 мм экстрагируют спиртом этиловым 70% при комнатной температуре 12 часов в соотношении сырье:экстрагент - 1:10 методом многоступенчатого противоточного экстрагирования с законченным циклом в батареи из 5 диффузоров в течение 4 часов однократно, с последующим дополнительным экстрагированием сырья в 4 и 5 диффузорах используемым экстрагентом, затем извлечения объединяют, фильтруют, сгущают под вакуумом при температуре 40-50°C, высушивают в вакуум-сушильном шкафу при 40-50°C до получения сухого экстракта и измельчают.

Способ осуществляют следующим образом

Способ проиллюстрирован фиг. 1-3.

На фиг. 1 дана таблица по содержанию экстрактивных веществ (в %) в извлечениях из трутовика лиственничного плодового тела, полученных с использованием спирта этилового различной концентрации, где x - среднее значение; Δ_x - доверительный интервал. Данные представлены в виде M.

На фиг. 2 дана таблица по влиянию экстракта плодового тела трутовика лиственничного сухого на активность ферментов печени крыс (∗различия статистически значимы при p<0,05), данные представлены в виде M±m, где M - среднее значение, m - стандартная ошибка среднего значения.

На фиг. 3 представлена таблица по влиянию экстракта плодового тела трутовика лиственничного сухого на основные биохимические показатели, характеризующие функции печени (∗различия статистически значимы при p<0,05), данные представлены в виде M±m, где M - среднее значение, m - стандартная ошибка среднего значения.

Трутовика лиственничного плодовые тела (FomitopsisofficinalisWill.), семейство трутовиковых (Polyporaceae), собранные в течение всего года, освобожденные от остатков древесины, разрубленные на куски. Сырье сушат воздушно-теневым способом, упаковывают в двойные бумажные мешки и хранят в сухом прохладном месте.

Измельчают трутовика лиственничного плодовые тела до размера 5-7 мм. Данное измельчение выбрано оптимальным, т.к. при указанном размере частиц быстрее наступает близкое к равновесному состояние в системе сырье:экстрагент по органическим кислотам.

Емкость диффузора на 100 г плодового тела трутовика лиственничного измельченностью 7-10 мм равна 2310 см³.

Экстрагируют трутовика лиственничного плодовое тело спиртом этиловым 70% при комнатной температуре, т.к. спирт этиловый хорошо извлекает органические кислоты и смолистые вещества, кроме того, предупреждается потеря данного летучего экстрагента. Данная концентрация спирта этилового обеспечивает большее извлечение вышеуказанных веществ по сравнению со спиртом этиловым 40% (фиг. 1).

Оптимальное соотношение фаз сырье:экстрагент для плодового тела трутовика лиственничного с измельченностью 7-10 мм составляет 1:10, т.к. оно обеспечивает необходимую величину «зеркала» экстрагента (свободный слой экстрагента) над поверхностью сырья выбранной измельченности.

Процесс экстракции проводят методом многоступенчатого противоточного экстрагирования с законченным циклом в батарее из 5 диффузоров. Данный способ выбран на основании расчета теоретической эффективности экстрагирования (Пономарев В.Д. Экстрагирование лекарственного сырья. М.: Медицина, 1976, 202 с.) четырех наиболее часто используемых в фармацевтической промышленности способов экстрагирования: 2- и 3-ступенчатой ремацерации, многоступенчатого противоточного экстрагирования (МПЭ) с законченным циклом в батарее из 5 или 6 диффузоров. Полученные данные свидетельствуют о том, что наибольший выход БАВ может быть достигнут при 3-ступенчатой ремацерации, но при этом необходимо использовать значительный объем экстрагента на 100 г сырья, что в дальнейшем может привести к повышению энергетических и экономических затрат производства, так как на заключительном этапе получения сухого экстракта необходимо будет удалить значительные объемы экстрагента. Теоретический выход БАВ при использовании многоступенчатого противоточного экстрагирования с законченным циклом в батарее из 5 диффузоров несколько ниже, но он предполагает уменьшение количества используемого экстрагента на 100 г сырья почти в 2 раза (по сравнению с ремацерацией) и получение более концентрированных извлечений.

В каждый диффузор загружают в равных количествах плодовые тела трутовика лиственничного, измельченные до 7-10 мм, в 5-6 приемов для более плотной укладки.

В первый диффузор при открытом спускном кране заливают спирт этиловый 70% до появления его первых порций, затем кран закрывают и добавляют экстрагент «до зеркала» (соотношение сырье:экстрагент в данном и последующих диффузорах составляет 1:10).

Диффузор оставляют для настаивания в течение 4 часов, по истечении этого времени производят слив извлечения, которое направляют во второй диффузор. Недостающее «до зеркала» количество экстрагента во втором диффузоре получают путем пропускания необходимого количества спирта этилового 60% через первый диффузор.

В первый диффузор заливают свежую порцию спирта этилового 70% «до зеркала», оба диффузора оставляют для настаивания в течение 4 часов. В дальнейшем экстрагирование проводят аналогично, по принципу противотока, при котором извлечение, полученное из второго диффузора, заливают в третий, из третьего - в четвертый и т.д. Все пять порций свежего экстрагента подают в первый диффузор. После ввода в работу всех диффузоров батареи отбор всех пяти порций готового извлечения производят из головного пятого диффузора, выводя поочередно хвостовые диффузоры.

Экспозиция настаивания на каждой ступени экстрагирования составляла 4 часа (время наступления равновесного состояния в системе сырье:экстрагент) или 16 часов (с учетом односменной работы предприятия), продолжительность экстрагирования в каждом диффузоре - 48 часов, а общая продолжительность процесса - 3 суток.

Для повышения выхода БАВ (свыше 65%) применяют дополнительное экстрагирование сырья в 4 и 5 диффузорах чистым экстрагентом, вводя его в 4 диффузор и выдерживая в течение 4 часов, после чего сливают и пропускают через 5 диффузор, выдерживая 16 часов, с последующим частичным отжимом отработанного сырья для удаления удержанного извлечения, которое осуществляется путем создания дополнительной нагрузки на верхний перфорированный диск перколятора.

Полученные извлечения тщательно перемешивают и производят очистку путем фильтрования.

Очищенное извлечение сгущают под вакуумом при температуре 40-50°C, а затем высушивают в вакуум-сушильном шкафу при температуре 40-50°C до получения сухого экстракта, данные щадящие режимы предупреждают разложение БАВ. Высушенную массу измельчают.

Проведено исследование по выявлению гепатопротекторного действия экстракта трутовика лиственничного плодового тела в дозе 40 мг/кг на модели хронического токсического гепатита, вызванного введением тетрахлорметана, на 60 белых крысах линии Wistar.

В экспериментах в качестве препарата сравнения был использован «Легалон» - официнальный растительный гепатопротектор, содержащий в качестве действующих веществ сумму флаволигнанов расторопши пятнистой, гепатопротекторное действие которого объясняют антиоксидантной активностью (торможением перекисного окисления липидов), стимуляцией синтеза белка, нормализацией обмена фосфолипидов (Машковский М.Д. Лекарственные средства. 15-е изд., перераб., испр. и доп. М.: ООО «Изд-во Новая Волна», 2005. 1200 с.: ил.).

Для изучения влияния экстракта трутовика лиственничного плодового тела на течение хронического гепатита белые крысы линии Wistar обоего пола (массой 180-220 г) были разделены на 4 группы по 15 животных. Животные содержались в стандартных условиях вивария на обычном рационе и свободном доступе к воде и пище. Экспериментальный хронический гепатит вызывали путем внутрижелудочного введения крысам 1 мл 25% маслянного раствора тетрахлорметана в течение 6 суток (группы животных №№2-4), интактные животные (группа №1) получали персиковое масло 1 мл. Гепатопротекторное действие препаратов изучалось при пероральном введении раз в сутки в течение 21 дня в лечебном режиме, т.е. после формирования модельной патологии. Первая и вторая группы (интактные и контрольные животные соответственно) получали через желудочный зонд по 0,5 мл крахмального клестера 2%; третья группа - эквиобъемные количества крахмального клестера, содержащего экстракт трутовика лиственничного сухой (40 мг/кг); четвертая - препарат сравнения Легалон (200 мг/кг).

На 28-й день исследования проводили забор крови для определения показателей, характеризующих функции печени, - глюкозы, общего билирубина, мочевины, триглицеридов, альбумина, общего холестерина, ферментов: аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT), гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ) и щелочной фосфатазы (ЩФ). Полученные в результате эксперемента данные подвергали статистической обработке. Данные представлены в виде M±m, где M - среднее значение, m - стандартная ошибка среднего значения. Соответствие выборок закону нормального распределения оценивали по критерию Шапиро-Уилка. Для проверки статистических гипотез о различии между исследуемыми группами в случае ненормального распределения использовали непараметрический критерий Манна-Уитни, в случае нормального распределения - параметрический критерий Стьюдента. Изменение биохимических показателей крови животных контрольной группы оценивали по сравнению с аналогичными показателями интактных животных; групп, получавших экспериментальный препарат и препарат сравнения, - контрольных животных.

Интоксикация тетрахлорметаном сопровождалась гиперферментацией, свидетельствующей о разрушении гепатоцитов и развитии холестаза (фиг. 2). В группе, принимавшей экстракт трутовика лиственничного плодового тела сухой в дозировке 40 мг/кг, наблюдалось статистически значимое снижение АЛТ, ГГТ и ЩФ, сопоставимое с препаратом сравнения. Активность ACT в сыворотке крови животных, принимавших экстракт трутовика лиственничного по сравнению с данным показателем контрольных животных снижался, однако статистически значимых различий выявлено не было.

Введение четыреххлористого углерода характеризовалось нарушением всех видов обмена и сопровождалось увеличением в сыворотке крови контрольных животных содержания холестерина, триглицеридов, мочевины и билирубина, а также снижением концентрации глюкозы и альбумина (фиг. 3). Ведение крысам экстракта трутовика лиственничного плодового тела в дозировке 40 мг/кг привело к снижению уровней холестерина, триглицеридов, билирубина, мочевины и глюкозы в плазме крови по сравнению с контрольной группой. Во всех случаях действие экспериментального препарата было сопоставимо или превышало эффект Легалона.

Введение экстракта трутовика лиственничного плодового тела сухого нормализовало уровень альбуминов, однако восстановление данного показателя не наблюдалось и в группе животных, получавших препарат сравнения.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов выявлено, что введение экспериментальным животным экстракта трутовика лиственничного плодового тела сухого в дозировке 40 мг/кг сопровождается снижением гиперферментации и восстановлением основных показателей липидного и углеводного обмена, а также мочевины.

Пример выполнения способа

250 г трутовика лиственничного плодового тела, заготовленного в течение года и высушенного воздушно-теневым способом, измельчают до размера частиц 7-10 мм, загружают поровну по 50 г в пять диффузоров в 5-6 приемов для более плотной укладки. Спирт этиловый 70% в количестве 2500 мл порциями по 500 мл заливают в 5 приемов в 1 диффузор. Экстрагирование проводят при 15-25°C по принципу противотока, при котором извлечение, полученное из 2 диффузора, направляется в 3, а из 3 - в 4 и т.д. Экспозиция настаивания составляет 4 или 16 часов. Готовое извлечение получают из 5 диффузоров в пять приемов. Затем проводят дополнительное экстрагирование сырья в 4 и 5 диффузорах чистым экстрагентом (150 мл), вводя его в 4 диффузор и выдерживая в течение 4 часов, после чего пропускают через 5 диффузор, выдерживая 4 часа, с последующим частичным отжимом обработанного сырья путем создания дополнительной нагрузки на верхний перфорированный диск диффузора для удаления удержанного извлечения. Общий объем извлечения составляет 2000 мл.

Полученное извлечение фильтруют, сгущают под вакуумом при температуре 40-50°C, высушивают в вакуум-сушильном шкафу при температуре 40-50°C до получения сухого экстракта и измельчают.

Заявляемый способ получения средства, обладающего гепатопротекторным действием, имеет следующие преимущества перед известным: отсутствие в конечном продукте неиндифферентного для организма экстрагента (спирта этилового) и создание более стабильной формы экстракционного препарата (сухой экстракт) для дальнейшего использования в производстве других технологически более совершенных лекарственных форм. Выявленная на модели острого токсического гепатита активность позволяет создать лекарственный препарат гепатозащитного действия для использования в терапии и, в частности, в гастроэнтерологии.

Изобретение относится к способу получения средства, обладающего гепатопротекторным действием. Указанный способ заключается в экстракции плодового тела трутовика лиственничного 70% спиртом этиловым, при соотношении сырье:экстрагент 1:10, методом многоступенчатого противоточного экстрагирования с законченным циклом в батарее из 5 диффузоров, при этом время экстрагирования на каждой ступени экстракции составляет 4 часа, затем дополнительно экстрагируют отработанное сырье в 4 и 5 диффузорах используемым экстрагентом, при времени экстрагирования в 4 диффузоре в течение 4 часов, а в 5 диффузоре - 16 часов отработанное сырье отжимают, объединенные извлечения фильтруют, сгущают под вакуумом, высушивают до получения сухого экстракта и измельчают. Изобретение обеспечивает расширение ассортимента растительных гепатопротекторов и позволяет получить стабильную форму экстракционного препарата, удобную для последующего изготовления на ее основе дозированных пероральных твердых лекарственных форм. 3 ил., 1 пр.

Способ получения средства, обладающего гепатопротекторным действием, путем экстракции плодового тела трутовика лиственничного спиртом этиловым 70%, отличающийся тем, что измельченное до 7-10 мм сырье экстрагируют при комнатной температуре в соотношении сырье:экстрагент - 1:10 методом многоступенчатого противоточного экстрагирования с законченным циклом в батарее из 5 диффузоров при времени экстрагирования на каждой ступени экстракции 4 часа, дополнительно экстрагируют отработанное сырье в 4 и 5 диффузорах используемым экстрагентом, при времени экстрагирования в 4 диффузоре в течение 4 часов, после чего сливают и пропускают через 5 диффузор, выдерживая 16 часов, далее отжимают отработанное сырье, затем объединенное извлечение фильтруют, сгущают под вакуумом при 40-50°C, высушивают в вакуум-сушильном шкафу при 40-50°C до получения сухого экстракта и измельчают.