СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ И ГИПОТЕНЗИВНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2004 года по МПК A61K35/78 A61P29/00 A61P9/02 

Изобретение относится к области фармации и касается способа получения средства из растительного сырья, обладающего противовоспалительной и гипотензивной активностью.

Современный арсенал противовоспалительных и гипотензивных лекарственных средств насчитывает значительное количество, как индивидуальных соединений, так и суммарных, комплексных препаратов. Однако проблема изыскания гипотензивных и противовоспалительных средств на основе природных биологически активных веществ (БАВ) является весьма актуальной. Это связанно с тем, что не все противовоспалительные препараты эффективны при различных формах воспаления, практически отсутствуют гипотензивные средства с противовоспалительным эффектом, не все лекарственные средства отвечают высоким требованиям эффективности и безопасности.

Среди растений, широко используемых в народной медицине и гомеопатии, известна очанка коротковолосистая - Euphrasia brevipila Burn. et Gremli. Трава этого растения издавна применяется в качестве эффективного противовоспалительного, вяжущего, гипотензивного, антисклеротического средства [Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения, их химический состав использование, семейства Caprifoliaceae -Plantaginaceae - М.: Наука, 1990, с. 139] . Особенно часто ее используют для лечения катаракты, глаукомы и воспалительных заболеваний глаз (конъюнктивиты, блефариты).

Известен способ получения водного настоя очанки лекарственной [Носаль М. А. , Носаль И.М. "Лекарственные растения и способы их применения в народе" - М. : Профиздат, 1993], который используется при воспалительных заболеваниях глаз, а у 10% водного настоя этого растения обнаружена гипотензивная активность в дозе 1 мл/кг [Юсупова Н.Я. Влияние очанки на кровообращение и экспериментальную гипертонию/ Автореф. дис. канд. мед. наук. Ташкент, 1956, 20 с. ].

Этот способ целесообразно принять за прототип вследствие наличия общих операций, сходного вида биологической активности, ботанического родства сырьевых источников.

Прототип имеет следующие недостатки:
- низкое содержание флавоноидов и полифенольных веществ - основных действующих веществ (табл. 1);
- невысокая гипотензивная активность водных настоев и отсутствие данных по противовоспалительной активности;
- отсутствие параметров стандартизации и возможности контроля качества продуктов;
- ограниченный срок хранения водных извлечений.

Целью настоящего изобретения является повышение выхода действующих веществ, и установление противовоспалительного действия и гипотензивной активности у нового природного источника биологически активных веществ.

Для достижения указанной цели растительный материал очанки коротковолосистой измельчают до размера частиц не более 2 мм, экстрагируют 40% этиловым спиртом в отношении сырье:экстрагент (1:5,9), методом реперколяции с равной загрузкой сырья и законченным циклом в батарее из 4 перколяторов, время настаивания в каждом перколяторе по 8 часов. Полученное извлечение отстаивают при температуре не выше +10^oС, в течение 2 суток отфильтровывают, сгущают, высушивают под вакуумом и получают сухой экстракт. Выход готового продукта составляет 14,8% от массы растительного сырья.

Параметры стандартизации конечного продукта:
Содержание суммы полифенольных (дубильных) веществ и влаги определяют по методике ГФ XI [Государственная фармакопея СССР, вып. 1, М., 1987, - 336 с.] .

Анализ на содержание флавоноидов
1. Качественное обнаружение:
0,1 г сухого экстракта растворяют в 10 мл 40% этилового спирта.

К 4 мл полученного раствора прибавляют 2 мл 2% раствора алюминия хлорида, появляется желтое окрашивание.

К 4 мл полученного раствора прибавляют 10 мг кристаллического магния и 5 капель концентрированной хлористоводородной кислоты, нагревают на кипящей водяной бане 3 мин, появляется оранжево-красное окрашивание.

0,01 мл спиртового раствора экстракта наносят на полоску хроматографической бумаги марки "Ленинградская средняя - С" размером 10х40 см и хроматографируют восходящим методом в системе растворителей бутанол - уксусная кислота - вода (4: 1: 2) в течение 17 часов. Хроматограмму высушивают и просматривают в УФ-свете до, и после обработки парами аммиака. При этом на хроматограмме должно проявиться пятно бледно-фиолетового цвета R_f=0,43±0,01 (цинарозид) и пятно фиолетового цвета R_f=0,08±0,01 (лютеолин). При обработке парами аммиака окраска пятен изменяется и приобретает желто-коричневый цвет.

2. Количественное определение флавоноидов:
Около 0,05 г (точная навеска) сухого экстракта помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят до метки 40% этиловым спиртом (раствор А). 5 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют 2 мл 2% спиртового раствора хлорида алюминия и 2 мл 8% спиртового раствора ацетата натрия, доводят объем раствора до метки 40% этанолом, перемешивают, через 30 мин измеряют оптическую плотность на спектрофотометре СФ-16 при длине волны 382 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 5 мл раствора А, доведенного 40% этиловым спиртом до метки в мерной колбе объемом 50 мл.

Содержание флавоноидов в % (X) в пересчете на цинарозид вычисляют по формуле:

D - оптическая плотность исследуемого раствора; m - масса сухого экстракта в граммах; 1 - толщина слоя в см; W - влажность сухого экстракта в процентах; 357 - удельный показатель поглощения комплекса цинарозида с реактивами при длине волны 382 нм.

Найдено 19,82±0,07%.

Анализ на содержание иридоидов
0,1 г сухого экстракта растворяют в 10 мл 40% этилового спирта.

К 5 мл полученного раствора прибавляют 5 капель реактива Шталя (1г п-диэтиламинобензальдегида, 5 г фосфорной кислоты и 50 г уксусной кислоты, разбавляют водой до 100 мл), доводят до кипения на водяной бане, появляется голубое окрашивание.

К 5 мл полученного раствора прибавляют 5 капель реактива Тримм - Хилла (смесь, состоящая из 5 мл концентрированной хлористоводородной кислоты, 10 мл 0,2% раствора сульфата меди и 100 мл ледяной уксусной кислоты), нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 мин, появляется синее окрашивание.

Предлагаемый способ получения достаточно прост, не требует сложной системы очистки, позволяет получить продукт постоянного состава. Способ получения может быть внедрен на предприятиях по выпуску лекарственных препаратов.

Для доказательства существенности предложенных признаков изучено влияние способа экстракции, состава и природы экстрагента, степени измельченности сырья, продолжительности экстракции на выход биологически активных веществ из исследуемого лекарственного растения.

Количественная оценка велась по выходу экстрактивных веществ, содержанию суммы полифенольных веществ (в пересчете на танин) и суммы флавоноидов (в пересчете на цинарозид - стандарт).

Подбор оптимальных условий получения извлечений проводился на образце очанки коротковолосистой, собранной в Пермской области (д. Суровцы) 21 июля 2000 г.

Выбор оптимального экстрагента является одним из основных условий при получении экстракционных препаратов. Экстрагент, действуя на активный компонент смеси, влияет на полноту, скорость и качество экстракции биологически активных веществ из растительного материала. В качестве экстрагента были использованы вода и этиловый спирт в концентрациях, наиболее часто применяемых для промышленного получения экстракционных препаратов - 40, 70 и 90%. С использованием этих экстрагентов были получены методом дробной мацерации спиртовые извлечения 1: 5,9, из сырья со степенью измельченности до 7 мм. Результаты определения сухого остатка, флавоноидов, полифенольных веществ в спиртовых извлечениях, а также экстрактивных веществ, определенных по методике ГФ XI, приведены в табл. 2.

Как видно из табл. 2 40% этиловый спирт является оптимальным экстрагентом, так как позволяет получить наибольшее количество суммы флавоноидов с учетом содержания экстрактивных и полифенольных веществ.

Для изучения влияния степени измельченности растительного материала на выход суммы флавоноидов и полифенольных веществ, содержание которых оценивали по величине сухого остатка, сырье подвергалось измельчению до 2,0, 7,0, 10,0 мм. Измельченное сырье настаивали с 40% этиловым спиртом в экстракторах в течение 24 часов. При этом экспериментально установили отношение фаз (сырье - экстрагент), обеспечивающее величину "зеркала" над слоем сырья. Результаты приведены в табл. 3.

Как следует из табл. 3 оптимальной степенью измельчения по выходу экстрактивных веществ, флавоноидов и полифенольных веществ является размер частиц >0,25≤2,0 мм.

Существенное влияние на содержание биологически активных веществ и фармакологическую активность конечного продукта оказывает метод экстрагирования сырья. Для выбора оптимального метода экстрагирования, нами изучен выход флавоноидов, полифенольных и экстрактивных веществ из травы очанки в спиртовые извлечения (экстрагент 40% этанол), полученные различными методами: 1 - реперколяции с законченным циклом и равной загрузкой сырья; 2 - ремацерации с делением экстрагента на части; 3 - фильтрационной экстракции; 4 - вихревой экстракции [Пономарев В.Д. Экстрагирование лекарственного сырья. - М.: Медицина, 1987, 204 с.]. Результаты приведены в табл. 4.

Проведенные исследования показали (табл. 4), что максимальное количество действующих веществ извлекается при использовании метода реперколяции.

С целью определения продолжительности экстракции, изучена зависимость времени наступления равновесного состояния, то есть времени прекращения прироста концентрации веществ, в системе сырье - экстрагент при первом контакте фаз. Для изучения данной характеристики серию навесок измельченного сырья с известным содержанием флавоноидов и полифенольных веществ заливали 40% этиловым спиртом до "зеркала". Через определенные промежутки времени (2, 4, 6, 8, 10, 12 часов) извлечение фильтровали, определяли содержание БАВ. Результаты приведены на чертеже.

Как следует из приведенных данных, равновесное состояние по флавоноидам и полифенольным веществам устанавливается через 8 часов.

Способ получения иллюстрируется следующим примером:
0,4 кг травы очанки коротковолосистой измельчают до размера частиц >0,25≤2,0 мм. Измельченное сырье загружают поровну в 4 перколятора. Сырье в первом перколяторе заливают 40% этанолом до "зеркала", настаивают 8 часов. Полученное извлечение сливают и используют для экстрагирования сырья во втором перколяторе и далее каждую последующую порцию сырья экстрагируют извлечением, полученным из предыдущего перколятора. Время настаивания в каждом перколяторе составляет 8 часов, общий расход экстрагента - 2,36 л, что соответствует отношению сырье - экстрагент 1:5,9. Извлечения, полученные из последнего перколятора, объединяют, отстаивают при температуре +10^oС в течение 2 суток, фильтруют, упаривают и высушивают в вакууме, получают 0,059 кг готового продукта, что составляет 14.75% сухого экстракта от массы исходного сырья.

Сухой экстракт представляет собой сыпучую гигроскопичную массу темно-коричневого цвета, с характерным специфическим запахом. Содержание флавоноидов 19,84±0,07%, суммы полифенольных веществ 42,64±0,56%, влажность 3,1±0,01%.

Оценку противовоспалительной активности экстракционных препаратов очанки коротковолосистой проводили на беспородных крысах обоего пола, массой 180 - 200 г по общепринятой методике [Методические рекомендации по экспериментальному (доклиническому) изучению нестероидных противовоспалительных фармакологических веществ. Одобрено фармакологическим комитетом МЗ СССР, 1982].

Асептическое воспаление конечности вызывали субплантарным введением в правую заднюю лапу крысы 0,1 мл 1% раствора карагенина. Водный раствор сухого экстракта вводили, перорально в дозах 10, 50, 150, 300 мг/кг в объеме 1 мл/100 г за один час до моделирования воспаления. Другой группе крыс, для сравнения, в аналогичных условиях вводили настой очанки коротковолосистой в дозе 150 мг/кг.

В качестве препарата сравнения использовали индометацин в дозе 10 мг/кг. Животным контрольной группы в равном объеме вводили дистиллированную воду. Через 1, 3 и 5 часов после введения карагенина определяли величину отека онкометрическим методом, по разности между объемами воспаленной и невоспаленной лапок животных. Статистическую обработку данных фармакологического эксперимента проводили по критерию Стьюдента. Эффект считали достоверным при р≤0,05 [Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта, 2-е изд., Л.: Медицинская литература, 1963]. Полученные данные приведены в табл. 5.

Как следует из приведенных данных сухой экстракт очанки, во всех исследуемых дозах проявил противовоспалительное действие. При этом выраженность эффекта зависела от используемой дозы, если при введении экстракта очанки коротковолосистой в дозе 10 мг/кг торможение отека составило 44%, то увеличение дозы испытуемого экстракта сопровождалось повышением его активности. Так, введение экстракта в дозах 50, 150, и 300 мг/кг угнетало развитие отека соответственно на 51, 64, и 66% по сравнению с данными контрольной группы. При этом водный настой очанки коротковолосистой в дозе 150 мг/кг не проявил противовоспалительного действия, а препарат сравнения (индометацин) оказывал аналогичное антиэкссудативное действие.

Испытание на гипотензивную активность проводили in vivo на кошках [Березина М. П. , Василевская Н.Е., Авербах М.С. и др. Большой практикум по физиологии человека и животных./Под общей редакцией Васильева Л.Л. и Ветюкова И.А. - М.: Высшая школа, 1961, с. 675], в качестве контроля использовали раствор папаверина гидрохлорида в дозе 3 мг/кг (0,1 ЛД₅₀). Он вызывает достоверное снижение артериального давления на 34,4% продолжительностью 2 мин. Результаты исследований приведены в табл. 6.

Как следует из табл. 6, сухой экстракт очанки коротковолосистой вызывает достоверное снижение артериального давления на 20,4% в течение 2 мин.

Сравнительная характеристика заявленного способа с выбранным прототипом представлена в табл.7.

Предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет получить препарат постоянного состава с более высокой противовоспалительной активностью в сочетании с гипотензивным эффектом за счет увеличения содержания действующих веществ; позволяет контролировать технологические стадии получения и стандартизовать целевой продукт; позволяет получить препарат, удобный для хранения и транспортировки.

Вышеуказанные преимущества в сочетании с простой схемой получения способствуют рациональному способу использования лекарственного растительного сырья, расширению ассортимента природных лекарственных средств с противовоспалительной и гипотензивной активностью и открывают перспективу внедрения данного способа в фармацевтическую промышленность.

Изобретение относится к медицине. В качестве растительного сырья используют траву очанки коротковолосистой. Ее измельчают до размера частиц > 0,25 (2,0 мм и экстрагируют методом реперколяции 40% этиловым спиртом в соотношении сырье - экстрагент 1: 5,9 в батарее из 4 перколяторов. Время настаивания в каждом перколяторе по 8 ч. Объединенные извлечения отстаивают, фильтруют, упаривают и высушивают в вакуум-сушильном аппарате. Изобретение позволяет реализовать указанное назначение. 7 табл., 1 ил.

Способ получения средства, обладающего противовоспалительной и гипотензивной активностью, включающий экстракцию растительного сырья - травы очанки коротковолосистой, измельченного от >0,25 мм до< 2,0 мм методом реперколяции 40%-ным этиловым спиртом при отношении сырье: экстрагент 1 : 5,9, в батарее из 4 перколяторов при времени настаивания в каждом перколяторе 8 ч, отстаивание объединенных извлечений, фильтрацию, упаривание и высушивание в вакуум-сушильном аппарате.