ФАКТОР II И ФИБРИНОГЕН ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЕМОСТАТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ Российский патент 2017 года по МПК A61K38/36 A61K38/48 A61P7/04 

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способам лечения гемостатических нарушений.

Описание области техники, к которой относится данное изобретение

Гемостаз относятся к процессу остановки потери крови из поврежденных кровеносных сосудов. Свертывание, или образование тромбов, является важной частью гемостаза. Чтобы остановить кровотечение из раны, поврежденная стенка кровеносного сосуда покрывается тромбом, содержащим тромбоциты и фибрин. Нарушения свертывания могут привести к увеличению риска кровотечения (кровоизлияния) или свертывания (тромбоз).

Массивное кровотечение или переливание крови у больных обычно связаны с нарушением свертывания. Это нарушение свертывания может вызываться дилюционной коагулопатией, определяемой как повышение склонности к кровотечению в связи с разжижением крови. Компенсация жидкости является обычным лечением обширной потери крови для нормализации кровяного давления и предотвращения циркуляторного шока. Однако компенсация жидкости разжижает факторы свертывания в оставшейся крови и нарушает их функцию, что может привести к усилению кровотечения, которое может являться опасным для жизни.

In vivo биохимические пути, ведущие к свертыванию, являются сложными и требуют большого количества факторов и кофакторов. Существует десять факторов, которые обозначаются римскими цифрами I-XIII, при этом III, IV и VI не являются используемыми обозначениями. Многочисленные взаимосвязанные факторы и кофакторы модулируют активность биохимических путей. Например, в пути тканевого фактора после повреждения кровеносного сосуда фактор VII (сокращенно FVII, как принято для факторов, обозначенных римскими цифрами) вступает в контакт с тканевым фактором (TF), экспрессированным на клетках, несущих тканевой фактор (стромальные фибробласты и лейкоциты). При этом образуется активированный комплекс (TF-FVIIa). TF-FVIIa активирует FIX и FX. FVII сам активируется тромбином, FXIa, плазмином, FXII и FXa. Преобразование FX в активированный FXa с помощью TF-FVIIa почти сразу же тормозится ингибитором пути тканевого фактора (TFPI). FXa и его кофактор FVa формируют протромбиназный комплекс, который активирует преобразование протромбина в тромбин. Тромбин затем активирует другие компоненты системы свертывания, в том числе FV и FVIII (который активирует FXI, который, в свою очередь, активирует FIX), а также активирует и высвобождает FVIII из связи с фактором фон Виллебранда (vWf). FVIIIa является кофактором FIXa, и вместе они образуют «теназный» комплекс, который активирует FX для непосредственного возвращения в цикл. Активация пути вызывает резкое увеличение активированного тромбина. Тромбин, активированный в этом цикле, может преобразовывать фибриноген в фибрин, который является белком, образующим тромб вместе с тромбоцитами.

Протромбин (FII) производится в печени и посттрансляционно модифицируется в витамин К-зависимой реакции, которая преобразует десять глутаминовых кислот в протромбине в гамма-карбоксиглутаминовую кислоту. Дефицит витамина K или введение антикоагулянта варфарина ингибирует превращение остатков глутаминовой кислоты фактора II в Gla, замедляя активацию системы свертывания. Тромбин (FIIa) производится путем ферментативного расщепления двух участков в FII активированным фактором X (FXa). Активность FXa значительно усиливается путем связывания с активированным фактором V (FVa). У взрослых людей нормальный уровень активности протромбина в крови при измерении составляет около 1,1 ед/мл. Уровни протромбина в плазме крови новорожденного неуклонно возрастают после рождения до достижения нормального уровня взрослого, с уровня около 0,5 ед/мл через день после рождения, до уровня около 0,9 ед/мл через 6 месяцев жизни.

Тромбин, который образуется из протромбина, имеет множество эффектов в каскаде коагуляции. Он представляет собой сериновую протеазу, которая преобразует растворимый фибриноген в нерастворимые нити фибрина, а также катализирует многие другие реакции, связанные с коагуляцией. Al Dieri и соавт. исследовали связь между концентрациями фактора свертывания, параметрами генерации тромбина и объемом кровопотери у больных с различными врожденными недостатками фактора коагуляции. Авторы показали, что склонность к кровотечениям была напрямую связана с объемом генерации тромбина, который изменялся линейно к FII концентрациям. Al Dieri et al. Thromb Haemost 2002, 88:576-82. Фенгер-Эриксон (Fenger-Erikson) и соавт. также показали, что в случае дилюционной коагулопатии помимо фибриногена, факторы коагуляции, включая FII, FX и FXIII, также снижаются ниже ожидаемого уровня после 32% разбавления раствором гидроксиэтилкрахмала. Fenger-Eriksen et al. J Thromb Haemost 2009, 7:1099-105.

Фибриноген (фактор I или FI) представляет собой растворимый гликопротеин плазмы, который синтезируется печенью и превращается под действием тромбина в фибрин во время свертывания крови. Процессы в системе свертывания преобразуют протромбин в активированную сериновую протеазу - тромбин, который превращает фибриноген в фибрин. Фибрин затем перекрестно связывается фактором XIII с образованием тромба. Нормальная концентрация фибриногена в плазме крови 1,5-4,0 г/л или около 7 мкМ. В случае значительной потери крови фибриноген более чем любые другие прокоагулирующие факторы или тромбоциты достигает критически низких концентраций в плазме. Hiippala et al. Anesth Analg 1995, 81 :360-5; Singbartl et al. Anesth Analg 2003, 96:929-35; McLoughlin et al. Anesth Analg 1996, 83:459-65. Небольшие количества коллоидов (менее 1000 мл) могут нарушать полимеризацию фибрина и, соответственно прочность тромба. Innerhofer P et al. Anesth Analg 2002, 95:858-65; Mittermayr et al. Anesth Analg 2007; 105:905-17; Fries et al. Anesth Analg 2002, 94:1280-7. Некоторые рекомендации приводят пороговую концентрацию фибриногена 1 г/л, на основе результатов исследования, в котором у четырех из четырех пациентов с концентрацией фибриногена менее 0,5 г/л наблюдали диффузное микрососудистое кровотечение. Spahn et al. Crit Care 2007, 11: R17; Stainsby et al. Br J Haematol 2006; 135:634-41; Ciavarella et al. Br J Haematol 1987;67:365-8. Напротив, последние клинические данные околородовых кровотечений, нейрохирургии и сердечной хирургии показывают, что при концентрации фибриногена менее 1,5-2 г/л уже существует повышенная склонность к пери- и послеоперационному кровотечению. Charbit et al. J Thromb Haemost 2007, 5:266-73; Gerlach et al. Stroke 2002, 33: 1618-23; Blome et al. J Thromb Haemost 2005, 93:1101-7; Ucar et al. Heart Surg Forum 2007, 10:E392-6.

Проблемы свертывания, связанные с нарушениями свертываемости, такие как дилюционная коагулопатия, могут быть решены с помощью гемостатической терапии. Целью гемостатической терапии является сведение к минимуму потери крови, необходимости переливания и смертности. У пациентов с травмой с одинаковыми показателями тяжести повреждения (ISS), смертность практически удваивается просто в результате коагулопатии. Brohi et al. J Trauma 2003, 54: 1127-30. Массивное кровотечение или массивное переливание у пациентов с множественными травмами связано с нарушениями свертывания крови. Таким образом, для достижения адекватного гемостаза требуется достаточное количество тромбина и достаточно способного к свертыванию субстрата. Ключевыми элементами в свертывании являются генерация тромбина на поверхности тромбоцитов и расщепление фибриногена под действием тромбина с образованием фибрина. Brohi et al. J Trauma 2003, 54:1127-30. Если образуется достаточно тромбина, он преобразует фибриноген в стабильный фибрин, который определяет плотность развивающегося тромба в присутствии фактора XIII (FXIII). Korte, et al., Hamostaseologie 2006, 26:S30-5.

Быстрая замена жидкости имеет решающее значение в случае массивной кровопотери у пациентов с грубой и множественной травмой, для поддержания нормоволемии. Sperry JL, et al. J Trauma 2008; 64:9-14. Однако гемодинамическая стабилизация путем введения больших количеств кристаллоидных или коллоидных растворов вызывает дилюционную коагулопатию. Клинические эффекты нарушения свертывания плазмы, вызванного нормоволемической гемодилюцией, ранее исследовались в нескольких публикациях. Innerhofer P, et al. Anesth Analg 2002;95:858-65, Singbartl et al. Anesth Analg 2003;96:929-35, Mittermayr et al. Anesth Analg 2007; 105:905-17.

Дилюционную коагулопатию обычно лечат с помощью свежезамороженной плазмы (FFP) и, если возможно, с помощью криопреципитата. Stainsby et al. Br J Anaesth 2000, 85:487-91; Spahn et al. Crit Care 2007, 11:17. Однако критически уменьшенные концентрации фактора свертывания едва ли возможно исправить путем введения FFP в связи с низкой концентрацией факторов свертывания крови в ней и ее эффектами расширения объема, которые уравновешивают намеренное увеличение концентрации любого интересующего белка. Mittermayer 2007, supra; Scalea et al. Ann Surg, 2008, 248:578-84; Chowdhury et al. Br J Haematol 2004, 125:69-73; Stanworth et al. Br J Haematol 2004, 126: 139-52; Abdel-Wahabet al. Transfusion 2006, 46:1279-85. Кроме того, введение FFP связано с несколькими осложнениями, такими как начало повреждения легкого, полиорганная недостаточность и инфекции. Watson GA, et al. J Trauma 2009, 67:221-7; Sarani et al. Crit Care Med 2008, 36: 1114-8; Dara et al. Crit Care Med. 2005, 33:2667-71 . Более того, необходимый процесс размораживания задерживает немедленное лечение, которое имеет особое значение в случае острых и тяжелых кровотечений.

Действие введения концентрата фибриногена на дилюционную коагулопатию ранее изучалось in vitro в нескольких животных моделях, а также в клинической практике. Fries et al. Br J Anaesth 2005, 95:172-7; Fries et al. Anesth Analg 2006, 102:347-51; Velik-Salchner et al. J Thromb Haemost 2007, 5:1019-25; Stinger et al. J Trauma 2008, 64:S79-85. Введение только концентрата фибриногена нормализует прочность тромба, но не инициацию свертывания, так как это является тромбин-зависимой реакцией. Fries et al. Br J Anaesth 2005, 95: 172-7; Fries et al. Anesth Analg 2006, 102:347-51; Fenger-Eriksen et al. J Thromb Haemost 2009, 7:795-802. Таким образом, ранее изучены комбинации фибриногена и комплексов факторов свертывания, таких как концентрат протромбинового комплекса (PCC).

В частности, Fries и соавт. исследовали эффект замещения фибриногена на реверсирование дилюционной коагулопатии в in vitro модели. British Journal of Anaesthesia, 2006, 97(4):460-467. Кровь от 5 здоровых мужчин-добровольцев разбавляли на 60%, с применением лактированного раствор Рингера, 4% раствора модифицированного желатина или 6% гидроксиэтилкрахмала (HES) 130/0,4, а также комбинации лактированного раствора Рингера с любым из 2 коллоидных растворов. Fries et al., Anesth Analg; 2006, 102:347-51. После этого, аликвотные пробы разбавленной крови инкубировали с 3-мя различными концентрациями фибриногена (0,75, 1,5 и 3,0 г/л). Измерения выполняли с помощью модифицированной тромбоэластографии (ROTEM®; Pentapharm, Мюнхен, Германия). После 60% разбавления время свертывания увеличилось, в то время как плотность тромба и полимеризация фибрина значительно уменьшились. После введения фибриногена время свертывания уменьшилось. Твердость тромба, а также полимеризация фибрина увеличились во всех разбавленных образцах крови при добавлении фибриногена. Эффект замещения фибриногена in vitro на переменные ROTEM® зависел от дозы фибриногена и типа раствора, применяемого для разбавления крови.

В другом исследовании, Fries и соавт. исследовали влияние фибриногена и концентрата протромбинового комплекса (PCC) в условиях гемодилюции и неконтролируемых кровотечений в свиной модели. Fries et al, British Journal of Anaesthesia, 2006, 97(4):460-467. После серьезной потери крови на 65% от расчетного общего объема крови, замещение объема жидкости с помощью HES (2500 мл) привело к дилюционной коагулопатии, по измерениям обычных коагуляционных проб и анализа ROTEM®. У животных, получавших только концентрат восстановленных эритроцитов, и в группе плацебо наблюдалось небольшое статистически значимое улучшение ROTEM® параметров. Однако в группе лечения дополнительное замещение фибриногена и PCC привело к нормализации параметров свертывания. Потеря крови и смертность после стандартизированного повреждения печени значительно уменьшались у животных, которых лечили с помощью фибриногена и РСС, по сравнению с плацебо.

PCC часто вводят в клинической практике в случае пролонгированного времени свертывания крови у пациентов в критическом состоянии, а также в ситуациях массивных кровотечений. Schochl et al. Anaesthesia 2009. PCC соответствует факторам II, VII, IX и X, а также протеину C и небольшому количеству гепарина, и применялся в течение многих лет для лечения наследственных дефицитов свертывания и для реверсирования антикоагуляции после введения антагонистов витамина К. Доступны только ограниченные данные для животных по применению современных препаратов PCC у свиней, показывающих приобретенные дефициты фактора свертывания, вызванные массивной кровопотерей и введением HES. Dickneite et al. Anesth Analg 2008, 106: 1070-7; Dickneite et al. Br J Anaesth 2009, 102:345-54; Dickneite et al. J Trauma 2009.

Staudinger и соавт. исследовали эффект PCC на свертывание плазмы у пациентов в критическом состоянии и указали, что доза 2000 единиц фактора IX в PCC (в среднем 30 МЕ/кг массы тела) нормализовала протромбиновое время (PT) за счет повышения плазменного уровня факторов свертывания II, VII, IX и X у пациентов с умеренно сниженной активностью свертывания. Staudinger et al. Intensive Care Med 1999, 25: 1105-10. Однако в отношении генерации тромбина, PCC представляется гораздо более активным, чем rhFVIIa. Dickneite et al. J Trauma 2009. PCC может быть связан с повышенным риском тромбоэмболических осложнений, особенно у пациентов с приобретенными пороками свертывания. Bagot et al. Thromb Haemost 2007, 98: 1141-2; Warren et al. Ann Emerg Med 2009, 53:758-61; Kohler et al. Thromb Haemost 1998, 80:399-402.

Также предлагались различные дополнительные способы лечения кровотечений и потери крови, включая добавление факторов свертывания. См., например, опубликованные патенты США 2003/0129183, 2004/0198647, 2004/0237970, 2005/0282771, 2006/0025336, 2006/0211621, 2007/0232788, 2008/0014251, 2008/0188400, 2008/0267940, 2010/0093607, 2009/0098103, 2009/0148502, 2009/0175931, 2009/0232877 и 2010/0086529.

Несмотря на предложение и изучение различных композиций и способов для восстановления гемостаза, в данной области остается потребность в усовершенствованных способах лечения гемостатических нарушений, таких как дилюционная коагулопатия.

Для достижения гемостаза у пациентов с нарушениями свертываемости или потерей крови, требуется достаточное количество тромбина и достаточно способного к свертыванию субстрата (фибриноген). Ключевыми аспектами в свертывании являются формирование тромбина на поверхности тромбоцитов и расщепление фибриногена под действием тромбина с образованием фибрина. При наличии достаточного количества фибриногена, если образуется достаточно тромбина, он преобразует фибриноген в стабильный фибрин, который определяет плотность развивающегося тромба в присутствии фактора XIII (FXIII).

Настоящее изобретение предусматривает лечение или минимизацию неконтролируемых кровотечений с применением рекомбинантного гемостатического средства (средств), включая только рекомбинантный человеческий фактор II (rhFII) или комбинацию из трех рекомбинантных человеческих факторов свертывания, rhII, rhFX и rhVIIa (3F), где гемостатические средства применяют с или без фибриногена. В частности, настоящее изобретение демонстрирует эффективность таких рекомбинантных гемостатических средств в лечении дилюционной коагулопатии. Удивительно, но введение только rhFII или в комбинации с фибриногеном является достаточным для восстановления нормального гемостаза. Введением только rhFII или в комбинации с фибриногеном можно избежать потенциально серьезных осложнений в виде тромбоэмболических явлений, которые могут сопровождать другие стандартные формы лечения, которые в настоящее время предусмотрены для контроля нарушений свертываемости или потери крови.

Следует отметить, что ссылки на какие-либо публикации в данном документе не следует истолковывать как признание того, что такая публикация является ограничительной частью патентной формулы изобретений, раскрытых в данном документе ниже.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

Лечение гемостатического нарушения или нормализация гемостаза может включать в себя применение лечения фактором свертывания, который выбирают из группы, включающей (1) только FII, (2) PCC, и (3) комбинацию трех факторов FII, FX, и VIIa. Лечение фактором свертывания (гемостатическим средством (средствами)) можно факультативно назначать в комбинации с фибриногеном. Гемостатическим средством (средствами) могут являться рекомбинантные человеческие факторы, например, rhFII, rhFX и rhVIIa (данная трехфакторная комбинация из рекомбинантных человеческих факторов может сокращаться 3F), или только rhFII. В некоторых вариантах осуществления эффективное лечение гемостатического нарушения или нормализация гемостаза может включать в себя совместное применение фибриногена и rhFII. Лечение можно проводить без существенного дополнения любым другим фактором свертывания. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления эффективное лечение гемостатического нарушения может включать в себя применение лечения фактором свертывания, который выбирают из группы, включающей (1) только FII, например, rhFII; (2) 3F; (3) фибриноген и комбинацию FII, FVIIa и FX, (4) или фибриноген и FII.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фигура 1: Потеря крови в мл на кг массы тела после рассечения печени и введения контрольного физиологического раствора, концентрата фибриногена (fib), концентрата фибриногена в комбинации с PCC (PCC + fib), концентрата фибриногена в комбинации с трехфакторной комбинацией (ThreeF + fib) или концентрата фибриногена в комбинации с рекомбинантным человеческим FII (FII + fib); показано как среднее +/- SD (стандартное отклонение).

Фигура 2 (A-B): ROTEM® анализ в исходном состоянии (BL), после забора крови (BW), после гемодилюции (HD), после введения исследуемого лекарственного средства (TH), и в конечной точке наблюдения (END). Исследуемые лекарственные средства соответствуют концентрату фибриногена (фибриноген), концентрату фибриногена в комбинации с PCC (PCC), концентрату фибриногена в комбинации с рекомбинантным человеческим FII (FII), концентрату фибриногена в комбинации с трехфакторной комбинацией (3F), или контрольному физиологическому раствору. Показаны время свертывания (СТ, в сек) (Фигура 2А) и максимальная плотность тромба (MCF, в мм) (Фигура 2B). Статистически значимые различия (Р<0,001) показаны по сравнению с группой физиологического раствора и группой фибриногена.

Фигура 3: Потеря крови в мл на кг массы тела после введения (1) контрольного физиологического раствора; (2) рекомбинантного человеческого FII (rhFII) в дозе 8 мг/кг; (3) трехфакторной комбинации, соответствующей rhFII + rhFX + rhFVIIa в дозе 4,0, 0,32 и 0,006 мг/кг, соответственно (низкая доза); (4) трехфакторной комбинации, соответствующей rhFII + rhFX + rhFVIIa в дозе 8,0, 0,64 и 0,012 мг/кг, соответственно (высокая доза); (5) FEIBA VH^® (концентрата активированного комплекса (АРСС); Baxter) в дозе 40 ед/кг; (6) NovoSeven^® (фактор свертывания VIIa; Novo Nordisk) в первой дозе 200 мкг/кг, с последующей второй дозой 100 мкг/кг через час; или Haemocomplettan^® HS (концентрат фибриногена; CSL-Behring), как отдельные значения и среднее (горизонтальная полоса).

Фигура 4 показывает кривые выживания для групп лечения rhFII, rhFII + rhFX + rhFVIIa, Feiba, NovoSeven и Haemocomplettan. Также присутствует носитель в качестве контрольной группы.

Фигура 5 (А-В): Результаты ROTEM после введения факторов свертывания или их комбинаций, как описано выше для фигуры 3, показывающие а) время свертывания (СТ), b) максимальную плотность тромба (MCF) в образцах активированной ех-ТЕМ (тканевой фактор) цельной крови, забранной в исходном состоянии, после разбавления, после введения лекарственного средства и в конце эксперимента, соответственно; показаны как среднее +/- SEM (стандартная ошибка среднего значения).

Фигура 6 (A-D): Результаты генерации тромбина (калиброванная автоматизированная тромбограмма) после введения факторов свертывания или их комбинаций, как описано выше для фигуры 3, показывающие (А) латентный период (длительность периода до начала свертывания крови), (В) время до пика, (С) пик и (D) эндогенный потенциал тромбина для образцов плазмы, полученных в исходном состоянии, после разбавления, после введения лекарственного средства и в конце эксперимента, показанные как среднее +/- SEM.

[0027] Фигура 7: Концентрация комплекса тромбин-антитромбин в образцах плазмы после введения факторов свертывания, или их комбинаций, как описано выше для фигуры 3, отобранных в исходном состоянии, после разбавления, после введения лекарственного средства и в конце эксперимента; показана как среднее.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Настоящее изобретение предусматривает лечение неконтролируемого кровотечения или нормализацию гемостаза путем назначения лечения фактором свертывания или комбинацией одного или нескольких факторов свертывания. В частности, изобретение предусматривает лечение неконтролируемого кровотечения или нормализацию гемостаза путем назначения FII или трехфакторной комбинации (FII, FX и VIIa). В некоторых вариантах осуществления гемостатическими средствами или факторами свертывания являются рекомбинантные человеческие факторы свертывания. В дальнейших вариантах осуществления факторы свертывания вводят с или без фибриногена. В некоторых других вариантах осуществления фактором свертывания лечения является РСС (FII, FVII, FIX и FX, факультативно с небольшим количеством гепарина).

Начало дилюционной коагулопатии и эффект лечения можно измерить обычными тестами коагуляции, такими как ротационная тромбоэластометрия (ROTEM^®) и генерация тромбина, измеряемая калиброванной автоматизированной тромбограммой (CAT), которая осуществляется с помощью 1 пМ TF активатора.

ROTEM^® исследует взаимодействие факторов свертывания, их ингибиторов, антикоагулянтных лекарственных средств, клеток крови, в частности, тромбоцитов, во время свертывания и последующего фибринолиза. Реологические условия имитируют медленный ток крови в венах. Если вкратце, кровь помещают в одноразовую кювету с помощью электронной пипетки. Одноразовая игла крепится к стержню, который соединен с тонкой пружиной и медленно колеблется взад и вперед. Сигнал иглы, находящейся во взвешенном состоянии в образце крови, передается по системе оптического детектора. Прибор измеряет и графически отображает изменения в эластичности на всех стадиях образования и рассасывания тромба. Типичная температура теста 37°C, но можно выбирать разные температуры. Основным результатом является кривая реакции, которая показывает эластичность в течение времени, когда тромб образуется или растворяется.

Четыре параметра описывают кривую свертывания при обычном применении. Временем свертывания (СТ) является латентное время от добавления начального реагента к крови до начала формирования тромба. Удлинение СТ может являться результатом дефицитов свертывания, прежде всего, факторов свертывания или гепарина (в зависимости от применяемого теста). Сокращение CT указывает на гиперкоагуляцию. Угол альфа является углом касательной к кривой, тогда как время образования тромба (CFT) является временем от CT до достижения тромбом точки плотности 20 мм. Данные параметры обозначают скорость, с которой формируется плотный тромб, и в первую очередь зависят от функции тромбоцитов, но фибриноген и факторы свертывания также вносят свой вклад. Удлиненное CFT (или меньший альфа-угол), как правило, вызвано недостаточной функцией тромбоцитов, низким количеством тромбоцитов, нарушениями полимеризации фибрина или дефицитом фибриногена. Сокращение CFT (или большой альфа-угол) указывает на гиперкоагуляцию. Максимальной плотностью тромба (MCF) является самая большая вертикальная амплитуда записи прибора. Она отражает абсолютную прочность сгустка фибрина и тромбоцитов. Низкая MCF указывает на пониженное количество или функцию тромбоцитов, пониженный уровень фибриногена или нарушения полимеризации фибрина, или низкую активность фактора XIII. Механически слабый тромб представляет риск тяжелого кровотечения.

Можно применять вариации ROTEM^®, чтобы подчеркнуть различные параметры и эффекты. Например, EXTEM является скрининг-тестом для (внешней) системы гемостаза. Реагент EXTEM мягко активирует гемостаз с применением тканевого фактора. Таким образом, на результат влияют внешние факторы свертывания крови, тромбоциты и фибриноген.

Калиброванная автоматизированная тромбограмма (CAT) описывается Hemker и соавт. (Pathophysiol Haemost Thromb, 2002, 32:249-253). С помощью "медленного" флуорогенного субстрата тромбина и непрерывного сравнения с одновременно работающим калибратором, генерацию тромбина можно контролировать автоматически. "Тромбограмма", полученная в результате, измеряет способность к гипокоагуляции и гиперкоагуляции в бедной тромбоцитами плазме.

Лечение гемостатического нарушения или нормализация гемостаза может включать применение лечения фактором свертывания, например, FII и, факультативно, FX и FVIIa или комбинацией фибриногена и FII, факультативно также в комбинации с FX и FVIIa. Гемостатическим средством (средствами) могут являться рекомбинантные человеческие факторы, например, rhFII, rhFX и rhVIIa или только rhFII. В некоторых вариантах осуществления эффективное лечение гемостатического нарушения может включать введение FII или совместное введение FII, FX и FVIIa, или совместное введение фибриногена с FII, и, факультативно, также совместное введение FX и FVIIa, где FII, FX и/или FVIIa могут являться рекомбинантно полученными человеческими факторами.

Лечение или нормализацию гемостаза можно проводить без существенного добавления любого другого фактора свертывания. В некоторых вариантах осуществления лечение гемостатического нарушения может включать FII или совместное введение фибриногена и FII, где FII может являться рекомбинантным человеческим FII (rhFII).

Термин "существенное добавление" относится к добавлению других компонентов, таких как факторы свертывания в дополнение к тем, которые описаны в настоящем изобретении, в количестве, при котором эффект одного или нескольких гемостатических средств, при добавлении таких дополнительных факторов свертывания, значительно отличается от такого эффекта введения одного или нескольких гемостатических средств без добавления.

Как применяется в данном документе, "рекомбинантные" протеины включают протеины, полученные с помощью рекомбинантных технологий. Такие протеины включают те, которые имеют сходство с природным протеином, а также те, которые модифицированы для повышения активности, периода полувыведения протеина, стабильности протеина, локализации и эффективности протеина. См. опубликованную патентную заявку США № US 2005/0164367, которая включена в настоящий документ в качестве ссылки.

Как применяется в данном документе, "лечение" является способом получения полезных или желаемых клинических результатов. Полезные или желаемые клинические результаты включают, но без ограничений, облегчение симптомов, уменьшение кровотечения, стабилизацию индивида и предотвращение кровотечения.

Фраза “включающий в основном” подразумевает не то, что необходимо воздерживаться от других одновременных обычных способов лечения пациента, а скорее то, что лечению, включающему в основном, например, введение FII или совместное введение эффективного количества фибриногена и FII, непосредственно не предшествует, не сопутствует, либо за ним не следует значительное добавление других факторов свертывания, в частности, белковых факторов свертывания, обозначаемых римскими цифрами V-XIII. В некоторых вариантах осуществления лечение, включающее в основном введение только FII или совместное введение эффективного количества фибриногена и FII, можно проводить одновременно с отдельными процедурами, такими как переливание крови, введение замороженных тромбоцитов, восстановленных клеток крови, жидкостей, содержащих кристаллоиды и/или коллоиды, и другими обычными способами лечения, которые не включают активное добавление факторов свертывания, сверх тех, которые могут являться эндогенными в переливаемой крови, препарате замороженных тромбоцитов или тому подобное. В других вариантах осуществления может оказаться ненужным или нежелательным одновременное проведение какой-либо процедуры, включающей отдельное введение композиции, которая включает значительные количества факторов свертывания (например, факторов V-XIII), при проведении лечения, включающего в основном введение эффективного количества из FII, 3F, фибриногена и FII или фибриногена и 3F.

В некоторых вариантах осуществления, способ лечения травматического нарушения свертываемости у млекопитающих, которые в этом нуждаются, может включать применение лечения фактором свертывания, который выбирают из группы, включающей (а) PCC (FII, FX, FIX, FVII и протеин C); (b) rhFII, rhFVIIa и rhFX; и (с) только rhFII, где (а), (b) или (с) предоставляются факультативно в комбинации с фибриногеном. Подобным образом, способ нормализации нарушенного гемостаза, связанного с травматическим нарушением свертываемости у млекопитающих, может включать применение лечения фактором свертывания, который выбирают из группы, включающей (а) PCC (FII, FX, FIX, FVII и протеин C), (b) rhFII, rhFVIIa и rhFX; и (с) только rhFII, где (а), (b) или (c) предоставляются факультативно в комбинации с фибриногеном. Кроме того, способ снижения смертности в результате травматического нарушения свертываемости может включать применение лечения фактором свертывания, который выбирают из группы, включающей (а) PCC (FII, FX, FIX, FVII и протеин C), (b) rhFII, rhFVIIa и rhFX; и (с) только rhFII, где (а), (b) или (c) предоставляются факультативно в комбинации с фибриногеном.

Способ лечения гемостатического нарушения или нормализации гемостаза может включать увеличение максимальной плотности тромба (MCF), сокращение времени свертывания (CT) и/или улучшение генерации тромбина после кровоизлияния или массивной кровопотери, связанных с травматическим нарушением свертываемости у млекопитающих, путем назначения комбинированной терапии, включающей или состоящей в основном из одного или более гемостатических средств, включая FII и факультативно фибриноген.

В любом из этих способов, лечение фактором свертывания можно выбирать из группы, включающей (а) PCC (FII, FX, FIX, FVII и протеин C), (b) rhFII, rhFVIIa и rhFX; и (с) rhFII. В одном из вариантов осуществления лечение фактором свертывания является комбинацией FII, FVIIa и FX. В другом варианте осуществления лечение фактором свертывания представляет собой FII или только rhFII. В других вариантах осуществления лечение фактором свертывания может являться либо комбинацией rhFII, rhFVIIa и rhFX, либо только rhFII, практически без добавления любого другого гемостатического фактора, в частности, других факторов свертывания, выраженных римскими цифрами. То есть, в некоторых вариантах осуществления способы могут включать введение rhFII и факультативно фибриногена, практически без добавления любого другого гемостатического фактора, в частности, факторов V-XIII.

В альтернативных вариантах осуществления способ лечения травматического нарушения свертывания у млекопитающих, которые в этом нуждаются, может включать применение лечения фактором свертывания, как описано выше. Подобным образом, способ нормализации нарушенного гемостаза, связанного с травматическим нарушением свертываемости у млекопитающих, может включать применение лечения фактором свертывания, как описано выше. Более того, способ снижения смертности в результате травматического нарушения свертываемости может включать применение лечения фактором свертывания, как описано выше.

Способ лечения гемостатического нарушения или нормализации гемостаза может включать увеличение максимальной плотности тромба (MCF), сокращение времени свертывания (CT), и/или улучшение генерации тромбина после кровоизлияния или массивной кровопотери, связанных с травматическим нарушением свертываемости, у млекопитающих способом, который может включать применение лечения фактором свертывания. В определенных вариантах осуществления, максимальная плотность сгустка возрастает от около 10 мм до около 40 мм, от около 10 мм до около 30 мм, до около 10 мм, до около 15 мм, до около 20 мм, до около 25 мм или до около 30 мм. В других вариантах осуществления время свертывания снижается на от около 35 до около 75 секунд или на около 35 секунд, на около 40 секунд, на около 45 секунд, на около 50 секунд, на около 55 секунд, на около 60 секунд, на около 65 секунд, на около 70 секунд или на около 75 секунд. Как и выше, лечение фактором свертывания можно выбирать из группы, включающей (а) PCC (FII, FX, FIX, FVII и протеин C), (b) rhFII, rhFVIIa и rhFX; и (с) только rhFII, где (а), (b) или (c) предоставляются факультативно в комбинации с фибриногеном. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления лечение фактором свертывания является либо комбинацией (1) FII, FVIIa и FX; либо (2) только FII. Лечение фактором свертывания может включать рекомбинантные человеческие факторы, т.е. либо комбинацию (1) rhFII, rhFVIIa и rhFX; либо (2) только rhFII. В некоторых вариантах осуществления способы могут включать совместное введение rhFII и факультативно совместное введение фибриногена.

"Совместное введение" или "совместное лечение" означает введение смеси компонентов, или отдельно вводимые компоненты совместного лечения во время, которое близко друг к другу, например, введение совместно вводимых компонентов в течение временно перекрывающихся периодов, или начальное введение одного из компонентов в пределах около часа, или получаса, или четверти часа от начала или прекращения введения совместно вводимого компонента.

Компоненты, вводимые в способах, раскрытых в данном документе, составляются и вводятся с применением методов, которые хорошо известны в данной области техники. Например, фибриноген и FII, rhFII или 3F можно вводить путем внутривенной инъекции или инфузии с применением фармацевтически приемлемого носителя или наполнителя. Носители и наполнители, подходящие для состава активных средств, включают любое фармацевтическое средство, которое не вызывает иммунный ответ, вредный для индивидуума, получающего композицию, и которое может вводиться без чрезмерной токсичности. Фармацевтически приемлемые наполнители включают, но без ограничений жидкости, такие как вода, физиологический раствор, глицерин, сахара и этанол. Фармацевтически приемлемые соли также могут включаться. Такие соли включают соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т.п., а также соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и тому подобное. Кроме того, вспомогательные вещества, такие как увлажняющие или эмульгирующие средства, рН буферные вещества и тому подобное, могут присутствовать в таких носителях. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых наполнителей доступно в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., 18th Edition, Easton, Pa., 1990).

Гемостатическое нарушение может быть связано с любой коагулопатией (например, дилюционной коагулопатией) травматического кровотечения, периоперационного кровотечения, послеоперационного кровотечения, послеродового кровотечения и тому подобное. Гемостатическое нарушение может быть связано с уровнем концентрации фибриногена в крови менее, чем от около 2 до около 1,5 г/л или менее, чем от около 1 г/л или менее чем около 0,5 г/л. Гемостатическое нарушение может быть связано с потерей крови от около 30% до около 85%, например, более чем около 30%, около 40%, около 45%, около 50%, около 55%, около 60%, около 70 %, около 80%, или около 85% от предполагаемого общего объема крови млекопитающего, в некоторых вариантах осуществления, дилюционная коагулопатия является результатом восстановления нормоволемии или восстановления стабилизации гемодинамики. Таким образом, млекопитающим, нуждающимся в лечении, которое раскрыто в данном документе, может являться млекопитающее, отвечающее одному или нескольким из данных критериев.

Гемостатические нарушения также могут включать гемофилию А и В, гемофилию А и В у пациентов с ингибирующими антителами, дефициты факторов свертывания, например, фибриногена, FII, FV, FVII, FIX, FVIII, FX, FXI, FXII и FXIII, фактора фон Виллебранда, комбинированный FV/FVII дефицит, дефицит C1 витамин K-эпоксидредуктазы, дефицит гамма-карбоксилазы; кровотечения, связанные с травмой, повреждением, тромбозом, тромбоцитопенией, инсультом, коагулопатией, диссеминированным внутрисосудистым свертыванием крови (ДВС-синдром); сверхантикоагуляцию, связанную с гепарином, низкомолекулярным гепарином, пентасахаридом, варфарином, низкомолекулярными антитромботическими средствами (т.е. FXa ингибиторами); и нарушения тромбоцитов, такие как синдром Бернара-Сулье, тромбластемия Гланцмана (Glanzman thromblastemia), и дефицит пула тромбоцитов.

Гемостатическое нарушение может также включать кровотечение, связанное с тромботическими нарушениями, такими как тромбоз глубоких вен, тромбоз, связанный с состояниями сердечнососудистого заболевания или злокачественными опухолями, тромбоз в результате присутствия постоянных катетеров или других инвазивных хирургических процедур, и тромбоз, связанный с аутоиммунными заболеваниями, такими как волчанка.

Способы, описанные в данном документе, могут включать или состоять в основном из совместного введения фибриногена в количестве, достаточном для повышения концентрации в крови фибриногена выше около 0,5, около 1, около 1,5 или около 2 г/л. В некоторых вариантах осуществления фибриноген вводят в дозе 12,5-200 мг/кг, например, в дозе, к примеру, около 12,5, 25, 50, 100 или 200 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления rhFII вводят в дозе 1, 2, 4, 8 или 10 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления совместное введение фибриногена и одного или более гемостатических средств приводит в результате к поддержанию приблизительно нормализованной коагуляции в течение, по меньшей мере, двух часов после введения.

В некоторых вариантах осуществления активные средства для лечения могут быть объединены в набор. Набор может содержать фибриноген и FIX, rhFII, и/или 3F, а также любые подходящие наполнители, такие как, но без ограничений, физиологический раствор и раствор сахарозы и любые дополнительные кофакторы для стабилизации или эффективности компонентов композиции, такие как, но без ограничений, сахара, антиоксиданты и альбумин. Кроме того, набор может включать другие элементы, участвующие в доставке активных средств, включая устройство для инъекции активных средств (например, шприц), жгут и проспиртованный тампон для очистки места инъекции. Другие элементы также могут включаться в набор, включая элементы, участвующие в ушивании раны, такие как шовный материал, иглы и пинцет.

Хотя способы, раскрытые в данном документе, были подробно описаны со ссылкой на варианты их осуществления, для специалиста в данной области очевидно, что можно вносить различные изменения и работающие эквиваленты, в пределах объема раскрытия сущности изобретения. Подобным образом, последующие примеры приведены в качестве иллюстраций раскрытых способов, но не должны рассматриваться как ограничение раскрытых способов.

Фибриноген или концентрат фибриногена можно вводить в дополнение к одному или более гемостатическим средствам для повышения конечной прочности тромба. В определенных вариантах осуществления комбинация фибриногена с PCC, rhFII или 3F сокращает время свертывания и улучшает генерацию тромбина. Введение PCC или rhFII, комбинированного с фибриногеном может использоваться для уменьшения смертности при лечении неконтролируемого кровотечения. Введение комбинации PCC и фибриногена можно применять для усиления коагуляции до 0,5 часа, одного часа или двух часов после введения. Таким образом, применение rhFII, особенно в комбинации с фибриногеном, может являться альтернативой PCC с сопоставимой эффективностью, но с меньшим риском тромбоэмболических осложнений.

Лечение, включающее совместное введение фибриногена и rhFII без добавления любых других гемостатических средств, может являться эффективным в нормализации нарушенного гемостаза после тяжелой потери крови, по меньшей мере достигающей около 60% гемодилюции с меньшим риском осложнений. Совместное введение фибриногена и rhFII, содержащего 3F, также является эффективным. Кроме того, эффективное лечение может включать в основном введение rhFII или 3 F с или без добавления фибриногена.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

МЕТОДЫ

Хирургическая подготовка и измерения: Исследование проводили с использованием пятидесяти здоровых свиней. Премедикацию животных проводили азапероном (4 мг кг^-1 внутримышечно, нейролептическое средство, Stresnil^ТМ, Janssen, Вена, Австрия) и атропином (0,1 мг кг^-1 внутримышечно) за один час до начала исследования. Анестезию индуцировали и поддерживали пропофолом (1-2 мг кг^-1 внутривенно). Для индукции аналгезии вводили пиритрамид (30 мг, опиоид с периодом полувыведения ~ от 4 до 8 часов, Dipidolor^ТМ , Janssen, Вена, Австрия). Для расслабления мышц 0,2 мг кг^-1 ч^-1 панкурония инъецировали после эндотрахеальной анестезии. После интубации в бедренную артерию вводили катетер 7,5 по французской шкале для сбора образцов крови и непрерывного измерения кровяного давления. Два катетера 7,5 по французской шкале вводили в обе бедренные вены для забора крови, введения коллоидов и кристаллоидов и введения исследуемых лекарственных средств. Катетер Суона-Ганца (катетер Swan-Ganz) поместили через правую яремную вену.

Протокол эксперимента: Основную потребность в замещении жидкости (4 мл/кг) удовлетворяли в течение всего хода испытания применением кристаллоидов (раствор Рингера с лактатом). Для индуцирования стандартной дилюционной коагулопатии, проводили нормоволемическую гемодилюцию с применением 6% HES (гидроксиэтилкрахмала) 130/0,4 (Voluven^®, Fresenius Co., Бад Хомбург, Германия): кровь забирали у животных через большие катетеры и заменяли коллоидом в соотношении 1:1. После завершения гемодилюции забранную кровь обрабатывали в системе Cell Saver (Cats^®, Fresenius, Вена, Австрия), концентрировали и переливали обратно с целью предотвращения гемодинамически значимой анемии. Нормоволемическую гемодилюцию завершали, когда полученная коагулопатия достигала критического уровня, что определяли с помощью ROTEM^® и применения реагента EXTEM: время свертывания (CT)>100 сек, и максимальная плотность тромба (MCF)<40 мм. Животным в произвольном порядке назначали либо 200 мг кг^-1 концентрата фибриногена (Haemocomplettan HS®, CSL-Behring) (группа фибриногена), 200 мг кг^-1 концентрата фибриногена и 35 МЕ/кг PCC (Beriplex®, CSL Behring, Марбург, Германия) (PCC группа), 200 мг кг^-1 концентрата фибриногена и 4 мг кг^-1 концентрата rhFII (AstraZeneca R&D Мельндаль, Швеция) (группа FII), 200 мг кг^-1 концентрата фибриногена и концентрата трехфакторной комбинации, включающего 4 мг/кг rhFII, 0,32 мг/кг rhFX и 0,006 мг/кг rhFVIIa (AstraZeneca R&D Мельндаль, Швеция) (группа 3F), либо равное количество физиологического раствора (группа физиологического раствора). Дозировка концентрата фибриногена и PCC основывалась на ранее опубликованных данных экспериментов на животных. Sperry et al. J Trauma 2008, 64:9-14; Innerhofer P et al. Anesth Analg 2002, 95:858-65.

Стандартное повреждение печени (12 см в длину и 3 см в глубину) индуцировали с применением шаблона непосредственно после введения факторов свертывания или комбинации факторов свертывания, описанных выше. Разрез производили по правой доле печени. Исследование являлось слепым для персонала, который выполнял исследование ткани, тесты на коагуляцию, регистрацию гемодинамики, разрез печени, или для тех, кто участвовал в сборе и измерении происходящей потери крови.

После разреза печени оценивали последующую потерю крови на протяжении периода времени до гибели животных от геморрагического шока. В дополнение к тромбоэластометрическим измерениям проводили стандартные коагуляционные тесты (РТ, аРТТ, фибриноген, количество тромбоцитов), измеряли параметры активированного свертывания крови (D-димеры и TAT) и тест генерации тромбина для оценки потенциала формирования тромбина (калиброванная автоматизированная тромбограмма, CAT).

Через два часа после травмы печени выживших животных умерщвляли инфузией калия. Сердце, легкие, части кишечника и почки удаляли и оценивали на наличие микрососудистых тромбозов.

Отбор проб крови и аналитические методы: Отбор проб артериальной крови проводили в исходном состоянии (BL), после забора крови (BW), гемодилюции (HD), терапии исследуемыми лекарственными средствами (TH) и спустя 120 мин после разреза печени или непосредственно перед ожидаемой смертью (END). Все образцы крови отбирали из бедренной артерии, в силу чего первые 5 мл крови отбрасывали. Пробы крови для ROTEM^® и коагуляционных анализов отбирали в пробирки по 3 мл, содержащие 0,3 мл (0,106 моль/л) буферного (рН 5,5) цитрата натрия (Sarstedt, Нюмбрехт, Германия). Пробы крови для подсчета клеток крови отбирали в пробирки по 2,7 мл, содержащие 1,6 мг ЭДТА/мл (Sarstedt, Нюмбрехт, Германия). Протромбиновое время (PT), частичное тромбопластиновое время (PTT-LA1), концентрацию фибриногена, антитромбина (AT) и комплекса тромбин-антитромбин (ТАТ) определяли стандартными лабораторными методами с применением соответствующих тестов от Dade Behring, Марбург, Германия и Amelung Coagulometer, Бакстер, Великобритания. Для измерения D-димера применяли тест D-димера 0020008500® (Instrumentation Laboratory Company, Лексингтон, США). Подсчет клеток крови проводили с применением Sysmex Poch-100i® счетчика (Sysmex, Лейк Цюрих, Иллинойс, США). Тромбоэластометрию (ROTEM^® Pentapharm, Мюнхен, Германия) применяли для функциональной оценки системы свертывания. Для ускорения и лучшей стандартизации применяли EXTEM реагент. Luddington, Clin Lab Haematol 2005, 27:81-90.

Анализ калиброванной автоматизированной тромбограммы (CAT) проводили в круглодонных 96-луночных планшетах (Greiner microlon, U-образной формы, высокосвязывающий, США). Пробы плазмы с цитратом (80 мкл) и триггерный раствор (20 мкл) (PPP reagent low Cat# TS31.00, Thrombinoscope, Маастрихт, Нидерланды), содержащий 1 пМ TF, смешивали в лунках для проб. Параллельно этому, калибратор (Cat # TS20.00, Thrombinoscope) анализировали путем смешивания 20 мкл калибратора и 80 мкл смешанной плазмы нормальных свиней с цитратом в лунках, сдвоенных с лунками проб. Затем планшет помещали в флюорометр (Ascent reader, Thermolabsystems OY, Хельсинки, Финляндия) и 20 мкл раствора FluCa (Cat # TS50.00, Thrombinoscope), содержащего флуорогенный субстрат и CaCl₂, распределяли по инструменту. Флуорогенный сигнал измеряли при λех 390 нм, λем 460 нм в течение 60 мин. 96-луночный планшет держали на нагревательном блоке при 37°C во время добавления реагентов. Начало активности тромбина (lagtime), время до пика активности тромбина (ttPeak), пик активности тромбина (Peak), и общую активность тромбина, то есть эндогенный потенциал тромбина (ETP), рассчитывали с применением программного обеспечения Thrombinoscope (версия 3.0.0.29) от Thrombinoscope BV (Маастрихт, Нидерланды).

Статистический анализ: Все статистические анализы проводили с применением пакета программ для статистической обработки данных SPSS 15.0 (SPSS, Чикаго, Иллинойс). Критерий Шапиро-Уилка применяли для определения нормальности. Те переменные, которые не являлись нормально распределенными, были логарифмически преобразованы для того, чтобы сделать возможным параметрический анализ. Дисперсионный анализ (ANOVA) проводили, применяя иерархическую процедуру, для определения общих групповых и временных эффектов (P<0,05 считали значимым). В случае существенных различий дисперсионный анализ (ANOVA) проводили для выявления различий между группами. Процедуру Бонферрони-Холма (Bonferroni-Holm procedure) применяли для коррекции множественных сравнений. P<0,005 считался значимым, в случае значимых различий определяли парные t-критерии в пределах и независимые t-критерии между группами. P<0,001 считалась значимой. Выживаемость между группами анализировали с применением методов Каплана-Мейера с логарифмическим ранговым (Мантеля-Кокса) сравнением совокупной выживаемости по группам лечения.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Исследовали 50 свиней со средним весом 36,98 кг (±4,23) и возрастом от четырех до пяти месяцев. В исходном состоянии не обнаружили статистически значимых различий между группами в отношении гемодинамики и показателей свертывания, количества тромбоцитов или эритроцитов. Все результаты тестов коагуляции находились в пределах нормы. Velik-Salchner et al. Thromb Res 2006, 117:597-602.

Время выживания: Животные, которых лечили фибриногеном в сочетании с rhFII (P=0,029) или PCC (Р=0,017) жили значительно дольше после повреждения печени с неконтролируемым кровоизлиянием, чем животные контрольной группы. У всех групп животных, которых лечили по меньшей мере одним фактором крови, увеличилось время выживания по сравнению с контрольной группой, в то время как только фибриноген и комбинация фибриногена с 3F показали подобный эффект на выживаемость после повреждения печени по сравнению с контрольной группой. Одно животное умерло из-за тромбоэмболического осложнения непосредственно после введения PCC.

Потеря крови: Как показано на фигуре 1, после повреждения печени с неконтролируемым кровотечением потеря крови значительно снизилась во всех группах по сравнению с группой физиологического раствора.

ROTEM^®: Время свертывания (СТ) значительно снизилось после введения фибриногена в комбинации с PCC или 3F, по сравнению с лечением физиологическим раствором или только фибриногеном. Как показано на фигуре 2а, в конце периода наблюдения (END) CT по-прежнему оставалось значительно сокращенным у животных, которых лечили комбинацией фибриногена и 3F по сравнению с физиологическим раствором или только фибриногеном. Сочетание фибриногена и PCC значительно сократило СТ по сравнению с физиологическим раствором.

Как показано на фиг. 2b, максимальная плотность тромба (MCF) значительно увеличилась после введения фибриногена в сочетании с 3F или rhFII по сравнению с лечением только физиологическим раствором. После разбавления MCF значительно уменьшилась на одну и ту же величину во всех группах. После введения фибриногена, MCF значительно увеличилась по сравнению с контрольными животными, которых лечили физиологическим раствором. В конце периода наблюдения MCF по-прежнему оставалась значительно увеличенной у свиней, которые получали комбинацию фибриногена и 3F концентрата (группа 3F) или фибриногена и rhFII, по сравнению с группой физиологического раствора.

Генерация тромбина (САТ): Латентный период и время до пика не отличались в пределах групп. Введение фибриногена в комбинации с PCC, rhFII или 3F привело к значительно более высокому пиковому значению, чем у животных, которых лечили только фибриногеном. По сравнению с контрольной группой пиковое значение также значительно увеличилось после введения фибриногена и rhFII, а также фибриногена и 3F. Через два часа после повреждения печени пиковое значение значительно увеличивалось у животных, которых лечили комбинацией фибриногена и РСС, по сравнению со всеми другими группами. Животные, которых лечили комбинацией фибриногена и rhFII, а также фибриногена и 3F, имели значительно более высокий ETP, чем животные, которых лечили только фибриногеном (#), в то время как комбинация фибриногена и rhFII также привела к значительно более высокому ЕТР, по сравнению с контрольной группой. В конце периода наблюдения комбинация фибриногена и PCC имела значительно более высокий ETP, чем все другие группы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как показано выше, введение PCC или rhFII в комбинации с фибриногеном по сравнению с физиологическим раствором или только фибриногеном привело к значительному снижению потери крови после нормоволемической гемодилюции и повреждения печени. Введение PCC или rhFII в комбинации с фибриногеном также привело к значительно более продолжительной жизни животных после повреждения печени. Время свертывания значительно сократилось при введении rhFII в комбинации с фибриногеном по сравнению с представителями контрольной группы, а максимальная плотность тромба также значительно увеличились при лечении rhFII в комбинации с фибриногеном. Данные результаты демонстрируют, что введение rhFII (в данном случае, в комбинации с фибриногеном) является эффективным лечением достаточным для восстановления нормального гемостаза, предотвращения потери крови и снижения смертности. Применение rhFII в лечении нарушений свертываемости и потери крови, таким образом, является эффективным и может помочь избежать потенциально серьезных осложнений случаев тромбоэмболии, которые могут сопровождать введение комбинации нескольких факторов свертывания.

Пример 2

МЕТОДЫ

Анестезия и поддержание гомеостаза: Свиньям в качестве премедикации внутримышечно вводили дормикум (2 мг/кг) и кетаминол (10 мг/кг). Приблизительно через 20 минут в ушную вену вводили полиэтиленовый катетер (Venflon 1,0×32 мм, Becton Dickinson, Хельсингборг, Швеция) с целью применения для введения анестетиков и раствора Рингера. Свиней первоначально анестезировали пентобарбиталом натрия (Apoteksbolaget, Умео, Швеция), введенным внутривенно болюсной дозой (15 мг/кг), чтобы сделать возможной интубацию. В течение эксперимента анестезия поддерживалась последующей инфузией пентобарбитала (10-15 мг/кг/ч), дополненной 1,8% изофлурана (Isoba^®vet, Schering-Plough, Дания) в течение подготовки. Свиней вентилировали (Servo Ventilator 900C, Siemens Elema, Сольна, Швеция) комнатным воздухом, снабженным 10% О₂. Частота дыхания поддерживалась постоянной на 15 циклов/мин, и парциальное давление CO₂ в выдыхаемом воздухе в конце выдоха поддерживали на уровне ~5,5 кПа путем регулирования дыхательного объема. Раствор Рингера (Fresenius Kabi AS, Халден, Норвегия) 1,5 мл/кг/ч вводили непрерывно для возмещения потери жидкости. Температуру тела поддерживали на уровне от 36 до 39°C на протяжении эксперимента путем накрывания животных и путем наружного подогрева. В конце эксперимента животным вводили летальную дозу пентобарбитала (>150 мг/кг).

Хирургическая подготовка: Полиэтиленовый катетер (Intramedic PE-200 Clay Adams, Парсиппани, Нью-Джерси, США) вводили в правую бедренную артерию для непрерывного измерения артериального давления и для отбора проб крови. Полиэтиленовые катетеры (Intramedic PE-200 Clay Adams, Парсиппани, Нью-Джерси, США) продвинули в обе бедренные вены для забора крови и введения обработанных эритроцитов (PRC), гидроксиэтилкрахмала (HES) и исследуемого лекарственного средства/носителя. Четвертый полиэтиленовый катетер (Intramedic PE-200 Clay Adams, Парсиппани, Нью-Джерси, США) для мониторинга центрального венозного давления (CVP) помещали в правую яремную вену. Температуру тела измеряли с помощью ректального датчика. Наконец, выполняли срединную лапаротомию, приблизительно 35 см, с целью обнажения печени. До проведения разреза печени рану закрывали с помощью гемостатического пинцета и защищали от высыхания с помощью тампонов, пропитанных физиологическим раствором.

Протокол эксперимента: после отбора проб крови в исходном состоянии (BS0) животных подвергали изоволемическому и нормотермическому замещению ~60% их общего объема крови (70 мл/кг) HES (гидроксиэтилкрахмалом) 60 мг/мл (Voluven^®, Fresenius Kabi AB, Упсала, Швеция). Столько крови, сколько возможно, отбирали подготовленными шприцами по 50 мл, с 5 мл 0,109 М цитрата натрия, до тех пор, пока среднее артериальное давления (MAP) не достигало критического уровня от 30 мм рт.ст. до 35 мм рт.ст. Затем животных оставляли в покое до повышения MAP до стабильного уровня (приблизительно 10 минут).

Отбор крови затем продолжали до тех пор, пока MAP не падало до минимального 30 мм рт.ст., и HES немедленно вводили внутривенно (1 мл HES:1 мл крови) при помощи пневматической манжеты. Отобрать расчетный объем крови, необходимый для возникновения коагулопатии в течение первого цикла замещения крови-HES, обычно является затруднительным. Если уровень коагулопатии, проверяемый ROTEM анализом, является слишком низким, больше крови отбирается и замещается HES (1:1, хотя кровь разбавлена после первого цикла замещения). Во втором и всех последующих циклах среднее артериальное давление не падает ниже 60 мм рт.ст., и необходимость в каком-либо восстановительном перерыве отсутствует. Для максимизации объема крови, отбираемой в первом цикле замещения, даже если MAP снижается, можно вводить фенилэфрина гидрохлорид (Apoteket AB, Мельндаль, Швеция) внутривенно для того, чтобы вытеснить кровь из периферических сосудов. Фенилэфрина гидрохлорид (около 2 мл 0,1 мг/мл) вводят после 10 мин. восстановительного перерыва, когда MAP упало приблизительно до 40 мм рт.ст. В течение короткого и быстрого повышения MAP несколько дополнительных шприцев можно наполнить кровью.

Забранную кровь обрабатывали с помощью программы качественной отмывки на устройстве Cell Saver (CATS^®, Fresenius Kabi AB, Упсала, Швеция), и после восстановления объема с помощью HES животные получали соответствующий объем обработанных эритроцитов с целью поддержания показателя гемоглобина выше 50 г/л и избежания тем самым ранней смерти от тяжелой анемии. После гемодилюции проводили ROTEM анализ для определения степени коагулопатии. Критериями коагулопатии являлись следующие: СТ_Ех-ТЕМ ≥100 сек и MCF ≤40 мм. После возникновения коагулопатии отбирали пробы крови (BS2). Затем вводили исследуемое лекарственное средство. Исследуемые лекарственные средства соответствовали следующим: (1) контроль физиологическим раствором; (2) рекомбинантный человеческий FII (rhFII) в дозе 8 мг/кг; (3) трехфакторная комбинация, соответствующая rhFII + rhFX + rhFVIIa в дозах 4,0, 0,32 и 0,006 мг/кг, соответственно (низкие дозы); (4) трехфакторная комбинация, соответствующая rhFII + rhFX + rhFVIIa в дозах 8,0, 0,64 и 0,012 мг/кг, соответственно (высокие дозы); (5) FEIBA VH^® (антиингибиторный коагулянтный комплекс (AICC); Baxter) в дозе 40 ед/кг; (6) NovoSeven^® (фактор свертывания VIIa; Novo Nordisk) в дозе 200 + 100 мкг/кг; или Haemocomplettan^® HS (концентрат фибриногена; CSL-Behring). Через десять (10) минут после завершения инфузии отбирали еще одну пробу крови (BS3). Производили стандартный разрез путем размещения самодельного шаблона на правой доле печени и протягивая лезвие скальпеля (№ 11) через щель в шаблоне (длина 8 см, глубина 3 см) для индуцирования неконтролируемого кровотечения. Максимальное время наблюдения после разреза печени составляло 120 мин. Непосредственно перед смертью отбирали последнюю пробу крови (BS4). Кровь собирали из брюшной полости и устанавливали общую потерю крови, а также время выживания. Смерть определяли как электрическую активность без пульса, MAP ниже 15 мм рт.ст. или парциальное давление диоксида углерода в выдыхаемом воздухе в конце выдоха ниже 1,5 кПа.

Отбор проб крови: артериальную кровь собирали в пробирки с цитратом (S-Monovette^® 9 NC/2,9 мл, Sarstedt, Нюмбрехт, Германия) для измерений ROTEM, и плазму сохраняли для анализов генерации тромбина и комплекса тромбин-антитромбин. Кровь для определения концентрации в плазме рекомбинантного человеческого фактора II (rhFII), рекомбинантного человеческого фактора X (rhFX), FVIIa, человеческого фибриногена и подсчета клеток собирали в пробирки с ЭДТА калия (S-Monovette^® 2,6 мл K3E, Sarstedt, Нюмбрехт, Германия).

Анализы цельной крови

ROTEM: На протяжении всего эксперимента получали серийные пробы крови для оценки компетенции гемостатической системы относительно развития эластичности тромба с применением стандартных тестов коагуляции (EXTEM^®, INTEM^®, Pentapharm GmbH, Мюнхен, Германия) в ротационной тромбоэластометрии (ROTEM^®, Pentapharm GmbH, Мюнхен, Германия). Применяли коммерчески доступные реагенты, за исключением раствора кальция хлорида, который готовили самостоятельно в такой же концентрации, как и коммерчески доступный раствор. В данном исследовании следовали инструкциям о порядке проведения анализа от производителя, оценивали времени свертывания (СТ), время формирования тромба (CFT) и максимальную плотность тромба (MCF).

Газы крови и электролиты: Газы артериальной крови, кислотно-основные параметры и электролиты анализировали в течение эксперимента (ABL 700, Radiometer Medical ApS, Бренсхей, Дания). Анализы проводили в соответствии с инструкциями производителя. Все животные показывали хорошее состояние газов крови на всем протяжении экспериментов.

Подсчет клеток: Для мониторинга возможных изменений в концентрациях клеток крови пробы артериальной крови анализировали в автоматизированном счетчике форменных элементов крови (KX-21N, Sysmex, Кобе, Япония) во всех случаях отбора проб крови. Анализы проводили в соответствии с инструкциями производителя.

Анализы плазмы

Комплекс тромбин-антитромбин (ТАТ): Плазменные уровни TAT измеряли с помощью иммуноферментного сэндвич-анализа (Enzygnost^® TAT micro, Dade Behring GmbH, Марбург, Германия). Следовали инструкциям от производителя. Если получали концентрации >90 мкг/мл, пробы разбавляли в 10 раз буферным разбавителем и анализировали заново. Если в пробах плазмы наблюдали сгустки, их не анализировали на ТАТ.

CAT: CAT анализ проводили, как описано в примере 1.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Анализ данных: Данные о среднем артериальном давлении, центральном венозном давлении и частоте сердечных сокращений собирали с применением собственного программного обеспечения (PharmLab V6.0, AstraZeneca R&D Мельндаль). Результаты представлены в виде описательной статистики со средними значениями ± стандартная ошибка среднего (SEM), за исключением времени свертывания цельной крови и результатов концентрации TAT. Данные результаты представлены в виде средних значений, так как выбросы в этих данных повлияли на среднее значение вводящим в заблуждение образом. Последняя проба крови в каждом эксперименте, которая называется "конец эксперимента" отбирается перед смертью, которая происходит в различных временных точках эксперимента для большинства животных.

Потеря крови: Фигура 3 показывает потерю крови в мл на кг массы тела после введения носителя, исследуемых и контрольных веществ и разреза печени. Данные показаны в виде отдельных значений со средним значением, представленным горизонтальной линией.

Время выживания: Фигура 4 показывает кривые выживания для различных групп лечения. В группе носителя 25% животных выжили на протяжении всего эксперимента. Выживание в течение 2 часов времени наблюдения в группах лечения составляло для низкой дозы трехфакторной комбинации 67%, более высокой дозы трехфакторной комбинации, NovoSeven® и Haemocomplettan® 80%, rhFII и FEIBA® 100%, соответственно.

ROTEM: результаты EXTEM активации, т.е. активация посредством TF, проб цельной крови, отобранных в исходном состоянии, после разбавления, после введения лекарственного средства и в конце эксперимента, показаны на фигурах 5а и 4b. В исходном состоянии СТ и MCF подобны для всех групп лечения. После разбавления CT увеличивается в два раза от исходного состояния, в то время как MCF уменьшается примерно до половины уровня исходного состояния. После разбавления обе переменные показывают большую вариабельность между группами по сравнению с исходным состоянием. После применения лечения CT для всех включенных видов лечения было аналогично смещено в сторону значений в исходном состоянии без полной нормализации. Влияние на MCF различных видов лечения являлось небольшим, за исключением Haemocomplettan^® (фибриноген), который показал почти нормализованный MCF после введения лекарственных средств.

CAT: Результаты анализа калиброванной автоматизированной тромбограммы проб плазмы, отобранных в исходном состоянии, после разбавления, после введения лекарственных средств и в конце эксперимента показаны на фигурах 6(a-d).

После разбавления латентный период (LT) и время до пика (ttPeak) снизились, в то время как пик и эндогенный потенциал тромбина (ETP) увеличились по сравнению со значениями в исходном состоянии. После введения веществ LT увеличилось примерно на 50% для rhFII, и небольшое увеличение было отмечено для Haemocomplettan^®, в то время как другие вещества имели в результате небольшие уменьшения LT. Далее, ttPeak показало такую же картину, как LT. Пиковые значения увеличились для rhFII на 100%, для трехфакторной комбинации (низкие дозы) на 30%, для трехфакторной комбинации (высокие дозы) на 150% и FEIBA^® на 150% по сравнению со значением после разбавления. Носитель, NovoSeven^® и Haemocomplettan^® не изменили пик по сравнению со значением непосредственно после разбавления. Наконец, значения ETP увеличились почти на 200% для rhFII, трехфакторной комбинации (высокие дозы) и FEIBA^® по сравнению со значениями после этапа разбавления. ETP для трехфакторной комбинации низкой дозы увеличился приблизительно на 30% по сравнению со значением после разбавления.

В конце эксперимента LT соответствовало тому же периоду времени, как в случае после введения дозы, с тем исключением, что для rhFII уменьшилось до такого же уровня, как после этапа разбавления. Значения ttPeak изменялись так же, как для LT. Ситуация для пика показала, что все группы веществ, за исключением FEIBA^®, вернулись к уровню, обнаруживавшемуся после завершения разбавления. FEIBA^® все еще показывал пик, сопоставимый с уровнем, обнаруживавшимся непосредственно после введения вещества. Значения ETP в конце эксперимента все являлись подобными на картине пика.

TAT: Как показано на фигуре 7, уровни TAT были подобными во всех группах лечения после этапа разбавления. Когда ввели лекарственные средства, наблюдали увеличение уровней TAT в 2-3 раза для всех видов лечения, включающих протромбин, то есть трехфакторные комбинации, rhFII и FEIBA^®. В конце эксперимента закономерность, полученная после введения лекарственных средств, по-прежнему сохранялась, с еще большим увеличением уровней TAT для видов лечения, включающих протромбин, за исключением только rhFII, который показал снижение уровня TAT по сравнению с уровнем после введения. Haemocomplettan^® и NovoSeven^® также увеличили уровни ТАТ в конце эксперимента по сравнению с уровнями после разбавления и после введения в 2-3 раза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как продемонстрировано выше, введение только rhFII, по сравнению с физиологическим раствором или другими видами лечения, привело к значительному уменьшению потери крови после нормоволемической гемодилюции и повреждения печени. Анализы тромбограммы показали увеличение латентного периода примерно на 50% только для rhFII, увеличение пикового значения только для rhFII на 100%, и увеличение значения ETP только для rhFII почти на 200%. Данные результаты также показывают, что введение только rhFII является эффективным лечением, достаточным для восстановления нормализованного гемостаза, предотвращения потери крови и увеличения времени выживания.

Применение только rhFII или применение трехфакторной комбинации ранее не испытывали в сложной животной модели неконтролируемого кровотечения в связи с дилюционной коагулопатией. Таким образом, настоящее изобретение впервые предусматривает эффективность только rhFII, или эффективность 3F для лечения нарушений свертываемости и потери крови. Как описано в примере 2 выше, уровни TAT и данные генерации тромбина в конце эксперимента уменьшились до уровней перед введением для всех проб. Для введения факторов свертывания, таких как только rhFII, это может являться преимуществом, поскольку позволяет лучше модулировать схемы лечения в ходе критического эпизода кровотечения или периода потери крови. Большая продолжительность времени может не предоставить возможности необходимых корректив в схемах лечения. Более того, введение только rhFII, рассматриваемое в данном документе выше, может предотвратить в течение лечения потенциально серьезные осложнения тромбоэмболических явлений, которые иногда сопровождают введение комбинации множественных факторов свертывания.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к гематологии и может быть использована для нормализации нарушенного гемостаза. Способы по изобретению включают лечение фактором свертывания, состоящим из FII, PCC и трехфакторной комбинации FII, FX и FVIIa или фибриногена и FII. Использование изобретений позволяет снизить риск тромбоэмболических осложнений. 4 н. и 20 з.п. ф-лы, 12 ил., 2 пр.

1. Способ нормализации нарушенного гемостаза у нуждающегося в этом млекопитающего, включающий применение лечения фактором свертывания, состоящего из (1) FII, (2) комбинации FII, FVIIa и FX, (3) фибриногена и комбинации FII, FVIIa и FX или (4) фибриногена и FII.

2. Способ увеличения максимальной плотности тромба (MCF) у млекопитающего с нарушенным гемостазом, включающий применение лечения фактором свертывания, состоящего из (1) FII, (2) комбинации FII, FVIIa и FX, (3) фибриногена и комбинации FII, FVIIa и FX или (4) фибриногена и FII.

3. Способ уменьшения времени свертывания (СТ) у млекопитающего с нарушенным гемостазом, включающий применение лечения фактором свертывания, состоящего из (1) FII, (2) комбинации FII, FVIIa и FX, (3) фибриногена и комбинации FII, FVIIa и FX, а также (4) фибриногена и FII.

4. Способ улучшения образования тромбина у млекопитающего с нарушенным гемостазом, включающий применение лечения фактором свертывания, состоящего из (1) FII, (2) комбинации FII, FVIIa и FX, (3) фибриногена и комбинации FII, FVIIa и FX, а также (4) фибриногена и FII.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где указанный нарушенный гемостаз связан с сопровождающимся кровотечением нарушением, кровоизлиянием, массивной потерей крови или случаем травматического кровотечения.

6. Способ по п. 5, где указанная массивная потеря крови связана с коагулопатией.

7. Способ по п. 5, где указанное сопровождающееся кровотечением нарушение представляет собой гемофилию.

8. Способ по п. 5, где указанное кровоизлияние или случай травматического кровотечения связаны с периоперационным кровотечением, послеоперационным кровотечением или послеродовым кровотечением.

9. Способ по любому из пп. 1-4, 6-8, где указанный FII представляет собой рекомбинантный человеческий FII (rhFII).

10. Способ по любому из пп. 1-4, 6-8, где указанный FVIIa представляет собой рекомбинантный человеческий FVIIa (rhVIIa).

11. Способ по любому из пп. 1-4, -6-8, где указанный FX представляет собой рекомбинантный человеческий FX (rhFX).

12. Способ по любому из пп. 1-4, 6-8, где млекопитающее, нуждающееся в лечении, имеет уровень концентрации фибриногена в крови менее чем около 2 г/л, менее чем около 1 г/л или менее чем около 0,5 г/л.

13. Способ по любому из пп. 1-4, 6-8, где млекопитающее, нуждающееся в лечении, имеет уровень концентрации фибриногена в крови менее чем около 200 мг/дл, менее чем около 150 мг/дл, менее чем около 100 мг/дл или менее чем около 50 мг/дл г/л.

14. Способ по любому из пп. 1-4, 6-8, где указанный нарушенный гемостаз связан с потерей крови более чем на около 30%, более чем на около 40%, более чем на около 50%, более чем на около 60%, более чем на около 70%, более чем на около 80% или более чем на около 85% от расчетного общего объема крови млекопитающего.

15. Способ по п. 6, где указанная коагулопатия является дилюционной коагулопатией, которая является результатом восстановления нормоволемии или гемодинамической стабилизации.

16. Способ по любому из пп. 1-4, 6-8 или 15, где фибриноген вводят в количестве, достаточном для повышения концентрации фибриногена в крови выше около 0,5 г/л; выше около 1 г/л, выше около 1,5 г/л или выше около 2 мг/л.

17. Способ по любому из пп. 1-4, 6-8 или 15, где фибриноген вводят в дозе от 12,5 до 200 мг/кг.

18. Способ по любому из пп. 1-4, 6-8 или 15, где FII является rhFII и вводится в дозе от 1 до 10 мг/кг.

19. Способ по любому из пп. 1-4, 6-8 или 15, где лечение фактором свертывания применяется в дозе, которая уменьшает время свертывания на от около 40 секунд до около 60 секунд.

20. Способ по любому из пп. 1-4, 6-8 или 15, где лечение фактором свертывания применяют в дозе, которая увеличивает максимальную плотность тромба до от около 10 мм до около 30 мм.

21. Способ по любому из пп. 1-4, 6-8 или 15, где применение указанного лечения фактором свертывания приводит к поддержанию нормализованной коагуляции в течение по меньшей мере двух часов после применения.

22. Способ по любому из пп. 1-4, 6-8 или 15, где указанное лечение фактором свертывания представляет собой (1) FII или (2) фибриноген и FII; и где указанное лечение фактором свертывания применяют совместно с FVIIa.

23. Способ по любому из пп. 1-4, 6-8 или 15, где указанное лечение фактором свертывания представляет собой (1) комбинацию FII, FVIIa и FX или (2) комбинацию FII, FVIIa и FX с фибриногеном, и где FII и FVIIa вводят в соотношении по меньшей мере 1:90.

24. Способ по любому из пп. 1-4, 6-8 или 15, где указанное лечение фактором свертывания представляет собой (1) FII или (2) фибриноген и FII; и где применение указанного лечения фактором свертывания выполняют без совместного применения любых других факторов свертывания из факторов свертывания FV-FXIII.