ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ПОЛИПЕПТИДЫ ФАКТОРА VII И ПОЛИПЕПТИДЫ PAI-1 Российский патент 2007 года по МПК A61K38/36 A61K38/57 A61P7/04 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей фактор VII или родственный фактору VII полипептид и PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид. Изобретение также относится к применению комбинации фактора VII или полипептида, родственного фактору VII, и PAI-1 или полипептида, родственного PAI-1, для производства лекарственного средства для лечения пациентов, страдающих кровотечениями, или профилактики случаев кровотечения. Изобретение также относится к способу лечения кровотечений у пациентов и к способу, улучшающему образование сгустка у пациента. Настоящее изобретение также относится к наборам, содержащим указанные соединения.

Предпосылки к созданию изобретения

Гемостаз инициируется посредством образования комплекса между тканевым фактором (TF), который экспонируется в кровотоке после повреждения стенки сосуда, и фактором FVIIa, который находится в кровотоке в количестве, соответствующем приблизительно 1% от общей массы белка FVII. Указанный комплекс прочно прикрепляется к TF-несущей клетке и активирует FX (фактор X) и превращает его в FXa (фактор Xa) и активирует FIX (фактор IX) и превращает его в FIXa (фактор IXa) на поверхности клетки. FXa активирует протромбин и превращает его в тромбин, который в свою очередь активирует FVIII, FV, FXI и FXIII. Кроме того, ограниченное количество тромбина, образованного на этой первоначальной стадии гемостаза, также активирует тромбоциты. После воздействия тромбина на тромбоциты последние изменяют форму и экспонируют на поверхность заряженные фосфолипиды. Активированная поверхность тромбоцита образует матрицу для дальнейшей активации FX и полного образования тромбина. Дальнейшая активация FX на активированной поверхности тромбоцита происходит посредством комплекса FIXa-FVIIIa, образованного на поверхности активированного тромбоцита, и затем FXa превращает протромбин в тромбин, все еще оставаясь на поверхности. Затем тромбин превращает фибриноген в фибрин, который является нерастворимым и который стабилизирует первоначальную «пробку» из тромбоцитов. Этот процесс является обособленным, т.е. локализируется на участке экспрессии или местоположения TF, тем самым снижается риск системной активации свертывающей системы крови. Нерастворимый фибрин, образующий «пробку», кроме того, стабилизируется посредством поперечного связывания фибриновых волокон, катализируемого фактором FXIII.

Фактор FVII существует в плазме, главным образом, в виде одноцепочечного зимогена, который расщепляется посредством фактора FXa на двухцепочечную активированную форму, FVIIa. Рекомбинантный активированный фактор VIIa (rFVIIa) был разработан в качестве прогемостатического агента. Введение rFVIIa приводит к быстрому и высокоэффективному прогемостатическому ответу у больных гемофилией с кровотечениями, которых нельзя лечить с помощью факторов свертывающей системы вследствие образования антител. Кроме того, пациентов, которые страдают от кровотечений, с недостаточностью фактора VII или пациентов, у которых свертывающая система крови находится в норме, но испытывающих чрезмерное кровотечение, можно успешно лечить с помощью фактора FVIIa. При изучении данной проблемы исследователи не сталкивались с неблагоприятными побочными эффектами, обусловленными введением rFVIIa (в частности, возможность возникновения тромбоэмболии).

Дополнительно введенный фактор FVIIa улучшает образование тромбина на активированной поверхности тромбоцита. Такое явление имеет место у больных гемофилией, у которых отсутствует фактор FIX или FVIII и поэтому не осуществляется самый эффективный путь полного образования тромбина. Также в присутствии пониженного количества тромбоцитов или тромбоцитов с нарушением функции добавочный фактор FVIIa увеличивает образование тромбина.

Промышленные препараты рекомбинантного человеческого фактора FVIIa выпускаются под маркой NovoSeven^®(Novo Nordisk A/S, Denmark). Novoseven^® показан для лечения случаев кровотечений у больных гемофилией А и В. Novoseven^® является единственным рекомбинантным фактором FVIIa, доступным на рынке, для эффективного и надежного лечения случаев кровотечения.

Результаты исследований показали, что ингибитор активатора плазминогена (PAI-1) играет важную роль в регуляции протеолиза, опосредованного плазмином. PAI-1, также называемый как ингибитор активатора плазминогена эндотелиального типа (e-PAI), ингибирует активатор плазминогена урокиназного типа (u-PA) и активатор плазминогена тканевого типа (t-PA), и его обычно выделяют из эндотелиальных клеток человека, тромбоцитов человека и клеток гепатомы крысы (НТС). Ингибитор PAI-1 может быть очищен из клеток фибросаркомы человека линии НТ-1080, как описано в патенте США № 6271352, или из эндотелиальных клеток крупного рогатого скота, как описано в публикации van Mourik, J.A. et al. (1984) J. Biol. Chem. 259, 14914-14921. PAI-1 представляет собой одноцепочечный гликопротеин с молекулярным весом 50 кДа (Van Mourik, J.A. et al., J. Biol. Chem. (1984) 259:14914-14921) и является самым эффективным ингибитором, известным из одноцепочечных и двухцепочечных форм tPA и uPA (Lawrence D et al., Eur. J. Biochem. (1989) 186:523-533). PAI-1 также ингибирует плазмин и трипсин (Hekman C.M. et al., Biochemistry (1988) 27:2911-2918) и также ингибирует тромбин и активированный белок С, хотя с намного меньшей эффективностью.

Хорошо известно, что у пациентов, у которых вследствие операции или значительной травмы происходит чрезмерное кровотечение и которые нуждаются в переливании крови, развивается больше осложнений, чем у пациентов, не испытывающих каких-либо кровотечений. Однако умеренные кровотечения, требующие восполнения крови путем введения крови человека или элементов крови (тромбоциты, лейкоциты, произведенные из плазмы концентраты для лечения нарушений свертывания крови и т.д.), могут привести к осложнениям, связанным с риском передачи с кровью вирусов человека (вируса гепатита, ВИЧ, парвовируса и других до сих пор не известных вирусов). Обширные кровотечения, требующие восполнения крови путем значительных переливаний крови, могут привести к развитию множественных органных поражений, включая нарушение функции легких и почек. Как только у пациента начинают развиваться указанные серьезные осложнения, «запускается» каскад реакций, в которые вовлекается ряд цитокинов, а также воспалительные реакции, делая любое лечение крайне затруднительным и, к сожалению, часто неэффективным. Поэтому основной задачей в хирургии, а также в лечении значительных повреждений ткани является предупреждение кровотечений или снижение их до минимума. Для того чтобы избежать кровотечений или снизить их до минимума, важно добиться образования стабильных и твердых гемостатических «пробок», которые с трудом растворяются под действием фибринолитических ферментов. Кроме того, важно достичь быстрого и эффективного образования таких «пробок» или сгустков.

На сегодняшний день в случаях кровотечений у пациентов, включая жертв различных травм и тех, у кого кровотечения связаны с операцией, лечение часто осуществляют посредством нескольких инъекций или инфузий фактора FVIIa, поскольку из-за короткого полупериода существования FVIIa (2,5 часа) может потребоваться более одного введения для поддержания определенного уровня гемостатической способности. Более быстрая остановка кровотечений принесет больше пользы таким пациентам. Поэтому в таких случаях следует снизить количество введений, чтобы остановить кровотечение и поддержать гемостаз.

Европейский патент № 225160 (Novo Nordisk) касается композиций FVIIa и способов лечения расстройств, сопровождающихся кровотечением, которые не вызваны дефектами факторов свертывающей системы крови или ингибиторами факторов свертывающей системы крови.

Европейский патент № 82182 (Baxter Travenol Lab.) касается композиции фактора VIIa, которую используют для восполнения недостаточности факторов свертывающей системы крови или противодействия ингибиторам факторов свертывающей системы крови у пациента.

Международная патентная публикация № WO 93/06855 (Novo Nordisk) касается местного применения FVIIa.

До сих пор в данной области существует необходимость улучшенного лечения пациентов, испытывающих кровотечения, включая пациентов, у которых случаи кровотечения вызваны операцией, травмой или другими видами повреждений ткани; коагулопатией, включая коагулопатию у пациентов, претерпевших многократные переливания крови; обусловлены врожденными или приобретенными расстройствами в системе свертывания крови или расстройствами, сопровождающимися кровотечением, включая гипофункцию печени («заболевание печени»); обусловлены нарушением функции тромбоцитов или снижением количества тромбоцитов; отсутствием существенных «соединений» свертывания крови или наличием аномальных «соединений» свертывания крови (например, тромбоциты или белковый фактор Виллебранда); связаны с повышенным фибринолизом; обусловлены терапией антикоагулянтными средствами или терапией тромболитическими средствами; или трансплантацией стволовой клетки.

В данной области также сохраняется потребность в улучшенном, надежном и широко применяемом способе, повышающем свертывающую способность крови, улучшающем или обеспечивающем образование стабильных гемостатических «пробок», или увеличивающем возможности для благотворного лечения пациента, или приводящем к достижению полного гемостаза у пациентов, в частности, у пациентов со сниженным образованием тромбина. Также имеется потребность в способах, где время остановки кровотечения сокращено.

Краткое описание сущности изобретения

Одной целью настоящего изобретения является создание композиций, которые могут быть эффективно использованы для лечения или профилактики случаев кровотечения и нарушений свертывания крови.

Второй целью настоящего изобретения является создание композиций в виде однократной стандартной лекарственной формы, которая может быть эффективно использована для лечения или профилактики случаев кровотечения или в качестве прокоагулянта. Другой целью настоящего изобретения является создание композиций, создание способов лечения или наборов, применение которых способствует проявлению синергического эффекта.

Другой целью настоящего изобретения является создание композиций, способов лечения и наборов, не имеющих существенных побочных эффектов, таких как высокий уровень системной активации системы свертывания крови.

Другие цели настоящего изобретения будут очевидны при прочтении настоящего описания.

В первом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей фактор VII или родственный фактору VII полипептид, и PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид.

Во втором аспекте изобретение относится к набору компонентов, предназначенному для лечения случаев кровотечения, содержащему:

a) эффективное количество препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и фармацевтически приемлемый носитель в первой стандартной лекарственной форме;

b) эффективное количество препарата PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида и фармацевтически приемлемый носитель во второй стандартной лекарственной форме; и

с) емкости, вмещающие указанные первую и вторую лекарственную формы.

В третьем аспекте изобретение относится к применению фактора VII или родственного фактору VII полипептида в комбинации с PAI-1 или родственным PAI-1 полипептидом для производства лекарственного средства с целью лечения случаев кровотечения у пациента. В другом аспекте изобретение относится к применению композиции, как описано в любом из пунктов формулы изобретения 1-18, для производства лекарственного средства с целью лечения случаев кровотечения у пациента.

В разных аспектах изобретения лекарственные средства предназначены для снижения времени, необходимого для достижения полного гемостаза, для снижения времени, необходимого для сохранения гемостаза, снижения времени свертывания крови, увеличения времени фибринолиза и повышения прочности сгустка.

В различных аспектах лекарственные средства предназначены для лечения пациентов, испытывающих кровотечения вследствие операции, травмы или других типов повреждения ткани; коагулопатии, включающей коагулопатию у пациентов, претерпевших многократные переливания крови; врожденных или приобретенных расстройств в системе свертывания крови или расстройств, сопровождающихся кровотечением, включающих гипофункцию печени («заболевание печени»); нарушения функции тромбоцитов или снижения количества тромбоцитов; отсутствия существенных «соединений» системы свертывания крови или наличия аномальных «соединений» системы свертывания крови (например, тромбоциты или белковый фактор Виллебранда); повышенного фибринолиза; терапии антикоагулянтными средствами и терапии тромболитическими средствами; трансплантации стволовой клетки. В одной серии аспектов кровотечения происходят в органах, таких как мозг, область внутреннего уха, глаза, печень, легкие, опухолевая ткань, желудочно-кишечный тракт; в другой серии аспектов кровотечение является диффузным кровотечением, таким как при геморрагическом гастрите и профузное маточное кровотечение. В другой серии аспектов случаи кровотечения связаны с операцией или травмой у пациентов, у которых наблюдаются острые гемартрозы (кровоизлияния в суставы), хроническая гемофилическая артропатия, гематомы (например, мышечные, забрюшинные, подъязычные и заглоточные), кровотечения в другой ткани, гематурия (кровотечение из мочевыводящих путей), внутримозговое кровоизлияние, у пациентов, которые претерпели операцию (например, гепатэктомия), удаление зуба и желудочно-кишечные кровоизлияния (например, кровотечения в UGI). В одном аспекте лекарственное средство предназначено для лечения случаев кровотечения вследствие травмы, операции или пониженного числа тромбоцитов или сниженной активности тромбоцитов у пациента.

В другом аспекте изобретение относится к способу лечения случаев кровотечения у пациента, способу, включающему в себя введение пациенту при необходимости некоторого количества первого препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и некоторого количества второго препарата PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида, где количества первого и второго препарата, вместе взятые, являются эффективными для лечения кровотечений.

В другом аспекте изобретение относится к способу снижения времени свертывания крови у пациента, способу, включающему в себя введение пациенту при необходимости некоторого количества первого препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и некоторого количества второго препарата PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида, где количества первого и второго препарата, вместе взятые, являются эффективными для снижения времени свертывания крови.

В другом аспекте изобретение относится к способу, способствующему повышению гемостаза, способу, включающему в себя введение пациенту при необходимости некоторого количества первого препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и некоторого количества второго препарата PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида, где количества первого и второго препарата, вместе взятые, являются эффективными для повышения гемостаза.

В другом аспекте изобретение относится к способу, позволяющему увеличить период времени фибринолиза у пациента, способу, включающему в себя введение пациенту при необходимости некоторого количества первого препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и некоторого количества второго препарата PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида, где количества первого и второго препарата, вместе взятые, являются эффективными для увеличения времени фибринолиза.

В другом аспекте изобретение относится к способу повышения прочности сгустка у пациента, способу, включающему в себя введение пациенту при необходимости некоторого количества первого препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и некоторого количества второго препарата PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида, где количества первого и второго препарата, вместе взятые, являются эффективными для повышения прочности сгустка.

В одной серии аспектов способов фактор VII или родственный фактору VII полипептид и PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид вводят в виде однократной стандартной лекарственной формы.

В другой серии аспектов фактор VII или родственный фактору VII полипептид и PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид вводят в виде первой стандартной лекарственной формы, содержащей препарат фактора VII или родственного фактору VII полипептида, и второй стандартной лекарственной формы, содержащей препарат PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида. В серии аспектов изобретения первую стандартную лекарственную форму и вторую стандартную лекарственную форму вводят раздельно с интервалом времени не более 15 минут.

В другом аспекте изобретение относится к набору, предназначенному для лечения случаев кровотечения, включающему в себя:

d) эффективное количество фактора VII или родственного фактору VII полипептида и эффективное количество PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида и фармацевтически приемлемый носитель в однократной стандартной лекарственной форме; и

е) емкости, вмещающие указанную однократную, стандартную лекарственную форму.

В одной серии аспектов изобретения фактором VII или родственным фактору VII полипептидом является родственный фактору VII полипептид. В одной серии аспектов изобретения родственный фактору VII полипептид представляет собой вариант аминокислотной последовательности фактора VII. В одном аспекте соотношение между активностью родственного фактору VII полипептида и активностью нативного фактора VIIa человека (FVIIa дикого типа) составляет, по крайней мере, приблизительно 1,25, причем приведенные данные получены в результате исследований с помощью «анализа посредством гидролиза in vitro», как описано в настоящем тексте.

В одной серии аспектов изобретения фактором VII или родственным фактору VII полипептидом является фактор VII. В одном аспекте указанным фактором VII является фактор VII человека. В одном аспекте фактор VII является фактором VII крупного рогатого скота, свиньи, собаки, лошади, мыши или лосося. В другом аспекте фактор VII является рекомбинантным фактором. В другом аспекте фактор VII получен из плазмы. В предпочтительном аспекте фактор VII является рекомбинантным фактором VII человека. В одной серии аспектов изобретения фактор VII или родственный фактору VII полипептид находится в его активированной форме. В одном предпочтительном аспекте изобретения фактор VII является рекомбинантным фактором VIIa человека.

В одной серии аспектов изобретения PAI-1 или родственным PAI-1 полипептидом является PAI-1-родственный полипептид. В одном аспекте PAI-1-родственный полипептид представляет собой вариант аминокислотной последовательности PAI-1. В одном аспекте соотношение между активностью указанного родственного PAI-1 полипептида и активностью нативного PAI-1 плазмы человека (PAI-1 дикого типа) составляет, по крайней мере, приблизительно 1,25, причем приведенные данные получены в результате исследований с помощью «анализа PAI-1», как описано в настоящем тексте. В одном аспекте PAI-1 или родственным PAI-1 полипептидом является полипептид PAI-1. В одном аспекте PAI-1 является PAI-1 человека. В одном аспекте PAI-1 является PAI-1 крупного рогатого скота, свиньи, собаки, лошади, мыши или крысы. В предпочтительном аспекте PAI-1 получают рекомбинантным способом. В одном аспекте PAI-1 получают из тромбоцитов; в другом аспекте его получают из эндотелиальных клеток. В предпочтительном аспекте PAI-1 является рекомбинантным PAI-1 человека. В одном аспекте PAI-1-родственный полипептид представляет собой фрагмент PAI-1. В одном аспекте PAI-1-родственный полипептид является гибридным полипептидом PAI-1, например гибридным полипептидом PAI-1, например гибридом свиньи/человека.

В одном аспекте фактор VII или родственный фактору VII полипептид и PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид присутствуют в соотношении по массе приблизительно от 100:1 до 1:100 (мас./мас. фактор VII:PAI-1).

В одном аспекте родственные фактору VII полипептиды представляют собой варианты аминокислотной последовательности, в которой не более чем 20 аминокислот заменены, удалены или вставлены по сравнению с фактором VII дикого типа (т.е. полипептид с аминокислотной последовательностью, описанной в патенте США № 4784950). В другом аспекте варианты фактора VII имеют не более чем 15 аминокислот, которые заменены, удалены или вставлены; в других аспектах варианты фактора VII имеют не более чем 10 аминокислот, таких как 8, 6, 5 или 3 аминокислоты, которые заменены, удалены или вставлены по сравнению с фактором VII дикого типа. В одном аспекте варианты фактора VII выбирают из перечня L305V-FVIIa, L305V/M306D/D309S-FVIIa, L305I-FVIIa, L305T-FVIIa, F374P-FVIIa, V158T/M298Q-FVIIa, V158D/E296V/M298Q-FVIIa, K337A-FVIIa, M298Q-FVIIa, V158D/M298Q-FVIIa, L305V/K337A-FVIIa, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVIIa, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVIIa, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVIIa, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII и S336G-FVII.

В другом аспекте родственные фактору VII полипептиды обладают повышенной активностью, независимой от тканевого фактора, по сравнению с активностью нативного фактора VIIa свертывания крови человека. В другом аспекте повышенная активность не сопровождается изменениями в субстратной специфичности. В другом аспекте изобретения связывание полипептидов, родственных фактору VII, с тканевым фактором не ухудшается, и родственные фактору VII полипептиды проявляют, по крайней мере, активность фактора VIIa дикого типа при связывании с тканевым фактором.

В предпочтительном аспекте фактор VII или родственный фактору VII полипептид и PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид представляют собой рекомбинантный фактор VIIa человека и рекомбинантный PAI-1 человека.

В одном аспекте время свертывания крови у млекопитающих снижается. В другом аспекте гемостаз в крови млекопитающих усиливается. В другом аспекте время фибринолиза в крови млекопитающих увеличивается. В другом аспекте прочность сгустка в крови млекопитающих повышается. В одном аспекте кровью млекопитающих является кровь человека. В другом аспекте кровью млекопитающих является кровь человека в норме; в одном аспекте кровь представляет собой кровь пациента, укоторого образование тромбина снижено. В одном аспекте кровь представляет собой кровь пациента с недостаточностью одного или более факторов свертывающей системы; в другом аспекте кровь представляет собой кровь пациента, содержащую ингибиторы одного или более факторов свертывающей системы; в одном аспекте кровь представляет собой кровь пациента, содержащую сниженную концентрацию фибриногена; в одном аспекте кровь представляет собой кровь человека с недостаточностью PAI-1. В одной серии аспектов кровью является плазма.

В одном аспекте изобретения фактор VII или родственный фактору VII полипептид и PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид являются единственными гемостатическими средствами, содержащимися в композиции. В другом аспекте фактор VII или родственный фактору VII полипептид и PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид являются единственными активными гемостатическими средствами, содержащимися в композиции. В другом аспекте фактор VII или родственный фактору VII полипептид и PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид являются единственными факторами свертывания крови, вводимыми пациенту. В одном аспекте изобретения фактор VII или родственный фактору VII полипептид и PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид являются единственными активными средствами, вводимыми больному. В одном аспекте композиция, по существу, лишена тромбина или протромбина; в другом аспекте композиция, по существу, лишена FX; в другом аспекте композиция, по существу, лишена FXa.

В другом аспекте фармацевтическую композицию получают для внутривенного введения, предпочтительно в виде инъекции или инфузии, в частности, инъекции. В одном аспекте композиция содержит по крайней мере один фармацевтически приемлемый наполнитель или носитель.

В одном аспекте изобретения композиция находится в виде однократной стандартной лекарственной формы, где однократная стандартная лекарственная форма содержит оба фактора свертывания. В одном аспекте изобретения композиция находится в виде набора компонентов, содержащего препарат фактора VII или родственного фактору VII полипептида как первую стандартную лекарственную форму и препарат PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида как вторую стандартную лекарственную форму, и содержащего емкости, вмещающие указанную первую и вторую стандартную лекарственную форму. В одном аспекте композиция или набор, по необходимости, также содержит инструкции для введения композиции или отдельных компонентов, соответственно.

В одном аспекте изобретения фактор VII или родственный фактору VII полипептид и PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид вводят в виде однократной стандартной лекарственной формы. В одном аспекте изобретения фактор VII или родственный фактору VII полипептид и PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид вводят в виде первой стандартной лекарственной формы, содержащей препарат фактора VII или родственного фактору VII полипептида, и второй стандартной лекарственной формы, содержащей препарат PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида.

В одном аспекте изобретения фактор VII или родственный фактору VII полипептид и PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид вводят одновременно. В другом аспекте фактор VII или родственный фактору VII полипептид и PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид вводят последовательно. В одном аспекте фактор VII или родственный фактору VII полипептид и PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид вводят раздельно с интервалом времени не более 15 минут, предпочтительно 10, более предпочтительно 5, наиболее предпочтительно 2 минуты. В одном аспекте фактор VII или родственный фактору VII полипептид и PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид вводят раздельно с интервалом времени вплоть до 2 часов, предпочтительно от 1 до 2 часов, более предпочтительно вплоть до 1 часа, более предпочтительно от 30 минут до 1 часа, более предпочтительно вплоть до 30 минут, наиболее предпочтительно от 15 до 30 минут.

В одном аспекте эффективное количество фактора VII или родственного фактору VII полипептида составляет количество от приблизительно 0,05 мг/день до приблизительно 500 мг/день (пациент весом 70 кг). В одном аспекте эффективное количество препарата PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида составляет приблизительно от 0,01 мг/день до приблизительно 500 мг/день (пациент весом 70 кг).

В одном аспекте фактор VII или родственный фактору VII полипептид и PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид присутствуют в соотношении по массе приблизительно от 100:1 до 1:100 (мас./мас. фактор VII: PAI-1).

В одном аспекте настоящего изобретения фармацевтическая композиция представлена в виде однократной стандартной лекарственной формы и состоит в основном из препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и препарата PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида и одного или более компонентов, выбранных из перечня фармацевтически приемлемых носителей, стабилизаторов, детергентов, нейтральных солей, антиоксидантов, консервантов и ингибиторов протеаз.

В другом аспекте настоящего изобретения фармацевтическая композиция представлена в виде набора компонентов с первой стандартной лекарственной формой, состоящей в основном из препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и одного или более компонентов, выбранных из перечня фармацевтически приемлемых носителей, стабилизаторов, детергентов, нейтральных солей, антиоксидантов, консервантов и ингибиторов протеаз; и со второй стандартной лекарственной формой, состоящей в основном из препарата PAI-1 или препарата родственного PAI-1 полипептида и одного или более компонентов, выбранных из перечня фармацевтически приемлемых носителей, стабилизаторов, детергентов, нейтральных солей, антиоксидантов, консервантов и ингибиторов протеаз.

В следующем аспекте пациентом является человек; в другом аспекте у пациента отмечается снижение образования тромбина; в одном аспекте у пациента наблюдается пониженная концентрация фибриногена в плазме (например, у пациента, претерпевшего многократные переливания крови); в одном аспекте у пациента наблюдается пониженная концентрация фактора VIII или FIX в плазме.

В другом аспекте изобретение касается способа, разработанного для повышения гемостаза у пациента с синдромом, связанным с фактором VII, сравненного со способом лечения пациента посредством фактора VII как единственного свертывающего белка, способа, включающего в себя введение пациенту при необходимости некоторого количества первого препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и некоторого количества второго препарата PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида, где количества первого и второго препарата, вместе взятые, способствуют эффективному повышению гемостаза.

В другом аспекте изобретение касается способа, разработанного для повышения образования тромбина у пациента, способа, включающего в себя введение пациенту при необходимости некоторого количества первого препарата фактора VII или родственного фактору VII препарата и некоторого количества второго препарата PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида, где количества первого и второго препарата, вместе взятые, эффективно повышают образование тромбина.

В другом аспекте изобретение касается способа, разработанного для повышения образования тромбина у пациента, страдающего синдромом, связанным с фактором VII, сравненного со способом лечения пациента посредством фактора VII как единственного белка свертывания крови, способа, включающего в себя введение пациенту при необходимости некоторого количества первого препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и некоторого количества второго препарата PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида, где количества первого и второго препарата, вместе взятые, способствуют эффективному повышению образования тромбина.

В другом аспекте изобретение касается способа, разработанного с целью уменьшения числа введений белкового фактора свертывания, требуемых для достижения гемостаза у пациента, страдающего синдромом, связанным с фактором VII, по сравнению с количеством введений, требуемых в тех случаях, когда фактор VII вводят пациенту в качестве единственного белкового фактора свертывания, способа, включающего в себя введение пациенту при необходимости некоторого количества первого препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и некоторого количества второго препарата PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида, где первое и второе количество вместе способствуют эффективному снижению числа введений белкового фактора свертывания.

В другом аспекте изобретение касается способа лечения кровотечений у пациента, страдающего синдромом, связанным с фактором VII, способа, включающего в себя введение пациенту при необходимости некоторого количества первого препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и некоторого количества второго препарата PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида, где количества первого и второго препарата, вместе взятые, проявляют эффективность в лечении кровотечений.

В одном аспекте фактор VII является рекомбинантным фактором VIIa человека (rFVIIa). В другом аспекте rFVIIa является NovoSeven^® (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark).

В другом аспекте изобретение относится к применению фактора VII или родственного фактору VII полипептида в комбинации с PAI-1 для производства лекарственного средства, способствующего повышению образования фибринового сгустка в плазме млекопитающих.

В другом аспекте изобретение относится к способу, направленному на повышение образования фибринового сгустка у пациента, способу, который включает в себя введение пациенту при необходимости некоторого количества первого препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и некоторого количества второго препарата PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида, где количества первого и второго препарата, вместе взятые, проявляют эффективность в лечении кровотечений.

Перечень фигур

Фигура 1: Добавление FVIIa привело к дозо-зависимому увеличению периода времени фибринолиза. Указанный эффект был оптимальным при 10 нМ FVIIa.

Фигура 2: В присутствии 10 нМ FVIIa, добавление PAI-1 привело к дальнейшему увеличению периода времени фибринолиза. Эффект был дозозависимым и оптимальным при 10 нМ PAI-1.

Фигура 3: Тромбоэластографию (roTEG) применяли для анализа действия комбинации FVIIa и PAI-1 на максимальную прочность сгустка (MCF), а также анализа устойчивости сгустков к растворению, опосредованному t-PA. В плазме крови человека в норме добавление PAI-1 (30 нМ) не приводило к изменению MCF, но увеличивало полупериод растворения сгустка до 16,1 мин. Шкала времени дана в минутах.

Фигура 4: Тромбоэластографию (roTEG) применяли для анализа действия комбинации FVIIa и PAI-1 на максимальную прочность сгустка (MCF), а также анализа устойчивости сгустков к растворению, опосредованному t-PA. В плазме крови при гемофилии добавление PAI-1 только приводило к повышению MCF до 5 мм и увеличивало полупериод растворения сгустка до 32,4 мин. Шкала времени дана в минутах.

Подробное описание изобретения

У пациентов, которые претерпевают обильные кровотечения в связи с операцией или большой травмой и которым вследствие кровопотери требуются переливания крови, развиваются осложнения в большей степени, чем у пациентов, не имеющих кровотечения. Однако умеренные кровотечения могут привести к осложнениям, если в случаях таких кровотечений требуется введение крови человека или элементов крови (тромбоцитов, лейкоцитов, концентратов, полученных из плазмы крови, для лечения нарушений в системе свертывания крови), поскольку переливания крови связаны с риском передачи с кровью вирусов человека (например, вируса гепатита, ВИЧ, парвовируса или других не известных в настоящее время вирусов), а также невирусных патогенов. Чрезмерные кровотечения, требующие больших переливаний крови, могут привести к развитию многообразной органной недостаточности, включая нарушение функции легких и почек. Как только у пациента развиваются эти серьезные осложнения, «запускается» каскад реакций, вовлекающих ряд цитокинов и воспалительных реакций, крайне затрудняющих любое лечение и делающих его, к сожалению, часто неэффективным. Больной, претерпевший большую потерю крови, становится клинически неустойчивым. Такие больные находятся в зоне риска появления мерцательной аритмии, которая может привести к фатальной остановки сердечной деятельности; нарушению функции почек; или выходу жидкости в легкие (так называемый «отек легких» или ARDS). Поэтому основной задачей в хирургии, а также в лечении значительных повреждений ткани является предотвращение сильного кровотечения или снижение его до минимума. Для того чтобы избежать нежелательных кровотечений или снизить их до минимума, необходимо добиться образования стабильных и твердых гемостатических «пробок», которые с трудом растворяются при действии фибринолитических ферментов. Кроме того, важно достичь быстрого и эффективного образования таких «пробок» или сгустков.

У пациентов с тромбоцитопенией (пониженное число тромбоцитов или сниженная активность тромбоцитов) снижена способность к образованию тромбина, а также наблюдается недостаточная стабилизация фибриновых «пробок», что приводит к образованию гемостатических «пробок», подвергаемых преждевременному растворению. Кроме того, пациенты, перенесшие существенную травму или повреждение органа, и которые в результате претерпевают многократные переливания крови, часто имеют пониженное число тромбоцитов, а также пониженные уровни фибриногена, фактора VIII и других белков свертывающей системы. У таких пациентов наблюдается нарушение (или снижение) в образовании тромбина. Поэтому такие пациенты имеют несовершенный, или менее эффективный, гемостаз, приводящий к образованию фибриновых «пробок», которые легко и преждевременно растворяются под действием протеолитических ферментов, которые, кроме того, в значительной степени высвобождаются в случаях, характеризующихся существенной травмой и повреждением органа.

Кровотечения в тканях также могут привести к образованию гематом. Размеры (в частности, внутричерепных и спинальных) гематом тесно коррелируют со степенью потери неврологической функции, с возникающими при реабилитации трудностями и/или с серьезностью и степенью постоянных ухудшений неврологической функции после реабилитации. Самые тяжелые последствия гематом наблюдаются в случаях их расположения в мозге, когда они могут привести даже к смерти больного.

Таким образом, главные задачи в лечении кровотечений заключаются в достижении гемостаза за минимальное время, что приводит к минимальной потере крови.

Таким образом, настоящее изобретение относится к эффективным композициям, применению этих композиций и способам обработки с целью лечения кровотечений у пациентов, нуждающихся в таком лечении. Композиции, их применение и способы обработки могут быть связаны с такими благотворными эффектами, как меньшая потеря крови до достижения гемостаза, меньшая потребность в крови в течение операции, поддержание кровяного давления на приемлемом уровне до достижения гемостаза, более быстрая стабилизация кровяного давления, более короткое время восстановления больного, подвергаемого лечению, более короткое время реабилитации больного, подвергаемого лечению, снижение случаев образования гематом или образование меньших по размеру гематом, включая гематомы в мозге, более быстрая остановка кровотечений, снижение количества введений, требуемых для остановки кровотечения и поддержания гемостаза.

Введение препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида, например фактора VIIa, в комбинации с препаратом PAI-1 или препаратом родственного PAI-1 полипептида способствует сокращению времени свертывания крови, образованию более прочного сгустка и повышению устойчивости к фибринолизу по сравнению со временем свертывания, прочностью сгустка и устойчивостью в случаях, когда пациентам вводят только фактор VIIa или PAI-1.

Введение препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида, например фактора VIIa, в комбинации с препаратом PAI-1 или препаратом родственного PAI-1 полипептида также способствует снижению времени достижения остановки кровотечения и снижению количества введений для поддержания гемостаза по сравнению со случаем, когда вводят только либо фактор VIIa, либо PAI-1. Настоящее изобретение обеспечивает благотворное действие одновременного или последовательного введения препарата PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида и препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида. Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может быть в виде единой композиции или может быть в виде многокомпонентного набора (набора компонентов). Композицию согласно настоящему изобретению используют в качестве терапевтического и профилактического прокоагулянта у млекопитающих, включая приматов, таких как человек. Настоящее изобретение также относится к способу лечения (включая профилактическое лечение или предотвращение) кровотечений у пациента, включая человека.

Всякий раз, когда в описании упоминают о первой, или второй, или третьей и т.д. стандартной дозе, то это упоминание не указывает на предпочтительный порядок введения, а только приводится для удобства.

Комбинация препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и препарата PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида представляет собой эффективный продукт, способствующий сокращению времени свертывания крови, быстрому образованию гемостатических "пробок" и образованию стабильных гемостатических "пробок". Автором изобретения было обнаружено, что комбинация препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и препарата PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида представляет собой эффективный продукт, способствующий образованию твердых, стабильных и быстро формирующихся ″пробок″.

Авторы настоящего изобретения показали, что комбинация фактора VIIa и PAI-1 может повысить прочность сгустка с большей эффективностью, чем фактор VIIa, либо PAI-1 по отдельности. Также было показано, что комбинация фактора VII или родственного фактору VII полипептида и PAI-1 может увеличить in vitro время фибринолиза в плазме человека в норме с большей эффективностью, чем фактор VIIa, либо PAI-1 по отдельности. Также было показано, что комбинация фактора VII или родственного фактору VII полипептида и PAI-1 может продлить полупериод фибринолиза в нормальной плазме человека с большей эффективностью, чем фактор VIIa, либо PAI-1 по отдельности. Также было показано, что комбинация фактора VII или родственного фактору VII полипептида и PAI-1 может защитить сгусток от фибринолиза, в частности, от tPA-опосредованного фибринолиза, в нормальной плазме человека с большей эффективностью, чем фактор VIIa либо PAI-1 по отдельности. Таким образом, повышая свертывающую способность пациента, можно достичь более эффективного лечения кровотечения у такого пациента.

Не опираясь на какую-либо теорию, авторы полагают, что полное образование тромбина является необходимым для формирования твердой стабильной гемостатической «пробки» и тем самым для поддержания гемостаза. Фибриновая структура такой «пробки» зависит как от количества образованного тромбина, так и от скорости первоначального образования тромбина. В случае снижения степени образования тромбина образуется рыхлая фибриновая «пробка», которая является высокопроницаемой. Фибринолитические ферменты, которые в норме находятся на поверхности фибрина, легко растворяют такую фибриновую «пробку». Образование стабильной фибриновой «пробки» также зависит от присутствия фактора XIIIa, который образуется в результате действия тромбина и поэтому также зависит от завершенного образования тромбина. Кроме того, недавно описан активируемый тромбином ингибитор фибринолиза, TAFI, для активации которого требуются высокие количества тромбина. В случае не полностью произошедшего образования тромбина TAFI не активируется, что приводит к образованию гемостатической «пробки», которая легче, чем обычно растворяется под действием фибринолитической активности в норме. В случае нарушения, характеризующегося сниженным числом тромбоцитов, тромбоцитопении, введение экзогенного добавочного фактора VIIa инициирует более скорое образование тромбина. Однако полное образование тромбина не нормализуется посредством фактора VIIa даже при его высоких концентрациях.

У пациентов с пониженными концентрациями фибриногена в плазме (пациенты с многократными переливаниями крови вследствие сложной травмы или обширной операции) полной активации тромбином не происходит. Более эффективный гемостаз достигается путем введения комбинации фактора VII или родственного фактору VII полипептида и PAI-1.

У пациентов с тромбоцитопенией наблюдается ухудшение образования тромбина, а также недостаточная стабилизация фибриновых «пробок», что приводит к образованию гемостатических «пробок», подверженных преждевременному растворению. Кроме того, пациенты, которые получают травму или повреждение органа и которые вследствие этого претерпевают многократные переливания крови, часто имеют пониженное число тромбоцитов, а также пониженные уровни фибриногена, фактора VIII и других белков системы свертывания крови. У таких пациентов наблюдается ухудшение (или снижение) образования тромбина. Кроме того, пониженный уровень фибриногена у таких пациентов отрицательно влияет на активацию фактора XIII. Такие пациенты поэтому имеют несовершенный или менее эффективный гемостаз, что приводит к образованию фибриновых «пробок», которые легко и преждевременно растворяются под действием протеолитических ферментов, причем такие ферменты высвобождаются в значительной степени в случаях, характеризующихся обширной травмой и повреждением органа.

Для того чтобы облегчить образование полностью стабилизированных «пробок» с полноценной способностью поддержать гемостаз у пациента, пациенту вводят композицию согласно изобретению. Указанная композиция является особенно благотворной для пациентов с пониженным числом тромбоцитов и для пациентов с пониженными уровнями фибриногена в плазме крови и/или других белков свертывающей системы.

Полипептиды фактора VII

Для осуществления настоящего изобретения может быть использован любой полипептид фактора VII, то есть полипептид, являющийся эффективным средством в предупреждении или лечении кровотечения. Такие полипептиды включают в себя полипептиды фактора VII, полученные из крови или плазмы или полученные рекомбинантными способами.

Настоящее изобретение охватывает полипептиды фактора VII, такие, например, полипептиды, аминокислотная последовательность которых описана в патенте США № 4784950 (человеческий фактор VII дикого типа). В некоторых аспектах полипептид фактора VII представляет собой фактор VIIa человека, описанный, например, в патенте США № 4784950 (фактор VII дикого типа). В одной серии аспектов полипептиды фактора VII включают в себя полипептиды, которые проявляют по крайней мере приблизительно 10%, предпочтительно, по крайней мере приблизительно 30%, более предпочтительно, по крайней мере приблизительно 50% и наиболее предпочтительно, по крайней мере приблизительно 70% удельной активности фактора VIIa человека. В одной серии аспектов полипептиды фактора VII включают в себя полипептиды, которые проявляют по крайней мере приблизительно 90%, предпочтительно, по крайней мере приблизительно 100%, предпочтительно, по крайней мере приблизительно 120%, более предпочтительно, по крайней мере приблизительно 140% и наиболее предпочтительно, по крайней мере приблизительно 160% удельной активности фактора VIIa человека. В одной серии аспектов полипептиды фактора VII включают в себя полипептиды, аминокислотная последовательность которых идентична по крайней мере приблизительно на 70%, предпочтительно, по крайней мере приблизительно на 80%, более предпочтительно, по крайней мере приблизительно на 90%, и наиболее предпочтительно, по крайней мере приблизительно на 95%, последовательности фактора VII дикого типа, описанной в патенте США № 4784950.

Употребляемый в тексте термин «полипептид фактора VII» охватывает без ограничения фактор VII, а также родственные фактору VII полипептиды. Термин «фактор VII» охватывает без ограничения полипептиды с последовательностью аминокислот 1-406 человеческого фактора VII дикого типа (как описано в патенте США № 4784950), а также фактора VII дикого типа, произведенного из других видов, таких как, например, крупный рогатый скот, свинья, собака, мышь и лосось, причем указанный фактор произведен из крови или плазмы или получен рекомбинантными способами. Указанный термин также охватывает природные аллельные варианты фактора VII, которые могут существовать и встречаться у разных представителей. Кроме того, степень и положение гликозилирования или других посттрансляционных модификаций может различаться в зависимости от выбранных клеток-хозяев и природы окружающей клетки-хозяева среды. Термин «фактор VII» также охватывает полипептиды фактора VII в их нерасщепленной форме (зимоген), а также полипептиды, которые подверглись протеолитическому процессингу с образованием соответствующих биоактивных форм, обозначенных как фактор VIIa. Обычно молекула фактора VII расщепляется между 152 и 153 аминокислотными остатками с получением фактора VIIa.

Термин «родственные фактору VII полипептиды» включает в себя без ограничения полипептиды фактора VII, которые представляют собой химические модификации фактора VII человека и/или включают одно или более изменений аминокислотной последовательности по сравнению с фактором VII человека (т.е. варианты фактора VII) и/или содержат полипептиды с укороченными аминокислотными последовательностями по сравнению с фактором VII человека (т.е. фрагменты фактора VII). Такие родственные фактору VII полипептиды могут проявлять свойства, отличные от свойств фактора VII человека, включая стабильность, связывание с фосфолипидами, удельную активность и тому подобное. Термин «родственные фактору VII полипептиды» охватывает полипептиды в их нерасщепленной форме (зимоген), а также полипептиды, которые подверглись протеолитическому процессингу с образованием соответствующих биоактивных форм, которые обозначают как «родственные фактору VIIa полипептиды» или «активированные родственные фактору VII полипептиды».

Употребляемый в тексте термин «родственные фактору VII полипептиды» охватывает без ограничения, полипептиды, проявляющие, главным образом, равную или улучшенную биологическую активность относительно человеческого фактора VII дикого типа, а также полипептиды, биологическая активность которых существенно модифицирована или снижена относительно активности человеческого фактора VIIa дикого типа. Такие полипептиды включают без ограничения фактор VII или фактор VIIa, модифицированный химическим путем, и варианты фактора VII, в которые были внесены специфические изменения аминокислотной последовательности, которые привели к модификации или нарушению биоактивности полипептида.

Кроме того, термин охватывает полипептиды с незначительно модифицированной аминокислотной последовательностью, например полипептиды с модифицированной N-концевой частью, включая делеции или добавления аминокислот в N-концевой части полипептидов, и/или полипептиды, которые были модифицированы химическим путем относительно фактора VIIa человека.

Родственные фактору VII полипептиды, включающие варианты фактора VII, которые проявляют в основном либо равную или улучшенную биологическую активность, по сравнению с фактором VII дикого типа, либо, в качестве альтернативы, проявляют в основном модифицированную или сниженную биоактивность относительно фактора VII дикого типа, включают в себя без ограничения полипептиды с аминокислотной последовательностью, отличающейся от последовательности фактора VII дикого типа включением, делецией или заменой одной или более аминокислот.

Родственные фактору VII полипептиды, включающие варианты, охватывают такие полипептиды, которые проявляют по крайней мере приблизительно 10%, по крайней мере приблизительно 20%, по крайней мере приблизительно 25%, по крайней мере приблизительно 30%, по крайней мере приблизительно 40%, по крайней мере приблизительно 50%, по крайней мере приблизительно 60%, по крайней мере приблизительно 70%, по крайней мере приблизительно 75%, по крайней мере приблизительно 80%, по крайней мере приблизительно 90%, по крайней мере приблизительно 100%, по крайней мере приблизительно 110%, по крайней мере приблизительно 120% или по крайней мере приблизительно 130% удельной активности фактора VIIa дикого типа, который продуцируется в клетках такого же типа, причем приведенные данные получены в результате исследований с помощью одного или более из таких анализов, как анализ свертывания крови, анализ посредством протеолиза или анализ связывания TF, как описано выше.

Родственные фактору VII полипептиды, включающие варианты, обладающие в основном равной или улучшенной биологической активностью по сравнению с фактором VIIa дикого типа, охватывают полипептиды, которые проявляют по крайней мере приблизительно 25%, предпочтительно, по крайней мере приблизительно 50%, более предпочтительно, по крайней мере приблизительно 75%, более предпочтительно, по крайней мере приблизительно 100%, более предпочтительно, по крайней мере приблизительно 110%, более предпочтительно, по крайней мере приблизительно 120% и наиболее предпочтительно, по крайней мере приблизительно 130% удельной активности фактора VIIa дикого типа, который продуцируется в клетках такого же типа, причем приведенные данные получены в результате исследований с помощью одного или более из таких анализов, как анализ свертывания крови, анализ посредством протеолиза или анализ связывания TF, как описано выше.

Родственные фактору VII полипептиды, включающие варианты, обладающие в основном сниженной биологической активностью по сравнению с фактором VIIa дикого типа, представляют собой полипептиды, которые проявляют приблизительно менее 25%, предпочтительно менее приблизительно 10%, предпочтительно менее приблизительно 5% и наиболее предпочтительно менее приблизительно 1% удельной активности фактора VIIa дикого типа, который продуцируется в клетках такого же типа, причем приведенные данные получены в результате исследований с помощью одного или более из анализов, таких как анализ свертывания крови, анализ протеолиза или анализа связывания TF, как описано выше. Варианты фактора VII, проявляющие, главным образом, модифицированную биологическую активность относительно фактора VII дикого типа, включают в себя без ограничения варианты фактора VII, которые проявляют независимую от TF протеолитическую активность по отношению к фактору Х, и такие варианты, которые связываются с TF, но не расщепляют фактор Х.

В некоторых аспектах полипептиды фактора VII представляют собой родственные фактору VII полипептиды, в частности, варианты, у которых отношение между активностью указанного полипептида фактора VII и активностью нативного человеческого фактора VIIa (FVIIa дикого типа) составляет по крайней мере приблизительно 1,25, причем приведенные данные получены в результате исследований с помощью «анализа посредством гидролиза in vitro» (см. «анализы», ниже); в других аспектах отношение составляет по крайней мере приблизительно 2,0; в следующих аспектах отношение составляет по крайней мере приблизительно 4,0. В некоторых аспектах изобретения полипептиды фактора VII являются родственными фактору VII полипептидами, в частности вариантами, у которых отношение между активностью указанного полипептида фактора VII и активностью нативного человеческого фактора VIIa (FVIIa дикого типа) составляет по крайней мере приблизительно 1,25, причем приведенные данные получены в результате исследований с помощью «анализа посредством гидролиза in vitro» (см. «анализы», ниже); в других аспектах отношение составляет по крайней мере приблизительно 2,0; в следующих аспектах отношение составляет по крайней мере приблизительно 4,0; в следующих аспектах отношение составляет по крайней мере приблизительно 8,0.

В некоторых аспектах полипептид фактора VII представляет собой фактор VII человека, как описано, например, в патенте США № 4784950 (фактор VII дикого типа). В некоторых аспектах полипептид фактора VII представляет собой фактор VIIa человека. В одной серии аспектов полипептиды фактора VII представляют собой родственные фактору VII полипептиды, которые проявляют по крайней мере приблизительно 10%, предпочтительно, по крайней мере приблизительно 30%, более предпочтительно, по крайней мере приблизительно 50% и наиболее предпочтительно, по крайней мере приблизительно 70% удельной биологической активности фактора VIIa человека. В некоторых аспектах полипептиды фактора VII имеют аминокислотную последовательность, которая отличается от последовательности фактора VII дикого типа введением, делецией или заменой одной или более аминокислот.

Неограничивающие примеры вариантов фактора VII, проявляющих равную или большую биологическую активность по сравнению с фактором VIIa дикого типа, включают в себя, но не ограничиваются, варианты, описанные в датских патентных заявках №№ PA 200000734 и РА 200001360 (соответствующая международной публикации WO 01/83725), и РА 200001361 (соответствующая международной патентной публикации WO 02/22776). Неорганичивающие примеры вариантов фактора VII, проявляющих, главным образом, равную или улучшенную биологическую активность по сравнению с фактором VII дикого типа, включают в себя S52A-FVII, S60A-FVII (Iino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998); L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVIIa, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII и S336G-FVII; варианты FVIIa, проявляющие повышенную устойчивость к протеолизу, как описано в патенте США № 5580560; фактор VIIa, который расщеплялся протеолитическими ферментами между остатками 290 и 291 или между остатками 315 и 316 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995); и окисленные формы фактора VIIa (Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999). Неорганичивающие примеры вариантов фактора VII, проявляющих в основном сниженную или модифицированную биологическую активность по сравнению с фактором VII дикого типа, включают в себя R125E-FVIIa (Wildgoose et al., Biochem. 29:3413-3420, 1990), S344A-FVIIa (Kazama et al., J. Biol. Chem. 270:66-72, 1995), FFR-FVIIa (Holst et al., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 15:515-520, 1998) и фактор VIIa с отсутствующим Gla доменом (Nicolaisen et al., FEBS Letts. 317:245-249, 1993). Неограничивающие примеры химически модифицированных полипептидов фактора VII и вариантов последовательностей описаны, например, в патенте США № 5997864.

Биологическая активность фактора VIIa в системе свертывания крови проявляется в его способности (i) связываться с тканевым фактором (TF) и (ii) катализировать протеолитическое расщепление фактора IX или фактора X с образованием активированного фактора IX или X (фактора IXa или Ха соответственно).

В рамках изобретения биологическую активность полипептидов фактора VII («биологическая активность фактора VII») можно оценить количественно путем измерения способности препарата стимулировать свертывание крови, используя плазму с недостаточным количеством фактора VII и тромбопластин, как описано, например, в патенте США № 5997864. В данном анализе биологическую активность выражают как снижение времени свертывания по сравнению с контрольным образцом и превращают в «единицы фактора VII» при сравнении со стандартом, представляющим объединенную сыворотку человека, который проявляет активность фактора VII, равную 1 единице/мл. В качестве альтернативы биологическая активность фактора VIIa может быть количественно оценена путем:

(i) измерения способности фактора VIIa или родственного фактору VIIa полипептида производить активированный фактор Х (фактор Ха) в системе, содержащей TF, встроенный в липидный слой мембраны, и фактор Х (Persson et al., J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997);

(ii) измерения степени гидролиза фактора Х в водной системе («анализ посредством протеолиза in vitro», см. ниже);

(iii) измерения физического связывания фактора VIIa или родственного фактору VIIa полипептида с TF, используя прибор, основанный на поверхностном резонансе плазмона (Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997);

(iv) измерения степени гидролиза синтетического субстрата под действием фактора VIIa или родственного фактору VIIa полипептида («анализ посредством гидролиза in vitro», см. ниже); и

(v) измерения образования тромбина в TF-независимой системе in vitro.

Термин «биологическая активность фактора VII» или «активность фактора VII» включает в себя способность образовывать тромбин; термин также включает в себя способность образовывать тромбин на поверхности активированных тромбоцитов в отсутствие тканевого фактора.

Препарат фактора VIIa, который может быть использован согласно изобретению, представляет собой без ограничения NovoSeven^® (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark).

Полипептиды PAI-1

Настоящее изобретение включает в себя применение полипептидов PAI-1, таких как, например, полипептиды, которые имеют аминокислотную последовательность, описанную в публикациях Gils et al., Biochim. Biophys. Acta. 1988 Sep 8;1387 (1-2):291-7; Sul et al. Biochem J. 1998 Apr 15; 331 (Pt 2):409-15; Ginsburg et al., J. Clin. Invest., vol. 78, pp. 1673-1680 (1986); такие, которые описаны в патенте США № 6303338; патенте США № 6103498, или описаны в публикации Pannekoek et al., JOURNAL EMBO J. 5 (10), 2539-2544 (1986) (PAI-1 дикого типа).

При осуществлении настоящего изобретения может быть использован любой полипептид PAI-1, то есть полипептид, являющийся эффективным в предупреждении или лечении кровотечения. Такие полипептиды включают в себя полипептиды PAI-1, полученные из крови или плазмы или полученные рекомбинантными способами. Термин «PAI-1» охватывает все имеющиеся в природе полипептиды PAI-1 как в активной конформации, включающей конститутивно активные формы, например, PAI-1 (14-1b, молекулярные инновации), так и в латентной конформации.

Употребляемый в тексте термин «полипептид PAI-1» охватывает без ограничения PAI-1, а также PAI-1-родственные полипептиды.

Обозначение «PAI-1» охватывает без ограничения полипептиды с аминокислотной последовательностью, описанной в публикациях Pannekoek et al., JOURNAL EMBO J. 5 (10), 2539-2544 (1986); Gils et al., Biochim. Biophys. Acta. 1988 Sep 8;1387 (1-2):291-7; Sul et al. Biochem J. 1998 Apr 15; 331 (Pt 2):409-15; Ginsburg et al., J. Clin. Invest., vol. 78, pp. 1673-1680 (1986); или полипептиды, описанные в патенте США № 6303338; патенте США № 6103498, а также PAI-1 дикого типа, произведенный из других видов, таких как крупный рогатый скот, свинья, собака, мышь и крыса.

Указанное обозначение также охватывает природные аллельные варианты PAI-1, которые могут существовать и встречаться у разных представителей. Кроме того, степень и положение гликозилирования или других посттрансляционных модификаций может различаться в зависимости от выбранных клеток-хозяев и природы окружающей клетки-хозяева среды. Обозначение «PAI-1» также охватывает полипептиды PAI-1 в форме зимогена, а также полипептиды, которые подверглись процессингу с образованием соответствующих биоактивных форм.

Термин «PAI-1-родственные полипептиды» включает в себябез ограничения полипептиды PAI-1, которые являются химически модифицированными относительно PAI-1 человека и/или содержат одно или более изменений аминокислотной последовательности относительно PAI-1 человека (т.е. варианты PAI-1), и/или содержат укороченные аминокислотные последовательности относительно PAI-1 человека (т.е. фрагменты PAI-1). Такие PAI-1-родственные полипептиды могут проявлять свойства, отличные от свойств PAI-1 человека, включая стабильность, связывание с фосфолипидами, удельную активность и тому подобное.

Термин «PAI-1-родственные полипептиды» охватывает полипептиды в форме зимогена, а также полипептиды, которые подверглись процессингу с образованием соответствующих биоактивных форм.

Употребляемый в тексте термин «PAI-1-родственные полипептиды» охватываетбез ограничения полипептиды, проявляющие, главным образом, равную или улучшенную биологическую активность по сравнению с человеческим PAI-1 дикого типа, а также полипептиды, биологическая активность которых является существенно модифицированной или сниженной относительно активности человеческого PAI-1 дикого типа. Такие полипептиды включаютбез ограничения PAI-1, который был модифицирован химическим путем, и варианты PAI-1, в которые были внесены специфические изменения аминокислотной последовательности, что привело к модификации или нарушению биоактивности полипептида.

Кроме того, термин охватывает полипептиды с незначительно модифицированной аминокислотной последовательностью, например полипептиды с модифицированной N-концевой частью, включая делеции или добавления аминокислот в N-концевой части полипептидов, и/или полипептиды, которые представляют собой химические модификации PAI-1 человека.

PAI-1-родственные полипептиды, которые включают в себя варианты PAI-1, проявляющие биологическую активность, в основном равную или улучшенную биологическую активность по сравнению с активностью PAI-1 дикого типа, или которые в качестве альтернативы имеют в основном модифицированную или сниженную биоактивность по сравнению с активностью PAI-1 дикого типа, включают в себябез ограничения полипептиды с аминокислотной последовательностью, которая отличается от последовательности PAI-1 дикого типа включением, делецией или заменой одной или более аминокислот.

PAI-1-родственные полипептиды, включающие варианты, охватывают такие полипептиды, которые проявляют по крайней мере приблизительно 10%, по крайней мере приблизительно 20%, по крайней мере приблизительно 30%, по крайней мере приблизительно 40%, по крайней мере приблизительно 50%, по крайней мере приблизительно 60%, по крайней мере приблизительно 70%, по крайней мере приблизительно 80%, по крайней мере приблизительно 90%, по крайней мере приблизительно 100%, по крайней мере приблизительно 110%, по крайней мере приблизительно 120% и, по крайней мере приблизительно 130% удельной активности PAI-1 дикого типа, который продуцируется в клетках такого же типа, причем приведенные данные получены в результате исследований с помощью анализа активности PAI-1, приведенного в настоящем описании.

PAI-1-родственные полипептиды, включающие варианты, которые обладают равной с PAI-1 дикого типа биологической активностью или улучшенной активностью по сравнению с PAI-1 дикого типа, охватывают полипептиды, которые проявляют по крайней мере приблизительно 25%, предпочтительно, по крайней мере приблизительно 50%, более предпочтительно, по крайней мере приблизительно 75%, более предпочтительно, по крайней мере приблизительно 100%, более предпочтительно, по крайней мере приблизительно 110%, более предпочтительно, по крайней мере приблизительно 120% и наиболее предпочтительно, по крайней мере приблизительно 130% удельной биологической активности человеческого PAI-1 дикого типа, который продуцируется в клетках такого же типа, причем приведенные данные получены в результате одного или более из анализов удельной активности PAI-1, как описано. В описании изобретения отмечено, что биологическая активность PAI-1 может быть оценена количественно путем измерения способности препарата ингибировать tPA-опосредованный фибринолиз, или плазмин-опосредованный фибринолиз, например, как описано в данном тексте. В обоих анализах биологическую активность выражают как снижение времени фибринолиза по сравнению с контрольным образцом. В качестве альтернативы биологическая активность PAI-1 может быть количественно оценена путем измерения степени ингибирования амидолитической активности tPA, произведенного с помощью PAI-1 и/или эквивалента PAI-1, как описано, например, в публикации Chandler et al., Clinical Chemistry, 35 (5) 787-793 (1989), или с помощью иммуноферментного анализа функционального PAI-1 человека (HPAIKT, молекулярные инновации) или других анализов, известных в данной области.

PAI-1-родственные полипептиды, включающие варианты, которые обладают в основном сниженной биологической активностью по сравнению с активностью PAI-1 дикого типа, представляют собой полипептиды, которые проявляют приблизительно менее 25%, предпочтительно менее 10%, более предпочтительно менее 5% и наиболее предпочтительно менее 1% удельной активности PAI-1 дикого типа, который продуцируется в клетках такого же типа, причем приведенные данные получены в результате исследований с помощью одного или более из анализов удельной активности PAI-1, как описано выше.

Неограничивающие примеры эквивалентов PAI-1 включают в себя эквиваленты PAI-1, описанные, например, в патенте США № 6103498.

В некоторых аспектах PAI-1 представляет собой эквиваленты PAI-1, у которых отношение между активностью указанного полипептида PAI-1 и активностью нативного человеческого PAI-1 (PAI-1 дикого типа) составляет по крайней мере приблизительно 1,25, когда исследования проводят с помощью «анализа PAI-1» (Chandler et al., Clinical Chemistry, 35 (5) 787-793 (1989) см. выше); в других аспектах отношение составляет по крайней мере приблизительно 2,0; в следующих аспектах отношение составляет по крайней мере приблизительно 4,0.

PAI-1-родственные полипептиды также включают в себя фрагменты PAI-1 или фрагменты полипептидов, родственных PAI-1, сохраняющие характерную, связанную с гемостазом активность. Связанная с гемостазом активность полипептида PAI-1 может быть измерена, например, с помощью анализа активности PAI-1, описанного в данном тексте.

Определения

В настоящем контексте использовали трехбуквенные или однобуквенные обозначения аминокислот в их обычном значении, как указано в таблице 1. Если не указано иное, то упоминаемые в тексте аминокислоты являются L-аминокислотами. Следует понимать, что первая буква, например, в обозначении К337 представляет аминокислоту, которая по природе находится в указанном положении молекулы фактора VII дикого типа и что, например, [К337А]-FVIIa означает FVII-вариант, где аминокислота, представленная однобуквенным кодом «К», по природе находящаяся в указанном положении, заменена на аминокислоту, представленную однобуквенным кодом «А».

Таблица 1
Сокращения аминокислотАминокислотаТрехбуквенный кодОднобуквенный кодГлицинGlyGПролинProPАланинAlaAВалинValVЛейцинLeuLИзолейцинIleIМетионинMetMЦистеинCysCФенилаланинPheFТирозинTyrYТриптофанTrpWГистидинHisH ЛизинLysKАргининArgRГлутаминGlnQАспарагинAsnNГлутаминовая кислотаGluEАспарагиновая кислотаAspD

Термин «фактор VIIa» или «FVIIa» может быть взаимозаменяемым.

В этом контексте термин «пациенты с ослабленной способностью к образованию тромбина» означает пациентов, у которых невозможно полное образование тромбина на активированной поверхности тромбоцитов, и, кроме того, термин также включает в себя пациентов, у которых тромбин образуется в меньшей степени, чем у пациентов с полностью функционирующей нормальной системой гемостаза, включая нормальное количество факторов свертывания, тромбоцитов и фибриногена и их функцию в норме (например, как в объединенной плазме человека в норме), и включаетбез ограничения пациентов, у которых отсутствует фактор VIII; пациентов с пониженным числом тромбоцитов или пациентов с нарушением функции тромбоцитов (например, тромбоцитопения или тромбастения Гланцмана или пациенты с обширными кровотечениями); пациентов с пониженными уровнями протромбина, FX или FVII; пациентов с пониженным уровнем некоторых факторов свертывающей системы (например, вследствие чрезмерного кровотечения в результате травмы или обширной операции), и пациентов с пониженными концентрациями фибриногена в плазме (например, у пациентов, претерпевших многократные переливания крови).

Под «уровнем образования тромбина» или «нормальным образованием тромбина» подразумевают уровень образования тромбина у больного, сравненный с уровнем образования тромбина у здоровых лиц. Уровень обозначают как процент от нормального уровня. Термины могут, где уместно, быть взаимозаменяемы.

Термин «улучшение гемостатической системы» означает повышение способности к образованию тромбина. Термин «улучшенный гемостаз» охватывает случаи, когда процесс образования тромбина тестируемого образца, содержащего препарат фактора VII или родственного фактору VII полипептида и препарат PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида, продливается по времени по сравнению с образованием тромбина контрольного образца, содержащего только фактор VII или родственный фактору VII полипептид или PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид соответственно при условии, что исследования проводят с помощью такого же анализа образования тромбина. Образование тромбина может быть проанализировано, как описано в анализе образования тромбина настоящего изобретения (см. часть "анализы").

"Единственные" агенты или факторы, используемые в данном изобретении, имеют отношение к тем случаям, когда фактор VII или родственный фактору VII полипептид и PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид, взятые вместе, являются единственными гемостатическими агентами, или активными гемостатическими агентами, или факторами свертывающей системы, содержащимися в фармацевтической композиции или наборе, или являются единственными гемостатическими агентами, или активными гемостатическими агентами или факторами свертывающей системы, которые вводят больному в ходе индивидуального лечения, такого как, например, индивидуальное лечение кровотечения. Следует понимать, что такие случаи охватывают такие ситуации, когда другие гемостатические агенты или факторы свертывающей системы, которые обычно применяют, не присутствуют в достаточном количестве или не имеют достаточной активности, чтобы в значительной степени влиять на один или более параметров свертывания крови.

Время фибринолиза, прочность сгустка, образование фибринового сгустка и время свертывания крови являются клиническими параметрами, применяемыми для характеристики состояния гемостатической системы больного. Образцы крови берут у больного при подходящих интервалах времени, и измерения одного или более параметров проводят известными способами, например, тромбоэластографией, как описано в публикациях Meh et al., Blood Coagulation & Fibrinolysis 2001, 12:627-637; Vig et al., Hematology, Vol. 6 (3) pp. 205-213 (2001); Vig et al., Blood coagulation & fibrinolysis, Vol. 12 (7) pp. 555-561 (2001) Oct; Glidden et al., Clinical and applied thrombosis/hemostasis, Vol. 6 (4) pp. 226-233 (2000) Oct; McKenzie et al., Cardiology, Vol. 92 (4) pp. 240-247 (1999) Apr; или Davis et al., Journal of the American Society of Nephrology, Vol. 6 (4) pp. 1250-1255 (1995).

Термин «увеличение времени фибринолиза» охватывает случаи, когда измеряемое время растворения сгустка для тестируемого образца, содержащего препарат фактора VII или родственного фактору VII полипептида и препарат PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида, увеличивается по сравнению с характерным временем растворения сгустка контрольного образца, содержащего только фактор VII или родственный фактору VII полипептид или PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид, соответственно, при условии, что исследования проводят с помощью такого же анализа растворения сгустка. Время растворения сгустка может быть определено, как описано выше.

Термин "повышение прочности сгустка" охватывает случаи, когда измеряемая прочность сгустка, например механическая прочность, для тестируемого образца, содержащего препарат фактора VII или родственного фактору VII полипептида и препарат PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида, повышается относительно характерной прочности сгустка контрольного образца, содержащего только фактор VII или родственный фактору VII полипептид или PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид соответственно, при условии, что исследования проводят с помощью такого же анализа прочности сгустка. Прочность сгустка может быть определена, как описано, например, в публикации Carr et al., 1991. (Carr ME, Zekert SL. Measurement of platelet-mediated force development during plasma clot formation. AM. J. MED. SCI. 1991, 302:13-8), или как описано выше, то есть с помощью тромбоэластографии.

Термин «повышение способности к образованию фибринового сгустка» охватывает случаи, когда измеряемая скорость или степень образования сгустка тестируемого образца, содержащего препарат фактора VII или родственного фактору VII полипептида и PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида, повышается по сравнению с характерной скоростью или степенью образования фибринового сгустка контрольного образца, содержащего только фактор VII или родственный фактору VII полипептид или PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид соответственно, при условии, что исследования проводят с помощью такого же анализа свертывания крови. Образование фибринового сгустка может быть измерено, как описано выше.

Термин "сокращение времени свертывания крови" охватывает случаи, когда измеряемое время образования сгустка (время свертывания) тестируемого образца, содержащего препарат фактора VII или родственного фактору VII полипептида и препарат PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида, сокращается относительно характерного времени свертывания контрольного образца, содержащего только фактор VII или родственный фактору VII полипептид или PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид соответственно, при условии, что исследования проводят с помощью такого же анализа свертывания крови. Время свертывания крови может быть измерено с помощью стандартных PT og aPTT анализов, которые широко известны специалистам в данной области.

Термин «пониженное число тромбоцитов или уменьшенная активность тромбоцитов» относится к количеству тромбоцитов (тромбоциты), имеющихся в плазме пациента, и к биологической связанной со свертыванием активности таких тромбоцитов. Уменьшение числа тромбоцитов может быть вследствие, например, повышения деструкции тромбоцитов, уменьшения образования тромбоцитов и объединения фракции тромбоцитов больше, чем нормальная фракция тромбоцитов в селезенке. Тромбоцитопению, например, определяют как число тромбоцитов менее чем 150000 тромбоцитов на микролитр; верхний предел нормального числа тромбоцитов находится обычно между 350000 и 450000 тромбоцитов на микролитр. Число тромбоцитов можно измерить с помощью автоматических счетчиков тромбоцитов, то есть хорошо известным для специалистов способом. Синдромы как следствие снижения числа тромбоцитов включают в себябез ограничения тромбоцитопению, коагулопатию. «Активность» включает в себябез ограничения агрегационную, адгезивную и свертывающую активность тромбоцитов. Снижение активности может быть обусловлено, например, изменениями гликопротеинов, аномальным взаимодействием мембраны и цитоскелета, изменениями гранул тромбоцитов, изменениями свертывающей активности тромбоцитов, изменениями сигнала трансдукции и секреции. Активность тромбоцитов, включающая агрегационную, адгезивную и свертывающую активность, измеряют стандартными способами, известными квалифицированному специалисту, см., например, публикации Platelets. A Practical Approach, Ed. S.P. Watson & K.S.Authi: Clinical Aspects of Platelet Disorders (K.J.Clemetson) 15:299-318, 1996, Oxford University Press; Williams Hematology, Sixth Edition, Eds. Beutler, Lichtman, Coller, Kipps & Seligsohn, 2001, McGraw-Hill. Синдромы, обусловленные снижением активности тромбоцитов, включают в себябез ограничения тромбастению Гланцмана, синдром Бернара-Сулье, лечение противосвертывающим средством и лечение тромболитическим средством. Термин «пониженный» относится к числу тромбоцитов или активности тромбоцитов в образце тестируемой плазмы по сравнению с числом тромбоцитов и активностью тромбоцитов в образце объединенной плазмы в норме, когда исследования проводят с помощью такого же анализа.

Употребляемый в тексте термин «расстройство, сопровождающееся кровотечением» отражает любой дефект, врожденный, приобретенный или индуцированный, клеточного или молекулярного происхождения, выражающийся случаями кровотечения. Примеры расстройств, сопровождающихся кровотечением, включают в себя, но не ограничиваются ими, недостаточность факторов свертывания крови (например, недостаточность факторов свертывания VIII, IX, XI или VII), ингибирование факторов свертывания, нарушение функции тромбоцитов (например, тромбастению Гланцмана и синдром Бернара-Сулье), тромбоцитопению, болезнь Виллебранда и коагулопатию, такую, которая вызвана разбавлением белков свертывающей системы, повышенным фибринолизом и пониженным числом тромбоцитов вследствие кровотечений и/или переливаний крови (например, у пациентов, подвергаемых многократным переливаниям крови вследствие перенесенной операции или травмы).

Кровотечение относится к экстравазации крови из любого компонента системы циркуляции крови. Термин "случаи кровотечения" подразумевает включить нежелательное, неконтролируемое и часто чрезмерное кровотечение в связи с операцией, травмой или другими видами повреждения ткани, а также нежелательные кровотечения у пациентов с расстройствами, сопровождающимися кровотечением. Случаи кровотечения могут иметь место у пациентов, у которых свертывающая система находится в основном в норме, но которые испытывают (временную) коагулопатию, а также у пациентов с врожденными или приобретенными расстройствами свертывания или расстройствами, сопровождающимися кровотечением. У пациентов с нарушением функции тромбоцитов кровотечения можно сравнить с кровотечениями, вызванными гемофилией, поскольку гемостатическая система, как при гемофилии, отсутствует или имеет аномальные существенные "соединения" свертывания крови (например, тромбоциты или белковый фактор Виллебранда). У пациентов, имеющих значительное повреждение ткани, например, в связи с операцией или существенной травмой, при потребности в незамедлительной остановки кровотечения может быть ослаблен нормальный механизм гемостаза, и у таких пациентов может возникнуть чрезмерное кровотечение несмотря на то, что в основном (до операции и до травмы) гемостаз у них осуществлялся по нормальному механизму. У таких пациентов, которые также часто претерпевают многократные переливания крови, возникает (временная) коагулопатия в результате кровотечения и/или переливаний крови (т.е. разбавление белков свертывающей системы, повышенный фибринолиз и пониженное количество тромбоцитов вследствие кровотечения и/или переливаний крови). Кровотечения также могут возникать в органах, таких как мозг, область внутреннего уха и глаза; указанные органы являются областями с ограниченными возможностями для гемостаза хирургическим путем, и поэтому достижение удовлетворительного гемостаза является проблематичным. Подобные проблемы могут возникать в процессе взятия биопсий из различных органов (печени, легких, опухолевой ткани, желудочно-кишечного тракта), а также при лапароскопической операции и радикальной залобковой простатэктомии. Общим фактором для всех указанных случаев является трудность достижения гемостаза с помощью хирургической техники (хирургические швы, зажимы и т.д.), а также в случае диффузного кровотечения (например, геморрагический гастрит и массивное маточное кровотечение) сталкиваются с такой же трудностью. Кровотечения также могут возникать у пациентов при антикоагулянтной терапии, у которых нарушение гемостаза вызвано данным лечением; указанные кровотечения часто являются резкими и обильными. Антикоагулянтную терапию часто назначают для предотвращения тромбоэмболического заболевания. Такая терапия может включать в себя применение гепарина, других видов протеогликанов, варфарина или других видов антагонистов витамина К, а также аспирина и других ингибиторов агрегации тромбоцитов, таких как, например, антитела или другие ингибиторы активности GP IIb/IIIa. Кровотечение также может быть обусловлено так называемой тромболитической терапией, которая включает в себя комбинированное лечение антитромбоцитарным средством (например, ацетилсалициловая кислота), антикоагулянтом (например, гепарин) и фибринолитическим средством (например, тканевой активатор плазминогена, tPA). Случаи кровотечений также включают в себябез ограничения случаи неконтролируемого и обильного кровотечения в связи с операцией или травмой у пациентов, которые страдают острыми гемартрозами (кровоизлияния в суставы), хронической гемофилической артропатией, гематомами (например, мышечные, забрюшинные, подъязычные и заглоточные), кровотечениями в других тканях, гематурией (кровотечение из мочевыводящих путей), внутримозговым кровоизлиянием, у пациентов, которые подвергаются операции (например, гепатэктомия), удалению зуба и которые страдают желудочно-кишечными кровотечениями (например, кровопотери в UGI). Случаи кровотечения могут быть связаны с ингибиторами фактора VIII; гемофилией А; гемофилией А и с ингибиторами; гемофилией В; недостаточностью фактора VII; недостаточностью PAI-1; тромбоцитопенией; недостаточностью фактора Виллебранда (болезнь Виллебранда); серьезным повреждением ткани; тяжелой травмой; операцией; лапароскопической операцией; геморрагическим гастритом; взятием биопсий; антикоагулянтной терапией; кровотечениями в верхнем отделе желудочно-кишечного тракта (UGI); или трансплантацией стволовой клетки. Случаями кровотечений могут быть профузное маточное кровотечение; кровотечение, возникающее в органах с ограниченной возможностью для достижения гемостаза механическим путем; возникающее в мозге; возникающее в области внутреннего уха или возникающее в глазах. Термины «случаи кровотечений» и «кровотечения» могут, когда уместно, быть взаимозаменяемыми.

В данном контексте термин «лечение» подразумевает включить в себя как предотвращение вероятного кровотечения, такого как, например, при операции, так и регулирование уже имеющегося кровотечения, такого как, например, при травме, с целью остановки или снижения до минимума кровотечения. Приведенный выше термин «вероятное кровотечение» может означать кровотечение, которое, вероятно, возникает в отдельной ткани или органе, или оно может быть точно не установленным кровотечением. Таким образом, термин «лечение» подразумевает введение с целью профилактики препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и препарат PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида.

Употребляемый в тексте термин "пациент" предназначен обозначить любое животное, в частности, млекопитающих, таких как человек, и может быть, когда уместно, заменен на термин "больной". Настоящее изобретение также охватывает применение фактора VII или FVII-родственных полипептидов и ингибиторов tPA в ветеринарии.

Фактор VII или родственные фактору VII полипептиды и PAI-1 или PAI-1-родственные полипептиды, как определено в настоящем описании, могут быть введены одновременно или последовательно. Факторы могут быть использованы в виде однократной лекарственной формы, где однократная лекарственная форма содержит оба фактора свертывания, или в виде набора компонентов, содержащего препарат фактора VII или родственного фактору VII полипептида в качестве первой стандартной лекарственной формы, и препарат PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида в качестве второй стандартной лекарственной формы. Всякий раз, когда в описании речь идет о первой или второй или третьей и т.д. стандартной дозе, при этом не указан предпочтительный порядок введения, то данные обозначения сделаны, главным образом, для удобства.

Под "одновременным" введением препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и препарата PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида подразумевают введение белковых факторов свертывания в однократной лекарственной форме или введение первого белкового фактора свертывания с последующим введением второго белкового фактора свертывания с интервалом времени введения не более 15 минут, предпочтительно 10, более предпочтительно 5, более предпочтительно 2 минуты. Любой фактор может быть введен первым.

Под "последовательным" введением подразумевают введение первого белкового фактора свертывания с последующим введением второго белкового фактора свертывания с интервалом времени введения вплоть до 2 часов, предпочтительно от 1 до 2 часов, более предпочтительно вплоть до 1 часа, более предпочтительно от 30 минут до 1 часа, более предпочтительно вплоть до 30 минут, более предпочтительно от 15 до 30 минут. Любая из двух стандартных лекарственных форм или белковых факторов свертывания, может быть введена первой. Предпочтительно оба продукта вводят одним и тем же внутривенным путем.

Под "уровнем PAI-1" или "PAI-1-уровнем" подразумевают уровень активности PAI-1 больного, сравненный с уровнем активности у здоровых лиц. Уровень обозначают как процент от нормального уровня. Термины могут, когда уместно, быть взаимозаменяемыми.

Под «снижением уровня PAI-1» или «сниженным уровнем PAI-1» подразумевают уменьшение количества или активности PAI-1 в кровотоке по сравнению со средним уровнем PAI-1 в популяции пациентов, не обладающих недостаточностью PAI-1 или ингибиторов PAI-1. Уровень циркулирующего PAI-1 может быть измерен с помощью анализа свертывания крови либо иммунологического анализа. Активность PAI-1 определяют по способности плазмы больного корректировать время свертывания плазмы с недостаточностью PAI-1 (например, анализ АРТТ, см. ниже; см. также часть «анализы» настоящего описания).

За одну единицу PAI-1 принимают количество PAI-1, находящегося в одном миллилитре нормальной (объединенной) плазмы человека (соответствующей 100% уровню PAI-1).

За одну единицу фактора VII принимают количество фактора VII, находящегося в 1 мл нормальной плазмы, соответствующей содержанию белка приблизительно 0,5 мкг белка. После активации 50 единиц соответствуют приблизительно 1 мкг белка.

Под «недостаточностью» подразумевают снижение количества или активности, например, PAI-1 в плазме по сравнению с количеством или активностью PAI-1 в плазме здоровых индивидуумов в норме. Термин может, когда уместно, быть заменим термином «сниженный уровень PAI-1».

Под "АРТТ" или "аРТТ" подразумевают частичное активированное тромбопластиновое время (описанное, например, в публикации, Proctor RR, Rapaport SI: The partial thromboplastin time with kaolin; a simple screening test for first-stage plasma clotting factor deficiencies. Am. J. Clin. Pathol. 36:212, 1961).

Под «синдромом, связанным с PAI-1» подразумевают синдром, когда введенный пациенту по необходимости экзогенный PAI-1 может предотвратить, излечить или улучшить любые симптомы, состояния или заболевания, возможные или уже имеющиеся, вызванные синдромом. Синдромы включают в себябез ограничения синдромы, вызванные снижением уровня PAI-1, например, связанные с кровотечением расстройства, вызванные ингибиторами PAI-1. Синдром, связанный с PAI-1, можно также лечить композицией согласно настоящему изобретению.

Под «синдромом, связанным с фактором VII» подразумевают синдром, когда введенный пациенту при необходимости экзогенный фактор VII, предпочтительно VIIa, может предотвратить, излечить или улучшить любые симптомы, состояния или заболевания, возможные или уже имеющиеся, вызванные синдромом. Синдромы включают в себя без ограничения синдромы, вызванные снижением уровня факторов свертывания VIII, IX, XI или VII, ингибиторов факторов свертывания, нарушением функции тромбоцитов (например, тромбастения Гланцмана и синдром Бернара-Сулье), тромбоцитопенией, болезнью Виллебранда и коагулопатией, которая вызвана разбавлением белков свертывающей системы, повышенным фибринолизом и снижением количества тромбоцитов вследствие кровотечений и/или переливаний крови (например, у пациентов, претерпевших многократные переливания крови после операции или травмы).

"Полупериод существования" относится ко времени, которое требуется для того, чтобы концентрация фактора VII или родственного фактору VII полипептида или PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида снизилась от данной величины до половины указанной величины.

Под "первичным гемостазом" подразумевают первоначальное образование тромбина под действием FXa и комплекса TF:фактора VIIa, последующую активацию тромбоцитов и образование первоначальной рыхлой "пробки" из активированных, плотно соединенных тромбоцитов, которая пока что не стабилизирована фибрином и, наконец, стабилизацию поперечно-связанным фибрином. Если "пробка" не стабилизируется фибрином, образованным на второй стадии гемостатического процесса (поддерживаемый гемостаз), она легко растворяется под действием фибринолитической системы.

Под «вторичным гемостазом» или «поддерживаемым гемостазом» подразумевают вторичное, полное и значительное образование тромбина в виде «вспышки», имеющее место на поверхности активированных тромбоцитов и катализируемое фактором VIIa и фактором VIIIa, последующее образование фибрина и стабилизацию первоначальной тромбоцитарной "пробки". Стабилизация "пробки" фибрином приводит к полному гемостазу.

Под "полным гемостазом" подразумевают образование стабильного и твердого фибринового сгустка или "пробки" на участке повреждения, который эффективно останавливает кровотечение и который нелегко растворяется под действием фибринолитической системы. В данном контексте термин гемостаз будет употребляться, чтобы представить полный гемостаз, как описано выше.

Общее количество белка в препарате можно измерить общеизвестными способами, например путем измерения оптической плотности. Количества PAI-1 или белкового фактора VII («антиген») можно измерить общеизвестными способами, такими как стандартные иммуноанализы Elisa. В общих чертах, такой анализ осуществляют путем взаимодействия, например, раствора препарата, содержащего белковый PAI-1, с антителом против тромбомодулина, иммобилизованным на пластине Elisa, последующего взаимодействия комплекса иммобилизованное антитело-PAI-1 со вторым антителом против PAI-1, несущим маркер, количества которого на третьей стадии измеряют. Количества каждого фактора свертывающей системы можно измерить подобным способом, используя соответствующие антитела. Общее количество белкового фактора свертывающей системы, присутствующего в препарате, определяют путем суммирования количеств индивидуальных белковых факторов свертывающей системы. В одном аспекте препарат содержит выделенный фактор свертывания. В другом аспекте препарат не содержит фактора II свертывания и фактора IIa свертывания (протромбин и тромбин) и/или фактора Х или Ха.

Употребляемый в тексте термин "выделенный" относится к факторам свертывающей системы крови, например, PAI-1 или родственным PAI-1 полипептидам, которые выделены из клетки, в которой они синтезируются, или из среды, в которой они обнаруживаются в природе (например, плазма или кровь). Отделение полипептидов от клетки, в которой они синтезируются, может быть достигнуто любым способом, известным в данной области, включаябез ограничения отделение среды культуры клеток, содержащей желаемый продукт, от прикрепленной культуры клеток; центрифугирование или фильтрацию для удаления неприкрепленных клеток и тому подобное. Выделение полипептидов из среды, в которой они по природе находятся, достигается любым способом, известным в данной области, включаябез ограничения аффинную хроматографию, такую как, например, на колонке с антителом против фактора VII или PAI-1 соответственно; гидрофобную хроматографию; ионообменную хроматографию; гель-хроматографию; электрофоретические процедуры (например, препаративное изоэлектрическое фокусирование (IEF)), дифференциальную растворимость (например, осаждение сульфатом аммония) или экстракцию и тому подобное.

В настоящем изобретении "эффективное количество" фактора VII или родственного фактору VII полипептида и PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида определяют как количество фактора VII или родственного фактору VII полипептида, например FVIIa, и PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида, которых вместе достаточно, чтобы предотвратить или снизить кровотечение или потерю крови с целью лечения, облегчения или частичного угнетения заболевания и его осложнений.

Термин «активность фактора VIIa» или «фактор VIIa-активность» включает в себя способность образовывать тромбин; термин также включает в себя способность образовывать тромбин на поверхности активированных тромбоцитов в отсутствие тканевого фактора.

Сокращения

TF тканевой фактор

FVII фактор VII в виде одноцепочечной, активированной формы

FVIIa фактор VII в его активированной форме

rFVIIa рекомбинантный фактор VII в его активированной форме

TAFI TAFI в его зимогенной неактивированной форме

PAI-1 ингибитор активатора плазминогена

Получение соединений:

Очищенный фактор VIIa человека, пригодный для использования в настоящем изобретении, предпочтительно получают методом рекомбинантных ДНК, например, описанным в публикации Hagen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2412-2416, 1986, или описанным в европейском патенте № 200421 (ZymoGenetics, Inc.).

Фактор VII также может быть получен способами, описанными в публикациях Broze and Majerus, J. Biol. Chem. 255 (4): 1242-1247, 1980 и Hedner and Kisiel, J. Clin. Invest. 71:1836-1841, 1983. Указанные способы позволяют получить препарат фактора VII без определяемых количеств других факторов свертывающей системы крови. Кроме того, препарат очищенного фактора VII может быть получен путем включения дополнительной гель-фильтрации в качестве конечной стадии очистки. Затем фактор VII превращают в активированный фактор VIIa известными способами, например, с помощью нескольких различных белков плазмы, таких как PAI-1Ia, IX или Xa. В качестве альтернативы, как описано в публикации Bjoern et al. (Research Disclosure, 269 September 1986, pp. 564-565), фактор VII может быть активирован путем пропускания его через ионообменную хроматографическую колонку, такую как Mono Q^® (Pharmacia fine Chemicals) или тому подобное.

Родственные фактору VII полипептиды можно получить путем модификации фактора VII дикого типа или рекомбинантной технологией. Родственные фактору VII полипептиды с измененной аминокислотной последовательностью по сравнению с последовательностью фактора VII дикого типа могут быть получены путем модификации последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор VII дикого типа, либо путем изменения кодонов, детерминирующих аминокислоты, или удаления некоторых из кодонов для аминокислот в молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей природный фактор VII, известными способами, например, сайт-специфическим мутагенезом.

Специалистам в данной области будет очевидно, что замены можно сделать вне участков, важных для функции фактора VIIa или молекулы PAI-1, и указанные замены приведут к образованию активного полипептида. Аминокислотные остатки, существенные для активности фактора VII или родственного фактору VII полипептида или PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида и поэтому предпочтительно не подвергаемые замене, могут быть идентифицированы согласно процедурам, известным в данной области, таким как сайтнаправленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (см., например, публикацию Cunningham and Wells, 1989, Science 244:1081-1085). В последнем способе мутации вносят у каждого положительно заряженного остатка в молекуле и полученные мутантные молекулы исследуют в отношении свертывающей соответственно поперечно-связывающей активности, чтобы идентифицировать аминокислотные остатки, существенные для активности молекулы. Участки фермент-субстратного взаимодействия также можно определить путем анализа трехмерной структуры такими способами, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография или фотоаффинное мечение (см., например, публикации de Vos et al., 1992, Science 255:306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224:899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309:59-64).

Введение мутации в последовательность нуклеиновой кислоты с целью замены одного нуклеотида на другой нуклеотид может быть осуществлено посредством сайт-направленного мутагенеза с помощью любого из известных в данной области способов. Наиболее применяемым является способ, в котором используют суперспиральный, двухцепочечный ДНК вектор с вставленными представляющими интерес праймерами и двумя синтетическими праймерами, включающими желаемую мутацию. Олигонуклеотидные праймеры, каждый из которых комплементарен противоположным цепям вектора, удлиняются в течение прохождения температурного цикла с помощью Pfu ДНК-полимеразы. При введении праймеров образуется мутированная плазмида, включающая в себя лишающие устойчивости одноцепочечные разрывы. После прохождения температурного цикла продукт обрабатывают посредством фермента DpnI, который является специфичным для метилированной и полуметилированной ДНК, чтобы переварить материнскую форму ДНК и выбрать синтезированную ДНК, включающую в себя мутации. Другие способы, известные в данной области для создания, идентификации и выделения вариантов, могут быть использованы, такие как, например, способы перестановки генов или воспроизведения фага.

Отделение полипептидов от клетки, в которой они синтезированы, может быть достигнуто любым способом, известным в данной области, включаябез ограничения отделение среды культуры клеток, содержащей желаемый продукт, от прикрепленной культуры клеток; центрифугирование или фильтрацию для удаления неприкрепленных клеток и тому подобное.

В случае необходимости фактор VII или родственные фактору VII полипептиды могут быть в дальнейшем очищены. Очистку осуществляют любым известным в данной области способом, включаябез ограничения аффинную хроматографию, такую как, например, колоночная хроматография с антителом к фактору VII (см., например, публикации Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261:11097, 1986 и Thim et al., Biochem. 27:7785, 1988); гидрофобную хроматографию; ионообменную хроматографию; гель-хроматографию; электрофоретические процедуры (например, препаративное электрофокусирование (IEF)), дифференциальную растворимость (например, осаждение сульфатом аммония) или экстракцию и тому подобное. См., в целом, Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York, 1982; и Protein Purification, J.C.Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989. После очистки препарат предпочтительно содержит менее 10 мас.%, более предпочтительно менее 5% и наиболее предпочтительно менее 1% продуктов, отличных от фактора VII или родственных фактору VII полипептидов, произведенных из клетки хозяина.

Фактор VII или родственные фактору VII полипептиды могут быть активированы посредством протеолитического расщепления, используя PAI-1Ia или другие протеазы, имеющие трипсиноподобную специфичность, такие как, например, фактор IXa, калликреин, фактор Xa и тромбин. См., например, публикации Osterud et al., Biochem. 11:2853 (1972); Thomas, патент США № 4456591 и Hender et al., J. Clin. Invest. 71:1836 (1983). В качестве альтернативы фактор VII или родственные фактору VII полипептиды могут быть активированы путем пропускания их через ионообменную хроматографическую колонку, такую как Mono Q^® (Pharmacia) или тому подобное. Таким образом, активированный фактор VII или родственные фактору VII полипептиды могут быть получены и введены, как описано ниже.

Для использования в настоящем изобретении PAI-1 может быть выделен, например, из тромбоцитов или эндотелиальных клеток согласно известным способам; однако предпочтительно использовать рекомбинантный PAI-1, чтобы избежать использования продуктов, произведенных из крови или ткани, которые несут в себе риск передачи заболевания. Способы выделения PAI-1 и получения рекомбинантного PAI-1 известны в данной области, см., например, публикацию Pannekoek et al., JOURNAL EMBO J. 5 (10), 2539-2544 (1986); Gils et al., Biochim. Biophys. Acta. 1998 Sep. 8; 1387 (1-2):291-7; Sul et al., Biochem. J. 1998 Apr 15; 331 (Pt. 2):409-15; Ginsburg et al., J. Clin. Invest., vol. 78, pp. 1673-1680 (1986) или патенты США № 6303338 и 6103498. Варианты PAI-1 могут быть получены способами сайт-направленного мутагенеза, как описано выше.

PAI-1-родственные полипептиды могут быть получены посредством модификации PAI-1 дикого типа или рекомбинантной технологии. PAI-1-родственные полипептиды, аминокислотная последовательность которых изменена относительно аминокислотной последовательности PAI-1 дикого типа, могут быть получены путем модификации последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей PAI-1 дикого типа, либо путем изменения кодонов, детерминирующих аминокислоты, либо путем удаления некоторых из кодонов для аминокислот в молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей природный PAI-1, известными способами, например, сайт-специфическим мутагенезом, как описано более подробно выше. Отделение полипептидов от клетки, в которой они синтезируются, может быть достигнуто любым способом, известным в данной области, включаябез ограничения отделение среды культуры клеток, содержащей желаемый продукт, от прикрепленной культуры клеток; центрифугирование или фильтрацию для удаления неприкрепленных клеток и тому подобное. Возможно, PAI-1 или PAI-1-родственные полипептиды могут быть в дальнейшем очищены. Очистку осуществляют любым известным в данной области способом, включаябез ограничения аффинную хроматографию, такую как, например, колоночная хроматография с антителом к PAI-1; гидрофобную хроматографию; ионообменную хроматографию; гель-хроматографию; электрофоретические процедуры (например, препаративное электрофокусирование (IEF)), дифференциальную растворимость (например, осаждение сульфатом аммония) или экстракцию и тому подобное, как описано более подробно выше. После очистки препарат предпочтительно содержит менее 10 мас.%, более предпочтительно менее 5% и наиболее предпочтительно менее 1% продуктов, отличных от PAI-1 или PAI-1-родственных полипептидов, произведенных из клетки хозяина. Активированный PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид затем может быть получен и введен, как описано ниже.

Как будет оценено специалистами в данной области, предпочтительно использовать полипептиды PAI-1 и полипептиды фактора VII, сингенные с пациентом, чтобы снизить риск возникновения иммунного ответа. Настоящее изобретение также охватывает применение таких полипептидов PAI-1 и полипептидов фактора VII в ветеринарии.

Фармацевтические композиции и способы их применения

Препараты согласно настоящему изобретению могут быть использованы для лечения какого-либо синдрома, связанного с фактором VII, такого как, например, расстройства, сопровождающиеся кровотечением, включая без ограничения синдромы, вызванные снижением уровня факторов свертывающей системы крови VIII, IX, XI или VII, ингибиторов факторов свертывающей системы крови, нарушением функции тромбоцитов (например, тромбастения Гланцмана и синдром Бернара-Сулье), тромбоцитопению, болезнь Виллебранда и коагулопатию, такую, которая вызвана разбавлением белков свертывающей системы, повышенным фибринолизом и пониженным количеством тромбоцитов вследствие кровотечений и/или переливаний крови (например, у пациентов, претерпевших многократные переливания крови после операции или травмы). Фармацевтические композиции, содержащие препарат фактора VII или родственного фактору VII полипептида и препарат PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида согласно настоящему изобретению, предназначены, главным образом, для парентерального введения с целью профилактического и/или терапевтического лечения. Предпочтительно фармацевтические композиции вводят парентерально, т.е. внутривенно, подкожно или внутримышечно; внутривенное введение является наиболее предпочтительным. Композиции также можно вводить с помощью непрерывной или прерывистой инфузии.

Фармацевтические композиции или препараты согласно изобретению содержат фактор VII или родственный фактору VII полипептид и PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид либо приготовленные в виде однократной, стандартной лекарственной формы или в виде набора компонентов, предпочтительно растворенные в фармацевтически приемлемом носителе, предпочтительно в водном носителе или разбавителе. Кратко, фармацевтические композиции, пригодные для использования согласно настоящему изобретению, получают смешиванием фактора VII или родственного фактору VII полипептида, или PAI-1, или фактора VII или родственного фактору VII полипептида в комбинации с PAI-1, предпочтительно в очищенном виде, с подходящими адъювантами и подходящим носителем или разбавителем. Может быть использован ряд водных носителей, таких как вода, забуференная вода, 0,4% солевой раствор, 0,3% глицин и тому подобное. Препараты согласно изобретению также могут быть составлены с использованием неводных носителей, например, в виде геля или в качестве липосомных препаратов для доставки к участкам повреждения или таргетирования указанных участков. Липосомные препараты описаны в основном в патентах США №№ 4837028, 4501728 и 4975282. Композиции могут быть стерилизованы подходящими, хорошо известными способами стерилизации. Полученные водные растворы могут быть упакованы для использования или отфильтрованы в асептических условиях и лиофилизированы, лиофилизированный препарат объединяют со стерильным водным раствором до введения.

Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества или адъюванты, включаябез ограничения агенты, регулирующие рН, и буферные агенты и агенты, регулирующие тонус, такие как, например, ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция и т.д.

Композиции также могут включать в себя один или более разбавителей, эмульгаторов, консервантов, буферов, наполнителей и т.д. и могут быть получены в виде жидкостей, порошков, эмульсий контролируемого высвобождения и т.д. Специалист в данной области может составить композиции согласно изобретению соответствующим образом и в соответствии с принятой практикой, как описано в публикации Remington^′s Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990. Таким образом, обычная фармацевтическая композиция для внутривенной инфузии должна быть составлена таким образом, чтобы она содержала 250 мл стерильного раствора Рингера и 10 мг препарата.

Композиции, содержащие препараты согласно настоящему изобретению, могут быть введены для профилактического и/или терапевтического лечения. В терапевтических целях композиции вводят пациенту, который уже страдает от заболевания, как описано выше, в количестве, достаточном для лечения, облегчения или частичной остановки клинических проявлений заболевания и его осложнений. Количество, достаточное для достижения таких результатов, определяют как «терапевтически эффективное количество». Эффективные количества для достижения каждой цели будут зависеть от тяжести заболевания или повреждения, а также веса и общего состояния пациента. Следует понимать, что определение соответствующей дозировки может быть осуществлено с помощью стандартного экспериментирования, создания матрицы величин и проверки разных точек в матрице.

Локальная доставка препаратов согласно настоящему изобретению, такая как, например, местное нанесение, может быть выполнена, например, посредством разбрызгивания, перфузии, двойных баллонных катетеров, стента, включенного в сосудистые трансплантаты или стенты, гидрогелей, применяемых для покрытия баллонных катетеров, или другими хорошо отработанными способами. В любом случае фармацевтическая композиция должна содержать количество препарата, достаточное для эффективного лечения состояния.

Концентрация фактора VII или родственного фактору VII полипептида, PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида, или фактора VII или родственного фактору VII полипептида в комбинации с PAI-1 или родственным PAI-1 полипептидом в данных композициях может значительно изменяться, т.е. от концентрации, составляющей менее приблизительно 0,5 мас.%, через концентрацию, составляющую обычно 1 мас.%, или по крайней мере приблизительно 1 мас.%, до концентрации, составляющей 15 или 20 мас.%, и будет выбрана, главным образом, исходя из объема жидкости, вязкости и т.д. в соответствии с отдельным выбранным способом введения. Введение посредством инъекции или инфузии, в частности инъекции, является предпочтительным. Таким образом, фактор VII или родственный фактору VII полипептид и PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид получают в виде препарата, подходящего для внутривенного введения, такого как препарат, который представляет собой либо растворенный лиофилизированный порошок или жидкую композицию, содержащую как фактор VII или родственный фактору VII полипептид, так и PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид в одной дозированной форме, либо растворенный лиофилизированный порошок или жидкую композицию, содержащую фактор VII или родственный фактору VII полипептид в одной дозированной форме и растворенный лиофилизированный порошок или жидкую композицию, содержащую PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид в другой дозированной форме.

Понятно, что количество фактора VII или родственного фактору VII полипептида и количество PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида вместе представляют собой суммарное эффективное количество для лечения случаев кровотечения.

Следует иметь в виду, что материалы настоящего изобретения могут в основном быть применены в случаях серьезного заболевания или повреждения, то есть угрожающих жизни или, возможно, угрожающих жизни случаях. В таких случаях ввиду сокращения до минимума посторонних веществ и общего отсутствия иммуногенности фактора VIIa и PAI-1 у человека, представляется возможным и даже желательным для лечащего врача ввести пациенту существенный избыток указанных композиций.

В целях профилактики композиции, содержащие препарат фактора VII или родственного фактору VII полипептида и препарат PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида, вводят пациенту, восприимчивому к заболеванию или повреждению, или в других случаях при риске заболевания или повреждения, чтобы повысить собственную способность пациента к свертыванию крови. Такое количество определяют как "профилактически эффективная доза". Понятно, что количество фактора VII или родственного фактору VII полипептида и количество PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида вместе представляет собой суммарное эффективное количество для предотвращения случаев кровотечения.

Однократные или многократные введения композиций могут быть выполнены при таких уровнях доз и режимах, которые выбраны лечащим врачом. Композиции могут быть введены один или более раз в день или в неделю. Эффективным количеством такой фармацевтической композиции является количество, которое способствует клинически значительному действию против случаев кровотечения. Такие количества будут зависеть отчасти от отдельного состояния, которое необходимо лечить, возраста, веса и общего здоровья пациента и других факторов, очевидных специалистам в данной области.

Композицию согласно изобретению обычно вводят в виде однократной дозы до возможного кровотечения или в начале кровотечения. Однако композицию можно вводить повторно (в виде многократных доз), предпочтительно с интервалами 2-4-6-12 часов в зависимости от данной дозы и состояния пациента.

Для лечения в связи с предупредительным вмешательством фактор VII или родственный фактору VII полипептид и PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид обычно вводят в течение приблизительно 24 часов до осуществления вмешательства и до 7 дней или более после него. Введение препарата в качестве коагулянта может быть выполнено с помощью ряда способов, приведенных в данном тексте.

Композиция может быть представлена в виде единого препарата (однократная лекарственная форма), содержащего оба препарата, а именно препарат фактора VII или родственного фактору VII полипептида и препарат PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида в подходящих концентрациях. Композиция также может быть представлена в виде набора компонентов, состоящего из первой стандартной лекарственной формы, содержащей препарат фактора VII или родственного фактору VII полипептида, и второй стандартной лекарственной формы, содержащей препарат PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида. В данном случае фактор VII или родственный фактору VII полипептид и PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид должны вводиться один за другим, предпочтительно в пределах приблизительно 15 минут друг от друга, например, в пределах 10 минут друг от друга или предпочтительно в пределах 5 минут или более предпочтительно в пределах 2 минут друг от друга. Любая из двух стандартных лекарственных форм может быть введена первой.

Набор включает в себя по крайней мере две отдельные фармацевтические композиции. Набор включает в себя емкости для содержания отдельных композиций, такие как разделенный флакон или разделенный пакет из фольги. Обычно набор включает в себя инструкции относительно введения отдельных компонентов. Применение набора является особенно благоприятным в случаях, когда отдельные компоненты предпочтительно вводят в различных дозированных формах, вводят при различных интервалах между дозами лекарственного средства или когда врачом предписано титрование индивидуальных компонентов комбинации.

Количество фактора VII или родственного фактору VII полипептида и количество PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида, вводимое согласно настоящему изобретению, может составлять от отношения приблизительно 1:100 до 100:1 (мас./мас.). Таким образом, отношение фактора VII к PAI-1 может быть, например, приблизительно 1:100, или 1:90, или 1:80, или 1:70, или 1:60, или 1:50, или 1:40, или 1:30, или 1:20, или 1:10, или 1:5, или 1:2, или 1:1, или 2:1, или 5:1, или 10:1, или 20:1, или 30:1, или 40:1, или 50:1, или 60:1, или 70:1, или 80:1, или 90:1, или 100:1, или приблизительно от 1:90 до 1:1, или приблизительно от 1:80 до 1:2, или приблизительно от 1:70 до 1:5, или приблизительно от от 1:60 до 1:10, или приблизительно от 1:50 до 1:25, или приблизительно от 1:40 до 1:30, или приблизительно от 90:1 до 1:1, или приблизительно от 80:1 до 2:1, или приблизительно от 70:1 до 5:1, или приблизительно от 60:1 до 10:1 или приблизительно 50:1 до 25:1, или приблизительно от 40:1 до 30:1.

Доза фактора VII или родственного фактору VII полипептида колеблется от дозы, которая соответствует приблизительно 0,05 мг, до дозы, соответствующей 500 мг/день фактора VII дикого типа, например, приблизительно от 1 мг до 200 мг/день, или, например, приблизительно от 5 мг до 175 мг/день для пациента весом 70 кг, причем доза может быть нагрузочной и поддерживающей дозой и может зависеть от веса пациента, состояния и тяжести заболевания.

Доза PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида колеблется от дозы, которая соответствует приблизительно 0,05 мг, до дозы, соответствующей 500 мг/день PAI-1 дикого типа, например, приблизительно от 1 мг до 200 мг/день, или, например, приблизительно от 5 мг до 175 мг/день для пациента весом 70 кг, причем доза может быть нагрузочной и поддерживающей дозой и может зависеть от веса пациента, состояния и тяжести заболевания.

Комбинация фактора VII или родственного фактору VII полипептида и PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида проявляет синергическое действие, когда исследования проводят in vitro с помощью анализа устойчивости сгустка и времени фибринолиза. Кроме того, комбинация фактора VII или родственного фактору VII полипептида и PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида проявляет синергическое действие при образовании стабильных фибриновых сгустков, увеличении полупериода фибринолиза, увеличении прочности сгустка и повышении устойчивости к фибринолизу.

Композиция может быть представлена в виде единого препарата, содержащего как фактор VII или родственный фактору VII полипептид, так и PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид в подходящих концентрациях. Композиция может быть представлена в виде набора, состоящего из первой стандартной лекарственной формы, содержащей фактор VII или родственный фактору VII полипептид, и второй стандартной лекарственной формы, содержащей PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид. В данном случае фактор VII или родственный фактору VII полипептид и PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид должны вводиться последовательно, предпочтительно в пределах 1-2 часов друг от друга, например в пределах 30 минут друг от друга или предпочтительно в пределах 10 минут, или более предпочтительно в пределах 5 минут друг от друга. Любая из двух стандартных лекарственных форм может быть введена первой.

Поскольку настоящее изобретение относится к предупреждению или лечению случаев кровотечения или к лечению нарушений свертывающей системы крови путем обработки комбинацией активных ингредиентов, которые можно вводить раздельно, изобретение также относится к объединению отдельных фармацевтических композиций в виде набора. Набор включает в себя, по крайней мере, две отдельные фармацевтические композиции. Набор включает в себя емкости для содержания отдельных композиций, такие как разделенный флакон или разделенный пакет из фольги. Обычно набор включает в себя инструкции относительно введения отдельных компонентов. Применение набора является особенно благоприятным в случаях, когда отдельные компоненты предпочтительно вводят в различных дозированных формах, вводят при различных интервалах между дозами лекарственного средства или когда врачом предписано титрование индивидуальных компонентов комбинации.

Анализы

Исследование активности фактора VIIa

Подходящий анализ для проверки активности фактора VIIa и, тем самым, выбора подходящих вариантов фактора VIIa можно провести в виде простого предварительного испытания in vitro:

Анализ посредством гидролиза in vitro

Нативный (дикий тип) фактор VIIa и вариант фактора VIIa (оба названы в тексте как "фактор VIIa") могут быть исследованы в отношении их удельной активности. Они могут быть исследованы параллельно для удобства сравнения их удельных активностей. Анализ проводят в титрационном микропланшете (MaxiSorp, Nunc, Denmark). Хромогенный субстрат D-Ile-Pro-Arg-п-нитроанилид (S-2288, Chromogenix, Sweden), конечная концентрация 1 мМ, добавляют к фактору VIIa (конечная концентрация 100 нМ) в 50 мМ буфере Hepes, рН 7,4, содержащем 0,1 М NaCl, 5 мМ CaCl₂ и 1мг/мл бычьего сывороточного альбумина. Абсорбцию измеряют при 405 нм постоянно в SpectraMax^TM 340 аппарате для считывания планшетов (Molecular Devices, USA). Величину абсорбции, развивающейся в течение 20-минутной инкубации, после вычитания абсорбции в контрольной лунке, не содержащей фермента, используют для расчета отношения между активностями варианта фактора VIIa и фактора VIIa дикого типа:

Отношение = (А_{405 нм} варианта фактора VIIa)/(А_{405 нм} фактора VIIa дикого типа)

На основании результатов данного расчета варианты фактора VIIa с активностью, сравнимой с активностью нативного фактора VIIa или выше указанной активности, могут быть идентифицированы, например, такие варианты, где отношение между активностью варианта и активностью нативного фактора VII (FVII дикого типа) составляет примерно выше 1,0.

Активность фактора VIIa или вариантов фактора VIIa можно измерить с использованием физиологического субстрата, такого как фактор Х, соответствующим образом при концентрации 100-1000 нМ, где образованный фактор Ха измеряют после добавления подходящего хромогенного субстрата (например, S-2765). Кроме того, анализ активности можно выполнять при физиологической температуре.

Анализ посредством протеолиза in vitro

Нативный (дикий тип) фактор VIIa и вариант фактора VIIa (оба названы в тексте как "фактор VIIa") исследуют параллельно для удобства сравнения их удельных активностей. Анализ проводят в титрационном микропланшете (MaxiSorp, Nunc, Denmark). Фактор VIIa (10 нМ) и фактор Х (0,8 микроМ) в 100 микролитрах 50 мМ буфера Hepes, рН 7,4, содержащего 0,1 М NaCl, 5 мМ CaCl₂ и 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, инкубируют в течение 15 минут. Затем останавливают реакцию расщепления фактора Х путем добавления 50 микролитров 50 мМ буфера Hepes, рН 7,4, содержащего 0,1 М NaCl, 20 мМ ЭДТА_{и 1мг/мл бычьего сывороточного альбумина. Количество образованного фактора Ха измеряют путем добавления хромогенного субстрата Z-D-Arg-Gly-Arg-п-нитроанилида (S-2765, Chromogenix, Sweden), конечная концентрация 0,5 мМ. Абсорбцию измеряют при 405 нм постоянно в аппарате SpectraMax^TM 340 для считывания планшетов (Molecular Devices, USA). Величину абсорбции, развивающейся в течение 10 минут, после вычитания абсорбции в контрольной лунке, не содержащей FVIIa, используют для расчета отношения между протеолитическими активностями варианта фактора VIIa и фактора VIIa дикого типа:}

Отношение = (А_{405 нм} варианта фактора VIIa)/(А_{405 нм} фактора VIIa дикого типа)

На основании результатов данного расчета варианты фактора VIIa с активностью, сравнимой с активностью нативного фактора VIIa или выше указанной активности, могут быть идентифицированы, например, такие варианты, где отношение между активностью варианта и активностью нативного фактора VII (FVII дикого типа) составляет примерно выше 1,0.

Анализ образования тромбина

Способность фактора VII или родственных фактору VII полипептидов или PAI-1 или родственных PAI-1 полипептидов (например, вариантов) образовывать тромбин можно измерить с помощью анализа, включающего в себя применение всех значимых факторов и ингибиторов свертывающей системы крови при физиологических концентрациях и применение активированных тромбоцитов (как описано в публикации p. 543 in Monroe et al. (1997) Brit. J. Haemotol. 99, 542-547, которая включена в данный текст в виде ссылки).

Проверка активности PAI-1

Проверку активности PAI-1 и, тем самым, выбор соответствующих вариантов PAI-1 для использования в настоящем изобретении можно осуществить с помощью простого испытания in vitro, как описано в публикации Chandler et al., Clinical Chemistry, 35 (5) 787-793 (1989), или с помощью других анализов, известных в данной области («анализ PAI-1»).

Настоящее изобретение также иллюстрируют следующими примерами, которые, однако, не рассматриваются как ограничивающие объем защиты. Характерные особенности, представленные в вышеприведенном описании и в следующих примерах, могут как отдельно, так и в любой их комбинации быть привлечены для осуществления изобретения в его многообразных формах.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Улучшение гемостатической стабильности сгустка посредством комбинирования факторов свертывающей системы крови VIIa и PAI-1

МЕТОДЫ:

Анализ растворения сгустка: Нормальную плазму человека, разбавленную в 10 раз буфером (20 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl₂, pH 7,4), содержащим инновин (Dade Behring, 2000-кратное разведение), rFVIIa (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark; различные концентрации) и t-PA (American Diagnostics, 8 нМ), добавляли к 96-луночным планшетам ELISA и измеряли мутность при 650 нм в течение времени при комнатной температуре. Где указано, добавляли очищенный PAI-1 человека (American Diagnostica, различные концентрации).

Ротационная тромбоэластография (roTEG): Измерения проводили с использованием цитратной, нормальной плазмы человека или плазмы с недостаточностью фактора VIII (George King Bio-Medical, Inc. #0800) с добавленным 5 нМ t-PA, и действие добавления 1 нМ фактора FVIIa только или в комбинации с 30 нМ PAI-1 анализировали. Свертывание инициировали путем добавления инновина (конечная концентрация 2000-кратное разведение, Dade Behring # 526945) и кальция (конечная концентрация 15 мМ) в 20 мМ буфере HEPES, 150 мМ NaCl, pH 7,4.

РЕЗУЛЬТАТЫ:

Анализ растворения сгустка: Добавление фактора FVIIa приводило к дозозависимому увеличению времени растворения сгустка (Фиг.1). Данное действие было оптимальным при 10 нМ FVIIa. В присутствии 10 нМ FVIIa добавление PAI-1 приводило к дальнейшему увеличению времени растворения сгустка (Фиг.2). Действие было дозозависимым и оптимальным 10 нМ PAI-1.

Тромбоэластография: roTEG измерения были применены для исследования влияния комбинирования FVIIa и PAI-1 на максимальную стабильность сгустка (MCF), а также на устойчивость сгустков к растворению, опосредованному t-PA. Измерения проводили как в нормальной человеческой плазме, так и в плазме с недостаточностью FVIII. До добавления FVIIa/PAI-1 размер сгустка при максимальной стабильности (MCF) составлял 25 мм и 4 мм, и полупериод растворения сгустка был 12,3 минуты и 14,3, в нормальной плазме и плазме при гемофилии соответственно (Фиг.3 и 4). В нормальной человеческой плазме добавление PAI-1 (30 нМ) не изменило MCF, но увеличило полупериод растворения сгустка до 16, 1 минуты (Фиг.3). В плазме при гемофилии добавление PAI-1 только привело к увеличению MCF до 5 мм и увеличению полупериода растворения сгустка до 32,4 мин. (Фиг.4). Добавление FVIIa (1 нМ) приводило к защите сгустка от фибринолиза, опосредованного t-PA (полупериод растворения сгустка 16,7 мин) без какого-либо влияния на MCF в нормальной плазме (Фиг.3), в то время как добавление FVIIa к плазме при гемофилии приводило к защите сгустка от фибринолиза (полупериод растворения сгустка 21,3 мин.) и значительному увеличению величины MCF (15 мм) (Фиг.4). Однако добавление FVIIa вместе с PAI-1 увеличивало полупериод растворения сгустка до 29,8 мин и 45 мин и величину MCF до 27,4 мм и 16,9 мм в нормальной плазме и плазме при гемофилии соответственно.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ:

Полученные результаты показывают, что добавление FVIIa и PAI-1 к плазме синергическим образом улучшает механическую прочность и устойчивость к фибринолизу.

Настоящая группа изобретений относится медицине и раскрывает композиции, содержащие фактор VII или родственный фактору VII полипептид и PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид, и к применению композиции для лечения случаев кровотечения. Изобретение раскрывает способ лечения случаев кровотечения у пациента, способ снижения времени свертывания у пациента, способ усиления гемостаза у пациента, способ увеличения времени фибринолиза у пациента, способ повышения прочности сгустков у субъекта, набор, предназначенный для лечения приступов кровотечения. Изобретение обеспечивает создание композиций, которые могут эффективно использованы для лечения или профилактики случаев кровотечения и нарушений свертывания крови; создание композиций в виде однократной стандартной лекарственной формы, которая может быть эффективно использована для лечения или профилактики случаев кровотечения или в качестве прокоагулянта; создание композиций, способов лечения или наборов, применение которых способствует проявлению синергического эффекта; создание композиций, способов лечения и наборов, не имеющих существенных побочных эффектов, таких как высокий уровень системной активации системы свертывания крови. 10 н. и 43 з.п. ф-лы, 4 ил.

1. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество фактора VII или родственного фактору VII полипептида и ингибитор активатора плазминогена (PAI-1) или PAI-1-родственный полипептид.2. Композиция по п.1, где указанным фактором VII или родственным фактору VII полипептидом является родственный фактору VII полипептид.3. Композиция по п.2, где указанным родственным фактору VII полипептидом является вариант аминокислотной последовательности фактора VII.4. Композиция по п.2, где отношение между активностью указанного родственного фактору VII полипептида и активностью нативного фактора Vila человека (FVIIa дикого типа) составляет по крайней мере приблизительно 1,25, когда исследования проводят с помощью анализа посредством гидролиза in vitro, как описано в настоящем описании.5. Композиция по п.1, где указанным фактором VII или родственным фактору VII полипептидом является фактор VII.6. Композиция по п.5, где указанным фактором VII является фактор VII человека.7. Композиция по п.6, где указанным фактором VII является рекомбинантный фактор VII человека.8. Композиция по п.1, где указанный фактор VII или родственный фактору VII полипептид находится в его активированной форме.9. Композиция по п.8, где указанным фактором VII является рекомбинантный фактор VIIa человека.10. Композиция по п.1, где указанным PAI-1 или родственным PAI-1 полипептидом является PAI-1-родственный полипептид.11. Композиция по п.10, где указанным родственным PAI-1 полипептидом является вариант аминокислотной последовательности PAI-1.12. Композиция по п.10, где отношение между активностью указанного родственного PAI-1 полипептида и активностью нативного PAI-1 человека (PAI-1 дикого типа) составляет по крайней мере приблизительно 1,25, когда исследования проводят с помощью анализа PAI-1, как описано в настоящем описании.13. Композиция по п.1, где указанным PAI-1 или родственным PAI-1 полипептидом является полипептид PAI-1.14. Композиция по п.13, где указанным PAI-1 является PAI-1 человека.15. Композиция по п.14, где указанным PAI-1 является рекомбинантный PAI-1 человека.16. Композиция по п.15, где указанный PAI-1 находится в активированной конформации.17. Композиция по п.1, где указанный фактор VII или родственный фактору VII полипептид и указанный PAI-1 или PAI-1-родственный полипептид присутствуют в отношении по массе приблизительно от 100:1 до 1:100 (мас./мас. фактор VII: PAI-1).18. Композиция по любому из пп.1-17, где композиция также содержит фармацевтически приемлемые наполнители, подходящие для инъекции или инфузии, в частности, инъекции.19. Набор компонентов для лечения случаев кровотечения, содержащий

f) эффективное количество препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и фармацевтически приемлемый носитель в первой стандартной лекарственной форме;

g) эффективное количество препарата PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида и фармацевтически приемлемый носитель во второй стандартной лекарственной форме; и

h) емкости, вмещающие указанную первую и вторую лекарственные формы.

a) эффективное количество фактора VII или родственного фактору VII полипептида и эффективное количество PAI-1 или родственного PAI-1 полипептида и фармацевтически приемлемый носитель в одной стандартной лекарственной форме; и

b) емкости, вмещающие указанную одну стандартную лекарственную форму.