Антикоагулянтный, антитромбоцитарный и фибриндеполимеризационный комплекс на основе гепарина, способ его получения и применение Российский патент 2017 года по МПК A61K31/727 A61K31/195 A61P7/00 

Описание патента на изобретение RU2606836C2

Изобретение относится к медицине и фармакологии и касается создания средств на основе гепарина, обладающих антикоагулянтным, антитромбоцитарным, фибриндеполимеризационным действием на организм.

Наиболее часто в медицине в качестве антикоагулянтных средств используются препараты на основе гепарина и его производных.

Гепарин является естественным противосвертывающим фактором и относится к антикоагулянтам прямого действия, т.е. непосредственно влияет на факторы свертывания крови. Гепарин обладает не только антикоагулянтным действием, но в некоторой степени может активировать фибриндеполимеризационные свойства крови и улучшать коронарный кровоток. [Клиническая биохимия / под ред. В.А. Ткачука. 2-е изд., испр. и доп. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. 512 с.].

Противосвертывающее действие гепарина проявляется in vitro и in vivo при внутривенном, внутримышечном и подкожном его введении. Гепарин действует быстро, но относительно кратковременно.

Гепарин применяют при профилактике и терапии различных тромбоэмболических заболеваний и их осложнений. Однако ему присущ ряд отрицательных свойств, таких как тромбоцитопения и аллергические реакции немедленного типа (крапивница, ангионевротический отек или бронхоспазм), при передозировке - возможность развития геморрагии.

Известны антикоагулянтные средства животного происхождения, представляющие собой фрагмент коллагена с М.М. около 12 кДа, содержащий 10,0-12,0% углеводов, 6,0-7,5% сульфатных групп, микро- и макроэлементы [патент РФ №2302250, А61К 35/56, 2007.07.10].

Известно антикоагулянно-фибринолитическое средство, включающее пептид "Семакс" и гепарин, описанный в патент РФ №2138289 (А61К 31/725, 1999.09.27). Наименование пептида "Семакс" утверждено решением Фармакологического комитета МЗ РФ от 11.11.93.

Указанные средства обладают иным механизмом антикоагулянтного действия, чем механизм действия гепарина, однако способ получения их сложен и длителен и, кроме того, антитромбоцитарное и антикоагулянтное действие их недостаточно.

Гепарин часто используют в сочетании с ферментными фибринолитическими препаратами.

Известно антикоагулянтно-фибринолитическое средство комплекса высокомолекулярного гепарина с протеолитическим ферментом тромбином. Препарат эффективен лишь при внутривенном и внутримышечном введениях. Небольшая длительность действия препарата - 1,5-2 часа и наличие побочных эффектов не позволяют его широко использовать в медицинской практике [Ж. "Биохимия животных и человека", "Неферментативный фибринолиз". Ляпина Л.А. и др., г. Киев 1982, №6, с. 64-73].

Известна терапевтическая композиция, обладающая антикоагулянтной активностью, на основе комплексов гепарина с веществами, усиливающими антикоагулянтное действие, в частности с аминокислотами, такими как аспарагиновая, антраниловая, р-аминобензойная, а также с глицином, валином, и β-аланином [Патент США №3577534, кл. C08B 3 7/10.1971. 05. 04].

К недостаткам известной композиции следует отнести отсутствие фибринолитических и антитромбоцитарных свойств получаемых продуктов.

Известен тромболитический комплекс гепарина с ферментом трипсином, взятых в соотношении 1:6. Однако использование трипсина придает полученному продукту токсичные протеолитические свойства. Более того, получаемый препарат активен только при внутривенном или внутримышечном введении [Mansfeld V, Hladovec J. Studien über Reactionen des Kristallisierten Trypsins. II. Beziehung zwischen der Aktivitat des Heparins und Trypsins "Collection of Czechoslovak chemical communication]", 1957, т. 21, №5, с. 1209].

Наиболее близким решением к заявляемому средству по фармакологическому действию является антитромботическая композиция, включающая глутаминовую кислоту и гепарин, описанная в статье Ляпиной Л.А., Зиадетдиновой Г.А. «Комплексное соединение гепарина с глутаминовой кислотой: получение и его влияние на показатели гемостаза in vitro и in vivo» // Известия РАН. Серия биологическая. 2001. №1. С. 82-86.

В известной композиции использованы препарат высокомолекулярного гепарина фирмы Sigma (Германия) с мол. массой 20000 Да и глутаминовая кислота фирмы «Реахим». Указанное средство получают смешением жидкого гепарина с мол. массой 20000 Да и глутаминовой кислоты с мол. массой 147 Да в молярном соотношении глутаминовая кислота: гепарин, равном 1: 1 (весовое соотношение 136:1), осаждением при pH 4.0 в течение 2-х часов при комнатной температуре с последующим центрифугированием в течение 10-15 мин при комнатной температуре и высушиванием. Препарат обладает антикоагулянтно-фибринолитическим действием при концентрации 10-1 мг/мл. Недостатком указанного средства является его невысокое антикоагулянтное и фибринолитическое действие и малый выход препарата (до 40-50%).

Все вышеизложенное позволяет сделать вывод, что поиск новых эффективных и безопасных антикоагулянтов и фибринолитиков остается до настоящего времени чрезвычайно актуальным.

В основу настоящего изобретения положена задача создания средства, обладающего более выраженным антикоагулянтным, антитромбоцитарным и фибриндеполимеризационным действием, обеспечивающего повышение широкого спектра его противосвертывающих активностей, при повышении эффективности способа с увеличением выхода готового препарата от первоначальной концентрации веществ.

Технический результат достигается за счет получения препарата, обладающего более выраженным антикоагулянтным, антитромбоцитарным фибриндеполимеризационным действием.

Для определения оптимальных соотношений исходных концентраций гепарина и аспарагиновой кислоты для образования комплекса, обладающего высокой антикоагулянтной и фибриндеполимеризационной активностями, была разработана термодинамическая модель химических равновесий системы, включающей высокомолекулярный гепарин (Na4 hep), аспарагиновую кислоту (H2Glu),хлорид кальция (CaCl2) и 0.15 М NaCl. Активность комплекса гепарина с аспарагиновой кислотой основана на снижении в плазме крови равновесной концентрации иона Са2+ (активатора неактивных факторов плазмы крови как в первой фазе ферментативного каскада реакций, так и во второй фазе фибринолиза) вследствие образования с ним смешанно-лигандного комплекса.

Термодинамическая модель равновесий была рассчитана на основе математического моделирования химических равновесий в системе CaCl2- Na4hep - H2Asp - Н2О - NaCl по компьютерной программе AUTOEQUIL (Кирьянов Ю.А., Николаева Л.С.Свидетельство о государственной регистрации программы на ЭВМ №2008512267 AUTOEQUIL) по данным pH-метрии в физиологическом растворе, адекватном раствору плазме крови по величине ионной силы 0.15 М NaCl, температуре (37°C и диапазону изменения концентраций компонент системы n10-3 М, n≤4). Полимерный гепарин был представлен совокупностью мономерных звеньев. Модель идентифицировала в области pH плазмы доминирующий эквимолярный комплекс гепарина с аспарагиновой кислотой HhepAsp5- и наиболее устойчивый смешанно-лигандный эквимолярный комплекс иона кальция Са2+ с гепарином и аспарагиновой кислотой CaHhepAsp-. Комплекс HhepAsp5- из-за образования комплекса CaHhepAsp-. уменьшает равновесную концентрацию иона Са2- в 37 раз больше, чем ион Са2+ с чистым гепарином.

Результаты расчета термодинамической модели доказывают, что молярное соотношение исходных концентраций 1:1 монозвена гепарина и аспарагиновой кислоты является оптимальным для проявления максимальной антикоагулянтной и фибринолитической активностей комплексной системы высокомолекулярный гепарин - аспарагиновая кислота. В этом существенное отличие предлагаемого способа от прототипа, использующего молярное соотношение 1:1 исходных концентраций полимерного гепарина и аспаргиновой кислоты.

Согласно результатам термодинамической модели предлагаемое средство получают смешением жидкого гепарина в расчете на концентрацию монозвена с молекулярной массой 600 Да и аспаргиновой кислоты в эквимолярном соотношении кислота - гепарин, равном 1:1 в молях (1±0.3) М, выдерживанием при температуре 36°-37°C в течение 15-20 мин, осаждением после добавления охлажденного чда ацетона и изменения pH до 3.5-4.0 при температуре +4°-+6° в течение 20-25 мин с последующим центрифугированием при 1800 об/мин. Методом молекулярной динамики по Amber пакету программ биомолекулярного моделирования идентифицирован устойчивый конформационный ансамбль комплекса полимерного гепарина, состоящего из четырех мономерных звеньев, с аспарагиновой кислотой и Са2+ ионами. Исследовано 4 системы: 1 - тетрамер гепарина в конформации 2S0 с 4 остатками аспарагиновой кислоты и 4 катионами Са2+, 2 - тетрамер гепарина в конформации 2S0 с 4 катионами Са2+, 3 - тетрамер гепарина в конформации 1С4 с 4 остатками аспарагиновой кислоты и 4 катионами Са2+, 4 - тетрамер гепарина в конформации 1С4 с 4 катионами Са2+. Основные результаты молекулярной динамики: 1)связь катионов кальция с молекулой гепарина является существенно более прочной в присутствии аспарагиновой кислоты, 2) связь между аспарагиновой кислотой и гепарином осуществляется через мостиковый ион кальция, 3) водородная связь между NH3+аспарагиновой кислоты и гепарином существует, но основную роль в образовании комплекса играет ион кальция, 4) в образовании смешанно-лигандного комплекса участвуют монозвено гепарина, кальций и аспарагиновая кислота в соотношении: 1:1:1, что согласуется с термодинамической моделью.

Согласно результатам термодинамической модели предлагаемое средство получают смешением жидкого гепарина в расчете на концентрацию монозвена с молекулярной массой 600 Да и аспарагиновой кислоты в эквимолярном соотношении в течение 12-15 мин при комнатной температуре и высушиванием. Выход препарата до 75% от первоначальной концентрации.

Таким образом, поставленная задача решается настоящим изобретением тем, что антикоагулянтный и фибриндеполимеризационный комплекс на основе гепарина согласно изобретению содержит высокомолекулярный гепарин и аспарагиновую кислоту в соотношении (1±0.3) М монозвена гепарина на (1±0.3) М аспарагиновой кислоты.

Поставленная задача решается также способом получения антикоагулянтного, антитромбоцитарного и фибриндеполимеризационного комплекса на основе гепарина. Способ получения антикоагулянтного, антитромбоцитарного и фибриндеполимеризационного комплекса на основе гепарина, включает перемешивание гепарина и аспарагиновой кислоты согласно изобретению с использованием в качестве гепарина жидкого или сухого гепарина при соотношении (1±0.3) М монозвена гепарина на (1±0.3) М аспарагиновой кислоты.

Поставленная задача решается также применением полученного комплекса на основе гепарина в виде его (1±0.3) М раствора в качестве антикоагулянтного, фибриндеполимеризационного, антитромбоцитарного и снижающего свертывание крови средства.

Препарат обладает высоким антикоагулянтным, дополнительным фибриндеполимеризационным и антитромбоцитарным действием.

Эксперимент проводили следующим образом.

В условиях in vitro исходный комплекс и его разведения проверяют на наличие фибриндеполимеризационной активности (фибринолитическую активность неферментативной природы), используя нестабилизированные фактором XIIIa фибриновые пленки. При добавлении композиции к нормальной плазме крови крыс проверяют антикоагулянтные, фибриндеполимеризационные и антитромбоцитарные ее свойства.

В образцах крови определяли антикоагулянтную активность по тестам активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), тромбинового времени (ТВ); фибриндеполимеризационную (ФДП) активность и антитромбоцитарную активность.

Следующие материалы иллюстрируют изобретение.

Пример 1

К 1 мл (1 ME) исходного коммерческого препарата гепарина фирмы Serva (Германия) в расчете на концентрацию (1±0.3) М монозвена добавляют (1±0.02) М аспарагиновой кислоты, перемешивая их в течение 15 мин при 36°C, далее к смеси добавляют 4-кратный объем (4 мл) охлажденного ацетона, изменяют pH до 3.5, оставляют на 20 мин в холодильнике при +4°-6°C до применения. Далее центрифугируют при 1800 об/мин в течение 12 мин, полученный осадок высушивают при комнатной температуре.

В условиях in vitro полученный препарат обладает высоким фибриндеполимеризационным эффектом, составляющим 200 мм2 (в контроле - 0 мм2), а при добавлении к плазме крови крыс обнаруживает фибриндеполимеризационную активность, равную 215%, антикоагулянтная активность составляет 288% от контроля, принятого за 100, агрегация тромбоцитов снижается на 30%.

Полученный комплекс обладает максимальным фибриндеполимеризационным эффектом, а также значительным антикоагулянтным действием в крови после его добавления к плазме крови животных (крыс). При внутримышечном введении такого комплекса крысам в дозе 1 мг/кг массы тела обнаружен высокий антикоагулянтный, антитромбоцитарный и фибриндеполимеризационный эффект, превышающий подобные свойства контроля в 5-6 раз.

Прототип проявлял антикоагулянтные и фибриндеполимеризационные свойства в концентрации 10-1.М на 30-35% ниже, чем полученный комплекс в широком диапазоне концентраций 10-9.-10-1 М

Пример 2

Смешивают 10 ME раствора гепарина и 1 М аспарагиновой кислоты, далее поступают, как описано в примере 1.

Полученный комплекс (доза гепарина в 10 раз выше, чем в примере 1) обнаруживает в плазме крови 280% антикоагулянтной активности, 115% фибриндеполимеризационной активности и не обладает антитромбоцитарным действием. Из-за избытка гепарина полученная композиция обладает слабым фибриндеполимеризационным эффектом и не обладает антитромбоцитарным действием в кровотоке после его внутримышечного введения животным в дозе 1 мг/кг массы тела крыс.

Пример 3.

Смешивают 0.1 ME раствора гепарина и 1М аспарагиновой кислоты, далее поступают, как в примере №1.

Полученный комплекс не обнаруживает в плазме крови антикоагулянтной, антитромбоцитарной, фибриндеполимеризационной активности. Следовательно, получена композиция (доза гепарина в 10 раз ниже, чем в примере 1), из-за недостатка гепарина не обладающая антикоагулянтным, фибриндеполяризационным и антитромбоцитарным действием.

Для примера 1 показатели плазменного и тромбоцитарного гемостаза после добавления к плазме крови комплекса с гепарином (М±m) приведены в таблице 1. Статистические показатели рассчитаны относительно соответствующих проб контроля. (* р<0.05, **р<0.01)

Таким образом, комплекс (1±0.3) М монозвена гепарина + (1±0.3) М аспарагиновой кислоты обладает in vitro высокой антикоагулянтной, антитромбоцитарной и фибриндеполимеризационной активностью даже в присутствии блокаторов ферментативного фибринолиза, улучшает реологические свойства крови, повышая время образования сгустка в присутствии фермента тромбина. Выход препарата повышается на 25-30%. Комплекс стабилен при хранении при +4-+6°C более 6-и месяцев. Способ получения его экономически выгоден. Выход препарата до 75% от первоначальной концентрации веществ.

Похожие патенты RU2606836C2

название год авторы номер документа
АНТИТРОМБОТИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС НА ОСНОВЕ ГЕПАРИНА, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ 2015
  • Николаева Лора Сергеевна
  • Ляпина Людмила Анисимовна
  • Григорьева Марина Евгеньевна
  • Оберган Тамара Юрьевна
  • Шубина Татьяна Александровна
RU2600817C2
АНТИТРОМБОТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ ГЕПАРИНА ДЛЯ ПЕРОРАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ 2008
  • Исаев Вячеслав Арташесович
  • Ляпина Людмила Анисимовна
  • Пасторова Валентина Ефимовна
  • Оберган Тамара Юрьевна
  • Николаева Лора Сергеевна
RU2359681C1
КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ГЕПАРИНА С АНТИКОАГУЛЯНТНЫМИ, АНТИТРОМБОЦИТАРНЫМИ, ФИБРИНОЛИТИЧЕСКИМИ И ФИБРИНДЕПОЛИМЕРИЗАЦИОННЫМИ СВОЙСТВАМИ 2011
  • Исаев Вячеслав Арташесович
  • Григорьева Марина Евгеньевна
  • Ляпина Людмила Анисимовна
  • Николаева Лора Сергеевна
  • Семёнов Артём Николаевич
  • Ершов Александр Алексеевич
  • Сергеев Валерий Николаевич
RU2454237C1
КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ГЕПАРИНА С АНТИКОАГУЛЯНТНЫМИ, АНТИТРОМБОЦИТАРНЫМИ, ФИБРИНОЛИТИЧЕСКИМИ И ФИБРИНДЕПОЛИМЕРИЗАЦИОННЫМИ СВОЙСТВАМИ 2011
  • Исаев Вячеслав Арташесович
  • Ляпина Людмила Анисимовна
  • Григорьева Марина Евгеньевна
  • Николаева Лора Сергеевна
  • Семёнов Артём Николаевич
  • Ершов Александр Алексеевич
RU2456993C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИКОАГУЛЯНТНО-ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОГО СРЕДСТВА НА ОСНОВЕ ГЕПАРИНА 2011
  • Исаев Вячеслав Арташесович
  • Ляпина Людмила Анисимовна
  • Оберган Тамара Юрьевна
  • Николаева Лора Сергеевна
  • Семёнов Артём Николаевич
  • Ершов Александр Алексеевич
RU2448717C1
АНТИТРОМБОТИЧЕСКОЕ, АНТИКОАГУЛЯНТНОЕ, ФИБРИНДЕПОЛИМЕРИЗАЦИОННОЕ, ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВА ДЛЯ ВНУТРИВЕННОГО ВВЕДЕНИЯ 2005
  • Ашмарин Игорь Петрович
  • Мясоедов Николай Федорович
  • Ляпина Людмила Анисимовна
  • Пасторова Валентина Ефимовна
RU2286168C1
АНТИТРОМБОТИЧЕСКОЕ, АНТИКОАГУЛЯНТНОЕ, ФИБРИНДЕПОЛИМЕРИЗАЦИОННОЕ, ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВА ДЛЯ ВНУТРИМЫШЕЧНОГО ВВЕДЕНИЯ 2005
  • Ашмарин Игорь Петрович
  • Мясоедов Николай Федорович
  • Ляпина Людмила Анисимовна
  • Пасторова Валентина Ефимовна
RU2288737C1
АНТИТРОМБОТИЧЕСКОЕ, АНТИКОАГУЛЯНТНОЕ, ФИБРИНДЕПОЛИМЕРИЗАЦИОННОЕ, ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО 2005
  • Ашмарин Игорь Петрович
  • Мясоедов Николай Федорович
  • Ляпина Людмила Анисимовна
  • Пасторова Валентина Ефимовна
RU2290194C1
АНТИТРОМБОТИЧЕСКОЕ, АНТИКОАГУЛЯНТНОЕ, ФИБРИНДЕПОЛИМЕРИЗАЦИОННОЕ, ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ИНТРАНАЗАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ 2005
  • Алфеева Людмила Юрьевна
  • Андреева Людмила Александровна
  • Ашмарин Игорь Петрович
  • Мясоедов Николай Федорович
  • Ляпина Людмила Анисимовна
  • Пасторова Валентина Ефимовна
RU2290193C1
СРЕДСТВО С АНТИКОАГУЛЯНТНОЙ, АНТИТРОМБОЦИТАРНОЙ, АНТИТРОМБОТИЧЕСКОЙ, ФИБРИНДЕПОЛИМЕРИЗАЦИОННОЙ И ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЯМИ 2005
  • Алфеева Людмила Юрьевна
  • Андреева Людмила Александровна
  • Ашмарин Игорь Петрович
  • Мясоедов Николай Федорович
  • Ляпина Людмила Анисимовна
  • Пасторова Валентина Ефимовна
RU2290195C1

Реферат патента 2017 года Антикоагулянтный, антитромбоцитарный и фибриндеполимеризационный комплекс на основе гепарина, способ его получения и применение

Группа изобретений относится к медицине и фармакологии и касается создания средств на основе гепарина, обладающих антикоагулянтным, антитромбоцитарным, фибриндеполимеризационным действием на организм. Комплекс содержит высокомолекулярный гепарин с молекулярной массой 20000 Да и аспарагиновую кислоту в соотношении (1±0.3) М монозвена гепарина на (1±0.3) М аспарагиновой кислоты. Способ получения комплекса включает перемешивание гепарина и аспарагиновой кислоты, где в качестве гепарина используют жидкий или сухой высокомолекулярный гепарин при соотношении (1±0.3) М гепарина в расчете на монозвено на (1±0.3) М аспарагиновой кислоты, выдерживание полученной смеси при температуре 36-37°С в течение 15-20 мин с последующим осаждением, центрифугированием и высушиванием осадка при комнатной температуре. Группа изобретений обеспечивает создание средства, обладающего более выраженным действием, повышение спектра его противосвертывающих активностей, повышение эффективности способа с увеличением выхода готового препарата. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 1 табл., 3 пр.

Формула изобретения RU 2 606 836 C2

1. Антикоагулянтный, антитромбоцитарный и фибриндеполимеризационный комплекс на основе гепарина, характеризующийся тем, что он содержит высокомолекулярный гепарин и аспарагиновую кислоту в соотношении (1±0.3) М монозвена гепарина на (1±0.3) М аспарагиновой кислоты.

2. Комплекс по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве высокомолекулярного гепарина использован гепарин с молекулярной массой 20000 Да.

3. Комплекс по п. 1, характеризующийся тем, что гепарин использован фирмы Serva.

4. Способ получения антикоагулянтного, антитромбоцитарного и фибриндеполимеризационного комплекса на основе гепарина, включающий перемешивание гепарина и аспарагиновой кислоты, где в качестве гепарина используют жидкий или сухой высокомолекулярный гепарин при соотношении (1±0.3) М гепарина в расчете на монозвено на (1±0.3) М аспарагиновой кислоты, выдерживание полученной смеси при температуре 36°-37°С в течение 15-20 мин с последующими осаждением, центрифугированием и высушиванием осадка при комнатной температуре.

5. Способ по п. 4, характеризующийся тем, что осаждение проводят после добавления охлажденного чда ацетона и изменения рН до 3.0-4.0 при температуре +4°-+6°С в течение 20-25 мин.

6. Способ по п. 4, характеризующийся тем, что центрифугирование осадка осуществляют при 1800 об/мин в течение 12-15 мин при комнатной температуре.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2017 года RU2606836C2

ЛЯПИНА Л.А
и др
Комплексное соединение гепарина с глутаминовой кислотой: получение и влияние на показатели гемостаза in vitro и in vivo
Известия РАН
Серия биологическая
Перекатываемый затвор для водоемов 1922
  • Гебель В.Г.
SU2001A1
US3577534, 04.05.1971
ПРЕОБРАЖЕНСКИЙ Н,А, и др
Планшайба для точной расточки лекал и выработок 1922
  • Кушников Н.В.
SU1976A1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИКОАГУЛЯНТНО-ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОГО СРЕДСТВА НА ОСНОВЕ ГЕПАРИНА 2011
  • Исаев Вячеслав Арташесович
  • Ляпина Людмила Анисимовна
  • Оберган Тамара Юрьевна
  • Николаева Лора Сергеевна
  • Семёнов Артём Николаевич
  • Ершов Александр Алексеевич
RU2448717C1
WO2011036444 A1, 31.03.2011.

RU 2 606 836 C2

Авторы

Николаева Лора Сергеевна

Ляпина Людмила Анисимовна

Григорьева Марина Евгеньевна

Оберган Тамара Юрьевна

Палюлин Владимир Александрович

Карлов Дмитрий Сергеевич

Даты

2017-01-10Публикация

2015-03-12Подача