АНТИТРОМБОТИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС НА ОСНОВЕ ГЕПАРИНА, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2016 года по МПК A61K31/727 A61K31/195 A61P7/02 

Изобретение относится к медицине и фармакологии и касается создания средств на основе гепарина, обладающих антикоагулянтным, антитромбоцитарным, фибринолитическим действием на организм.

Наиболее часто в медицине в качестве антикоагулянтных средств используются препараты на основе гепарина и его производных.

Гепарин является естественным противосвертывающим фактором и относится к антикоагулянтам прямого действия, т.е. непосредственно влияет на факторы свертывания крови. Гепарин обладает не только антикоагулянтным действием, но в некоторой степени может активировать фибринолитические свойства крови и улучшать коронарный кровоток [Клиническая биохимия / под ред. В.А. Ткачука. 2-е изд., испр. и доп. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. 512 с.].

Противосвертывающее действие гепарина проявляется in vitro и in vivo при внутривенном, внутримышечном и подкожном его введении. Гепарин действует быстро, но относительно кратковременно.

Гепарин применяют при профилактике и терапии различных тромбоэмболических заболеваний и их осложнений. Однако ему присущ ряд отрицательных свойств, таких как тромбоцитопения и аллергические реакции немедленного типа (крапивница, ангионевротический отек или бронхоспазм), при передозировке - возможность развития геморрагии.

Известны антикоагулянтные средства животного происхождения, представляющие собой фрагмент коллагена с М.М. около 12 кДа, содержащий 10,0-12,0% углеводов, 6,0-7,5% сульфатных групп, микро- и макроэлементы [патент РФ №2302250, А61К 35/56, 2007.07.10].

Известно антикоагулянтно-фибринолитическое средство, включающее пептид "Семакс" и гепарин, описанный в патенте РФ №2138289 (А61К 31/725, 1999.09.27). Наименование пептида "Семакс" утверждено решением Фармакологического комитета МЗ РФ от 11.11.93

Указанные средства обладают иным механизмом антикоагулянтного действия, чем механизм действия гепарина, однако способ получения их сложен и длителен и, кроме того, антитромбоцитарное и антикоагулянтное действие их недостаточно.

Гепарин часто используют в сочетании с ферментными фибринолитическими препаратами.

Известно антикоагулянтно-фибринолитическое средство комплекса высокомолекулярного гепарина с протеолитическим ферментом тромбином. Препарат эффективен лишь при внутривенном и внутримышечном введениях. Небольшая длительность действия препарата - 1,5-2,0 часа и наличие побочных эффектов не позволяет его широко использовать в медицинской практике [Ж. "Биохимия животных и человека", "Неферментативный фибринолиз", Ляпина Л.А. и др. г. Киев 1982, №6, с. 64-73].

Известна терапевтическая композиция, обладающая антикоагулянтной активностью на основе комплексов гепарина с веществами, усиливающими антикоагулянтное действие, в частности с аминокислотами, такими как аспарагиновая, антраниловая, р-аминобензойная, а также с глицином, валином и β-аланином [Патент США №3577534, Кл. С08В 37/10. 1971.05.04].

К недостаткам известной композиции следует отнести отсутствие фибринолитических и антитромбоцитарных свойств получаемых продуктов.

Известен тромболитический комплекс гепарина с ферментом трипсином, взятых в соотношении 1:6. Однако использование трипсина придает полученному продукту токсичные протеолитические свойства. Более того, получаемый препарат активен только при внутривенном или внутримышечном введении [Mansfeld V, Hladovec J. Studien über Reactionen des Kristallisierten Trypsins.II.Beziehung zwischen der Aktivität des Heparins und Trypsins-"Collection of Czechoslovak chemical communication]", 1957, т.21, №5, с.1209].

Наиболее близким решением к заявляемому средству по фармакологическому действию является антитромботическая композиция, включающая глутаминовую кислоту и гепарин, описанная в статье Ляпиной Л.Α., Зиадетдиновой Г.А. «Комплексное соединение гепарина с глутаминовой кислотой: получение и его влияние на показатели гемостаза in vitro и in vivo» // Известия РАН. Серия биологическая. 2001. №1. С.82-86.

В известной композиции использованы препарат высокомолекулярного гепарина фирмы Sigma (Германия) с мол. массой 20000 Да и глутаминовая кислота фирмы «Реахим». Указанное средство получают смешением жидкого гепарина с мол. массой 20000 Да и глутаминовой кислоты с мол. массой 147 Да в молярном соотношении глутаминовая кислота:гепарин равном 1:1 (весовое соотношение 136:1), осаждением при рН 4.0 в течение 2-х часов при комнатной температуре с последующим центрифугированием в течение 10-15 мин при комнатной температуре и высушиванием. Препарат обладает антикоагулянтно-фибринолитическим действием при концентрации 10^-1 мг/мл. Недостатком указанного средства является его невысокое антикоагулянтное и фибринолитическое действие и малый выход препарата (до 40-50%).

Все вышеизложенное позволяет сделать вывод, что поиск новых эффективных и безопасных антикоагулянтов и фибринолитиков остается до настоящего времени чрезвычайно актуальным.

В основу настоящего изобретения положена задача создания средства, обеспечивающего повышение широкого спектра его противосвертывающих активностей, при повышении эффективности способа с увеличением выхода готового препарата от первоначальной концентрации веществ.

Технический результат достигается за счет получения препарата, обладающего более выраженным антикоагулянтным, фибринолитическим (суммарным, ферментативным и неферментативным) и антитромбоцитарным действием.

Для определения оптимальных соотношений исходных концентраций гепарина и глутаминовой кислоты для образования комплекса, обладающего высокой антикоагулянтной и фибринолитической активностями, была разработана термодинамическая модель химических равновесий системы, включающий высокомолекулярный гепарин (Na₄ hep), глутаминовую кислоту (Н₂Glu), хлорид кальция (СаСl₂) и 0.15М NaCl. Активность комплекса гепарина с глутаминовой кислотой основана на снижении в плазме крови равновесной концентрации иона Са²⁺ (активатора неактивных факторов плазмы крови, как в первой фазе ферментативного каскада реакций, так и во второй фазе фибринолиза) вследствие образования с ним смешаннолигандного комплекса.

Термодинамическая модель равновесий была рассчитана на основе математического моделирования химических равновесий в системе СаСl₂-Na₄hep - H₂Asp - Н₂О - NaCl по компьютерной программе AUTOEQUIL (Кирьянов Ю.А., Николаева Л.С. Свидетельство о государственной регистрации программы на ЭВМ №2008512267 AUTOEQUIL) по данным рН-метрии в физиологическом растворе, адекватном раствору плазме крови по величине ионной силы 0.15М NaCl, температуре (37°С и диапазону изменения концентраций компонент системы n10^-3 M, n≤4). Полимерный гепарин был представлен совокупностью мономерных звеньев. Модель идентифицировала в области рН плазмы доминирующий комплекс гепарина с глутаминовой кислотой HhepGlu^5- и наиболее устойчивый смешаннолигандный комплекс иона кальция Са²⁺ с гепарином и глутаминовой кислотой CaHhepGlu^-. Комплекс HhepGlu^5- из-за образования комплекса CaHhepGlu^- уменьшает равновесную концентрацию иона Са^2- в 72 раза больше, чем ион Са²⁺ с чистым гепарином.

Результаты расчета термодинамической модели доказывают, что молярное соотношение исходных концентраций 1:1 монозвена гепарина и глутаминовой кислоты является оптимальным для проявления максимальной антикоагулянтной и фибринолитической активностей комплексной системы высокомолекулярный гепарин - глутаминовая кислота. В этом существенное отличие предлагаемого способа от прототипа, использующего молярное соотношение 1:1 исходных концентраций полимерного гепарина и глутаминовой кислоты.

Согласно результатам термодинамической модели предлагаемое средство получают смешением жидкого гепарина в расчете на концентрацию монозвена с молекулярной массой 600 Да и глутаминовой кислоты в эквимолярном соотношении глутаминовая кислота:гепарин равном 1:1 в молях (1±0.02)М, выдерживанием при температуре 36-37°С в течение 20-30 мин, осаждением после добавления охлажденного чда ацетона и изменения рН до 3.0-4.0 при температуре +4-+6°С в течение 30 мин с последующим центрифугированием при 1800 об/мин в течение 15-18 мин при комнатной температуре и высушиванием. Выход препарата составляет до 70% от первоначальной концентрации веществ.

Таким образом, поставленная задача решается настоящим изобретением тем, что антитромботический комплекс на основе гепарина согласно изобретению содержит высокомолекулярный гепарин и глутаминовую кислоту в соотношении (1±0.3)М монозвена гепарина на (1±0.3)М глутаминовой кислоты.

Поставленная задача решается также способом получения антитромботического комплекса на основе гепарина. В способе получения антитромботического комплекса на основе гепарина, включающего перемешивание гепарина и глутаминовой кислоты согласно изобретению, используют в качестве гепарина жидкий или сухой гепарин при соотношении (1±0.3)М монозвена гепарина на (1±0.3)М глутаминовой кислоты.

Поставленная задача решается также применением антитромботического комплекса на основе гепарина в виде его (1±0.3)М раствора в качестве антикоагулянтного, антитромбоцитарного, фибринолитического, фибриндеполимеризационного и снижающего свертывание крови средства.

Препарат обладает высоким антикоагулянтным, дополнительным антитромбоцитарным, фибриндеполимеризационным действием и удлиняет тромбоэластографические параметры показателей начала, конца образования сгустка, его эластичность, т.е. улучшает реологические свойства (текучесть) крови.

Эксперимент проводили следующим образом.

В условиях in vitro исходный комплекс и его разведения проверяют на наличие фибриндеполимеризационной активности (фибринолитическую активность неферментативной природы), используя нестабилизированные фактором ХIIIа фибриновые пленки. При добавлении композиции к нормальной плазме крови крыс проверяют антикоагулянтные, фибринолитические (ферментативной и неферментативной природы), антитромбоцитарные ее свойства, а также эластичность сгустка и другие тромбоэластографические параметры, свидетельствующие о реологических свойствах крови.

В образцах крови определяли антикоагулянтную активность по тесту активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), суммарную (СФА) и неферментативную (НФ), ферментативную (ФФ) фибринолитическую активность, агрегацию тромбоцитов, параметры тромбоэластограммы.

Ниже представлены примеры, иллюстрирующие заявляемое изобретение.

Пример 1.

К 1 мл (1 ME) исходного коммерческого препарата гепарина фирмы Serva (Германия) в расчете на концентрацию (1±0.3)М монозвена добавляют (1±0.3)М глутаминовой кислоты, перемешивая их в течение 20-30 мин. При 36-37°С далее к смеси добавляют 4-6-кратный объем (6 мл) охлажденного ацетона, изменяют рН до 3.0, оставляют на 30 мин в холодильнике при +4-6°С до применения. Далее центрифугируют при 1800 об/мин в течение 15 мин, полученный осадок высушивают при комнатной температуре.

В условиях in vitro полученный препарат обладает высоким фибриндеполимеризационным эффектом, составляющим 200 мм² (в контроле - 0 мм²), а при добавлении к плазме крови крыс обнаруживает суммарную фибринолитическую активность, равную 159%, фибриндеполимеризационную активность, равную 200%, антикоагулянтная активность составляет 258% от контроля, принятого за 100%, агрегация тромбоцитов снижается до 10%, по данным тромбоэластограммы показатели R (начало образования сгустка) удлиняются на 100%, К (скорость свертывания) на 17%, ma - максимальная амплитуда (свидетельствует о количестве фибриногена крови - на 8%, Ε - эластичность или прочность сгустка увеличивается в 2 раза, S - константа синерезиса (отражает всю фазу свертывания фибриногена) увеличивается на 27%, Т - тотальная константа свертывания увеличивается на 44%, индекс коагуляции уменьшается на 70%.

Полученный комплекс обладает максимальным суммарным и неферментативным фибринолитическим эффектом, а также значительным антикоагулянтным и, что важно, значительным антитромбоцитарным действием в кровотоке после его добавления к плазме крови животных (крыс). Кроме того, по данным тромбоэластограммы препарат увеличивает прочность сгустка, индекс свертывания (коагуляции) уменьшается, а все фазы свертывания крови увеличиваются, что свидетельствует о его высоком спектре противосвертывающих свойств и его способности улучшать реологию крови.

Прототип проявлял антикоагулянтные и фибриндеполимеризационные свойства в концентрации 10^-1 M на 20-25% ниже, чем полученный комплекс в широком диапазоне концентраций 10^-9-10^-1 М.

Пример 2.

Смешивают 10 ME раствора гепарина и 1М глутаминовой кислоты, далее поступают как описано в примере 1.

Полученный комплекс (доза гепарина в 10 раз выше, чем в примере №1) обнаруживает в плазме крови 180% антикоагулянтной активности, 115% фибриндеполимеризационной активности, 114% суммарной фибринолитической активности и не обнаруживает антикоагулянтной и антитромбоцитарной активности. Из-за избытка гепарина полученная композиция обладает слабым суммарным и неферментативным фибринолитическим эффектом и не обладает антитромбоцитарным действием в кровотоке после его перорального введения животным, недостоверно меняет показатели тромбоэластограммы крови.

Пример 3.

Смешивают 0.1 МЕ раствора гепарина и 1М глутаминовой кислоты, далее поступают как в примере №1.

Полученный комплекс не обнаруживает в плазме крови антикоагулянтной, фибриндеполимеризационной активности, суммарной фибринолитической и антитромбоцитарной активности. Следовательно, полученная композиция (доза гепарина в 10 раз ниже, чем в примере №1), из-за недостатка гепарина не обладающая антикоагулянтным, суммарным фибринолитическим, фибриндеполяризационным и антитромбоцитарным действием, и не изменяет параметры тромбоэластограммы крови в условиях in vitro. Для примера 1 показатели плазменного и тромбоцитарного гемостаза после добавления к плазме крови комплекса с гепарином (М±m) приведены в таблице 1. Статистические показатели рассчитаны относительно соответствующих проб контроля (^∗р<0.05, ^∗∗р<0.01).

Примечание к табл. 2. Запись проведена на приборе Hellige (Германия).

Удлинение времени реакции - R, К, Т, S свидетельствует об активации антикоагулянтного звена противосвертывающей системы; Е указывает на значительную эластичность сгустка, на некоторое снижение функциональной активности тромбоцитов и уменьшение количества фибриногена в опыте.

Таким образом, комплекс (1±0.3)М монозвена гепарина + (1±0.3)М глутаминовой кислоты обладает in vitro высокой антикоагулянтной, антитромбоцитарной, суммарной фибринолитической, фибриндеполимеризационной активностью даже в присутствии блокаторов ферментативного фибринолиза, улучшает реологические свойства крови, повышая параметры тромбоэластограммы (эластичность или прочность сгустка, максимальную амплитуду, константу синерезиса, снижая индекс коагуляции). Выход препарата повышается на 20-25%. Комплекс стабилен при хранении при +4-+6°С более 6-ти месяцев. Способ получения его экономически выгоден. Выход препарата составляет до 70% от первоначальной концентрации веществ.

Группа изобретений относится к области медицины и фармакологии, а именно к антитромботическому комплексу на основе гепарина, который содержит высокомолекулярный гепарин и глутаминовую кислоту в соотношении (1±0.3)М монозвена гепарина на (1±0.3)М глутаминовой кислоты, к способу его получения и применения в качестве антикоагулянтного, антитромбоцитарного, фибринолитического, фибриндеполимеризационного и снижающего свертывание крови средства. Группа изобретений обеспечивает увеличение выхода готового препарата и повышение его антикоагулянтного, фибринолитического и антитромбоцитарного действия. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 3 пр., 2 табл.

1. Антитромботический комплекс на основе гепарина, характеризующийся тем, что он содержит высокомолекулярный гепарин и глутаминовую кислоту в соотношении (1±0.3)М монозвена гепарина на (1±0.3)М глутаминовой кислоты.

2. Антитромботический комплекс по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве высокомолекулярного гепарина использован гепарин с молекулярной массой 20000 Да.

3. Способ получения антитромботического комплекса на основе гепарина по п. 1, включающий перемешивание гепарина и глутаминовой кислоты, где в качестве гепарина используют жидкий или сухой высокомолекулярный гепарин при соотношении (1±0.3)М гепарина в расчете на монозвено на (1±0.3)М глутаминовой кислоты, выдерживание полученной смеси при температуре 36-37°С в течение 20-30 мин с последующими осаждением, центрифугированием и высушиванием осадка при комнатой температуре.

4. Способ по п. 3, характеризующийся тем, что осаждение проводят после добавления охлажденного чда ацетона и изменения рН до 3.0-4.0 при температуре +4-+6°С в течение 30 мин.

5. Способ по п. 3, характеризующийся тем, что центрифугирование осадка осуществляют при 1800 об/мин в течение 15-18 мин при комнатной температуре.

6. Применение антитромботического комплекса на основе гепарина по п. 1 в качестве антикоагулянтного, антитромбоцитарного, фибринолитического, фибриндеполимеризационного и снижающего свертывание крови средства.