ВАКЦИНЫ STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE Российский патент 2017 года по МПК A61K39/09 A61P31/04 

Уровень техники

Пневмококковое заболевание, вызванное бактерией Streptococcus pneumoniae (также известной как пневмококк) является одним из наиболее значительных бактериальных патогенов в мире. Особенно тяжелое бремя болезни в развивающихся странах приходится на детей в возрасте до пяти лет, если вакцина недоступна. Пневмококковое заболевание представляет собой комплексную группу болезней и включает инвазивные инфекции, такие, как бактериемия / сепсис, менингит, пневмония и отит среднего уха, который поражает как детей, так и взрослых. Prevnar 13 (также известный как "Prevenar 13" и называемый здесь "Prev(e)nar 13") представляет собой композицию полисахаридов из тринадцати пневмококковых серотипов (1, 3, 4, 5, 6А, 6 В, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F и 23F), которые по отдельности конъюгированы с CRM₁₉₇ (перекрестно реагирующий материал из мутантного штамма Corynebactetim diphtheriae). Prev(e)nar 13 рекомендуется для активной иммунизации грудных и начинающих ходить детей для обеспечения максимально широкого охвата серотипов любыми пневмококковыми конъюгатными вакцинами. Так, серотип 19A в Prev(e)nar 13 является преобладающим во многих регионах мира и часто связан с резистентностью к антибиотикам. См. например, документы WO2006/110381; WO2008/079653; WO2008/079732; WO2008/143709 и приведенные в них ссылки на источники.

Тимеросал (также известный как Тиомерсал; мертиолат) представляет собой содержащий этилртуть консервант, который с начала 1930-х годов добавляют ко многим многодозным инъекционным композициям и растворам для местного нанесения для их защиты от потенциального загрязнения, когда они могут подвергаться воздействию окружающей среды и при введении нескольким субъектам. Тимеросал по-прежнему применяется в рамках обязательной иммунизации и в других фармацевтических продуктах в США и остальных странах мира. Он известен как эффективный консервант для удаления потенциальных загрязняющих бактерий во время многократного применения продуктов по назначению при минимальном взаимодействии с антигенной структурой и свойствами вакцин. Из-за растущих противоречий, связанных с возможными вопросами безопасности и неблагоприятным воздействием этилртути на развитие головного мозга детей и подростков некоторые агентства начали рекомендовать поиск альтернативных консервантов с более низким или пренебрежимым риском для безопасности. В 1999 г. в обзоре Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, которое подчиняется Конгрессу США, было указано, что некоторые дети могут получать большее количество ртути из вакцин, чем считается допустимым согласно определенным рекомендациям на национальном уровне.

Американская академия педиатрии (ААР) и Служба здравоохранения США (USPHS) опубликовали совместное заявление, касающееся Тимеросала в вакцинах, а затем ААР выпустила предварительный отчет для клинических врачей, рекомендующий немедленное изъятие Тимеросала из вакцин при поддержании усилий по обеспечению высокого уровня вакцинации по всему миру без ущерба для безопасности.

Потребности в добавлении консервантов к вакцинам можно избежать или снизить ее путем приготовления и применения только однодозовых композиций вакцин. Однако применение однодозовых композиций без консервантов повышает общую стоимость вакцинации и подвергает риску эффективность программ иммунизации в развивающихся странах. Кроме того, извлечение консервантов из многодозовых флаконов вообще рассматривается как нежелательный вариант, в особенности в странах с ограниченными возможностями холодильного хранения и субоптимальными стандартами здравоохранения (Drain et al., Bull World Health Organ 81(10): 726-731 (2003). В 1928 г. двенадцать из 21 ребенка, привитого загрязненной вакциной от дифтерии, умирали от множественных стафилококковых абсцессов и токсемии (Wilson, The Hazards of Immunization. Athlone Press, London, pp.75-78 (1967). Таким образом, хотя многодозовые флаконы считаются наиболее подходящими для производства менее дорогих вакцин, существует потребность в формулировании многодозовых вакцин с как минимум одним консервантом для защиты субъектов от микроорганизмов, непреднамеренно включенных в вакцину время многократного применения или после одного или нескольких нестерильных явлений. Однако эффективность консервантов для устойчивости от загрязнения бактериальными и другими микроорганизмами должна быть сбалансирована с воздействием конкретного консерванта на иммуногенность, а также на долгосрочную устойчивость любой другой антигенной детерминанты в выбранной иммуногенной композиции. Совместимость композиций Prev(e)nar 13 с консервантами ранее не рассматривалась. Существует потребность в оптимизированной композиции, включающей как минимум один консервант, защищающий и/или стабилизирующий антигенные детерминанты серотипов пневмококкового антигена, присутствующих в Prev(e)nar13.

Краткое описание изобретения

В первом аспекте настоящее изобретение обеспечивает поливалентную иммуногенную композицию, включающую множество капсульных полисахаридов из серотипов Streptococcus pneumoniae и 2-феноксиэтанола (2-РЕ). В некоторых вариантах осуществления капсульные полисахариды взяты из одного или нескольких из серотипов Streptococcus pneumoniae, выбранных из 1, 3, 4, 5, 6А, 6 В, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F и 23F. В некоторых вариантах осуществления капсульные полисахариды взяты из семи или более из серотипов Streptococcus pneumoniae, выбранных из 1, 3, 4, 5, 6А, 6 В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F. В некоторых вариантах осуществления капсульные полисахариды взяты из каждого из серотипов Streptococcus pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F.

В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция включает 2-РЕ в концентрации от 7 мг/мл до 15 мг/мл, приблизительно 10 мг/мл, не менее, чем 7 мг/мл, не менее, чем 10 мг/мл или не менее, чем 15 мг/мл.

Иммуногенные композиции согласно изобретению в некоторых вариантах осуществления также могут включать один или несколько из компонентов, к которым относятся адъювант, буфер, криопротектор, соль, двухвалентный катион, неионный детергент и ингибитор окисления свободных радикалов. В некоторых вариантах осуществления адъювантом является фосфат алюминия.

Предпочтительной поливалентной иммуногенной композицией согласно изобретению является композиция пневмококковых капсульных полисахаридов из серотипов 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F, по отдельности конъюгированных с CRM₁₉₇, причем поливалентная иммуногенная композиция формулируется в стерильной жидкости таким образом, чтобы включать: приблизительно 4,4 мкг/мл каждого полисахарида, за исключением 6B в количестве приблизительно 8,8 мкг/мл; приблизительно 58 мкг/мл белка-носителя CRM₁₉₇; приблизительно 0,25 мг/мл элементного алюминия в форме фосфата алюминия; приблизительно 0,85% хлорида натрия; приблизительно 0,02% полисорбата 80; приблизительно 5 мМ буфера на основе сукцината натрия при pH 5,8; и приблизительно 10 мг/мл 2-феноксиэтанола.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенность иммуногенной композиции сохраняет устойчивость в течение не менее 1 года, 1,5 года, 2 лет или 2,5 лет при температуре 2-8°С, 20-25°С или 37°С.

В некоторых вариантах осуществления изобретения после прививки иммуногенной композицией с одним или несколькими микроорганизмами концентрация вышеупомянутых микроорганизмов со временем снижается. В некоторых вариантах осуществления после прививки одним или несколькими бактериальными штаммами композиция обеспечивает логарифмическое уменьшение как минимум 1,0 по сравнению с изначальным числом микроорганизмов за 24 часа, логарифмическое уменьшение как минимум 3,0 за 7 дней по сравнению с предыдущим измеренным значением и логарифмическое увеличение не более 0,5 через 28 дней по сравнению с предыдущим измеренным значением. В некоторых вариантах осуществления после прививки одним или несколькими бактериальными штаммами композиция обеспечивает логарифмическое уменьшение как минимум 2,0 по сравнению с предыдущим рассчитанным значением через 6 часов после прививки, логарифмическое уменьшение как минимум 3,0 по сравнению с предыдущим измеренным значением за 24 часа и отсутствие восстановления через 28 дней. Штаммы микроорганизмов включают один или несколько штаммов, выбранных из Р. aeruginosa, S. aureus, Е. coli и В. subtilis.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенную композицию прививают несколько раз. В некоторых вариантах осуществления вторая прививка производится через 6 часов после первой прививки, третья прививка производится через 24 часа после первой прививки, третья прививка производится через 7 дней после первой прививки, и четвертая прививка производится через 14 дней после первой прививки.

Во втором аспекте настоящее изобретение также предлагает флакон, содержащий поливалентную иммуногенную композицию согласно изобретению. Флакон может содержать одну дозу или несколько доз иммуногенной композиции. Изобретение также обеспечивает предварительно заполненное устройство для доставки вакцины, включающее поливалентную иммуногенную композицию согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления предварительно заполненное устройство для доставки вакцины представляет собой или включает шприц. Устройства для доставки вакцины согласно изобретению могут включать двух- или многокамерные шприцы или флаконы или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления предварительно заполненное устройство для доставки вакцины включает поливалентную иммуногенную композицию, сформулированную для внутримышечной или подкожной инъекции.

В третьем аспекте настоящее изобретение также обеспечивает комплект для приготовления поливалентной иммуногенной композиции согласно изобретению, причем комплект включает (i) множество капсульных полисахаридов в лиофилизированной форме композиции и (ii) водный материал для восстановления влагосодержания компонента (i) с целью обеспечения водной композиции.

В четвертом аспекте настоящее изобретение обеспечивает многодозовую вакцину, включающую четыре дозы вакцины в флаконе, причем каждая доза включает от 4 до 20 мг/мл, предпочтительно 10 мг/мл 2-феноксиэтанола, причем доза составляет 0,5 мл вакцины.

В пятом аспекте настоящее изобретение также обеспечивает способ измерения эффективности композиции вакцины, включающей один или несколько выбранных консервантов в присутствии некоторых или всех иммуногенных и неиммуногенных компонентов композиции вакцины, причем испытание включает как минимум два этапа прививки испытуемой композицией с выбранной популяцией микроорганизмов и сравнение логарифмического уменьшения привитого(ых) микроорганизма(ов) с течением времени и в конкретных условиях среды (например, температуры) с логарифмическим уменьшением в контрольной композиции без испытуемого(ых) консерванта(ов).

Краткое описание фигур

Фигура 1 - Эффективность Тимеросала в качестве консерванта вакцины в различных композициях.

Фигура 2 - Эффективность и устойчивость 2-феноксиэтанола (2-РЕ) в качестве консерванта вакцины в различных композициях и в разных концентрациях.

Фигура 3 - Динамика уменьшения количества колоний микроорганизмов в композиции вакцины Prev(e)nar 13 без консерванта при 20-25°С после однократной провокации микроорганизмов (выраженного как изменение среднего log₁₀ в сравнении с временем провокации; t=0,6 часов, 24 часа, 7 дней, 14 дней и 28 дней).

Фигура 4 - Динамика уменьшения количества колоний микроорганизмов в композиции вакцины Prev(e)nar 13 с 0,01% Тимеросала при 20-25°С после однократной провокации микроорганизмов (выраженного как изменение среднего log₁₀ в сравнении с временем провокации; t=0,6 часов, 24 часа, 7 дней, 14 дней и 28 дней).

Фигура 5 - Динамика уменьшения количества колоний микроорганизмов в композиции вакцины Prev(e)nar 13 с 0,02% Тимеросала при 20-25°С после однократной провокации микроорганизмов (выраженного как изменение среднего log₁₀ в сравнении с временем провокации; t=0,6 часов, 24 часа, 7 дней, 14 дней и 28 дней).

Фигура 6 - Динамика уменьшения количества колоний микроорганизмов в солевом растворе с 0,02% Тимеросала при 20-25°С после однократной провокации микроорганизмов (выраженного как изменение среднего log₁₀ в сравнении с временем провокации; t=0,6 часов, 24 часа, 7 дней, 14 дней и 28 дней).

Фигура 7 - Динамика уменьшения количества колоний микроорганизмов в композиции вакцины Prev(e)nar 13 с 5 мг/0,5 мл 2-феноксиэтанола при 20-25°С после однократной провокации микроорганизмов (выраженного как изменение среднего log₁₀ в сравнении с временем провокации; t=0,6 часов, 24 часа, 7 дней, 14 дней и 28 дней).

Фигура 8 - Динамика уменьшения количества колоний микроорганизмов в композиции вакцины Prev(e)nar 13 без консерванта при (А) 22-24°С или при (В) 2-8°С, после множественных провокаций микроорганизмов; t=0,6 часов, 24 часа, 7 дней и 14 дней (выраженного как изменение среднего log₁₀ в сравнении с временем провокации; t=0,6 часов, 24 часа, 7 дней, 14 дней и 28 дней).

Фигура 9 - Динамика уменьшения количества колоний микроорганизмов в композиции вакцины Prev(e)nar 13 с 0,01% Тимеросала при (А) 22-24°С или при (В) 2-8°С, после множественных провокаций микроорганизмов; t=0,6 часов, 24 часа, 7 дней и 14 дней, (выраженного как изменение среднего log₁₀ в сравнении с временем провокации; t=0,6 часов, 24 часа, 7 дней, 14 дней и 28 дней).

Фигура 10 - Динамика уменьшения количества колоний микроорганизмов в композиции вакцины Prev(e)nar 13 с 0,02% Тимеросала при (А) 22-24°С или при (В) 2-8°С после множественных провокаций микроорганизмов; t=0,6 часов, 24 часа, 7 дней и 14 дней (выраженного как изменение среднего log₁₀ в сравнении с временем провокации; t=0,6 часов, 24 часа, 7 дней, 14 дней и 28 дней).

Фигура 11 - Динамика уменьшения количества колоний микроорганизмов в солевом растворе с 0,02% Тимеросала при (А) 22-24°С или при (В) 2-8°С после множественных провокаций микроорганизмов; t=0,6 часов, 24 часа, 7 дней и 14 дней (выраженного как изменение среднего log₁₀ в сравнении с временем провокации; t=0,6 часов, 24 часа, 7 дней, 14 дней и 28 дней).

Фигура 12 - Анализ нелинейной регрессии разложения S. aureus в различных провокационных исследованиях.

Фигура 13 - Сравнение 2-РЕ и Тимеросала в качестве консерванта вакцины против однократных или множественных провокаций микроорганизмов: соответствие или несоответствие критериям В ЕР 5.1.3.

Фигура 14 - Долгосрочная устойчивость антигенности композиций полисахарида Streptococcus pneumoniae из каждого серотипа в Prev(e)nar 13, сформулированных с 5 мг 2-РЕ.

Фигура 15 - Долгосрочная устойчивость 2-РЕ в композиции вакцины Prev(e)nar 13.

Подробное описание изобретения

Процентная концентрация в контексте данного описания указывается как масса к объему (масса/объем) или масса к массе (масса/масса).

Если не указано иного, "доза" означает дозу вакцины 0,5 мл.

Термин "многодозовый" относится к композиции, включающей более одной дозы вакцины, которая может вводиться одному субъекту или нескольким субъектам на различных этапах введения и в течение определенного периода времени.

Настоящее изобретение обеспечивает поливалентную иммуногенную композицию, включающую множество капсульных полисахаридов из серотипов Streptococcus pneumoniae (также известного как пневмококк) и консервант. Композиция также может называться вакциной и применяться для вызывания иммунной реакции против пневмококка и для защиты субъекта, например, человека, предпочтительно ребенка или грудного ребенка, от инфекции.

Многие капсульные полисахариды Streptococcus pneumoniae являются приемлемыми для композиции согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления изобретения поливалентная иммуногенная композиция включает капсульные полисахариды, полученные из серотипов 4, 6 В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F Streptococcus pneumoniae. В некоторых вариантах осуществления капсульные полисахариды получают из серотипов 4, 6 В, 9V, 14, 18С, 19F, 23F и как минимум одного дополнительного серотипа Streptococcus pneumoniae. В некоторых вариантах осуществления капсульные полисахариды получают из как минимум 4, как минимум 5, как минимум 6, как минимум 7, как минимум 8 или как минимум 9 серотипов, выбранных из серотипов 1, 4, 5, 6 В, 7F, 9V, 14, 18С, 19F и 23F Streptococcus pneumoniae. В некоторых вариантах осуществления капсульные полисахариды получают из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6 В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F Streptococcus pneumoniae. Капсульные полисахариды согласно изобретению получают из серотипов Streptococcus pneumoniae с применением известных технологий. См., например, международные патентные заявки WO2006/110381; WO2008/079653; WO2008/079732 и WO2008/143709, каждая из которых включается в данное описание путем ссылки.

В некоторых вариантах осуществления изобретения капсульные полисахариды конъюгируются с белком-носителем. Эти пневмококковые конъюгаты могут быть получены отдельно. Например, в одном варианте осуществления каждый серотип пневмококкового полисахарида выращивают в среде на соевой основе. Отдельные полисахариды затем очищают путем центрифугирования, осаждения, ультрафильтрации и колоночной хроматографии. Очищенные полисахариды химически активируют таким образом, чтобы сахариды были способны реагировать с выбранным белком-носителем для образования пневмококковых конъюгатов.

После активации каждый капсульный полисахарид отдельно конъюгируется с белком-носителем для образования гликоконъюгата. В некоторых вариантах осуществления каждый отдельный капсульный полисахарид конъюгируется с одинаковым белком-носителем. В таких вариантах осуществления конъюгация может осуществляться, например, путем восстановительного аминирования.

Химическая активация полисахаридов и последующая конъюгация с белком-носителем достигаются традиционными средствами. См., например, Патенты США №№4,673,574 и 4,902,506, включенный в данное описание путем ссылки.

Белки-носители предпочтительно представляют собой белки, которые являются нетоксичными и нереактогенными и могут быть получены в достаточном количестве и с достаточной степенью чистоты. Белки-носители должны поддаваться стандартным процедурам конъюгации. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения CRM₁₉₇ применяют в качестве белка-носителя.

CRM₁₉₇ (Pfizer, Sanford, NC) представляет собой нетоксичный вариант (то есть, токсоид) токсина дифтерии, выделенный из культур Corynebacterium diphtheria штамма С7 (CRM₁₉₇), выращиваемых в среде на основе казаминовых кислот и экстракта дрожжей. CRM₁₉₇ очищают путем ультрафильтрации, осаждения сульфатом аммония и ионообменной хроматографии. В альтернативном варианте CRM₁₉₇ получают рекомбинантным способом, например, в соответствии с Патентом США №5,614,382, который включает в данное описание путем ссылки. Другие токсоиды дифтерии также пригодны в качестве белков-носителей.

К другим приемлемым белкам-носителям относятся инактивированные бактериальные токсины, такие, как токсоид столбняка, токсоид коклюша, токсоид холеры (например, как описано в международной патентной заявке WO2004/083251), E. coli LT, E. coli ST и экзотоксин А из Pseudomonas aeruginosa. Также могут применяться наружные белки мембраны растений, такие, как комплекс белков наружной мембраны с (ОМРС), порины, трансферрин-связывающие белки, пневмолизин, пневмококковый поверхностный белок A (PspA), пневмококковый адгезиновый белок (PsaA), C5a пептидаза из стрептококков Группы А или Группы В или белок D Haemophilus influenzae. В качестве белков-носителей также могут применяться другие белки, такие, как овальбумин, гемоцианин лимфы улитки (KLH), альбумин сыворотки крупного рогатого скота (BSA) или очищенный белковый продукт туберкулина (PPD).

После конъюгации капсульного полисахарида с белком-носителем конъюгаты полисахарид-белок очищают (то есть, обогащают в отношении количества конъюгата полисахарид-белок) различными способами. К этим способам относятся концентрация/диафильтрация, осаждение/элюирование, колоночная хроматография и глубинная фильтрация.

Как более подробно обсуждается ниже, иммуногенные композиции согласно настоящему изобретению включают как минимум один консервант, применимый для изготовления многодозовых композиций вакцин, который обладает благоприятными свойствами в отношении долгосрочной устойчивости одной или нескольких антигенных детерминант поливалентных пневмококковых капсульных конъюгатов полисахарид-белок и надлежащим образом защищает композиции от загрязнения путем обеспечения резистентности к одному или нескольким микроорганизмам перед введением субъекту, который в этом нуждается.

Дополнительное формулирование содержащей консервант иммуногенной композиции согласно настоящему изобретению может осуществляться с применением общепринятых в данной области способов. Например, тринадцать отдельных пневмококковых конъюгатов могут быть формулированы с физиологически приемлемой основой для приготовления композиции. Примерами таких основ, помимо прочих являются вода, буферный солевой раствор, полиолы (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль) и растворы декстрозы, как описывается более подробно ниже.

Иммуногенные композиции согласно изобретению включают один или несколько консервантов дополнительно к множеству пневмококковых капсульных конъюгатов полисахаридов-белков. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) требует, чтобы биологические продукты в многодозовых флаконах содержали консервант, с очень немногими исключениями. К вакцинным продуктам, содержащим консерванты, относятся вакцины, содержащие хлорид бензетония (сибирская язва), 2-феноксиэтанол (DTaP, HepA, болезнь Лайма, полиомиелит (парентеральная)), фенол (Pneumo, брюшной тиф (парентеральная), коровья оспа) и тимеросал (DTaP, DT, Td, HepB, Hib, грипп, JE, Mening, Pneumo, бешенство). К консервантам, утвержденным к применению в медикаментах для инъекций, относятся, например, хлоробутанол, m-крезол, метилпарабен, пропилпарабен, 2-феноксиэтанол, хлорид бензетония, бензалконий хлорид, бензойная кислота, бензиловый спирт, фенол, тимеросал и нитрат фенилртути.

После испытаний различных потенциально приемлемых композиций, включающих консервант для повышения эффективности и устойчивости иммуногенных композиций Prev(e)nar 13, описанное авторами изобретение обеспечивает подобные пневмококковые иммуногенные композиции, включающие 2-феноксиэтанол (2-РЕ) в концентрации приблизительно 2,5-10 мг/дозу (0,5-2%). В некоторых вариантах осуществления концентрация 2-РЕ составляет приблизительно 3,5-7,5 мг/дозу (0,7-1,5%). В некоторых вариантах осуществления концентрация 2-РЕ составляет приблизительно 5 мг/дозу (1%). В некоторых вариантах осуществления концентрация 2-РЕ составляет не менее, чем 3,5 мг/дозу (0,7%), не менее, чем 4,0 мг/дозу (0,8%), не менее, чем 4,5 мг/дозу (0,9%), не менее, чем 5,0 мг/дозу (1%), не менее, чем 5,5 мг/дозу (1,1%), не менее, чем 6,0 мг/дозу (1,2%), не менее, чем 6,5 мг/дозу (1,3%), не менее, чем 7,0 мг/дозу, не менее, чем 7,5 мг/дозу (1,5%), не менее, чем 8,0 мг/дозу (1,6%), не менее, чем 9,0 мг/дозу (1,8%) или не менее, чем 10 мг/дозу (2%).

В некоторых вариантах осуществления изобретения пневмококковые иммуногенные композиции содержат один или несколько дополнительных консервантов, включающих, помимо прочих, Тимеросал и формалин.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция может включать один или несколько адъювантов. В контексте данного описания "адъювант" означает вещество, которое служит для повышения иммуногенности иммуногенной композиции согласно данному изобретению. Таким образом, адъюванты часто вводятся для усиления иммунной реакции и являются хорошо известными среди специалистов в данной области. Подходящими адъювантами для повышения эффективности композиции, помимо прочих, являются:

(1) соли алюминия (квасцы), такие, как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия и т.п.;

(2) композиции в форме эмульсий "масло в воде" (с другими конкретными иммуностимулирующими агентами, такими, как мурамилпептиды (определенные ниже) или компоненты стенок бактериальных клеток, или без них), например,

(a) MF59 (Заявка РСТ WO 90/14837), содержащий 5% сквалена, 0,5% Tween 80 и 0,5% Span 85 (с необязательным содержанием разных количеств МТР-РЕ (см. ниже, хотя не обязательно)), сформулированный в форме субмикронных частиц при помощи микрофлюидизатора, такого, как Model HOY (Microfluidics, Newton, MA),

(b) SAF, содержащий 10% сквалена, 0,4% Tween 80, 5% блок-сополимер этилена и оксида пропилена L121 и thr-MDP (см. ниже), микрофлюидизированный в субмикронную эмульсию или подвергнутый вихреванию для образования эмульсии с большим размером частиц, и

(c) адъювант Ribi adjuvant system (RAS) (Corixa, Hamilton, MT), содержащий 2% сквалена, 0.2% Tween 80 и один или несколько компонентов стенок бактериальных клеток из группы, состоящей из 3-O-деацилированного монофосфорилипида A (MPL), описанного в Патенте США №4,912,094 (Corixa), димиколата трегалозы (TDM) и скелета клеточной стенки (CWS), предпочтительно MPL+CWS (Detox);

(d) Полисорбат 80 (Tween 80);

(3) могут применяться сапониновые адъюванты, такие, как Quil А или STIMULON QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (Патент США №5,057,540), или образованные из них частицы, такие, как ISCOM (иммуностимулирующие комплексы);

(4) бактериальные липополисахариды, аналоги синтетического липида А, такие, как соединения аминоалкил глюкозамин фосфата (AGP) или их производные или аналоги, которые могут быть приобретены у Corixa, и которые описываются в Патенте США №6,113,918; одним таким AGP является 2-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоиламино] этил 2-деокси-4-O-фосфоно-3-O-[(Р)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоил]-2-[(Р)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоиламино]-b-D-глюкопиранозид, также известный как 529 (ранее известный как RC529), который формулируется как водная форма или как устойчивая эмульсия, синтетические полинуклеотиды, такие, как олигонуклеотиды, содержащие мотив(ы) CpG (Патент США №6,207,646);

(5) цитокины, такие, как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 и т.п.), интерфероны (например, гамма-интерферон), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), фактор некроза опухолей (TNF), костимулирующие молекулы В7-1 и В7-2 и т.п.;

(6) детоксифицированные мутанты бактериального АДФ-рибозилирующего токсина, такого, как токсин холеры (СТ) в немутантной или мутантной форме, где, например, глутаминовая кислота в аминокислотной позиции 29 заменена на другую аминокислоту, предпочтительно гистидин, в соответствии с опубликованной международной патентной заявкой WO00/18434 (см. также документы WO02/098368 и WO02/098369), токсин коклюша (РТ) или термолабильный токсин (LT) E. coli, в частности, LT-K63, LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129 (см., например, документы WO93/13302 и WO92/19265); и

(7) другие вещества, действующие в качестве иммуностимулирующих агентов для повышения эффективности композиции, такие, как соль кальция, железо, цинк, суспензия ацилированного тирозина, ацилированный сахар, дериватизированные сахара/сахариды, полифосфазены, биодеградируемые микросферы, монофосфорил липид А (MPL), производные липида А (например, со сниженной токсичностью), 3-0-деацилированный MPL, quil А, Сапонин, QS21, токол, неполный адъювант Фрейнда (Difco Laboratories, Detroit, Ml), Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ), AS-2 (Smith-Kline Beecham, Philadelphia, PA), олигонуклеотиды CpG (предпочтительно неметилированные), биоадгезивы и мукоадгезивы, микрочастицы, липосомы, композиции эфиров полиоксиэтилена, композиции сложных эфиров полиоксиэтилена и мурамилпептиды или соединения имидазохинолона. Мурамилпептидами, помимо прочих являются N-ацетил-мурамил-L-треонил-О-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетил-нормурамил-L-anaHHH-2-(1’-2’дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (МТР-РЕ) и т.п.

В некоторых вариантах осуществления композиция адъюванта способствует индукции цитокинов TH1-типа (например, IFN-γ, TNFα, IL-2 и IL-12) в большей степени, чем цитокинов ТН2-типа, что может способствовать вызыванию клеточно-опосредованных иммунных реакций на введенный антиген. К конкретным адъювантным системам, способствующим преимущественно TH1-ответу, помимо прочих, относятся производные липида А, такие, как монофосфорил липид А (MPL) или его производные, например, 3-де-O-ацилированный MPL (3D-MPL), комбинация MPL и/или 3D-MPL и соль алюминия и/или производная сапонина (например, QS21 в комбинации с 3D-MPL, как описывается в документе WO 94/00153, или QS21 и холестерин, как описывается в документе WO96/33739), тритерпеноиды, и эмульсии типа "масло в воде", например, содержащие токоферол (как описывается в документе WO95/17210).

Адъювант необязательно может быть адсорбирован или скомбинирован с одним или несколькими иммуногенными компонентами сохраняемой композиции вакцины согласно изобретению. В контексте данного описания термин "адсорбированный антиген" означает смесь, в которой более 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% антигена адсорбируется адъювантом. В некоторых вариантах осуществления адъювант адсорбируется фосфатом алюминия (Al+) или гидроксифосфатом алюминия. Так правило, общее содержание алюминия составляет 200-1000 мкг, 300-900 мкг, 400-800 мкг, 500-700 мкг или около 630 мкг Al+ на дозу 0,5 мл, который может быть полностью гидроксидом алюминия или полностью фосфатом алюминия. В альтернативном варианте содержание Al+ может обеспечиваться смесью гидроксида алюминия и фосфата алюминия в разных соотношениях, например, 1:8-8:1, 1:4-4:1, 3:8-8:3, 1:2-2:1 или 1:1 фосфата алюминия:гидроксида алюминия. Хотя большинство алюминия обеспечивается предварительно адсорбированными антигенами до смешивания для образования комбинированной вакцины, определенная часть алюминия может добавляться в свободной форме во время формулирования комбинированной вакцины согласно изобретению, например, до описанного авторами этапа регулирования pH. Как правило, содержание свободного алюминия на дозу 0,5 мл может составлять 0-300 мкг, 50-250 мкг, 75-200 мкг, 100-150 мкг или около 120 мкг Al3+. Свободный Al3+ может представлять полностью Al(ОН)3 или полностью AlPO4, или смесь Al(ОН)3 и A1PO4 в разных соотношениях.

Антигенные компоненты вакцины могут быть по отдельности предварительно адсорбированы на соль алюминия перед смешиванием. В другом варианте осуществления смесь антигенов может быть предварительно адсорбирована перед смешиванием с другими адъювантами. В альтернативном варианте некоторые компоненты вакцин согласно изобретению могут быть сформулированы, но без преднамеренного адсорбирования на адъювант.

Композиции согласно изобретению также может включать один или несколько из компонентов, к которым относятся буфер, соль, двухвалентный катион, неионный детергент, криопротектор, такой, как сахар, и антиоксидант, такой, как акцептор свободных радикалов или комплексообразующий агент, или комбинацию любого их множества. Выбор любого компонента, например, комплексона, может определять целесообразность применения другого компонента (например, акцептора). Готовая композиция, сформулированная для введения, должна быть стерильной и/или апирогенной. Специалист в данной области может эмпирическим путем определить, какие комбинации этих и других компонентов будут оптимальными для включения в содержащие консервант композиции вакцин согласно изобретению в зависимости от различных факторов, таких, как конкретные необходимые условия хранения и введения.

В некоторых вариантах осуществления композиция согласно изобретению, совместимая с парентеральным введением, включает один или несколько физиологически приемлемых буферов, выбранных, помимо прочих, из Tris (триметамина), фосфата, ацетата, бората, цитрата, глицина, гистидина и сукцината. В некоторых вариантах осуществления композиция буферируется в диапазоне pH от приблизительно 6,0 до приблизительно 9,0, предпочтительно от приблизительно 6,4 до приблизительно 7,4.

В некоторых вариантах осуществления может быть желательным регулирование уровня pH иммуногенной композиции согласно изобретению. Уровень pH композиции согласно изобретению может регулироваться с применением стандартных способов, принятых в данной области. Уровень pH композиции может регулироваться между показателями от 3,0 и 8,0. В некоторых вариантах осуществления уровень pH композиции может составлять или может регулироваться между показателями от 3,0 до 6.0, от 4,0 до 6,0 или от 5,0 до 8,0. В других вариантах осуществления уровень pH композиции может составлять или может регулироваться до показателя приблизительно 3,0, приблизительно 3,5, приблизительно 4,0, приблизительно 4,5, приблизительно 5,0, приблизительно 5,5, приблизительно 5,8, приблизительно 6,0, приблизительно 6,5, приблизительно 7,0, приблизительно 7,5 или приблизительно 8,0. В некоторых вариантах осуществления уровень pH композиции может составлять или может регулироваться между показателями от 4,5 до 7,5 или от 4,5 до 6,5, от 5,0 до 5,4, от 5,4 до 5,5, от 5,5 до 5,6, от 5,6 до 5,7, от 5,7 до 5,8, от 5,8 до 5,9, от 5,9 до 6,0, от 6,0 до 6,1, от 6,1 до 6,2, от 6,2 до 6,3, от 6,3 до 6,5, от 6,5 до 7,0, от 7,0 до 7,5 или от 7,5 до 8,0. В конкретном варианте осуществления уровень pH композиции составляет приблизительно 5,8.

В некоторых вариантах осуществления композиция согласно изобретению, совместимая с парентеральным введением, включает один или несколько двухвалентных катионов, включая, помимо прочих, MgCl₂, CaCl₂ и MnCl₂, в концентрации от приблизительно 0,1 мМ до приблизительно 10 мМ, предпочтительно до приблизительно 5 мМ.

В некоторых вариантах осуществления композиция согласно изобретению, совместимая с парентеральным введением, включает одну или несколько солей, включая, помимо прочих, хлорид натрия, хлорид калия, сульфат натрия и сульфат калия, присутствующие с ионной силой, которая является физиологически приемлемой для субъекта после парентерального введения, и включенные в конечной концентрации для обеспечения выбранной ионной силы или осмоляльности в конечной композиции. Конечная ионная сила или осмоляльность композиции определяется многими компонентами (например, ионами из буферного(ых) соединения(й) и других небуферных солей). Предпочтительная соль, NaCl, присутствует в количестве до приблизительно 250 мМ, причем концентрацию солей выбирают таким образом, чтобы дополнять другие компоненты (например, сахара), чтобы конечная общая осмолярность композиции была совместимой с парентеральным введением (например, внутримышечной или подкожной инъекцией) и способствовала долгосрочной устойчивости иммуногенных компонентов композиции вакцины в различных диапазонах температур. Бессолевые композиции должны выдерживать повышенное количество одного или нескольких выбранных криопротекторов для поддержания нужного конечного уровня осмолярности.

В некоторых вариантах осуществления композиция согласно изобретению, совместимая с парентеральным введением, включает один или несколько криопротекторов, выбранных, помимо прочего, из дисахаридов (например, лактозы, мальтозы, сахарозы или трегалозы) и полигидроксиуглеводородов (например, дульцита, глицерина, маннита и сорбита).

В некоторых вариантах осуществления осмолярность композиции составляет от приблизительно 200 мОс/л до приблизительно 800 мОс/л, предпочтительно от приблизительно 250 мОс/л до приблизительно 500 мОс/л или приблизительно 300 мОс/л - приблизительно 400 мОс/л. Бессолевая композиция может содержать, например, от приблизительно 5% до приблизительно 25% сахарозы, предпочтительно от приблизительно 7% до приблизительно 15% или от приблизительно 10% до приблизительно 12% сахарозы. В альтернативном варианте бессолевая композиция может содержать, например, от приблизительно 3% до приблизительно 12% сорбита, предпочтительно приблизительно от 4% до 7%, или приблизительно от 5% до приблизительно 6% сорбита. Если добавляют соль, такую, как хлорид натрия, эффективное количество сахарозы или сорбита является относительно сниженным. Эти и другие подобные показатели осмоляльности и осмолярности могут легко определяться специалистами в данной области.

В некоторых вариантах осуществления композиция согласно изобретению, совместимая с парентеральным введением, включает один или несколько ингибиторов окисления свободных радикалов и/или комплексообразующих агентов. Различные акцепторы свободных радикалов и комплексоны известны специалистам в данной области и применимы к описанным авторами композициям и способам использования. Примерами, помимо прочих, могут быть этанол, ЭДТА, комбинация ЭТА/этанола, триэтаноламин, маннит, гистидин, глицерин, цитрат натрия, гексафосфат инозита, триполифосфат, аскорбиновая кислота/аскорбат, янтарная кислота/сукцинат, яблочная кислота/малеат, десферал, ЭДОФА и ДТПА и различные комбинации двух и более вышеупомянутых соединений. В некоторых вариантах осуществления может добавляться как минимум один не восстановительный акцептор свободных радикалов в концентрации, которая эффективно повышает долгосрочную устойчивость композиции. Также в различных комбинациях могут добавляться один или несколько ингибиторов окисления свободных радикалов/комплексонов, такие, как акцептор и двухвалентный катион. Выбор комплексона определяет целесообразность добавления акцептора.

В некоторых вариантах осуществления композиция согласно изобретению, совместимая с парентеральным введением, включает одно или несколько неионных поверхностно-активных веществ, включая, помимо прочих, полиоксиэтиленовые эфиры сорбита и жирной кислоты, Полисорбат-80 (Tween 80), Полисорбат-60 (Tween 60), Полисорбат-40 (Tween 40) и Полисорбат-20 (Tween 20), полиоксиэтиленовые алкил эфиры, включая, помимо прочих, Brij 58, Brij 35, а также другие, такие, как Triton Х-100; Triton X-114, NP40, Span 85 и неионные поверхностно-активные вещества серии Pluronic (например, Pluronic 121), с предпочтительными компонентами Полисорбат-80 в концентрации от приблизительно 0,001% до приблизительно 2% (предпочтительно до приблизительно 0,25%) или Полисорбат-40 в концентрации приблизительно от 0,001% до 1% (предпочтительно до приблизительно 0,5%).

В некоторых вариантах осуществления композиция согласно изобретению включает один или несколько дополнительных стабилизаторов, приемлемых для парентерального введения, например, восстановитель, включающий как минимум одну тиольную (-SH) группу (например, цистеин, N-ацетил цистеин, восстановленный глутатион, тиогликолят натрия, тиосульфат, монотиоглицерин или их смеси). В альтернативном варианте или необязательно содержащие консервант композиции вакцин согласно изобретению могут быть дополнительно стабилизированы путем удаления кислорода из вместилищ для хранения, защищающих композицию от воздействия света (например, путем использования вместилищ из янтарного стекла).

Содержащие консервант композиции вакцин согласно изобретению могут включать один или несколько фармацевтически приемлемых носителей или формообразующих, к которым относится любое формообразующее, которое само не вызывает иммунную реакцию. Приемлемые формообразующие, помимо прочих, включают макромолекулы, такие, как белки, сахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, полипептиды, сахароза (Paoletti et al, 2001, Vaccine, 19: 2118), трегалоза, лактоза и агрегаты липидов (такие, как капельки масла или липосомы). Такие носители являются хорошо известными среди специалистов в данной области. Фармацевтически приемлемые формообразующие обсуждаются, например, в публикации Gennaro, 2000, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20^th edition, ISBN: 0683306472.

Композиции согласно изобретению могут быть лиофилизированными или существующими в водной форме, то есть, в форме растворов или суспензий. Жидкие композиции преимущественно вводят непосредственно из тары, в которой они содержатся и, таким образом, являются идеальными для инъекций без необходимости в восстановлении влагосодержания в водной среде, как требовалось бы для лиофилизированных композиций согласно изобретению.

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения вакцина представляет собой поливалентную иммуногенную композицию, включающую один или несколько пневмококковых капсульных полисахаридов, выбранных из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6 В, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F и 23F, по отдельности конъюгированных с CRM₁₉₇ Вакцину формулируют таким образом, чтобы она включала: от 1 до 5 мкг, предпочтительно приблизительно 4,4 мкг/мл каждого полисахарида, предпочтительно приблизительно 8,8 мкг/мл 6 В; от 20 до 100 мкг/мл, предпочтительно приблизительно 58 мкг/мл CRM₁₉₇ белка-носителя; от 0,02 до 2 мг/мл, предпочтительно 0,25 мг/мл элементного алюминия в форме фосфата алюминия; от 0,5 до 1,25%, предпочтительно приблизительно 0,85% хлорида натрия; от 0,002 до 0,2%, предпочтительно приблизительно 0,02% полисорбата 80; от 1 до 10 мМ, предпочтительно приблизительно 5 мМ буфера на основе сукцината натрия при pH от 4 до 7, предпочтительно при pH 5,8; и от 4 до 20 мг/мл, предпочтительно приблизительно 10 мг/мл 2-феноксиэтанола.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения вакцина представляет собой поливалентную иммуногенную композицию, содержащую пневмококковые капсульные полисахариды из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6 В, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F и 23F, по отдельности конъюгированные с CRM₁₉₇ Вакцину формулируют таким образом, чтобы она включала: приблизительно 4.4 мкг/мл каждого сахарида, за исключением 6 В в количестве приблизительно 8,8 мкг/мл; приблизительно 58 мкг/мл CRM₁₉₇ белка-носителя; приблизительно 0,25 мг/мл элементного алюминия в форме фосфата алюминия; приблизительно 0,85% хлорида натрия; приблизительно 0,02% полисорбата 80; приблизительно 5 мМ буфер на основе сукцината натрия при pH 5,8; и приблизительно 10 мг/мл 2-феноксиэтанола.

Количество многих из материалов, которые может включать композиция согласно изобретению, может быть выражено как масса/доза, масса/объем или процентная концентрация (как масса/объем или масса/масса). Все эти значения могут быть преобразованы из одного в другое. Для преобразования в единицу масса/доза и наоборот указывается объем дозы. Например, при дозе 0,5 мл 5,0 мг/дозу 2-РЕ является эквивалентом концентрации 10 мг/мл или 1,0% (г/100 мл).

Состав вакцины также может быть выражен как соотношение полисахарида:2-РЕ. Например, доза 0,5 мл предпочтительной композиции 4,4 мкг/мл каждого сахарида, за исключением 6B в количестве 8,8 мкг/мл, и 10 мг/мл 2-РЕ включает 30,8 мкг полисахарида (2,2 мкг × 12 серотипов +4,4 мкг для серотипа 6 В) и 5000 мкг 2-РЕ. Таким образом, массовое соотношение полисахарида:2-РЕ составляет 30,8:5000.

В некоторых вариантах осуществления изобретения массовое соотношение полисахарида:2-РЕ в вакцине составляет от 5:5000 до 100:5000. В предпочтительном варианте осуществления изобретения вышеупомянутое массовое соотношение полисахарида:2-РЕ составляет приблизительно 30,8:5000.

Доставка композиций вакцин

Также обеспечиваются способы применения описанных фармацевтических композиций, включающих как минимум один консервант, для вызывания иммунной реакции против пневмококка у млекопитающего, такого, как человек, предпочтительно у ребенка или грудного ребенка, и для защиты таким образом от инфекции. Композиции вакцин согласно настоящему изобретению могут применяться для защиты человека, восприимчивого к пневмококковой инфекции, путем системного или мукозального введения вакцины. К этим способам введения относятся, например, парентеральное введение или мукозальное введение через рот/пищеварительный тракт, дыхательные пути мочеполовой тракт.

Прямая доставка вакцинных композиций согласно настоящему изобретению в организм субъекта может осуществляться путем парентерального введения (внутримышечно, внутрибрюшинно, внутрикожно, подкожно, внутривенно или в интерстициальное пространство ткани); или путем ректального, перорального вагинального, местного, чрескожного, внутриносового, глазного, ушного, легочного или другого мукозального введения. В предпочтительном варианте осуществления парентеральное введение осуществляют путем внутримышечной инъекции, например, в бедро и плечо субъекта. Инъекция может осуществляться при помощи иглы (например, иглы для подкожных инъекций), однако в альтернативном варианте может применяться безыгольная инъекция. Типичная внутримышечная доза составляет 0,5 мл. Композиции согласно изобретению могут приготавливаться в различных формах, например, для инъекций в форме растворов или суспензий. В некоторых вариантах осуществления композиция может приготавливаться в форме порошка или аэрозоля для легочного введения, например, в виде ингалятора. В других вариантах осуществления композиция может быть изготовлена в форме суппозитория или пессария, или для назального, ушного или глазного введения, например, в форме аэрозоля, капель, геля или порошка.

В одном варианте осуществления может применяться внутриносовое введение для профилактики пневмонии или отита среднего уха (поскольку таким образом может эффективно предотвращаться носоглоточное носительство пневмококков, инфекция ослабляется на самой ранней стадии).

Количество конъюгата в каждой дозе вакцины выбирают как количество, вызывающее иммунопротективную реакцию без значительных неблагоприятных воздействий. Такое количество может колебаться в зависимости от пневмококкового серотипа. Как правило, каждая доза включает от 0,1 до 100 мкг полисахарида, в частности, от 0,1 до 10 мкг, в частности, от 1 до 5 мкг.

Оптимальное количество компонентов для конкретной вакцины может устанавливаться путем стандартных исследований, включающих наблюдение за соответствующими иммунными реакциями у субъектов. После первичной вакцинации субъекты могут получать одну или несколько бустер-иммунизаций с надлежащими интервалами.

Привычный график прививок для грудных и начинающих ходить детей от инвазивного заболевания, вызванного S. Pneumoniae, обусловленный серотипами, включенными в вакцину Prev(e)nar 13 предусматривает введение в возрасте 2, 4, 6 и 12-15 месяцев. Композиции согласно настоящему изобретению также могут применяться для старших детей, подростков, тинейджеров и взрослых, для которых могут быть приемлемы те же или другие привычные графики применения, определяемые специалистами в данной области.

Упаковка и лекарственные формы

Вакцины согласно изобретению могут расфасовываться в однодозовую или многодозовую форму (например, 2 дозы, 4 дозы или более). Для многодозовых форм обычно, но не обязательно, флаконам отдают предпочтение перед предварительно заполненными шприцами. Приемлемые многодозовые форматы, помимо прочих, относятся: от 2 до 10 доз на упаковку при 0,1-2 мл на дозу. В некоторых вариантах осуществления доза составляет 0,5 мл. См., например, международную патентную заявку WO2007/127668, включенную в данное описание путем ссылки.

Композиции могут содержаться в флаконах или других подходящих вместилищах для хранения, или могут содержаться в предварительно заполненных устройствах для доставки, например, одно- или многокомпонентных шприцах, которые могут поставляться с иглами или без них. Шприц обычно, но не обязательно, включает единичную дозу содержащей консервант композиции вакцины согласно изобретению, хотя также могут предусматриваться и многодозовые предварительно наполненные шприцы. Подобным образом флакон может включать единичную дозу, но в альтернативном варианте может включать несколько доз.

Эффективные объемы доз могут устанавливаться традиционным образом, однако типичная доза композиции для инъекций имеет объем 0,5 мл. В некоторых вариантах осуществления доза формулируется для введения человеку. В некоторых вариантах осуществления доза формулируется для введения взрослому человеку, тинейджеру, подростку, начинающему ходить или грудному ребенку (то есть, в возрасте не более года) и в предпочтительных вариантах осуществления может вводиться путем инъекции.

Жидкие вакцины согласно изобретению также приемлемы для восстановления влагосодержания других вакцин, предусмотренных в лиофилизированной форме. Если применение вакцины предусмотрено для такого немедленного восстановления влагосодержания, изобретение обеспечивает комплект с двумя или более флаконами, двумя или более предварительно наполненными шприцами, или каждой (одной или несколькими) из таких форм, причем содержание флакона применяется для восстановления влагосодержания содержимого флакона перед инъекцией, или наоборот.

В альтернативном варианте композиции вакцин согласно настоящему изобретению могут быть лиофилизированы и восстановлены, например, с применением одного или нескольких способов высушивания замораживанием, общеизвестных среди специалистов в данной области, для образования сухих, имеющих правильную форму (например, сферическую) частиц, таких, как микропеллеты или микросферы, имеющие характеристики частиц, такие, как средний диаметр, которые могут выбираться и регулироваться путем варьирования конкретных способов, применяемых для их изготовления. Композиции вакцин также могут включать адъювант, который необязательно может быть получен с отдельными сухими, имеющими правильную форму (например, сферическую) частицами, такими, как микропеллеты или микросферы, или содержаться в них. В таких вариантах осуществления настоящее изобретение также обеспечивает комплект вакцины, включающий первый компонент, включающий стабилизированную сухую композицию вакцины, которая необязательно также включает один или несколько консервантов согласно изобретению, и второй компонент, включающий стерильный водный раствор для восстановления влагосодержания первого компонента. В некоторых вариантах осуществления водный раствор включает один или несколько консервантов и необязательно может включать как минимум один адъювант (см., например, WO2009/109550 (включенный в данное описание путем ссылки).

В еще одном варианте осуществления контейнер многодозового формата выбирают из группы, к которой относятся, помимо прочих, лабораторная стеклянная посуда общего назначения, колбы, мензурки, мерные цилиндры, ферментаторы, биореакторы, пробирки, трубки, пакеты, банки, флаконы, крышки флаконов (например, резиновые пробки, резьбовые колпачки), ампулы, шприцы, двух- или многокамерные шприцы, шприц-пробки, поршни шприцев, резиновые крышки, пластиковые крышки, стеклянные крышки, картриджи и одноразовые шприц-ручки и т.п. Материалы, из которых изготавливают контейнер согласно настоящему изобретению, не ограничиваются, и к ним относятся такие материалы, как стекло, металлы (например, сталь, нержавеющая сталь, алюминий и т.п.) и полимеры (например, термопласты, эластомеры, термопластичные эластомеры). В конкретном варианте осуществления контейнер соответствующего формата представляет собой 5 мл стеклянный флакон Schott Type 1 с бутиловой пробкой. Специалисту в данной области станет понятно, что вышеуказанные форматы не представляют исчерпывающий список, а только служат ориентиром для специалиста относительно различных форматов, приемлемых для настоящего изобретения. Дополнительные форматы, которые могут использоваться согласно настоящему изобретению, можно найти в опубликованных каталогах поставщиков и производителей лабораторного оборудования, таких, как United States Plastic Corp. (Lima, ОН), VWR. Способы оценки эффективности консервантов в композициях вакцин Настоящее изобретение также обеспечивает новые способы измерения эффективности композиции вакцины, включающей один или несколько выбранных консервантов в присутствии некоторых или всех иммуногенных и неиммуногенных компонентов композиции вакцины. Протокол ВО3 об эффективности консервантов предусматривает применение тестов согласно USP и ЕР и включает принципы «политики открытых флаконов» (Open Vial Policy) при выполнении определенных испытаний. Типичным испытанием эффективности консерванта является испытание с однократной провокацией, при котором испытуемую композицию прививают один раз с выбранной популяцией микроорганизмов и логарифмическое уменьшение привитого микроорганизма с течением времени и в конкретных условиях среды (например, температуры) сравнивают с логарифмическим уменьшением привитого микроорганизма в контрольной композиции без испытуемого(ых) консерванта(ов). См., например, Примеры 2 и 3 ниже. Однако дополнительных испытаний не требуется для исследования эффективности консерванта после многократных загрязнений, например, для исследования флаконов и пробок путем многократного затравливания одних и тех же флаконов.

Соответственно, изобретение предусматривает испытание с многократной провокацией для оценки эффективности одного или нескольких консервантов в иммуногенной композиции, причем испытание включает как минимум два этапа прививки испытуемой композицией с выбранной популяцией микроорганизмов и сравнение снижения привитого(ых) микроорганизма(ов) с течением времени и в конкретных условиях среды (например, температуры) со снижением в контрольной композиции без испытуемого(ых) консерванта(ов). См. Примеры 4 и 5 ниже.

Эффективность консерванта

Содержащие консервант композиции вакцин согласно настоящему изобретению являются приемлемыми для заполнения многодозовых флаконов или вместилищ, совместимых, например, с парентеральным введением, и сохраняют устойчивость в течение длительных периодов времени при 2-8°С, комнатной температуре или 37°С со сниженной или пренебрежимой потерей активности по сравнению с той же композицией, не содержащей консерванта(ов).

Количество консерванта в композиции выбирают таким образом, чтобы выполнялось требование к безопасности вакцины, определенное в фармакопеях США, Европы или Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) или их комбинации.

Для определения уровня консерванта согласно Фармакопеям США и Европы (USP и ЕР, соответственно), композицию вакцины прививают один раз с использованием приблизительно от 10⁵ до 10⁶ КОЕ/мл в момент начала отсчета времени (КОЕ=колониеобразующие единицы):

1. Staphylococcus aureus (бактерии; АТСС # 6538; "SA")

2. Pseudomonas aeruginosa (бактерии; АТСС # 9027; "PA")

3. Candida ate/cans (дрожжи; АТСС # 10231; "СА")

4. Aspergillus niger (плесень; АТСС # 16404; "AN") Для представления наихудшего возможного случая загрязнения, который может произойти на практике во время многократного использования многодозовой формы, ВО3 требует проведения испытания безопасности с преднамеренным подверганием воздействию многократного загрязнения с использованием бактериальных штаммов, Pseudomonas Aeruginosa ("PA"), Staphylococcus Aureus ("SA"), Escherichia coli ("EC") и Bacillus subtilis ("BA"). В композиции добавляют 5×10³ КОЕ/мл каждого организма в момент начала отсчета времени, через 6 часов, 24 часа, 7 дней и 14 дней после первичной провокации и хранят при 2-8°С или при 22-24°С для моделирования возможных условий хранения на практике.

USP 29 NF 24, Приложение 2 (USP) требует, чтобы после прививки бактериальным(и) микроорганизмом(ами) логарифмическое уменьшение составляло как минимум 1,0 по сравнению с предыдущим рассчитанным значением (то есть, во время прививки) за 7 дней, логарифмическое уменьшение как минимум 3,0 за 14 дней по сравнению с предыдущим измеренным значением, и не наблюдалось повышения через 28 дней по сравнению с предыдущим измеренным значением. См. Таблицу 1. Для дрожжей и грибков требование USP состоит в отсутствии повышения со времени прививки через 7, 14 и 28 дней.

Требования ЕР более жестки. Требования ЕР, 5-е издание, 5.6 (5.1.3) для парентеральный и глазных композиций включают два компонента: Категорию А и Категорию В. Категория А (ЕР-А) для бактерий требует логарифмического уменьшения как минимум 2,0 по сравнению с предыдущим рассчитанным значением через 6 часов после прививки, логарифмического уменьшения как минимум 3,0 по сравнению с предыдущим измеренным значением за 24 часа и отсутствия восстановления через 28 дней. Категория В (ЕР-В) для бактерий требует логарифмического уменьшения как минимум 1,0 по сравнению с предыдущим рассчитанным значением за 24 часа, логарифмического уменьшения как минимум 3,0 за 7 дней по сравнению с предыдущим измеренным значением и логарифмического увеличения не более, чем 0,5 по сравнению с предыдущим измеренным значением (то есть без увеличения) через 28 дней. См. Таблицу 1. Для дрожжей и грибков Категория А требует логарифмического уменьшения как минимум 2,0 за 7 дней по сравнению с предыдущим рассчитанным значением и отсутствия повышения через 28 дней по сравнению с предыдущим измеренным значением; и Категория В требует логарифмического уменьшения как минимум 1,0 по сравнению с предыдущим рассчитанным значением через 14 дней и отсутствия повышения через 28 дней по сравнению с предыдущим измеренным значением.

Таблица 1 Критерии приемлемости для испытания эффективности консерванта между фармакопеями США, Европы и Японии Организмы Способ Логарифмическое уменьшение КОЕ/мл 6 ч 24 ч 7 д 14 д 28 д Бактерии ЕР А* 2 3 - - NR*** ЕР В - 1 3 - Nl** USP - - 1 3 Nl JP - - - 3 Nl Дрожжи и грибки ЕР А - - 2 - Nl ЕР В - - - 1 Nl USP - - Nl Nl Nl JP - - - Nl Nl * Критерии А означают рекомендуемую эффективность, которая должна достигаться. В оправданных случаях, если критерии А не могут быть достигнуты, должны удовлетворяться критерии В.
** Nl: без увеличения: определяется как увеличение не более, чем на 0,5 log₁₀ по сравнению с предыдущим измеренным значением.
*** NR: отсутствие восстановления

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения консервант согласно изобретению эффективен для снижения концентрации микроорганизмов в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция вакцины, включающая как минимум один консервант, снижает концентрацию одного или нескольких микроорганизмов после прививки вышеупомянутыми микроорганизмами по сравнению с композицией вакцины без одного или нескольких консервантов. В конкретном варианте осуществления изобретения композиция демонстрирует логарифмическое уменьшение как минимум 1,0 по сравнению с изначальным числом микроорганизмов за 24 часа, логарифмическое уменьшение как минимум 3,0 за 7 дней по сравнению с предыдущим измеренным значением и логарифмическое увеличение не более, чем 0,5, через 28 дней по сравнению с предыдущим измеренным значением. В другом конкретном варианте осуществления изобретения композиция демонстрирует логарифмическое уменьшение как минимум 2,0 по сравнению с предыдущим рассчитанным значением через 6 часов после прививки, логарифмическое уменьшение как минимум 3,0 за 24 часа по сравнению с предыдущим измеренным значением и отсутствие восстановления через 28 дней по сравнению с изначальным числом микроорганизмов. В другом варианте осуществления изобретения композиция соответствует требованиям Европейской фармакопеи (ЕР) для парентеральных и глазных препаратов, в частности, требованиям Категории А (ЕР-А) и/или Категории В (ЕР-В) ЕР, 5-е издание, 5.6 (5.1.3). В другом варианте осуществления изобретения композиция соответствует требованиям Фармакопеи США (USP) 29 NF 24, Приложение 2, для парентеральных препаратов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения как минимум один консервант согласно изобретению эффективен для снижения концентрации микроорганизмов в композиции при провокации микроорганизмами по сравнению с композицией без одного или нескольких консервантов. Микроорганизмами могут быть, помимо прочих, один или несколько из следующих: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Candida albicans Aspergillus niger и другие.

В некоторых вариантах осуществления изобретения микроорганизмы могут вводиться или прививаться в вакцину один или несколько раз с разными интервалами. Прививка может осуществляться в рамках спланированной экспериментальной прививки или с использованием загрязненной иглы для подкожных инъекций, введенной во сосуд с многодозовой композицией вакцины. Интервал между прививками может составлять от 1 минуты до 1 месяца. В конкретном варианте осуществления осуществляют несколько прививок после первичной прививки, через 6 часов после первой прививки, через 24 часа после первой прививки, через 7 дней после первой прививки и через 14 дней после первой прививки.

Параметры вакцины и устойчивость консерванта

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенность как минимум одной антигенной детерминанты (то есть, полисахаридной композиции из серотипа Streptococcus pneumoniae) в композиции вакцины сохраняет устойчивость в пределах определенного диапазона времени и температуры. Антигенность может измеряться известными специалистам в данной области способами. Например, общая антигенность может определяться путем применения типоспецифических антисывороток, как описывается в Примере 3.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенность как минимум одной антигенной детерминанты в композиции вакцины сохраняет устойчивость в течение не менее 4 недель, не менее 6 недель, не менее 8 недель, не менее 10 недель, не менее 12 недель, не менее 18 недель, не менее 24 недель, не менее 48 недель, не менее 1 года, не менее 1,25 года, не менее 1,5 года, не менее 1,75 года, не менее 2 лет, не менее 2,25 года или не менее 2,5 года. Предпочтительно антигенность множества антигенных детерминант, например, как минимум 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более антигенных детерминант в вакцине в композиции сохраняет устойчивость в течение не менее 4 недель, не менее 6 недель, не менее 8 недель, не менее 10 недель, не менее 12 недель, не менее 18 недель, не менее 24 недель, не менее 48 недель, не менее 1 года, не менее 1,25 года, не менее 1,5 года, не менее 1,75 года, не менее 2 лет, не менее 2,25 года или не менее 2.5 года.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенность как минимум одной антигенной детерминанты в композиции вакцины устойчива при хранении при температуре от приблизительно -25°С до приблизительно 37°С или от -20 до -10°С или от 2 до 8°С или приблизительно при комнатной температуре или от 22°С до 28°С или приблизительно 37°С. В конкретном варианте осуществления изобретения антигенность как минимум одной антигенной детерминанты в композиции вакцины устойчива после хранения в течение не менее 2,5 года при температуре от 2 до 8°С.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения концентрация консерванта согласно изобретению устойчива после хранения вакцины в течение вышеупомянутого периода времени и при вышеупомянутых температурах хранения. В конкретном варианте осуществления изобретения концентрация консерванта в композиции вакцины устойчива после хранения вакцины в течение не менее 2,5 года при температуре от 2 до 8°С. Концентрация консерванта может быть измерена известными специалистам в данной области способами. Например, Тимеросал может измеряться с применением спектрометрии при помощи атомной абсорбции с использованием низкотемпературного пара (CVAAS), как описывается в Примере 3. Концентрация по 2-ЕР может измеряться при помощи ВЭЖХ с обращением фаз, так же, как описывается в Примере 3. Анализ при помощи ВЭЖХ с обращением фаз может выполняться следующим образом: образцы подвергают вихреванию и разбавляют в соотношении 1:10 в 5 мМ сукцинатного буфера в солевом растворе, центрифугируют и снова разбавляют в соотношении 1:10 в 5 мМ сукцинатного буфера в солевом растворе (окончательное разбавление испытуемого образца составляет 1:100). Затем образец анализируют, используя колонку для ВЭЖХ Agilent Eclipse XDB-C18 и линейный градиент воды и ацетонитрила с содержанием трифтороуксусной кислоты. Количественное определение консерванта затем сравнивают со стандартной кривой. См. также, Sharma et al., Biologicals 36(1): 61-63 (2008).

Выше настоящее изобретение было описано в общих чертах. Более полное понимание может быть получено по ознакомлении с представленными ниже конкретными примерами. Эти примеры описываются только с целью пояснения и не ограничивают объем изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1 - Исследование с предварительным отбором консервантов

Разработку композиции многодозовой вакцины Prev(e)nar 13 начинали с предварительного отбора консервантов, включая фенол (0,25%), 2-феноксиэтанол (5 мг/мл), мета-крезол (0,3%), метилпарабен и пропилпарабен (0,18% и 0,12%, соответственно) в композициях Prev(e)nar 13.

Для испытания на эффективность консерванта аликвоты вакцины прививали следующими организмами:

1. Staphylococcus aureus (бактерии; АТСС # 6538)

2. Pseudomonas aeruginosa (бактерии; АТСС # 9027)

3. Candida albicans (дрожжи; АТСС # 10231)

4. Aspergillus niger (плесень; АТСС # 16404)

Тринадцать миллилитров (мл) каждой композиции вакцины с Тимеросалом или 2-РЕ или без них в указанной концентрации или солевой раствор, содержащий Тимеросал в концентрации 0,02%, прививали в трех экземплярах суспензией каждого испытуемого организма для достижения плотности посева приблизительно от 10⁵ до 10⁶ КОЕ/мл в момент начала отсчета времени (КОЕ=колониеобразующие единицы). Объем каждого прививочного материала не превышал 1% от объема продукта во время каждой запланированной провокации. Образцы смешивали для обеспечения равномерного распределения провоцирующих организмов. Еще 30 мл вакцины в трех экземплярах (с консервантом и без него) использовали в качестве негативного контроля и смешивали только с культуральной средой для оценки собственного загрязнения, которое может присутствовать в образце или среде. Каждую из трех серий вакцин и позитивные и негативные контрольные образцы затем отдельно инкубировали при температуре от 20 до 25°С. Аликвоты (1 мл) провоцируемых образцов и контрольных образцов (в их соответствующем десятикратном разбавлении) пересчитывали путем чашечного подсчета в двух экземплярах в момент начала отсчета времени и с интервалами в 6 часов, 24 часа, 7 дней, 14 дней и 28 дней после прививки.

USP 29 NF 24, Приложение 2 (USP), требует, чтобы после прививки бактериального(ых) микроорганизма(ов), обеспечивалось логарифмическое уменьшение как минимум 1,0 по сравнению с предыдущим рассчитанным значением (то есть, во время прививки) за 7 дней, логарифмическое уменьшение как минимум 3,0 через 14 дней по сравнению с предыдущим измеренным значением и не наблюдалось повышения через 28 дней по сравнению с предыдущим измеренным значением. См. Таблицу 1. Для дрожжей и грибков требование USP состоит в отсутствии повышения со времени прививки до 7, 14 и 28 дней.

Требования ЕР более жестки. ЕР, 5-е издание, 5.6 (5.1.3), требует для парентеральных и глазных препаратов двух компонентов: Категории А и Категории В. Категория А (ЕР-А) для бактерий требует логарифмического уменьшения как минимум 2,0 по сравнению с предыдущим рассчитанным значением через 6 часов после прививки, логарифмического уменьшения как минимум 3,0 за 24 часа по сравнению с предыдущим измеренным значением и отсутствия восстановления через 28 дней. Категория В (ЕР-В) для бактерий требует логарифмического уменьшения как минимум 1,0 за 24 часа по сравнению с предыдущим рассчитанным значением, логарифмического уменьшения как минимум 3,0 за 7 дней по сравнению с предыдущим измеренным значением и логарифмического увеличения не более, чем 0,5, через 28 дней по сравнению с предыдущим измеренным значением (то есть, без увеличения). См. Таблицу 1. Для дрожжей и грибков Категория А требует логарифмического уменьшения как минимум 2,0 за 7 дней и без увеличения по сравнению с предыдущим измеренным значением через 28 дней, и Категория В требует логарифмического уменьшения как минимум 1,0 через 14 дней и без увеличения по сравнению с предыдущим измеренным значением через 28 дней.

Во время подсчета использовали чашки, содержавшие <300 КОЕ для бактерий или <100 КОЕ для дрожжей или плесени. Для исследований с однократной провокацией измеряли среднеарифметическое число всех выживших микроорганизмов в трех экземплярах и на чашках в двух экземплярах (6 значений для каждого момента времени) плюс их разбавленные образцы и нормализовали как КОЕ/мл. Результаты выражали как среднее снижение log₁₀ КОЕ/мл (по сравнению с моментом отсчета времени). В этом случае число выживших микроорганизмов определяют в момент начала отсчета времени как исходное значение и сравнивают с показателем после инкубации в течение 6 часов, 24 часов, 7 дней, 14 дней и 28 дней.

Испытуемые консерванты не продемонстрировали явного воздействия на устойчивость Prev(e)nar 13, за исключением парабенов (метилпарабена и пропилпарабена), которые продемонстрировали снижение связанной с Prev(e)nar 13 антигенности. Кроме того, фенол, мета-крезол, метил- и пропилпарабены влияли на модифицированный белковый анализ Лоури (концентрация белка в вакцине определяется при помощи серийно выпускаемого комплекта для модифицированного белкового анализа Лоури).

Результаты испытания эффективности консерванта (PET) показали, что все испытанные консерванты соответствовали требованиям USP, но не критериям ЕР (ЕР-А или ЕР-В). См. Таблицу 2. 2-РЕ был единственным возможным консервантом, который был безопасным при более высоких дозах. Таким образом, осуществляли дальнейшие испытания эффективности консерванта с более высокими дозами 2-РЕ.

Таблица 2 Эффективность потенциальных консервантов в соответствии с требованиями к безопасности вакцин USP и ЕР* после однократной провокации микроорганизмов Доза 0,5 мл Консервант Провоцирующие организмы Бактерии Дрожжи Грибки S aureus E. coli P. aeruginosa C. albicans A. niger 2-феноксиэтанол, 5,0 мг/мл USP Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. ЕР Несоотв. Несоотв. Несоотв. Несоотв. Несоотв. 0,3% м крезола USP Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. ЕР Несоотв. Несоотв. Несоотв. Соотв. Соотв. 0,18% метилпарабенов и 0,02% пропилпарабенов USP Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. ЕР Несоотв. Несоотв. Несоотв. Соотв. Соотв. 0,25% фенола USP Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. ЕР Несоотв. Несоотв. Несоотв. Соотв. Соотв. * ЕР-В

Пример 2 - Испытание эффективности консерванта путем однократной провокации: 2-РЕ и Тимеросал

Тимеросал в концентрации 0,01% широко применяют в большинстве вакцин, лицензированных в США. Эффективность Тимеросала в качестве консерванта испытывали, определяя тот же способ однократной провокации, описанный выше в Примере 1. Композиция вакцины Prev(e)nar 13, содержащая Тимеросал в количестве 0,01% (эквивалент 25 мкг ртути на дозу 0,5 мл) не соответствовала европейским критериям приемлемости ЕР-А или ЕР-В, определяемым способом согласно ЕР для антимикробной эффективности консерванта. Однако она соответствовала допустимым пределам, установленным фармакопеями США или Японии, поскольку допустимые пределы, установленные этими фармакопейными способами, являются менее жесткими по сравнению с установленными в ЕР. См. Фигуру 1.

Тимеросал в концентрации 0,02% (с содержанием 50 мкг ртути на дозу), которая является эквивалентом двойной рекомендуемой концентрации Тимеросала в некоторых лицензированных в США вакцинах, или в концентрации 0,04% (с содержанием 100 мкг ртути на дозу), которая является эквивалентом четырехкратной рекомендуемой концентрации Тимеросала в некоторых лицензированных в США вакцинах, соответствовал определяемым в ЕР критериям приемлемости В, но не соответствовал более жестким критериям приемлемости А (с однократной провокацией микроорганизмов). См. Фигуру 1.

2-РЕ был более эффективен в качестве консерванта, чем Тимеросал. Хотя 2-РЕ при 2,5 мг/дозу не соответствовал определенным в ЕР критериям приемлемости А и В, 2-РЕ в концентрации от 3,5 до 5,5 мг/дозу соответствовал определенным в ЕР критериям приемлемости В. В концентрации свыше 6,0 мг/дозу 2-РЕ соответствовал критериям приемлемости антимикробной эффективности ЕР-А и ЕР-В (Фигура 2).

Пример 3 - Способ однократной провокации с 2-РЕ и Тимеросалом: изменение уровня загрязнения

Отсутствие консервантов в композиции вакцины Prev(e)nar 13 в результате приводило к медленному росту Р. aeruginosa, не вызывало изменений уровня С. albicans и A. niger и приводило к медленному снижению колониеобразующих единиц S. aureus за 28-дневный провокационный период при 20-25°С (Фигура 3).

Присутствие 0,01% Тимеросала (с содержанием 25 мкг ртути на дозу) снижало уровень загрязнения всех четырех привитых микроорганизмов. Однако ингибирование S. aureus и С. albicans было слабее, чем ингибирование Р. aeruginosa и А. niger (Фигура 4). Наблюдалась зависимость реакции от дозы, влияющая на антимикробный эффект Тимеросала в композициях вакцин Prev(e)nar 13, в частности, против С. albicans, причем снижение уровня загрязнения было более выраженным при 0,02% Тимеросала (Фигура 5). Отсутствие Prev(e)nar 13 в содержащей 0,02% Тимеросала композиции в солевом растворе несколько улучшало эффективность Тимеросала в ингибировании роста в отношении S. aureus и С. albicans (Фигура 6).

2-РЕ был более эффективен в качестве консерванта, чем Тимеросал. Например, в отличие от медленного снижения S. aureus при применении Тимеросала, антимикробная эффективность 5,0 мг/дозу 2-РЕ в результате обеспечивала снижение S. aureus до исходного значения за 24 часа после прививки (Фигура 7). Хотя 2-РЕ был менее эффективен, чем Тимеросал, в качестве консерванта против А. niger (Фигура 7), и показатель снижения загрязнения А. niger был меньше по сравнению с Тимеросалом (Фигуры 4 и 5), более высокая эффективность 2-РЕ по отношению к другим штаммам позволяла соответствовать критериям приемлемости консерванта ЕР-В в концентрации 3,5 и 5 мг/дозу (Фигура 2), в отличие от 0,01% Тимеросала (Фигура 1).

Эффективность консерванта 2-РЕ при 3,5-5,0 мг/дозу сохранялась, когда композиции хранили при 37°С в течение месяца или при 2-8°С в течение двух с половиной лет (Фигура 2). Концентрация 2-РЕ в композиции имела подобную устойчивость (Фигура 15). Иммунологическая активность (общая антигенность) каждого из 13 серотипов, присутствующих в композиции Prev(e)nar 13, также была устойчивой в этих условиях хранения (Фигура 14).

Общая антигенность была обусловлена как связанными, так и несвязанными полисахаридами, присутствующими в вакцине для каждого серотипа. Типоспецифическую антигенность определяли путем применения типоспецифических антисывороток. Перед анализом 13-валентную вакцину, сформулированную с фосфатом алюминия, сначала солюбилизировали. Затем раствор нейтрализовали во избежание вызванного щелочью распада. С использованием нефелометра при анализе измеряли показатель изменения интенсивности светорассеяния вследствие образования комплекса антитело-антиген. Антигенность испытуемых образцов определяли при помощи линейной регрессии с использованием стандартных кривых, измеряемых непосредственно до или после анализа образцов.

Для обеспечения содержания Тимеросала в вакцине Prev(e)nar 13 и композициях в солевом растворе определяли концентрацию ртути в некоторых из композиций с применением способа спектрометрии при помощи атомной абсорбции с использованием низкотемпературного пара (CVAAS). Измеренная концентрация ртути была очень приближенной к прогнозируемым значениям, что указывало на то, что концентрация Тимеросала в этих композициях соответствовала требуемому значению и не была заниженной. Измеренная концентрация 2-РЕ также была очень приближенной к прогнозируемому значению и не изменялась со временем при хранении композиций Prev(e)nar 13 при 2-8°С или 37°С. Концентрацию 2-РЕ измеряли при помощи ВЭЖХ с обращением фаз. Образцы подвергали вихреванию и разбавляли в соотношении 1:10 в 5 мМ сукцинатного буфера в солевом растворе, центрифугировали и снова разбавляли в соотношении 1:10 в 5 мМ сукцинатного буфера в солевом растворе. Окончательное разбавление испытуемого образца составляло 1:100. При анализе использовали колонку для ВЭЖХ Agilent Eclipse XDB-C18 и линейный градиент воды и ацетонитрила с содержанием трифтороуксусной кислоты. 2-РЕ в образцах многодозовой вакцины 13vPnC количественно определяли по стандартной кривой 2-РЕ. См. также, Sharma et al., Biologicals 36(1): 61-63 (2008).

Пример 4 - Испытание эффективности консерванта путем множественных провокаций: Тимеросал

Для оценки целесообразности применения принятой ВО3 «политики открытых флаконов» в отношении многодозовых вакцин при проведении кампаний по множественной иммунизации длительностью до четырех недель осуществляли экспериментальный план, предусмотренный ВО3. В этом исследовании эффективность Тимеросала оценивали в концентрации, в которой он присутствует в большинстве лицензированных в США вакцин (0,01%), а также в более высокой концентрации 0,02%. Для представления наихудшего возможного случая загрязнения, который может случиться на практике во время многократного использования многодозовой формы, и для испытания на соответствие требованиям ВО3 композиции вакцины Prev(e)nar 13 с 0,01 или 0,02% Тимеросала или с 5,0 мг/дозу 2-РЕ преднамеренно подвергали многократному загрязнению с применением рекомендованных ВОЗ бактериальных штаммов, Р. aeruginosa, S. aureus, Е. coli и В. subtilis. В композиции добавляли 5×10³ КОЕ/мл каждого организма в момент начала отсчета времени, через 6 часов, 24 часа, 7 дней и 14 дней после первичной провокации и хранили при 2-8°С или при 22-24°С для моделирования возможных условиях хранения на практике. Композицию в солевом растворе, содержащую 0,02% Тимеросала, также использовали в качестве контроля для оценки возможного воздействия Prev(e)nar 13 на антимикробную эффективность Тимеросала в композиции.

После многократного преднамеренного загрязнения композиции вакцины Prev(e)nar 13 при отсутствии консерванта уровень организмов Р. aeruginosa и Е. coli в процессе исследования возрастал, в особенности при хранении при 22-24°С (Фигуры 8А и 8В). Уровень S. aureus в композиции, которую хранили при 22-24°С, медленно снижался, подобно ситуации, наблюдаемой во время исследования с однократной провокацией (Фигура 8А в сравнении с Фигурой 3). Жизнеспособность В. subtilis снижалась еще более заметно (Фигуры 8А и 8 В). Эти результаты указывают, что В. subtilis не является устойчивым организмом в этой композиции для использования в качестве модели для таких исследований провокации при испытании эффективности консерванта, несмотря на то, что он был рекомендован ВО3.

В композиции вакцины Prev(e)nar 13 антибактериальная эффективность 0,01% Тимеросала была наивысшей для В. Subtilis, а затем для Р. aeruginosa. Однако снижение S. aureus и Е. coli было медленным, в особенности при хранении композиций при 2-8°С (Фигуры 9А и 9В).

Как показывается в анализе нелинейной регрессии снижения жизнеспособности S. aureus на Фигуре 12, скорость снижения для S. aureus была значительно меньше (-5,98 log₁₀ снижением в день и с 50%-м снижением за 30,28 дней) при хранении композиции при 2-8°С в сравнении с хранением при 22-24°С (-1,39 log₁₀ снижение в день и с 50%-м снижением за 6,2 дней) (Фигура 12). Эти результаты демонстрируют, что 0,01% Тимеросала в композиции вакцины Prev(e)nar 13, которые загрязняются на практике в процессе многодозовой доставки и в дальнейшем хранятся при температуре замораживания, неэффективны для уменьшения бактериального загрязнения.

Эффективность Тимеросала зависела как от концентрации, так и от температуры (Фигуры 9 и 10). Тимеросал был более эффективным консервантом при более высокой концентрации 0,02%. Он также был более эффективным консервантом при более высокой температуре хранения 22-24°С. Однако, как обсуждалось выше, даже при концентрации 0,02% и хранении при 22-24°С Тимеросал не соответствовал требованиям ЕР, ни ЕР-А, ни ЕР-В, когда эти критерии применялись во время исследований с многократной провокацией (Фигура 1).

Для исследования воздействия самой вакцины на действие Тимеросала в качестве консерванта эффективность 0,02% Тимеросала при многократных провокациях сравнивали между солевым раствором и композицией вакцины Prev(e)nar 13. В присутствии 0,02% Тимеросала скорость снижения как для S. Aureus, так и для E. coli, была более выраженной в композиции солевого раствора, чем в композиции вакцины (Фигура 11 в сравнении с Фигурой 10 и Фигурой 12), что демонстрирует, что присутствие вакцины в определенной мере снижало эффективность Тимеросала в качестве консерванта. Несмотря на это, даже в композиции солевого раствора в качестве контроля, которая не содержала вакцины, 0,02% Тимеросала все же соответствовали критериям приемлемости ЕР-А или ЕР-В при многократных провокациях (Фигура 1).

Пример 5 - Испытание эффективности консерванта способом многократных провокаций: 2-РЕ

В отличие от недостаточной эффективности Тимеросала в качестве консерванта, в особенности при множественных прививках или хранении при 2-8°С, композиция вакцины Prev(e)nar 13, содержащая 5 мг/дозу 2-РЕ в качестве консерванта в результате ведет к большему подавлению жизнеспособности S. aureus, независимо от способа провокации (то есть, однократной или множественной) или температуры хранения (Фигура 12).

Фактически при выполнении способа многократных провокаций, независимо от температуры хранения, и при всех испытываемых организмах (Р. aeruginosa, S. aureus, E. coli и B. subtilis), 2-РЕ в количестве 5 мг/дозу превосходил в качестве консерванта 0,01% Тимеросала. При анализе нелинейной регрессии в исследованиях снижения S. aureus в различных провокационных исследованиях композиции вакцин с 2-РЕ демонстрировали большую скорость снижения микробного загрязнения по сравнению с Тимеросалом, как в отношении 50%-го снижения, так и в отношении и среднего уклона снижения (log₁₀ снижение/день). См. Фигуру 12. Кроме того, 2-РЕ в количестве 5 мг/дозу соответствовал критериям ЕР-В при многократной провокации, в то время, как ни один из вариантов Тимеросала не обеспечивал соответствия при тех же условиях (Фигура 13).

Тимеросал не является эффективным консервантом для защиты Prev(e)nar 13 в многодозовой композиции от потенциального загрязнения, которое может быть внесено во время распределения. Это становится еще более очевидным, когда загрязнение вносится много раз во время введения доз субъектам при многодозовых композициях. Тимеросал имеет низкую скорость инактивации, в частности, отношении S. aureus и E. coli. с запаздыванием немедленного эффекта очищения от потенциально загрязняющих организмов в случаях, когда врачи общей практики могут извлекать вакцины из многодозовых флаконов в неблагоприятных гигиенических условиях. Однако 2-РЕ в количестве от 3,5 до 5 мг/дозу является устойчивым с гораздо более высоким показателем антимикробной эффективности в сравнении с Тимеросалом и, таким образом, защищает продукт от непреднамеренного загрязнения при введении доз субъектам.

Пример 6 - Иммунная реакция, вызванная иммунизацией Prevenar 13 с 2-феноксиэтанолом в качестве консерванта или без него у отличных от человека приматов

Способность Prevenar 13 и Prevenar 13 с содержанием 2-феноксиэтанола к вызыванию иммунной реакции определяют на яванских макаках.

Для исследования используют две подлежащих иммунизации группы из 10 макак в общем количестве 20 яванских макак, как показано в Таблице 3.

Таблица 3 Группа Макак на группу Вакцина Конечный объем Доставка 1 10 13vPnC 0,5 мл IM 2 10 13vPnC+5 мг 2PE 0,5 мл IM

Предварительно отобранных животных рандомизированно распределяют по двум группам на основе массы тела и исходных титров.

Макаки получают клиническую дозу 13vPnC, содержащую 0 или 5 мг 2-феноксиэтанола в качестве консерванта. Вакцину вводят внутримышечно в одно место четырехглавой мышцы каждой обезьяны. Конечный введенный объем составляет 0,5 мл.

Все макаки получают три дозы и вакцинируются через 2, 4 и 8 недель.

Схема кровопускания: периферическую кровь берут в момент начала исследования и через 6, 8, 10, 12 и 16 недель для наблюдения за вызыванием иммунных реакций на вакцины.

Иммунная реакция, вызванная вакцинацией, наблюдается путем выполнения указанных ниже анализов сыворотки, взятой во время исследования:

In vitro связывание и функциональные антитела:

- Серотип-специфический ELISA-анализ lgG (см., например, Fernsten P, et al., Hum Vaccin. 2011 Jan 1; 7: 75-84)

- Серотип-специфическая опсоно-фагоцитарная проба (ОФП) (см., например, Fernsten P, et al., Hum Vaccin. 2011 Jan 1: 7: 75-84)

- In vivo защита в модели провокации новорожденных крыс (см., например, Fernsten P, et al., Hum Vaccin. 2011 Jan 1: 7: 75-84):

- Объединенные сыворотки макак оценивают в отношении серотип-специфической защиты.

Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии и иммунологии. Описана иммуногенная композиция, включающая множество капсульных полисахаридов из серотипов Streptococcus pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F и 23F, конъюгированных с белком-носителем. Композиция также включает как минимум один консервант, предпочтительно 2-феноксиэтанол (2-РЕ). Содержащие консервант иммуногенные композиции согласно изобретению обеспечивают резистентность к одному или нескольким микроорганизмам и применимы для изготовления многодозовых композиций вакцин, которые обладают благоприятными свойствами в отношении долгосрочной устойчивости различных антигенных детерминант выбранной иммуногенной композиции. Предложенная группа изобретений может быть использована в медицине. 7 н. и 20 з.п. ф-лы, 15 ил., 3 табл., 6 пр.

1. Поливалентная иммуногенная композиция по отношению к пневмококкам, включающая капсульные полисахариды из серотипов Streptococcus pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F, по отдельности конъюгированных с CRM₁₉₇, а также включающая 2-феноксиэтанол (2-РЕ) в концентрации от 7 мг/мл до 15 мг/мл.

2. Поливалентная иммуногенная композиция по п. 1, отличающаяся тем, что вышеупомянутая композиция включает 2-РЕ в концентрации 10 мг/мл.

3. Поливалентная иммуногенная композиция по п. 1, отличающаяся тем, что вышеупомянутая композиция включает 2-РЕ в концентрации 8 мг/мл.

4. Поливалентная иммуногенная композиция по п. 1, отличающаяся тем, что вышеупомянутая композиция включает не менее чем 7 мг/мл 2-РЕ.

5. Поливалентная иммуногенная композиция по п. 1, отличающаяся тем, что вышеупомянутая композиция включает не менее чем 10 мг/мл 2-РЕ.

6. Поливалентная иммуногенная композиция по п. 1, отличающаяся тем, что вышеупомянутая композиция включает не менее чем 15 мг/мл 2-РЕ.

7. Поливалентная иммуногенная композиция по п. 1, отличающаяся тем, что вышеупомянутая композиция также включает адъювант и вышеупомянутым адъювантом является фосфат алюминия.

8. Поливалентная иммуногенная композиция по любому одному из пп. 1-7, отличающаяся тем, что антигенность иммуногенной композиции сохраняет устойчивость в течение не менее 1 года, 1,5 года, 2 лет или 2,5 года.

9. Поливалентная иммуногенная композиция по п. 8, отличающаяся тем, что после прививки одним или несколькими микроорганизмами концентрация вышеупомянутых микроорганизмов со временем снижается.

10. Поливалентная иммуногенная композиция по п. 9, отличающаяся тем, что, после прививки одним или несколькими бактериальными штаммами, композиция обеспечивает логарифмическое уменьшение как минимум 1,0 по сравнению с изначальным числом микроорганизмов за 24 часа, логарифмическое уменьшение как минимум 3,0 за 7 дней по сравнению с предыдущим измеренным значением и логарифмическое увеличение не более чем 0,5 через 28 дней по сравнению с предыдущим измеренным значением.

11. Поливалентная иммуногенная композиция по п. 9, отличающаяся тем, что, после прививки одним или несколькими бактериальными штаммами, композиция обеспечивает логарифмическое уменьшение как минимум 2,0 по сравнению с предыдущим рассчитанным значением через 6 часов после прививки, логарифмическое уменьшение как минимум 3,0 за 24 часа по сравнению с предыдущим измеренным значением и отсутствие восстановления через 28 дней.

12. Поливалентная иммуногенная композиция по любому одному из пп. 9-11, отличающаяся тем, что штаммы микроорганизмов представляют собой один или несколько штаммов, выбранных из P. aeruginosa, S. aureus, Е. coli и В. subtilis.

13. Поливалентная иммуногенная композиция по любому одному из пп. 9-11, отличающаяся тем, что композицию прививают многократно.

14. Поливалентная иммуногенная композиция по п. 12 или 13, отличающаяся тем, что вторая прививка производится через 6 часов после первой прививки, третья прививка производится через 24 часа после первой прививки, третья прививка производится через 7 дней после первой прививки, и четвертая прививка производится через 14 дней после первой прививки.

15. Поливалентная иммуногенная композиция по п. 1, отличающаяся тем, что вышеупомянутая композиция также включает один или несколько из компонентов, к которым относятся буфер, криопротектор, соль, двухвалентный катион, неионный детергент и ингибитор окисления свободных радикалов.

16. Поливалентная иммуногенная композиция по отношению к пневмококкам, содержащая пневмококковые капсульные полисахариды из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F, по отдельности конъюгированные с CRM₁₉₇, где поливалентная иммуногенная композиция формулируется в стерильной жидкости таким образом, чтобы включать: 4,4 мкг/мл каждого полисахарида, за исключением 6В в количестве 8,8 мкг/мл; 58 мкг/мл белка-носителя CRM₁₉₇; 0,25 мг/мл элементного алюминия в форме фосфата алюминия; 0,85% хлорида натрия; 0,02% полисорбата 80; 5 мМ буфера на основе сукцината натрия при рН 5,8; и 10 мг/мл 2-феноксиэтанола.

17. Поливалентная иммуногенная композиция по отношению к пневмококкам, содержащая пневмококковые капсульные полисахариды из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F, по отдельности конъюгированных с CRM₁₉₇, сформулированная таким образом, чтобы включать: 4,4 мкг/мл каждого полисахарида, за исключением 6В в количестве 8,8 мкг/мл; от 20 до 100 мкг/мл белка-носителя CRM₁₉₇; от 0,02 до 2 мг/мл элементного алюминия в форме фосфата алюминия; от 0,5% до 1,25% хлорида натрия; от 0,002% до 0,2% полисорбата 80; от 1 до 10 мМ буфера на основе сукцината натрия при рН от 4 до 7; и от 4 до 20 мг/мл 2-феноксиэтанола.

18. Применение поливалентной иммуногенной композиции по любому одному из пп. 1-17 при производстве вакцин, для наполнения флакона.

19. Применение по п. 18, где вышеупомянутый флакон содержит не более одной дозы иммуногенной композиции.

20. Применение поливалентной иммуногенной композиции по любому одному из пп. 1-17 при производстве вакцин, для наполнения устройства для доставки вакцины.

21. Применение по п. 20, где вышеупомянутое устройство представляет собой или включает шприц.

22. Применение по п. 20, где вышеупомянутое устройство представляет собой или включает двух- или многокамерные шприцы, или колбы, или их комбинации.

23. Применение по п. 20, где вышеупомянутую поливалентную иммуногенную композицию формулируют для внутримышечной или подкожной инъекции.

24. Комплект для приготовления поливалентной иммуногенной композиции по любому одному из пп. 1-17, включающий (i) вышеупомянутое множество капсульных полисахаридов в форме лиофилизированной композиции по любому одному из пп. 1-17, и (ii) водный материал для восстановления влагосодержания компонента (i) с целью обеспечения водной композиции.

25. Применение поливалентной иммуногенной композиции по любому одному из пп. 1-17 при производстве вакцин, для наполнения контейнера, включающего две дозы или более, в количестве от 0,1 до 2 мл на дозу.

26. Применение по п. 25, отличающееся тем, что доза составляет 0,5 мл.

27. Применение по п. 25 или 26, отличающееся тем, что включает от 2 до 10 доз.