КОМБИНИРОВАННАЯ ВАКЦИНА, СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОЙ КОМБИНИРОВАННОЙ ВАКЦИНАЦИИ И СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ИММУНОГЕННОСТИ Российский патент 1998 года по МПК A61K39/116 A61K39/02 

Изобретение относится к комбинированной педиатрической вакцине, включающей дифтерийный антиген, столбнячный антиген, коклюшный антиген и конъюгат фрагментов капсульного полисахаридного антигена Haemophilus influenzae типа b (Hib) и дифтерийного протеина CRM₁₉₇(CRM₁₉₇) в одной иммунизирующей дозе. Эта комбинированная вакцина проявляет улучшенную иммуногенность у младенцев для каждого из четырех вакцинных компонентов по сравнению с ДСК (DTP) и Haemophilus influenzae типа b конъюгатной (Hib конъюгатная) вакцинами, применяемыми одновременно, но раздельно. Изобретение также относится к способам одновременной комбинированной вакцинации и усиления иммуногенности каждого вакцинного компонента в комбинированной вакцине.

Описание известного уровня развития области изобретения
Комбинированные вакцины дают много преимуществ, и их применение в основном поощряется. Оптимальным возрастом для вакцинации против многих заболеваний является период младенчества и раннего детства. Обычно поэтому во время этого периода назначаются многочисленные прививки в течение короткого отрезка времени. Одновременное введение может снизить затраты, связанные с введением вакцины, увеличить темпы вакцинации и дать возможность ранней и широкоохватной иммунизации детей.

Примерами вакцинных комбинаций, используемых для вакцинации детей, являются дифтерийный и столбнячный анатоксины с убитыми целыми клетками Bardetella pertussis (DTP) или с бесклеточными коклюшными антигенами, комбинация живых вакцин кори, эпидемического паротита и краснухи (ММР); трех полиомиелитных серотипов, или живых (пероральная полиомиелитная вакцина) или инактивированных (IPY); и комбинация DTP-IPV.

В настоящее время практика иммунизации в США требует вакцинации младенцев раннего возраста, начиная с двухмесячного возраста, как (1) дифтерийным и столбнячным анатоксином и коклюшной (DTP) вакциной, так и (2) вакциной конъюгата Haemophilus influenzae типа b. Двумя такими коммерчески доступными вакцинами являются Tri Immunol ^® (Lederle Laboratories) и HibTITER ^® (Praxis Biologics, Inc).

Обе эти вакцины рекомендованы для введения в двух-, четырех- и шестимесячном возрасте, с активной иммунизирующей дозой в 15-18 месяцев. Дополнительная доза DTP рекомендуется в 4-6-летнем возрасте. Обе вакцины, вводимые раздельно, обеспечили заметный успех в снижении частоты заболеваемости в Соединенных Штатах.

В то же время было бы желательно объединить в одну вакцину DTP и конъюгат Haemophilus influenzae типа b, чтобы снизить число иммунизаций, которые должен получить ребенок, причем такая комбинация должна иметь приемлемые показатели безвредности и защитной иммуногенности, которые не должны быть меньше, чем у вакцин, вводимых отдельно.

Краткое изложение изобретения
Было обнаружено, что комбинированная педиатрическая вакцина, содержащая в одной иммунизирующей дозе композицию из дифтерийного антигена, столбнячного антигена, коклюшного антигена и конъюгат фрагментов капсульных полисахаридов Haemophilus influenzae типа b и протеина CRM₁₉₇ в фармацевтически приемлемом водном носителе проявляет повышенную иммуногенность у детей для каждого из четырех компонентов вакцины. В частности, комбинированная вакцина настоящего изобретения содержит стерильную смесь дифтерийного анатоксина, адсорбированного фосфатом алюминия, столбнячного анатоксина, адсорбированного фосфатом алюминия, инактивированного Bordetella pertussis и конъюгат фрагментов капсульных полисахаридов Haemophilus influenzae типа b и белка CRM₁₉₇ в фармацевтически приемлемом носителе. После встряхивания композиция комбинированной вакцины настоящего изобретения является гомогенной белой суспензией. Кроме того, вакцинные компоненты стабильны и совместимы и не проявляют взаимной подавляющей активности между компонентами.

Также были найдены способы для одновременно комбинированной вакцинации младенцев и для повышения иммуногенности полисахарида Haemophilus influenzae типа b дифтерийного антигена, столбнячного антигена и коклюшного антигена, как компонентов вакцины. Эти способы включают создание единственной иммунизирующей дозы с дифтерийным антигеном, столбнячным антигеном, коклюшным антигеном и конъюгатом фрагментов капсульных полисахаридов Haemophilus influenzae типа b и белка CRM₁₉₇ и инъекцию этой единственной дозы людям, особенно детям.

Описание предпочтительных примеров осуществления
Композиция комбинированной педиатрической вакцины настоящего изобретения содержит дифтерийный, столбнячный и коклюшный антигены, смешанные с конъюгатом фрагментов капсульных полисахаридов Haemophilus influenzae типа b, ковалентно связанных с CRM₁₉₇. При предпочтительном осуществлении дифтерийный антиген является дифтерийным анатоксином, адсорбированным фосфатом алюминия, и столбнячный антиген является столбнячным анатоксином, адсорбированным фосфатом алюминия. Эти анатоксины могут быть получены хорошо известными в данной области способами. Дифтерийный анатоксин и столбнячный анатоксин получают их Corynebacterium diphtheriae и Clostridium tetani соответственно, которые выращиваются в среде по методу Mueller and Miller, J. Immunol, 1941, 40:21-32 и J.Immunol., 1947, 56:143-147 и детоксифицируют с помощью формальдегида. Анатоксины очищаются по методу спиртового фракционирования Pillemer. , J. Immunol. , 1946, 54:213-224 и разводятся водным раствором, содержащим одноосновной фосфат натрия, двухосновной фосфат натрия, глицин и тимерозал (ртутное производное) в качестве консерванта.

Коклюшный антиген является предпочтительно препаратом целых инактивированных клеток одного штамма или комбинации штаммов Bordetella pertussis. Инактивированный препарат целых коклюшных клеток получают путем выращивания Bordetella pertussis фазы I в модифицированном бульоне Cohen-Whecler, содержащем кислотный гидролизат казеина. Bordetella pertussis инактивируется тимеросалом, отделяется и затем суспендируется в водном растворе, содержащем моноосновной фосфат калия, двухосновной фосфат натрия, хлорид натрия и тимеросал (ртутное производное) в качестве консерванта.

Компоненты DTP могут быть представлены в виде смеси. Например, коммерчески доступный препарат DTP, такой как поставляемый Lederle Laboratories под названием Tri-Immunol ^® может быть использован для композиции комбинированной вакцины настоящего изобретения. Конъюгатный компонент Hib комбинированной вакцины настоящего изобретения содержит фрагменты бактериального капсульного полисахарида Haemophilus influenzae типа b, ковалентно связанные с белком CRM₁₉₇. Фрагменты получают путем постепенного расщепления очищенного капсульного полисахарида, выделенного из Haemophilus influenzae типа b, выращенной в химически определенной среде. Белок CRM₁₉₇ является нетоксичным вариантом дифтерийного токсина, выделенного из культур C. diphteriae штамма С7 (бета 197), выращенных в среде на основе казаминокислот и дрожжевого экстракта. Фрагменты Haemophilus influenzae типа b соединяли с белком CRM₁₉₇ путем ковалентного связывания. Особенно предпочтителен способ ковалентного связывания сахарида с белком - восстановительное аминирование. Получение конъюгатов Haemophilus influenzae типа b и CRM₁₉₇ путем восстановительного аминирования описано в патентах США 4673574, 4761283 и 4902506. Конъюгат очищают путем диафильтрации, чтобы удалить непрореагировавший белок или полисахаридные фрагменты и реагенты и стерилизуют фильтрованием. Коммерчески доступный конъюгат Haemophilus influenzae типа b, такой как поставляемый Praxis Biologics, Inc. , под названием HibTITER может быть использован для композиции комбинированной вакцины настоящего изобретения.

Композиция комбинированной вакцины настоящего изобретения получается путем добавления концентрата конъюгата Haemophilus influenzae типа b к препарату DTP, когда вакцина DTP разбавляется доведением до окончательного объема. Окончательная иммунизирующая доза поэтому остается в объеме 0,5 мл. Каждая единичная доза в 0,5 мл комбинированной вакцины составляется так, что она содержит минимум 7,5 Lf дифтерийного анатоксина, 5 Lf столбнячного анатоксина (оба анатоксина индуцируют образование не менее, чем 2 единиц антитоксина на мл при определении эффективности на морских свинках), 10 мкг очищенного сахарида Haemophilus influenzae типа b и примерно 25 мкг белка CRM₁₉₇. Каждая доза вакцины составляется так, чтобы содержать менее 16 OPU инактивированных коклюшных клеток. Общая иммунизирующая доза (первые три вводимые дозы по 0,5 мл) для людей содержит по оценке 12 единиц коклюшной вакцины с оценкой в 4 защитных единицы на одну человеческую дозу. Каждый компонент вакцины - дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин, коклюшный и конъюгат Haemophilus influenzae типа b - удовлетворяет стандартам необходимой активности.

В качестве консерванта добавляется тимеросал (ртутное производное) к комбинированной вакцине до конечной концентрации 1:10000. Содержание алюминия в дозе окончательного продукта не превышает 0,85 мг на 0,5 мл дозу по результатам определения. Остаточное содержание свободного формальдегида по результатам исследования ≤ 0,02%.

Комбинированная вакцина, содержащая каждый из четырех вакцинных компонентов (D,T,P и конъюгат Hib получается в виде водной композиции. После взбалтывания вакцина представляет собой гомогенную белую суспензию. В комбинированную вакцину могут также включаться подходящие вакцинные адъюванты. Вакцина вводится с помощью внутримышечного пути введения.

Четырехкомпонентную комбинированную вакцину получали, как описано выше, используя DTP (Tri-Immunol ^® , Lederle Laboratories) и конъюгат Hib (HibTITER ^®, Praxic Biologics).

Повышенная иммуногенность каждого из четырех компонентов в объединенной вакцине была показана при клинических испытаниях. Изучение безопасности и иммуногенности было проведено у начинающих ходить детей и младенцев при участии многих медцентров. Кроме того, было проведено широкомасштабное исследование безопасности применения у младенцев, чтобы оценить появление редких побочных явлений на большом числе субъектов.

Для обоих исследований по безвредности и иммуногенности у детей, начинающих ходить, и младенцев субъекты для введения или единственной дозы 0,5 мл, одной из трех последовательных в серии введений четырехкомпонентной объединенной вакцины (D,T,P и конъюгат Hib объединенные) или дозы 0,5 мл каждой из DTP и конъюгатой Hib вакцин, выбранных на одной из трех соответствующих серий DTP и конъюгата Hib, вводимых одновременно в виде отдельных инъекций (DTP- конъюгат Hib отдельно) в возрасте 18±3 месяца или в примерно 2-, 4- и 6-месячном возрасте, отбирались по методу случайной выборки. Таким образом субъекты относились к одной из шести групп, проходивших курс профилактики. Безвредность при остром воздействии вакцины оценивали по сообщениям родителей о побочных эффектах в течение 72 часов после каждой иммунизации. Иммуногенность определяли с помощью серологического анализа на антитела к полисахариду Hoemophilus influenzae типа b (полисахариду Hib дифтерийных, столбнячных и коклюшных).

Протокол каждой стадии анализировали независимо. Первичный анализ данных по безвредности и иммуногенности позволил заключить, что все три последовательных серии четырехкомпонентной комбинированной вакцины были сходны по всем испытанным параметрам, и таким образом данные объединялись. Это же наблюдалось и для трех соответствующих серий DTP и конъюгата Hib, которые вводили одновременно в виде раздельных инъекций.

8. Исследование безвредности и иммуногенности для детей, начинающих ходить.

В протокол исследования у детей, начинающих ходить, были включены общим числом 125 субъектов (для комбинированной вакцины n=107, для DTP- конъюгат Hib отдельно n=108), отобранные в каждом лечебном учреждении из 4 по методу случайной выборки. Демографические характеристики всех субъектов были сходными.

Серологический анализ образцов сыворотки до и спустя месяц после иммунизации не выявил различий в реакции на полисахарид Hib дифтерию или столбняк (смотрите таблицу 1). Однако антительная реакция на коклюшные агглютинины была значительно выше в группе, получавшей комбинированную вакцину (142,58) по сравнению с группой, получавшей DTP-конъюгат Hib отдельно (82,44: p=0,013).

6. Исследование без вредности и иммуногенности для младенцев.

В протокол исследования младенцев было включено всего 378 субъектов (для комбинированной вакцины n= 189, для DTP - конъюгата Hib отдельно n=189) и отобраны по методу случайной выборки в каждом из пяти клинических учреждений. Демографические характеристики всех субъектов были сходными.

Реакция на полисахарид Hib после каждой из трех иммунизаций была выше у субъектов, получавших комбинированную вакцину (см. таблицу 2). После двух доз среднее геометрическое значение титра (СГТ) в группе комбинированной вакцины составило 0,66 мкг/мл по сравнению с 0,34 мкг/мл в группе, получавшей DTP-конъюгат Hib отдельно (p< 0,001). Та же самая тенденция наблюдалась после третьей дозы, 6,67 мкг/мл, по сравнению с 4,42 мкг/мл для комбинированной вакцины и DTP - конъюгата Hib отдельных вакцин соответственно (p= 0,034).

Серологическую реакцию на компоненты DTP определяли через месяц после введения третьей дозы, СГТ антител к дифтерии (0,71 IV/мл против 0,40 IV/мл; p = 0,009), столбняка (8,20 против 4,51; p<0,001) и коклюшным агглютининам (51,93 против 23,34; p=0,008) был во всех случаях значительно выше в группе, получавшей комбинированную вакцину по сравнению с группой, получавшей раздельное введение, соответственно (смотрите таблицу 2). В случае дифтерии и коклюша это развитие терялось, если сравнивали отношение реакции к основному титру. Сыворотку субпопуляции анализировали на антитела к специфическим коклюшным антигенам; коклюшному токсину (КТ), FHA и белку 69К, Реакция на КТ (85,92 против 17,60 p= 0,001) и FHA (2,32 против 0,79; p=0,0001) была значительно выше в группе, получавшей комбинированную вакцину по сравнению с группой, получавшей раздельное введение, соответственно (смотрите таблицу 3). Однако никакого различия не наблюдалось для 69К (комбинированная вакцина 66,43 против 41,55; p = 0,11 при раздельном введении).

В. Широкомасштабное исследование безвредности и иммуногенности для младенцев в субпопуляциях.

Широкомасштабное исследование безопасности для младенцев было проведено в рамках Kaiser Permanente Medical Care program of Nothern California. Это исследование проводилось по плану как со случайной, так и с неслучайной выборкой. Первая выборка позволяла накопить данные по применению комбинированной вакцины у больного числа субъектов (n=5777). Последняя выборка являлась контролем, при котором безвредность комбинированной вакцины (n=720) могла перспективно сравниваться с безвредностью в группе, получавшей DTP - конъюгат Hib (n=691) одновременно в виде отдельных инфекций. Таким образом, 3 дозы комбинированной вакцины (D, T, P и конъюгата Hib объединенных) получили всего 6497 субъектов возрастом примерно 2,4 и 6 месяцев.

Частоту местных и системных явлений определяли в течение 24 часов иммунизации. Редкие проявления, такие как припадки, оценивались путем определения числа госпитализаций в течение 60 дней и вызовов скорой помощи на дом в течение 30 дней иммунизации. Для трех рассмотренных серий местные и системные реакции не встречались закономерно более часто после применения комбинированной вакцины по сравнению с одной DTP. Кроме того, не существует значительного различия для частот побочных явлений, связанных с применением лекарственных средств, наблюдаемых при госпитализации или вызовах скорой помощи. Уровень смертности от синдрома внезапной смерти младенцев был несколько ниже в группе комбинированной вакцины, чем в контрольной группе.

Антительные реакции на полисахарид Hib дифтерию, столбняк и коклюш определяли через месяц после введения третьей дозы комбинированной вакцины у субпопуляции из 123 субъектов. Полученные значения были сравнимы со значениями, полученными при изучении безопасности и иммуногенности у младенцев с участием многих медцентров, описанными выше (смотрите таблицу 4).

г.Серологические методики
Серологические исследования выполняли с помощью ELISA на антитела к полисахариду Haemophilus influenzae типа b и столбнячные (в исследованиях у младенцев), путем определения с клетками Vero (J. Biol. Stand 2:189-201; J. Biol Stand. 2:203-209) на дифтерийные антитела, по методу летальности мышей (Bull. WHO 43:453-459; Minimum Reguirements: Tetanus Toxoid Appendix A, June 15, 1953, Pub. Health Serv. NIH, Craig, 1986, Manual of Clinical Laboratory Immunol, pp 408-414 3 rd ed), на столбнячные антитела (исследование у детей, начинающих ходить) и путем пробы микроагглютинации (Manelark et al., 1986, Manual of Clinical Laboratory Immunol, pp 388-394, 3 rd ed), на коклюшные антитела.

Как будет ясно из данных клинического изучения, представленных здесь, реакция у младенцев на каждый из вакцинных компонентов была выше в случае комбинированной вакцины, чем при одновременном, но раздельном введении DTP и конъюгата Hib вакцин. Использование такой комбинированной вакцины таким образом может вдвое уменьшить количество прививок, получаемых младенцами, и является поэтому важным шагом в направлении улучшения проведения вакцинации.

Комбинированная вакцина предназначена для вакцинации детей одной иммунизирующей дозой. Вакцина проявляет улучшенную иммуногенность у младенцев для каждого из четырех вакцинных компонентов. Комбинированная вакцина содержит в одной иммунизирующей дозе дифтерийный, столбнячный, коклюшный антигены и конъюгат фрагментов капсульных полисахаридов Haemophilus influenzae 2 типа b и протеина CRM₁₉₇ в фармацевтически приемлемом водном носителе. Дифтерийный и столбнячный антигены могут быть представлены соответствующим анатоксином. Коклюшный антиген может быть представлен инактивированными клетками Bordetella pertussis. Дифтерийный и столбнячный анатоксин адсорбируют на фосфате алюминия. Инактивированные клетки Bordetella pertussis вводят в виде суспензии с первичным кислым фосфатом калия, вторичным кислым фосфатом натрия и хлоридом натрия. 3 с. и 8 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Комбинированная вакцина на основе смеси диортерийного, столбнячного и коклюшного антигенов с капсульным полисахаридным антигеном в фармацевтически приемлемом водном носителе, отличающаяся тем, что она содержит капсульный полисахаридный антиген в виде конъюгата с белком CRM₁₉₇, при этом компоненты вакцины берут в количествах, обеспечивающих повышенное образование антител к каждому из антигенов. 2. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве дифтерийного и столбнячного антигенов она содержит соответствующий анатоксин, а в качестве коклюшного антигена - инактивированные клетки Bordetella pertussis. 3. Вакцина по п. 2, отличающаяся тем, что она содержит дифтерийный и столбнячный анатоксины, адсорбированные на фосфате алюминия, а инактивированные клетки Bordetella pertussis - в виде суспензии с первичным кислым фосфатом калия, вторичным кислым фосфатом натрия и хлоридом натрия. 4. Способ одновременной комбинированной вакцинации, предусматривающий введение комбинированной вакцины, отличающийся тем, что вводят вакцину по п. 1. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что вводят вакцину по п.2. 6. Способ по п.4, отличающийся тем, что вводят вакцину по п.3. 7. Способ по п.4, отличающийся тем, что вакцину вводят внутримышечно. 8. Способ повышения иммуногенности Haemophiles influenzae типа b, дифтерийного антигена, столбнячного антигена и коклюшного антигенных компонентов комбинированной вакцины, отличающийся тем, что вводят разовую дозу комбинированной вакцины по п.1. 9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что дифтерийный антиген является дифтерийным анатоксином, столбнячный антиген является столбнячным анатоксином и коклюшный антиген является инактивированными клетками Bordetella pertussis. 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что дифтерийный анатоксин адсорбирован на фосфате алюминия, столбнячный анатоксин адсорбирован на фосфате алюминия и инактивированные клетки Bordetella pertussis суспендированы в растворе, содержащем первичный кислый фосфат калия, вторичный кислый фосфат натрия и хлорид натрия. 11. Способ по п.8, отличающийся тем, что вакцину вводят внутримышечно.