ШТАММ ТУЛЯРЕМИЙНОГО БАКТЕРИОФАГА ГАЛ Российский патент 2009 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к средствам лабораторной диагностики туляремии, и может быть использовано в научных и практических лабораториях, занимающихся индикацией и идентификацией туляремийных бактерий, выделяемых из организма больного и инфицированных объектов внешней среды.

Известны многие бактериофаги, используемые для идентификации и фаготипирования бактерий различного систематического положения (Медицинская микробиология. / Гл. ред. В.И.Покровский, O.K.Поздеев. - М.: ГЭОТАР, Медицина, 1999). Общими по отношению к заявляемым фагам являются этапы их получения, состоящие в выделении и накоплении фаговых частиц, проверки специфичности свойств и использования в целях лабораторной диагностики. Однако известные бактериофаги не могут быть использованы для идентификации и фаготипирования Francisella tularensis в связи с высокой специфичностью механизмов взаимодействия бактерий и паразитирующих в них вирусов. По этой причине они не способны адсорбироваться на поверхности клеток Francisella tularensis, репродуцироваться в них и вызывать их лизис.

О существовании феномена бактерофагии у туляремийного микроба известно из данных, приведенных в литературе (Н.Г.Олсуфьев Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. - М., Медицина, 1975. - С.115-116). Там же отмечено, что обнаруженный литический агент относится к умеренным фагам, однако выделить бактериофаг не удалось.

Штаммы специфических туляремийных бактериофагов в патентной литературе не описаны.

Задачей изобретения является получение специфического штамма туляремийного бактериофага, предназначенного для идентификации основных подвидов Francisella tularensis и лабораторной диагностики туляремии.

Решение задачи достигается путем выделения бактериофага из органов лабораторных животных, инфицированных живой культурой туляремийного вакцинного штамма №15 линии НИИЭГ.

С целью выделения однородной популяции фага проведена селекция негативных колоний. Чистая линия фага ГАЛ была получена путем десятикратного пассирования отдельных негативных колоний на штамме №15 линии НИИЭГ Francisella tularensis.

Штамм бактериофага ГАЛ хранится в коллекции фагов ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» (г.Киров) и характеризуется следующими морфологическими и физиологическими свойствами.

Фаг ГАЛ относится к первой морфологической группе вирусов бактерий по А.С.Тихоненко (1968 г.). Бактериофаг представляет собой корпускулы нитевидной формы толщиной 20±4 нм и длиной до 400 нм.

Негативные колонии формируются на двухслойном FT-агаре, приготовленном по методу Грациа, с типовой индикаторной культурой Francisella tularensis штамма №501. Через 36-72 часов инкубации при температуре 36-38°С образуются мутные колонии, а также - с прозрачным центром и зоной неполного лизиса по периферии, диаметр которых не превышает 1-2 мм. Мутные негативные колонии имеют следы роста индикаторной культуры. Нанесение фаговой суспензии на газон индикаторной культуры по методу Отто вызывает через 36-72 часа термостатирования при температуре 36-38°С образование зоны специфического лизиса в виде «стерильного» пятна или четко контурируемого мутного пятна, или группы мелких негативных пятен.

Адсорбция фага индикаторными бактериями в жидкой питательной среде на основе ферментативного гидролизата мяса, разведенного дистиллированной водой до содержания аминного азота 145-155 мг%·дм^-3 и с добавлением NaCl - 0,5 г; Na₂HPO₄·12H₂O - 1,0 г; KCl - 0,2 г; дрожжевого экстракта - 0,25 г;, L-цистеина - 0,4 г; остальное - дистиллированная вода, составляет не менее 90 процентов, латентный период - 4 часа, урожайность - 10-12 корпускул на инфицированную клетку.

При посевной дозе n·10⁶ микробных клеток 1-суточной агаровой культуры в 1 см³ указанной среды и множественности инфекции 0,01-0,001 в течение 24-36 часов инкубирования при температуре 36-38°С накапливаются до n·10⁴ БОЕ·см^-3.

Фаг термолабилен. Инактивация начинается при температуре 50°С, а полное разрушение происходит после инкубации при температуре 55°С в течение 30 минут.

Антигенные свойства

При иммунизации кроликов суспензией фага с адъювантом Фрейнда образуются специфические антитела. Полученная антисыворотка нейтрализует фаг с константой нейтрализации 51. Бактериофаг туляремийный ГАЛ относится к ДНК-содержащим фагам.

Специфичность

Бактериофаг лизирует бактерии возбудителей туляремии трех подвидов (среднеазиатский, неарктический и голарктический) и основных видов болезни легионеров (Legionella pneumophila, Legionella, micdadei, Legionella dumoffii и Legionella bozemanii). Фаг ГАЛ не оказывает литического действия на близкородственный вид Francisella novicida, а также на Pasteurella multocida, Yersinia pestis (5 штаммов), Vibrio cholerae, Bacillus anthracis, Brucella abortus, Yersinia pseudotuberculosis, Escherichia coli (4 штамма), Salmonella choleraesuis, Streptococcus faecium, equi, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus saprophyticus и Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, Proteus vulgaris и Proteus mirabilis, Shigella son-nei и Shigella flexneri, Serratia marcescens, Pseudomonas aeroginosa, Burkcholderia mallei, Burkcholderia pseudomallei, Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii.

На фиг 1 показаны частицы туляремийного бактериофага ГАЛ. Контрастирование уранилацетатом X 30000.

На фиг.2 показана адсорбция частиц бактериофага ГАЛ на поверхности Francisella tularensis. Контрастирование уранилацетатом X 30000.

Пример. Фаг ГАЛ репродуцируется на клетках Francisella tularensis штамма №501 в среде на основе ферментативного гидролизата мяса с содержанием аминного азота 145-155 мг%·дм^-3 и с добавлением NaCl - 0,5 г; Na₂HPO₄·12H₂O - 1,0 г; KCl - 0,2 г; дрожжевого экстракта - 0,25 г; L-цистеина - 0,4 г; остальное - дистиллированная вода.

При посевной дозе 2·10⁶ клеток возбудителя туляремии на 1 см³ среды и множественности инфекции 0,01-0,001 при инкубации в течение 24-36 часов при температуре 36-38°С накапливается до n·10⁴ фаговых частиц на 1 см³.

Для получения препарата фага ГАЛ 24-часовую культуру туляремийного микроба штамма №501, выращенную на FT-агаре, вносят в жидкую питательную среду до конечной концентрации 5·10⁶ клеток на 1 см³, добавляют фаг ГАЛ (множественность инфекции 0,01-0,001). Через 24 часа инкубации при температуре 36-38°С к фаголизату добавляют хлороформ по объему (1/35 часть хлороформа по объему), выдерживают 1,5-2 часа при комнатной температуре (18-22°С) и 12 часов в холодильнике (2-8°С). Затем фаголизат фильтруют через стерильные фильтры с размером пор 0,2 мкм. Полученный фильтрат разливают по ампулам и контролируют на специфическую, общую стерильность и активность.

Фаг ГАЛ, подобно типовым фагам других видов, используют для фаготипирования основных подвидов возбудителя туляремии в дифференцирующем рабочем титре (ДРТ).

ДРТ фага определяется следующим образом: 48-часовую туляремийного микроба штамма №501, выращенную на FT-агаре, в объеме 0,1 см³ с концентрацией 1,0 млрд бактериальных клеток по отраслевому стандарту мутности ГКИ, вносят в 10 пробирок с 4,5 см³ расплавленного и остуженного до 47°С 0,7% FT-агара (рН 6,95). Затем в пробирки последовательно добавляют в объеме 0,1 см³ десятикратные разведения фага ГАЛ. Содержимое пробирок перемешивают и выливают на поверхность агаровых пластинок (1,5% FT-агар, рН 6,95). После застывания второго слоя посевы инкубируют при 36-38°С в течение 2-4 суток. За ДРТ принимают то разведение, в котором фаг ГАЛ образует не менее 10 негативных колоний.

Изучение чувствительности исследуемых культур к фагу ГАЛ проводится так же, как и определение дифференцирующего рабочего титра.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для идентификации возбудителя туляремии, выделяемого из организма больного и инфицированных объектов внешней среды. Штамм туляремийного бактериофага ГАЛ предназначен для идентификации основных подвидов Francisella tularensis и лизирует возбудителей туляремии трех подвидов (среднеазиатский, неарктический и голарктический) и основных видов болезни легионеров, а также для лабораторной диагностики туляремии. Штамм выделен из органов лабораторных животных, инфицированных живой культурой туляремийного вакцинного штамма №15 линии НИИЭГ. Штамм бактериофага депонирован в коллекции фагов ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» под обозначением ГАЛ. Использование бактериофага позволяет повысить специфичность идентификации возбудителя туляремии от других возбудителей. 2 ил.

Штамм туляремийного бактериофага ГАЛ-КСМ №17-4 (Коллекция стандартизированных микроорганизмов для проверки эффективности средств разведки, профилактики и защиты от возбудителей инфекционных заболеваний ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России»), обладающий специфической литической активностью в отношении культур штаммов Francisella tularensis и возбудителей основных видов болезни легионеров.