СПОСОБ ИНАКТИВАЦИИ ИНФЕКЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ И ВАКЦИНА ДЛЯ ИММУНИЗАЦИИ ЖИВОТНЫХ Российский патент 1997 года по МПК A61L2/12 

Изобретение относится к ветеринарии и медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано для инактивации инфекционности микроорганизмов, находящихся в жидких средах, в частности возбудителей пищевых токсикоинфекций (сальмонеллезов, эшерихиозов) путем обработки их СВЧ полем.

Известен способ уничтожения (или угнетения) электромагнитным полем сверхвысокой частоты в импульсном режиме возбудителей болезней растений, животных и человека преимущественно за счет электродинамических факторов, при котором обработка ведется на основной частоте 860 МГц, тип волны H₁₀, частота следования импульсов 500 Гц, длительность импульсов 2 с, поляризация поля линейная, режим волны бегущий. Обработка в таком режиме комбикорма, зараженного кишечной палочкой или сальмонеллой показала его полную стерилизацию (См. Бородин И. Ф. Кузнецов С.Г. Воздействие импульсного электромагнитного поля сверхвысокой частоты на микроорганизмы /Вестн. с.-х. науки, 1991, N 3 (414), с. 84-86).

Недостатками этого способа СВЧ обработки является то, что для обработки используются мощные СВЧ генераторы промышленной частоты 860 МГц, используемые на радиолокационных станциях и практически не применяемые в пищевой промышленности и медицине, которые требуют дополнительных средств защиты и специальных помещений для работы, что повышает стоимость такой стерилизации.

Известен также "Способ стерилизации медицинских инструментов" (а.с. N 1123705, A 61 L 2/12, 82), при котором обеззараживание инструментов от споровых форм микроорганизмов в частности Bac. anthracoides, проводят в СВЧ печах "Электроника", работающих на частоте 2400±50 МГц.

При общей доступности и простоте осуществления недостатком этого способа стерилизации является то, что он не пригоден для работы с жидкими средами, содержащими микроорганизмы, так как в нем используются специальные формы для размещения инструментов из пористой керамики, в которых материал нагревается до конечных температур нагрева 160-470^oC при скорости нагрева 15-210^oC/мин, а при работе с жидкими средами такие режимы приведут к взрывному кипению и разбрызгиванию среды.

Задачей изобретения является разработка способа инактивации инфекционной активности возбудителей кишечных инфекций, в частности, родов Salmonella и Escherichia, содержащихся в жидких питательных средах, после осуществления которого микроорганизмы сохраняют иммуногенность, но утрачивают способность размножаться in vitro и in vivo, теряя таким образом свою патогенность. При этом обработка жидкой среды с микроорганизмами должна производиться на общепромышленных или бытовых СВЧ печах с минимальными затратами времени и средств на инактивацию и обслуживание оборудования.

Задача решается тем, что для инактивации инфекционной активности возбудителей кишечных инфекций, находящихся в жидкой среде, применяют воздействие на них СВЧ излучением с частотой от 2350 до 2450 МГц, при плотности СВЧ излучения в рабочей камере от 1 до 3 ватт на миллилитр среды в течение 10-110 мин.

Способ осуществляется следующим образом.

Среду, содержащую культуры Salmonella enteritidis, S. dublin, S. typhimurium, E. coli (сероварианты 0124, 0111, 026, 0114), помещают в химический стакан из термостойкого стекла. Емкость с содержимым ставят в рабочую камеру микроволновой печи и обрабатывают СВЧ излучением с частотой 2350-2450 МГц от 1,0 до 110 мин при мощности СВЧ излучения от 1 до 3 Вт/мл. В процессе СВЧ обработки за счет термодинамических и электродинамических факторов СВЧ воздействия на жидкую среду происходит инактивация инфекционной активности микроорганизмов.

Оценку результатов инактивации проводят по определению подвижности микробов, микроскопии мазков, окрашенных по Граму, посеву на различные питательные среды (мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА), среду Эндо, среду Симонса, среду Клиглера), а также по выживаемости лабораторных животных (белых мышей), которым вводят (подкожно или внутрибрюшинно) летальные дозы микробов, подвергнутых действию микроволнового излучения в сравнении с выживаемостью контрольной группы животных, зараженных необработанными СВЧ излучением суспензиями микроорганизмов.

Пример 1. Односуточные, суспендированные в 50 мл физиологического раствора, чистые культуры Salmonella dublin или S. typhimurium в концентрации 3,0•10⁶ микробных клеток в миллилитре, налитые в химический термостойкий стакан, помещают в рабочую камеру СВЧ печи "Титан". Мощность СВЧ излучения в рабочей камере 600 Ватт. Объем воды для балластной загрузки - 400 мл с температурой воды +15^oC. Экспозиция СВЧ обработки от 1 до 140 мин. Повторность опытов 4х-кратная. При сохранении подвижности и морфологических свойств микробы теряли способность размножаться. Результаты представлены в таблице.

Пример 2. Бактериальную суспензию чистой культуры S. typhimurium на физиологическом растворе в концентрации 3,0•10⁶ микробных клеток/мл, в объеме 50 мл наливают в химический термостойкий стакан и помещают в рабочую камеру СВЧ печи. Объем воды для балластной загрузки 400 мл при начальной температуре воды 15^oC. Экспозиция от 1 до 140 мин в зависимости от аранжировки опыта. Повторность опытов 4х-кратная. После отключения СВЧ печи и охлаждения с обработанными в микроволновой печи суспензиями проводили микробиологические исследования. Характерные результаты представлены в таблице.

Исследования молока, зараженного Salmonella и Escherichia coli и обработанного СВЧ излучением при экспозициях от 5 до 40 мин, показало, что микробы, как и в опытах с чистыми культурами, не потеряли подвижности, не утратили способность расти на питательных (МПБ и МПА) средах.

Заражение лабораторных животных (белых мышей) подкожно культурой Salmonella typhimurium в концентрации 3,0•10⁶ м.к./мл не утратившими подвижность, но утратившими способность расти на питательных средах после 10-минутного воздействия СВЧ облучения показало, что указанные культуры микробов потеряли инфекционность: 100% -ная выживаемость опытных животных и 100%-ная гибель животных в контрольных группах. Всего в работе было использовано и микроскопировано (методом раздавленной капли) 95 препаратов, произведено 118 посевов на различные питательные среды, окрашено по Граму и изучено 60 мазков. Заражено и микробиологически обследовано по 4 группы опытных и контрольных животных.

Оценку иммуногенных свойств инактивированных микробных суспензий S. typhimurium и E. coli проводили путем подкожного заражения 1-кратно иммунизированных (по 3,0•10⁶ м.к./мл) белых мышей (через 7 суток после иммунизации) нативной суспензией микробов в концентрации 5,0•10⁶ м.к./мл. Отмечалась 100%-ная гибель животных в контрольных группах и 100%-ная выживаемость иммунизированных животных.

Пример 3. Бактериальную суспензию культуры на физиологическом растворе в концентрации 3,0•10⁶ м.к./мл в объеме 50 мл наливали в химический термостойкий стакан и помещали в рабочую камеру СВЧ печи "Титан". Объем воды для балластной загрузки 400 мл. Экспозиция 10 мин. После охлаждения микробной суспензии ее в концентрации 3,0•10⁶ м.к./мл (в объеме 0,3 мл) вводили подкожно белым мышам.

Через 7 суток после иммунизации подопытных животных, а также группы контрольных (неиммунизированных) белых мышей, заражали неинактивированной суспензией S. typhimurium в концентрации 5,0•10⁶ м.к./мл подкожно (в объеме 0,5 мл). Через 3-е суток отмечалась 100%-ная гибель невакцинированных животных. Все вакцинированные животные выжили. В крови животных контрольной группы в реакции агглютинации выявлены антитела к S. typhimurium. Аналогичные результаты получены и в опытах с E. coli.

Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод, что воздействие микроволнового излучения с частотой 2350-2450 МГц при экспозиции от 1 до 110 мин и мощности от 1 до 3 ватт на мл среды на микробные культуры Salmonella typhimurium, S. dublin, Esherichia coli приводит к инактивации их инфекционности (100% -ная выживаемость лабораторных животных белых мышей). СВЧ облучение в этих параметрах вызывает изменение биологических свойств микроорганизмов: потерю способности расти на питательных средах при сохранении подвижности. Подвижность эшерихии теряют при экспозиции 110 мин. Сальмонеллы сохраняли подвижность и при 140 мин СВЧ облучения (срок наблюдения). При полной потере инфекционной активности микробы сохраняли иммуногенные свойства, что выражалось в выработке антител и 100%-ном предотвращении гибели лабораторных животных (белых мышей), подвергнутых последующему заражению летальными дозами возбудителей.

Использование предложенного способа инактивации инфекционной активности возбудителей кишечных инфекций позволяет упростить и оптимизировать технологию производства диагностических и профилактических препаратов на основе микроорганизмов, в частности инактивированных вакцин для ветеринарии и медицины.

При использовании этого способа инактивации инфекционной активности возбудителей кишечных инфекций, диагностические и профилактические препараты возможно изготовлять в условиях ветеринарных лабораторий, имеющих производственные отделы, при оснащении их микроволновыми печами, соответствующим оборудованием и технической документацией.

Данный способ может быть использован также в работе предприятий по производству бактерийных препаратов.

Использование предложенного способа даст значительный экономический и социальный эффект для народного хозяйства Российской Федерации.

Назначение: изобретение относится к ветеринарии и медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано для инактивации инфекционности микроорганизмов, находящихся в жидких средах, в частности, возбудителей пищевых токсикоинфекций (сальмонеллезов, эшерихиозов) путем обработки их СВЧ полем. Сущность изобретения: микробосодержащую среду обрабатывают в микроволновой печи с частотой СВЧ излучения 2350-2450 МГц при удельной мощности в рабочей камере от 1 до 3 Вт/мл в течение от 1 до 110 мин, а корректировку удельной мощности проводят при помощи балластной нагрузки в виде воды. 2 с. и 1 з.п.ф-лы, 1 табл.

1. Способ инактивации инфекционной активности возбудителей кишечных инфекций, включающий обработку микробосодержащей среды СВЧ-излучением, отличающийся тем, что микробосодержащую жидкую среду помещают в микроволновую печь в химическом термостойком стакане, а обработку проводят с частотой СВЧ-излучения 2350 2450 МГц в течение 1 110 мин и мощности 1 3 Вт/мл инактивируемой среды. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что удельную мощность СВЧ излучения корректируют при помощи балластной нагрузки в виде воды. 3. Применение инактивированной СВЧ-излучением в течение 10 110 мин микробной суспензии кишечной инфекции с концентрацией 3,0 х 10⁷ м.к./мл в качестве вакцины для иммунизации животных.