ПОЛУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ИМПРИНТИРОВАННЫХ ПОЛИМЕРОВ В РЕЗУЛЬТАТЕ СШИВАНИЯ Российский патент 2017 года по МПК C08F8/00 C08F301/00 C08J3/24 B01D15/38 A61K31/74 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к получению молекулярно-импринтированных полимеров (МИП), которые характеризуются высокими емкостью и специфичностью связывания. В частности, способ изобретения предлагает способ получения композиции нерастворимых (то есть, высокомолекулярных) полимеров МИП, все из которых представляют собой агенты связывания для конкретного целевого агента. Изобретение также относится к способам получения изделий, образованных из нерастворимых полимеров МИП, где упомянутые изделия могут иметь практически любые желательные форму или структуру.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Молекулярное импринтирование синтетических полимеров представляет собой способ, при котором функциональные и сшивающие агенты (обычно мономеры), способные полимеризоваться, сополимеризуют в присутствии целевой молекулы, которая исполняет функцию молекулярной матрицы. Перед проведением полимеризации функциональные мономеры либо образуют комплекс с матрицей в результате нековалентных взаимодействий, либо производят ковалентное сочетание с образованием полимеризуемого производного матрицы. После проведения полимеризации функциональные группы мономеров удерживаются по месту благодаря наличию высокосшитой полимерной структуры. Последующее удаление матрицы в результате сольвентного экстрагирования и/или химического расщепления выявляет центры связывания, которые являются комплементарными по размеру и форме по отношению к целевой молекуле. Данным образом, в полимер (который теперь называют «молекулярно-импринтированным полимером» или «МИП») вводится молекулярная память, так что теперь он способен обеспечивать повторное связывание целевого агента при очень высокой специфичности.

Первоначально полимеры МИП использовали в качестве неподвижных фаз в методе ВЭЖХ, в особенности для хирального разделения. В дальнейшем их использование было распространено на другие аналитические методики, такие как тонкослойная хроматография, капиллярный электрофорез, твердофазная экстракция и анализы связывания, относящиеся по типу к иммуноанализу. Центры связывания зачастую демонстрируют сродство и селективности, приближающиеся к соответствующим характеристикам для систем антитело-антиген. Данные имитаторы обнаруживают определенные очевидные преимущества в сопоставлении с антителами для сенсорной технологии. Вследствие своей высокосшитой природы полимеры МИП сами по себе являются устойчивыми и надежными, что облегчает их применение в экстремальных условиях окружающей среды, таких как в присутствии кислот, оснований или металлических ионов, в органических растворителях или при высоких температурах и давлениях. Кроме того, полимеры МИП являются относительно недорогими в производстве и могут храниться в сухом состоянии при комнатной температуре в течение продолжительных периодов времени.

Таким образом, в принципе все полимеры МИП получают следующим далее образом: мономеры (или полимеризуемые агенты) и целевые (или матричные) молекулы перемешивают, происходит самосборка, добавляют агент поперечного связывания, и может быть инициирована полимеризация. После проведения полимеризации полимер обычно (но не всегда, см. ниже) разбивают на маленькие фракции и экстрагируют целевую молекулу. В случае помещения полимеров МИП в раствор целевых молекул последние будут повторно связываться с полимерами МИП (см. также публикации: Yu Cong; Leif Schweitz; и Ioanna Wärnmark-Surugiu).

История полимеров МИП

Один из первых примеров получения полимера МИП был описан уже в 1949 году (Dickey), где использовали определенный тип диоксида кремния (растворимое стекло) для селективного распознавания красителей. Намного позже были описаны другие типы самоорганизующихся систем, которые образуют сетки, где было возможным специфическое связывание целевых/анализируемых соединений (Ramström et al., Schweitz et al. и Vlatakis et al.).

Выбор мономеров и полимеризация

В 1970-х и 1980-х годах (см. публикации Shea 1986, Shea 1990 и Wulff 1987) была описана концепция ковалентного связывания матричной/целевой молекулы непосредственно с полимером, использующимся для образования каркаса. Притязание заключалось в том, что непосредственное связывание будет приводить к более однородному распределению центров связывания по всему объему полимера. Однако, в то же самое время это оставляет проблему удаления матрицы после проведения полимеризации. Для удаления матрицы требуются как тонкое измельчение полимера, так и разрыв химических связей.

Получение полимеров МИП без ограничения матрицы одним из мономеров, использующихся во время проведения полимеризации, зачастую в результате приводит к получению хороших полимеров МИП, но практический опыт в литературных источниках заключается в том, что большое количество частиц полимеров МИП будет содержать центры связывания, которые имеют тенденцию к связыванию матричного/анализируемого соединения на менее специфических частях молекулы и, таким образом, не обеспечивают достижения желательной специфичности получающихся в результате полимеров МИП. Это очень важно для полимеров МИП, использующихся для аналитических целей, в особенности в случае цели, заключающейся в разделении стереоизомерных форм молекул, тогда как это менее важно в том случае, когда основная цель заключается в улучшении совокупной емкости связывания для получающихся в результате полимеров МИП.

Как оказалось в определенных аналитических ситуациях, матрица должна иметь другую сущность, то есть, вместо использования фактической матрицы полученные полимеры МИП образуются на «имитаторах» матрицы для того, чтобы не загрязнять анализируемый образец. Ясно то, что идентификация имитатора матрицы, который способен обеспечить специфическое связывание между анализируемым соединением и полимером МИП, может представлять собой трудную задачу.

Совершенно другой способ получения полимеров МИП заключается в полимеризации смеси при одновременном сохранении мономера, агентов поперечного связывания и матрицы (или имитаторов матрицы) в дисперсном формате в эмульсии, таким образом, при непосредственном оставлении получающегося в результате полимера МИП в виде частицы (Funke et al.). Размер частиц полимера МИП, полученного по данному способу, помимо прочего, будет зависеть от концентрации мономера и скорости перемешивания (определяющей размер капель в эмульсии). (Для достижения размеров частиц вплоть до 1 мкм требуется перемешивать раствор при более, чем 1000 об/мин). В соответствии с литературой недостатками данного типа способов являются продолжительные времена получения и низкие выходы.

В общем случае на предшествующем уровне техники зачастую описываются трудности получения воспроизводимых полимеров МИП, где как емкость, так и специфичность не ухудшаются (таким образом как менее, чем желательно).

В патенте США 4111863 описывается «Ненабухаемый трехмерный полимер, содержащий компонент, который представляет собой остаток оптически активного соединения, где данный остаток является химически удаляемым из упомянутого полимера при оставлении в физической структуре упомянутого полимера полости, соответствующей размеру и форме упомянутого остатка оптически активного соединения и конкретной стерической компоновке функциональных групп в пределах полости упомянутого полимера, соответствующего химической структуре упомянутого остатка оптически активного соединения…», при этом оптически активное соединение представляет собой матрицу, с которой полимер МИП намеренно должен быть способен связываться впоследствии.

Как заявляется в патенте США 5110833, «Способ получения синтетических ферментов или синтетических антител, включающий ориентирование мономеров в окрестности молекулы отпечатка, добавление сшивателей, полимеризацию с образованием полимера и последующее удаление молекулы отпечатка, что, тем самым, создает в полимере полость, соответствующую упомянутой молекуле отпечатка», увеличивает специфичность полимера МИП по отношению к матричной молекуле. Другими словами, улучшение эксплуатационных характеристик, заявленное в публикации US 5110833, базируется на оптимизировании контакта между матричной молекулой и мономерными звеньями перед проведением полимеризации.

В патенте США 6881804 описывается введение в полимер МИП пористости в качестве средства увеличения эксплуатационных характеристик полимера МИП в результате увеличения доступа в полость, которая предназначена для взаимодействия с матрицей.

В патенте США 6638498 заявляются конкретно выбранные мономеры для выработки специфических полимеров МИП желчных кислот, и в документе US 2004/0157209 A1 предполагается иммобилизирование матричной молекулы на материале носителя перед проведением полимеризации. Все предложения по улучшению эксплуатационных характеристик полимеров МИП имеют дело с химическими характеристиками мономеров или с архитектурой полимеров МИП, все из которых относятся к технологическим стадиям, которые имеют место до или во время получения полимера МИП.

В публикации US 5994110 описываются полимеры МИП, которые получают «по месту» с образованием маленьких полимеров/олигомеров, которые включают структуру, комплементарную по отношению к матричной молекуле. Полимеры или олигомеры образуют покрытие или образ в окрестности биомолекулы, где данные покрытие или образ отсюда удаляют и из них производят дискретные сущности, которые могут быть использованы, например, в качестве терапевтических или профилактических средств, то есть, лекарственных препаратов. Вследствие данного типа способа получения в публикации US 5994110 не используют стадии тонкого измельчения, как при обычном получении частиц полимера МИП. В публикации US 5994110 в действительности предлагается отделение полимеров МИП от агентов несвязывания, но все предложенные способы полагаются на очень маленький размер полученных полимеров МИП, например, при использовании хроматографии, но только в случае полимеров МИП в виде растворимых сущностей. Например, конкретно указывается на то, что терапевтически активные полимеры МИП, соответствующие публикации US 5994110, представляют собой те соединения, которые имеют молекулярные массы на нижнем крае диапазона 1–200 кДа. Кроме того, в публикации US 5994110 не описывается каких-либо средств разделения суспендированных нерастворимых полимеров МИП на «хорошие агенты связывания», с одной стороны, и «менее эффективные агенты или агенты несвязывания», с другой стороны.

Публикация US 2009/0194481 относится к композитному материалу, получаемому в результате агломерирования полученных прежде полимеров МИП.

Авторы настоящей заявки прежде подали заявку WO 2007/095949, которая относится к получению композиций полимера МИП, обладающих улучшенным сродством к матричному/целевому соединению. Говоря вкратце, способ влечет за собой воздействие на полученные нерастворимые полимеры МИП традиционными способами, включающими описанное выше тонкое измельчение, а затем впоследствии воздействие на них по методике аффинной очистки, которая адаптирована для аффинной очистки нерастворимого материала; подходящие для использования технологии, обсуждавшиеся в публикации WO 2007/095949, представляют собой адсорбцию на слой вспученного адсорбента и агглютинацию. Данная технология обеспечивает получение композиций полимеров МИП, где все или по существу все полимеры МИП в композициях связывают одного и того же целевого агента, поскольку, как было установлено, композиции нерастворимых полимеров МИП предшествующего уровня техники включают большие фракции полимеров МИП, которые только слабо связываются или совершенно не связываются с предполагаемым целевым агентом.

Авторы настоящей заявки также прежде подали заявку WO 2011/033021, которая относится к схеме очистки, подходящей для использования в случае мультиспецифических рецепторов, таких как полимеры МИП, – при этом в способе используют, по меньшей мере, 2 последовательных раунда аффинной очистки, где агент захвата при аффинной очистке сочетается через различные функциональности с носителем в каждом из, по меньшей мере, двух раундов. Данная технология обеспечивает прохождение через весь способ очистки только мультиспецифических рецепторов, которые связывают все соответствующие центры связывания на агенте захвата, поскольку центры связывания, которые могут «скрываться» от взаимодействия с рецепторами во время первого раунда очистки, подвергаются связыванию с рецепторами в последующем раунде(ах). Технология в публикации WO 2011/033021, в частности, была разработана для обеспечения получения полимеров МИП, целевыми агентами для которых являются аминокислоты, такие как фенилаланин.

ЦЕЛЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Одна цель вариантов осуществления изобретения заключается в предложении новых способов получения нерастворимых полимеров МИП, то есть, полимеров МИП, которые могут быть отделены от водного раствора при использовании фильтрования и/или центрифугирования. Другая цель вариантов осуществления изобретения заключается в предложении способов получения изделий/устройств, образованных из таких нерастворимых полимеров МИП, а также в предложении таких изделий/устройств.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как подробно обсуждалось выше, традиционный подход к получению нерастворимых полимеров МИП вовлекает в себя получение высокосшитой полимерной структуры в присутствии матричных агентов с последующим варьированием степеней тонкого измельчения сшитой структуры и следующим далее удалением матрицы для того, чтобы обнажить полости связывания матрицы для окружающего растворителя. Для получений нерастворимых полимеров МИП, характеризующихся высокими емкостью и специфичностью связывания, такая композиция может быть подвергнута аффинной очистке, такой как адсорбция на слой вспученного адсорбента или агглютинация, в соответствии с описанием в публикации WO 2007/095949.

Как теперь было установлено авторами настоящего изобретения, одна эффективная альтернатива для данной технологии заключается в получении растворимых полимеров МИП с последующими аффинной очисткой растворимых полимеров МИП и, в заключение, сочетания растворимых полимеров МИП при использовании реакции сшивания для получения полимеров МИП, которые являются нерастворимыми в соответствии с описанием в настоящем документе.

Как известно, наноразмерные частицы (приблизительно 50 нм) являются подходящими для использования в живом организме при устранении токсинов в кровотоке (Hoshino et al. (2008)). Также известно, что наноразмерные частицы могут быть отделены или очищены при использовании аффинной хроматографии в обычной хроматографической установке в режиме со слоем уплотненного адсорбента, когда они попадают в диапазон размеров белка и ведут себя подобно тому, как если бы они были растворимыми, (Piletsky et al. (2006), Guerreiro et al. (2009)).

В случае сначала очистки таких наноразмерных полимеров МИП в результате аффинной хроматографии, а после этого их сшивания с образованием частиц, имеющих существенно больший размер, например, 0,5–50 мкм, что делает их нерастворимыми, они будут подходящими для использования в тех же самых целях, что и нерастворимые полимеры МИП, полученные по более традиционному подходу.

Таким образом, в своем наиболее широком аспекте настоящее изобретение относится к способу получения нерастворимых молекулярно-импринтированных полимеров (МИП), при этом данный способ включает:

а. получение растворимых или полурастворимых полимеров МИП, которые 1) по существу все связывают матричные агенты и 2) имеют размеры, которые делают возможным их разделение на хроматографической стадии при использовании хроматографии со слоем уплотненного адсорбента,

b. сшивание растворимых полимеров МИП, связывающих матричные агенты, полученных на стадии а, в целях получения нерастворимых полимеров МИП и

необязательно выделение, концентрирование или очистку полимеров МИП, полученных на стадии b.

По данной технологии достигаются несколько преимуществ:

Прежде всего, можно получить нерастворимые полимеры МИП при использовании любого протокола получения на стадии а, включая те протоколы, которые описываются в разделе описания предпосылок создания изобретения, которые имеют своей целью получение растворимых полимеров МИП. Таким образом, полимеры МИП могли бы быть синтезированы в результате проведения полимеризации осаждением или гибридизации «по месту» (см. ниже) при требуемом размере, и стадию уменьшения размеров можно было бы упростить или избежать.

Во-вторых, материал, полученный после стадии а, имеет форму, которая делает его подходящим для использования при очистке в результате хроматографии при использовании хроматографии со слоем уплотненного адсорбента, что может быть более удобным в сопоставлении с агглютинацией или хроматографией со слоем вспученного адсорбента вследствие доступности большого диапазона различных хроматографических сред и различных форматов колонок, а также вследствие меньшей дороговизны обычных способов хроматографии со слоем уплотненного адсорбента, в особенности при использовании в больших масштабах.

Кроме того, вне зависимости от введения стадии очистки между стадиями а и b факт получения растворимых или полурастворимых полимеров МИП на стадии а делает возможным проведение последующего сшивания на стадии b в обстоятельствах, которые позволяют проводить формование или отливку продукта, произведенного из полимера МИП, при любых желательных профиле или форме.

Чем меньшими будут частицы, тем большей будет вариация емкости связывания между частицами. То есть, очень маленькие частицы способны быть отсортированными до еще большей емкости в сопоставлении с тем, что имеет место для более крупных частиц. В предельном варианте в случае получения полимеров МИП в результате традиционного получения полимера МИП при использовании тонкого измельчения, а после этого уменьшения их размеров в той степени, в которой полимеры МИП имели бы один центр связывания или ноль центров связывания, то тогда имело бы место максимальное различие между различными соединениями в образце полимеров МИП.

Кроме того, обычная хроматография, использующая слой уплотненного адсорбента, является намного более дешевой в сопоставлении с хроматографией со слоем вспученного адсорбента, в особенности при использовании в больших масштабах.

В случае если способ влечет за собой уменьшение размеров полимеров МИП перед проведением стадии очистки, выход на стадии уменьшения размеров будет намного большим в сопоставлении с уменьшением размеров, например, до 1–10 мкм.

Стадию промывания, когда матрицу удаляют, будет легче осуществить тогда, когда очень маленькие (например, наноразмерные) частицы можно было бы промывать в результате простого диализа, поскольку доступ к поверхности увеличивается.

В случае проведения аффинной очистки для полимеров МИП в виде более крупных нерастворимых частиц, например, >1 мкм, как правило, предполагается то, что количество и качество центров связывания в расчете на полимер, доступных с внешней поверхности, будут представителями для остальной части полимерной частицы. Данное предположение становится все более близким к истине по мере уменьшения частиц полимера МИП.

В публикации US 2009/0194481 предлагается способ, обнаруживающий некоторое подобие с настоящим подходом. Однако, в публикации US 2009/0194481 не рассматривают качества полимеров МИП исходного материала, которые вступают в процесс агломерирования (например, процесс сшивания), так что качество, выражаемое в сродстве к связыванию для композитного материала, полученного по способу публикации US 2009/0194481, является, самое большее, настолько же хорошим, как и сродство к связыванию, демонстрируемое исходным материалом полимера МИП. Настоящее изобретение предлагает улучшенный исходный материал и, как это подробно обсуждается ниже, также обращается к проблеме сохранения сродства полимеров МИП исходного материала.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

«Молекулярно-импринтированный полимер» (МИП) является полимером, включающим полости (или пустоты), которые, по меньшей мере, отчасти соответствуют одному или нескольким матричным агентам, которые включали в матрицу мономеров, включая сшивающие мономеры, перед проведением полимеризации. Получающийся в результате полимер после проведения полимеризации включает несколько полостей, которые соответствуют по форме матричному агенту. Обычно полимер МИП разделяют на маленькие частицы, что, тем самым, облегчает удаление матрицы и сохранение частично доступных полостей открытыми для взаимодействия с целевой молекулой, которая напоминает матричный агент или идентична ему.

«Полимер МИП исходного сырья» является полимером МИП, полученным после сшивания в виде части традиционного способа получения полимера МИП, но который еще не был подвергнут какому-либо тонкому измельчению и, таким образом, все еще включает матричные агенты или, по меньшей мере, осколки, произведенные из матричных агентов в полостях в структуре полимера МИП.

«Сшивание» в настоящем контексте обозначает способ разнонаправленных удлинения или разветвления цепи полимеров, который приводит к образованию сетчатых структур. Сшивание может происходить либо в результате полимеризации мономеров, характеризующихся функциональностью, большей, чем 2, (в режиме конденсации), либо в результате ковалентного связывания между предварительно полученными полимерными молекулами, осуществляемого, например, в результате облучения или по различным химическим реакциям. Сшивание делает полимер более устойчивым к воздействию тепла, света и других физических агентов, что придает ему высокую степень стабильности геометрических размеров, механической прочности и химической стойкости и стойкости к действию растворителей. Сшивание нельзя смешивать с «прививкой» полимеров, которая представляет собой методику получения разветвленных макромолекул, при которой ответвления обычно отличаются по типу от основной цепи полимера, и где ответвления сочетаются только через одну единственную функциональность. В противоположность сшиванию прививка не приводит в результате к образованию фиксированных сеток полимеров, то есть, приводит в результате к образованию привитого полимера.

«Тонкое измельчение» обозначает способ разделения полимеров МИП, которые все еще могут содержать матрицу, на более мелкие частицы. Может быть использован любой способ, подходящий для использования в данной цели.

«Целевая молекула» или «целевой агент» в настоящем контексте представляет собой любые молекулу/агент, с которыми может специфически связываться полимер МИП, и обычно представляет собой молекулу/агент, с которыми предположительно должны связываться очищенные полимеры МИП в случае использования полимеров МИП, в конечном счете, по назначению. Термин «целевая молекула» в настоящем контексте используется взаимозаменяющим образом с термином «агент» в случае обсуждения связывания полимера МИП с таким «агентом», но необходимо отметить то, что «агент», использующийся на стадии очистки, образующей часть способа изобретения, необязательно должен быть идентичным целевой молекуле – скорее агент достаточно часто представляет собой имитатор или производное целевой молекулы, которые являются подходящими для использования на стадиях очистки, обсуждаемых в настоящем документе. Агент может, например, составлять часть целевой молекулы в сопоставлении с целевой молекулой – например, в случае предполагаемой целевой молекулы в виде аминокислоты в качестве агента на стадии очистки подходящим для использования также может оказаться и соответствующий аминокислотный остаток, образующий часть белка или пептида. Например, способ изобретения может включать способ очистки, организованный для обогащения полимеров МИП, которые связывают аминокислотный остаток, где на одной стадии при очистке используют пептид, где аминокислота находится на С-конце молекулы, и где на другой стадии используют аминокислоту на N-конце пептида – в таком случае агент представляет собой вещество, использующееся на стадиях очистки, тогда как «целевая молекула» считается веществом(ами), которое эффективно связывается обогащенными полимерами МИП. Целевой агент также может быть образован несколькими молекулами – это относится к тому случаю, когда целевой агент представляет собой молекулярный комплекс, так как это может иметь место в случае целевого агента в виде комплекса между рецептором и лигандом (в своем наиболее широком значении и, таким образом, также при включении и комплекса между антителом и антигеном) – как известно, некоторые комплексы между рецепторами и лигандами могут приобретать уникальную 3-мерную структуру, так что присутствие комплекса можно будет отличить от присутствия несвязанных лиганда или рецептора при использовании полимеров МИП, которые специфически распознают комплекс. Подобным образом, «матричная молекула» или «целевой агент» обычно идентичны целевым молекуле/агенту, но также могут представлять собой их имитатор или производное (то есть молекулу, обладающую, по меньшей мере, отчасти идентичными 3-мерными структурой и профилем, которые отвечают соответствующим характеристикам целевой молекулы – имитатор может, например, быть образован фрагментом целевой молекулы). Целевые молекула/агент используются в качестве «генератора» полостей в структуре полимера МИП, которые впоследствии должны быть способными связывать целевую молекулу.

«Аффинная очистка» обозначает любой способ очистки вещества, при котором используют специфическое связывание между веществом и партнером по связыванию. Во многих таких способах используют агент захвата, связанный с твердым носителем (таким как хроматографическая матрица), который улавливает данное вещество. Типичными примерами, известными на современном уровне техники, является аффинная очистка, использующая антитела в качестве агентов захвата, сочетающихся с хроматографическими гранулами, для очистки антигенов, которые связывают антитело. Необходимо понимать то, что способами аффинной очистки, использующимися в соответствии с настоящим изобретением, являются те варианты, которые способны захватывать суспендированные растворимые полимеры МИП, обсуждавшиеся в настоящем документе. Таким образом, типичный способ аффинной очистки мог бы представлять собой хроматографию, использующую колонку для аффинной хроматографии со слоем уплотненного адсорбента, например, в методах ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) или ЖЭХБ (жидкостной экспресс-хроматографии белков) или других таких технологиях со слоем уплотненного адсорбента, известных для специалистов в соответствующей области техники.

«Твердая фаза» в настоящем контексте представляет собой любой материал, который может быть использован для фиксирования агента захвата в результате ковалентного или нековалентного связывания. Таким образом, в качестве твердой фазы может быть использован любой материал (полимерные пластики, сахара, металлы, стекло, диоксид кремния, каучук и тому подобное), который обычно используют при получении материалов хроматографической матрицы. Материал твердой фазы может содержать подходящие для использования функциональные группы, которые делают возможным сочетание агента захвата с рассматриваемым материалом. Такие дериватизированные материалы известны для специалистов в соответствующей области техники хроматографической очистки белков и других макромолекул. Кроме того, твердая фаза может иметь любую физическую форму, которая делает возможным захват относительно крупных и нерастворимых частиц, таких как полимеры МИП, (в сопоставлении с индивидуальными биомолекулами, такими как белки). Таким образом, твердая фаза может иметь форму волокон (предпочтительно пустотелых), хроматографической матрицы (предпочтительно матрицы, подходящей для использования при адсорбции на слой вспученного адсорбента), гранул (предпочтительно тех гранул, которые могут быть разделены при использовании электромагнитных способов) или любой другой подходящей для использования формы, см. ниже.

Выражение «растворимые полимеры МИП» относится к полимерам МИП, которые являются достаточно маленькими по размеру для того, чтобы сделать возможным их отделение от жидкого носителя при использовании средств традиционных хроматографических способов, использующих слой уплотненного адсорбента в виде материала хроматографической матрицы. Обычно растворимый полимер МИП будет иметь размер и форму, которые делают возможным фильтрование через микропористый материал, такой как мембранный фильтр, имеющий отсечку 450 нм. Как подробно будет описываться ниже, растворимые полимеры МИП, имеющие меньшие размеры, также рассматриваются в качестве исходных материалов для настоящего изобретения, и такие растворимые полимеры МИП могут быть отфильтрованы через мембранный фильтр, имеющий отсечки, составляющие всего лишь, например, 400 нм, 350 нм, 300 нм, 250 нм, 200 нм, 150 нм, 100 нм, 50 нм и 10 нм.

Выражение «нерастворимые полимеры МИП» относится к полимерам МИП, которые на практике не могут быть подвергнуты очистке при использовании средств традиционного хроматографического способа, использующего слой уплотненного адсорбента в виде материала хроматографической матрицы. Обычно нерастворимый полимер МИП будет удерживаться микропористым материалом, таким как мембранный фильтр, имеющий отсечку, равную или меньшую 900 нм. Данные полимеры МИП являются в особенности хорошо подходящими для использования в качестве фармацевтического препарата, предназначенного для применения в желудочно-кишечном тракте, поскольку их нерастворимость ограничивает или предотвращает их проход в организм (например, в кровоток) из желудочно-кишечного тракта. Другими словами, при пероральном приеме использующиеся нерастворимые полимеры МИП будут по существу оставаться удержанными в желудочно-кишечном тракте вплоть до своего удаления с экскрементами.

Выражение «полурастворимые полимеры МИП» обозначает полимеры МИП, которые удерживаются микропористым материалом, таким как мембранный фильтр, имеющий отсечку 450 нм, но которые отфильтровываются через микропористый материал, такой как мембранный фильтр, имеющий отсечку 900 нм. В зависимости от гидрофильности таких полурастворимых полимеров МИП их поведение при хроматографии со слоем уплотненного адсорбента будет варьироваться. Предпочтительные полурастворимые полимеры МИП будут отфильтровываться через мембраны, имеющие отсечку 800 нм, где более предпочтительные полурастворимые полимеры МИП будут отфильтровываться через мембраны, имеющие отсечки, соответственно, 700, 600 и 500 нм.

Конкретные варианты осуществления изобретения

Получение растворимых или полурастворимых полимеров МИП на вышеупомянутой стадии а в соответствии с изобретением может быть осуществлено по любому известному способу современного уровня техники, и растворимые или полурастворимые полимеры МИП исходного материала, например, могут быть получены из коммерческого источника. Существенный признак стадии а заключается в том, что полученные полимеры МИП являются достаточно маленькими для создания возможности очищать их впоследствии при использовании стадии традиционной аффинной хроматографии, использующей слой уплотненного адсорбента в виде материала хроматографической матрицы, в то время как точный способ получения или генерирования растворимых или полурастворимых полимеров МИП играет незначительную роль.

Необходимо понимать то, что настоящее изобретение в своем объеме включает получение растворимых или полурастворимых полимеров МИП в результате их получения из композиции, содержащей, по меньшей мере, один полимеризуемый агент в смеси с матричным агентом, при этом матричный агент связывает растворимые или полурастворимые полимеры МИП – то есть, в определенных вариантах осуществления изобретения получение растворимых или полурастворимых полимеров МИП достигается в результате стадии получения, известной на современном уровне техники.

Например, подходящим для использования является способ, в общем случае описанный в публикации WO 2007/095949, где полимеры МИП получают по обычным способам, а после этого подвергают тонкому измельчению до желательного малого размера. При использовании данного подхода полученные полимеры МИП могут быть уменьшены по размерам до любого желательного малого размера и отделены, например, в результате фильтрования, от более крупных остаточных полимеров МИП. После этого полученные очень маленькие полимеры МИП могут быть подвергнуты воздействию обычных схем аффинной очистки, таких как аффинная хроматография, использующая традиционную колонку со слоем уплотненного адсорбента. После элюирования полимеров МИП получающаяся в результате фракция полимеров МИП будет состоять почти что исключительно из растворимых или полурастворимых полимеров МИП, все из которых связывают матричный агент, использующийся на начальных фазах получения полимера МИП.

Кроме того, можно получить полимеры МИП, имеющие желательные малые размеры, при использовании любых из обсуждавшихся выше способов получения растворимых полимеров МИП. В качестве примеров стадия а в способе изобретения может повлечь за собой получение полимеров МИП в результате проведения конденсации осаждением (Hoshino et al. (2008)) или полимеризации «по месту» (в соответствии с описанием в публикации US 5994110).

В предпочтительных вариантах осуществления размеры растворимых или полурастворимых полимеров МИП, полученных на стадии а, являются такими, что они будут отфильтровываться через мембранный фильтр, имеющий отсечку 900 нм, поскольку это обычно обеспечивает возможность разделения полимеров МИП при использовании аффинной хроматографии в колонке со слоем уплотненного адсорбента. Однако, могут быть получены частицы меньшего размера, где минимальный размер частиц в общем случае определяется размером предполагаемого центра связывания в лигандах для полимеров МИП: чем меньшим будет предполагаемый центр связывания, тем меньшими будут полимеры МИП, так что настоящее изобретение предусматривает использование полурастворимых или растворимых полимеров МИП (см. выше), которые будут отфильтрованы через мембранный фильтр, имеющий отсечки, выбираемые из 800 нм, 700 нм, 600 нм, 500 нм, 450 нм, 400 нм, 350 нм, 300 нм, 250 нм, 200 нм, 150 нм, 100 нм, 50 нм и 10 нм.

В некоторых вариантах осуществления способа изобретения по существу все полимеры МИП связывания матричного агента связывают один и тот же матричный агент – то есть, в данном варианте осуществления растворимый или полурастворимый полимеры МИП, полученные на стадии а, образуются по одному или нескольким способам полимеризации в присутствии одних и тех же матричных молекулы/агента.

В альтернативном варианте, полимеры МИП связывания матричного агента связывают, по меньшей мере, два различных матричных агента – то есть, в данном варианте осуществления растворимые или полурастворимые полимеры МИП, полученные на стадии а, образуются в способе, включающем несколько матричных молекул/агентов, или растворимые или полурастворимые полимеры МИП на стадии а образованы смесью из полимеров МИП, которые были образованы в отношении нескольких различных матричных молекул/агентов.

Выгодно, чтобы полимеризуемый агент(ы), использующийся для получения растворимых или полурастворимых полимеров МИП на стадии а, включал(и) бы необязательно защищенные функциональные группы, где с функциональных групп в случае наличия защиты защиту снимают после получения растворимых или полурастворимых полимеров МИП на стадии а, но перед стадией b. Данный подход облегчает последующее сшивание на стадии b, которое в выгодном случае включает функциональные группы растворимых или полурастворимых полимеров МИП.

Необязательная очистка после стадии а

Все варианты осуществления, описанные в настоящем документе, при необходимости могут включать стадию аффинной очистки для обеспечения связывания всеми растворимыми или полурастворимыми полимерами МИП матричных агентов – это, например, имеет отношение к случаю, когда растворимые или полурастворимые полимеры МИП на стадии а получают из коммерческого источника, и не все из них представляют собой агенты связывания матричного/целевого соединения, или когда способ их получения сам по себе не обеспечивает связывание всеми полимерами МИП матрицы. Таким образом, в данном варианте осуществления стадия а после получения растворимых или нерастворимых полимеров МИП влечет за собой, по меньшей мере, одну стадию аффинной очистки, использующую матричный агент или целевой агент или их имитатор в качестве агента аффинной очистки, в целях обогащения растворимых полимеров МИП, обладающих сродством к упомянутым матрице, целевому соединению или их имитатору.

Назначение стадии очистки заключается в проведении сшивания на стадии при использовании исходного материала, по существу исключительно образованного полимерами МИП, которые связывают матричное/целевое соединение, во избежание включения несвязывающих или слабо связывающих полимеров МИП.

В описанных выше вариантах осуществления, где растворимые или полурастворимые полимеры МИП, полученные на стадии а, связывают множество матричных агентов, аффинная очистка может быть образована стадией, где агенты захвата, отвечающие всем соответствующим матричным/целевым агентам связывания полимера МИП, используют в качестве агентов захвата при одностадийной очистке, или в альтернативном варианте, в случае проведения аффинной очистки в последовательных стадиях (при использовании одного агента захвата на каждой стадии), где элюированные фракции, которые не содержат полимеры МИП, захваченные на предшествующих стадиях, подвергают воздействию последующих стадий для захвата тех полимеров МИП, которые связывают другой(ие) агент(ы) захвата, – после этого за данными последовательными стадиями следует накапливание полимеров МИП, захваченных на каждой из стадий очистки. Оба данных подхода, в конечном счете, обеспечивают получение смеси из полимеров МИП, все из которых связывают целевое соединение, и где смесь связывает более, чем одно целевое соединение.

Один более простой способ обеспечения использования полимеров МИП связывания единственной матрицы в качестве начальной точки на стадии b заключается в получении множества наборов полимеров МИП, где каждый набор полимеров МИП образован из полимеров МИП, которые связывают одно и то же матричное/целевое соединение – то есть, полимеры МИП для одного целевого соединения получают/формируют обычным образом и необязательно обогащают, а после этого полимеры МИП для одного целевого соединения накапливают перед проведением стадии b. Таким образом, в данном варианте осуществления реализуют последовательность из параллельных получений растворимых и полурастворимых полимеров МИП, полимеры МИП объединяют, после чего объединенные полимеры МИП сшивают на стадии b.

В одном конкретном варианте осуществления любой из подробно описанных способов аффинной очистки может включать, по меньшей мере, два последовательных раунда аффинной очистки, где агент аффинной очистки, использующийся в каждом раунде, иммобилизируют на хроматографической матрице через функциональную группу, не использующуюся в любом другом из, по меньшей мере, двух раундов аффинной очистки.

Таким образом, в данном конкретном варианте осуществления используют технологию, описанную в публикации WO 2011/033021, результатом которой является то, что каждый из обогащенных растворимых или полурастворимых полимеров МИП способен связывать более, чем один дискретный эффективный центр связывания на своем соответствующем матричном/целевом соединении. Таким образом, настоящее изобретение вовлекает в себя использование на стадии а способа получения композиции, обогащенной по растворимым или полурастворимым полимерам МИП, которые связывают агент, где каждый из упомянутых полимеров МИП специфически связывает, по меньшей мере, два дискретных центра на упомянутом агенте, при этом данный способ включает

i) получение образца, содержащего упомянутые полимеры МИП,

ii) воздействие на упомянутый образец первой стадией аффинной хроматографии, где упомянутый агент используют в качестве агента аффинной очистки, и где упомянутый агент иммобилизируют на твердой или полутвердой фазе в результате связывания с одним единственным из упомянутых, по меньшей мере, двух дискретных центров,

iii) извлечение рецепторов, связывающихся с агентом,

iv) воздействие на полимеры МИП, извлеченные на предшествующей стадии, по меньшей мере, одной дополнительной стадией аффинной хроматографии, где упомянутый агент используют в качестве агента аффинной очистки, и где упомянутый агент иммобилизируют на твердой или полутвердой фазе в результате связывания с еще одним из упомянутых, по меньшей мере, двух дискретных центров, и извлечение полимеров МИП, связывающихся с агентом,

где на каждой упомянутой, по меньшей мере, одной дополнительной стадии аффинной хроматографии упомянутый еще один из упомянутых, по меньшей мере, двух дискретных центров отличается от любого одного из упомянутых, по меньшей мере, двух дискретных центров, который использовали прежде на стадиях b и d для иммобилизирования агента на твердой или полутвердой фазе.

Подробности в отношении данного варианта осуществления, описываются в публикации WO 2011/033021, которая во всей своей полноте посредством ссылки включается в настоящий документ.

Как это обсуждалось в настоящем документе, в особенности предпочитается, чтобы на стадии аффинной очистки использовалась бы хроматографическая матрица слоя уплотненного адсорбента. Однако, для очистки растворимых или полурастворимых полимеров МИП из образца исходного сырья, содержащего растворимые, полурастворимые и нерастворимые частицы, могла бы быть использована адсорбция на слой вспученного адсорбента.

В общем случае выбор матричных агентов и агентов аффинной очистки зависит от точного предполагаемого конечного варианта использования полученных нерастворимых полимеров МИП – для полимеров МИП, использующихся в аналитических областях применения, любой выбранный лиганд может составлять матричный агент или его имитатор. В особенности предпочтительные матричные молекулы/агенты и целевые молекулы/агенты описываются в публикации WO 2011/033021 и в публикации WO 2007/095949, и к настоящему изобретению относятся все описания изобретений в данных 2 литературных ссылках в отношении матричных и целевых молекул, а также их имитаторов при внесении соответствующих изменений. Примерами целевых молекул/агентов или матриц являются:

а: химическое вещество, описывающееся формулой H₃N⁺-CH(R)-COO^–, такое как аминокислота, или агент может представлять собой пептид, содержащий, самое большее, 12 аминокислотных остатков, таким образом, как в случае 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 аминокислот. Аминокислоту обычно выбирают из фенилаланина, тирозина, гистидина, лейцина, метионина, изолейцина, триптофана, треонина, валина и лизина. Кроме того, пептидом обычно является та структура, которая включает в пределы своей последовательности, по меньшей мере, одну аминокислоту, выбираемую из группы, состоящей из фенилаланина, тирозина, гистидина, лейцина, метионина, изолейцина, триптофана, треонина, валина и лизина. В конкретных вариантах осуществления данные аминокислоты присутствуют в виде аминокислоты на N-конце и/или С-конце в пептиде. В вариантах осуществления, в которых агент представляет собой пептид, он обычно представляет собой дипептид, трипептид, тетрапептид или пентапептид.

b: углевод, такой как разветвленный или линейный олигосахарид, содержащий, как максимум, 10 моносахаридных звеньев. В определенных вариантах осуществления, таким образом, углевод выбирают из моносахарида, дисахарида и трисахарида. В особенности интересные углеводы представляют собой D-галактозу и лактозу.

с: жирная кислота или липид; в случае агента в виде липида его обычно выбирают из группы, состоящей из холестерина, триглицерида и желчной кислоты или ее соли.

d: олигонуклеотид или олигонуклеотидное производное, такие как олигонуклеотид или олигонуклеотидное производное, выбираемые из группы, состоящей из олигонуклеотида РНК, олигонуклеотида ДНК, олигонуклеотида ЗНК, олигонуклеотида ПНК и смешанного олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотид или олигонуклеотидное производное представляют собой смешанный олигонуклеотид, который содержит, по меньшей мере, одно рибо- или дезоксорибонуклеотидное звено и, по меньшей мере, одно нуклеотидное звено ЗНК или ПНК.

е: любые молекулы, которые представляют собой комбинации из целевых матриц a–d (то есть, молекулы, которые включают компонент из, по меньшей мере, 2 из групп a–d; примерами являются липо- или гликопептиды).

Сшивание на стадии b

Для сшивания растворимых или полурастворимых полимеров МИП могли бы быть предусмотрены различные стратегии.

В общем случае все способы агломерирования полимеров МИП, описанные в публикации US 2009/0194481, являются подходящими для использования на стадии b настоящего изобретения. Таким образом, публикация US 2009/0194481 посредством ссылки включается в настоящий документ, в частности, в той мере, в которой описание в настоящем документе относится к сшиванию для объединения маленьких полимеров МИП с образованием более крупных структур.

Функциональная группа предпочтительно является доступной на частице перед тем, как может произойти сшивание. Функциональная группа могла бы быть введена в полимер или привита на полимер после проведения полимеризации (и уменьшения размеров в случае использования данной стратегии). Функциональные группы могли бы быть включены в полимер или привиты на полимер в виде либо защищенных, либо незащищенных функциональных групп.

Функциональная группа могла бы быть выбрана из группы, состоящей из -NH₂, -NRH, -NR₂, -N⁺R₃, -OH, -SH, -COOH, -CHCH₂, -NCO, -NCS, X (то есть, галогена и галогенидных производных) и их активных производных, таких как сложный эфир, галогенангидрид кислоты, ангидрид, амиды (первичные и вторичные), сульфонамиды и амидины. В качестве одной альтернативы введения функциональной группы специфически для целей сшивания могла бы быть получена функциональная группа на одном из функциональных мономеров или реакционно-способном производном функциональной группы, уже включенной в полимер МИП в качестве функционального мономера, после получения растворимого или полурастворимого полимера МИП. Одним примером является возможность превращения СООН, например, из метакриловой кислоты – функционального мономера, очень часто использующегося при синтезе полимеров МИП – в активный N-гидроксисукцинимидный сложный эфир, а впоследствии соединение, содержащее 2 и более аминогруппы, могло бы быть использовано в качестве сшивателя. Еще одним примером было бы использование бета-циклодекстрина в качестве функционального мономера в полимере МИП: в данном случае гидроксильные группы на бета-циклодекстрине могли бы быть использованы в качестве маркеров для сшивания при использовании, например, дивинилсульфона в качестве сшивателя.

К раствору растворимых или полурастворимых полимеров МИП добавляют сшивающий реагент. Сшивающий реагент может быть либо двух-, либо трех-, либо поливалентным и должен содержать функциональные группы, которые могут вступать в реакцию с функциональными группами в частицах растворимого или полурастворимого полимера МИП, а условия проведения реакции, такие как растворитель, значение рН, температура и тому подобное, должны облегчать прохождение реакции. Реакция должна продолжаться вплоть до получения сшитых частиц с желательным/требуемым размером. Это можно было бы регулировать при использовании параметров, таких как концентрация растворимого полимера МИП, концентрация сшивающего реагента, концентрационное соотношение между полимерами МИП и сшивающим реагентом, добавление веществ, гасящих реакцию, изменение температуры, разбавление реакционной смеси и тому подобное.

Один предпочтительный диапазон размеров для полученных нерастворимых полимеров МИП составляет 0,5–50 мкм, что предотвращает абсорбирование частиц из желудочно-кишечного тракта в случае использования сшитых частиц для терапевтического воздействия при несистемном способе действия.

В альтернативном варианте, сшивание на стадии b проводят в соответствии с представленным выше описанием в форме или в присутствии каркаса в целях отливки полимеров МИП, полученных с желательной формой, – в данном варианте осуществления размеры полученных полимеров МИП могут быть намного большими, чем 50 мкм, поскольку такой сшитый полимер может иметь размеры, которые даже делают возможной обработку структуры полимера МИП вручную. Например, полимеры МИП могли бы быть отлиты в форме губки, сетки, волокнистого материала, фильтра, волокна, которые сделали бы возможными устройства на основе полимера МИП, подходящие для использования при проведении операций в больших масштабах (например, или при очистке сточных вод), или устройства на основе полимера МИП в форме функционализованных поверхностей (таких как микротитрационные планшеты и тому подобное).

Во время проведения реакции сшивания предпочитается, чтобы сшивание не включало бы поля сшивания матрицы для полимеров МИП. Например, стадия b может повлечь за собой блокирование полей связывания матрицы на полимерах МИП матричными молекулой/агентом или их имитатором во время процесса сшивания, то есть, лиганд-специфический центр связывания мог бы, например, быть защищенным в результате присутствия матрицы или лиганда или их производного, имитатора или аналога, находящихся в растворе, при одновременном проведении сшивания. Данный подход обеспечил бы защиту центров связывания у индивидуальной частицы растворимого полимера МИП от создания стерических препятствий при последующем (после сшивания) повторном связывании лиганда. Например, в случае использования недостаточного количества лиганда в реакции в качестве агента защиты от сшивания будет иметь место внутренне присущий отбор для сохранения лучших центров связывания после завершения сшивания.

Необязательное выделение на стадии с

Последняя стадия в способе изобретения влечет за собой необязательные очистку или выделение полученных нерастворимых полимеров МИП. Может быть использован любой способ, известный на современном уровне техники, такой как, например, центрифугирование, фильтрование, диализ и тому подобное. В том случае, если использующийся способ сшивания не обеспечивал того, что все полученные полимеры МИП представляли бы собой действительные агенты связывания для целевого/матричного соединения, возможным также будет использование и способов аффинной очистки, таких как те, которые описываются в публикации WO 2007/095949, – то есть, на данной стадии могут быть использованы адсорбция на слой вспученного адсорбента или агглютинация. Однако вследствие преимуществ, задействованных при получении нерастворимых полимеров МИП, где центры связывания или карманы связывания защищены от способа сшивания на стадии b, наиболее предпочтительные варианты осуществления изобретения полагаются на более быстрые и простые способы, такие как центрифугирование или фильтрование.

Варианты использования полимеров МИП, полученных в соответствии с настоящим изобретением

Настоящее изобретение также относится к способу лечения, облегчения течения или профилактики заболевания, выбираемого из группы, состоящей из фенилкетонурии (ФКУ, болезни Феллинга), гиперфенилаланинемии (ГФА), алкаптонурии (болезни Гаррода), тирозинемии, гипертирозинемии, тяжелой миастении, гистидинемии, урокановой ацидурии, болезни кленового сиропа (валинолейцинурии), изовалериановой ацидемии (изовалериановой ацидурии), гомоцистинурии, пропионовой ацидемии, метилмалоновой ацидемии, глутарацидурии типа 1 (GA-1) и галактоземии, включающему прием в желудочно-кишечном тракте пациента, нуждающегося в этом, эффективного количества композиции молекулярно-импринтированных полимеров (МИП), которые получают в соответствии с настоящим изобретением, и при этом упомянутая композиция способна связывать агент, провоцирующий симптом, для упомянутого заболевании, а упомянутые полимеры МИП получают в соответствии с описанием в настоящем изобретении – в данном контексте ссылка делается на описание изобретения в публикации WO 2011/033021, где приводятся подробности в отношении данных заболеваний и соответствующих агентов, провоцирующих симптомы. К данному аспекту относится композиция полимеров МИП, полученных в соответствии с настоящим изобретением в целях использования в таком способе.

В альтернативном варианте, заболевание представляет собой гиперхолестеринемию. В данном случае обращаются к описанию изобретения как в публикации WO 2011/033021, так и в публикации WO 2007/095949, где подробно описываются соответствующие целевые соединения для полимеров МИП.

Полимеры МИП и композиции полимеров МИП изобретения

Настоящее изобретение также относится к новым полимерам МИП и новым композициям полимеров МИП. Полимеры МИП, получаемые по способам настоящего изобретения, структурно отличаются от нерастворимых полимеров МИП, которые получают по традиционным способам, вследствие технологий, использующихся для сшивания индивидуальных полимеров МИП, – помимо прочего, выбора сшивающей функциональности, которая формирует уникальные точки присоединения между первоначально нерастворимыми полимерами МИП. В частности, в случае использования условий сшивания, которые направлены на избегание сшивания в центрах связывания матрицы полимеров МИП, см. выше, физическую структуру каждого сшитого полимера МИП можно отличать от того, что имеет место для известных нерастворимых полимеров МИП.

Пример очистки перед сшиванием

Полимер синтезировали при использовании L-фенилаланина в качестве целевого соединения, а после этого при уменьшении размеров для растворимых частиц в результате механической классификации и размалывания на шаровой мельнице с последующим центрифугированием. Для удаления целевых молекул и других примесей из данной фракции растворимых полимеров МИП образец подвергали обширному диализу по отношению к буферу ФСБ. После этого образец наносили на обычную хроматографическую колонку со слоем уплотненного адсорбента. Матрица колонки представляла собой активированный при использовании N-гидроксисукцинимидила (NHS) материал sepharose 4 FF (GE Lifescience, 17-0906-01), с которым перед очисткой проводили сочетание пептида Gly-(L)Phe. Размер слоя колонки составлял приблизительно 30 мл, а скорость течения составляла 1 мл/мин. Результаты по хроматографии отслеживали в оперативном режиме при 210 нм. Большой сквозной пик был виден при приблизительно 9–20 мин после введения образца. Полимеры МИП, которые связывались с колонкой, элюировали из колонки в результате использования 1 мл фенилаланина, 10 мг/мл в подвижном буфере, при 70 мин. Небольшой пик (приблизительно 1–2% по размеру в сопоставлении со сквозным пиком) при 78–83 мин собирали и подвергали обширному диализу по отношению к буферу ФСБ для удаления соединения Phe из элюированной фракции. При 94–102 мин элюировали очень большой пик, содержащий соединение Phe. В заключение, данный образец элюированных полимеров МИП подвергали испытанию на емкость связывания соединения Phe и сопоставляли с исходным материалом. Данное испытание на емкость связывания соединения Phe проводили в результате добавления к образцу полимеров МИП соединения Phe, содержащего введенное ³H-меченое соединение Phe, и соединение Phe, связанное с полимерами МИП, отделяли от несвязанного соединения Phe в результате перепускания образца через колонку эксклюзионной хроматографии размеров (GE Lifescience 28-9180-04) и, в заключение, производили отсчет в сцинтилляционном детекторе после перемешивания со сцинтилляционной жидкостью. Полимеры МИП в пике 78–83 продемонстрировали емкость связывания соединения Phe, более чем в 500 раз превышающую то, что имело место для неочищенных полимеров МИП.

ПЕРЕЧЕНЬ ССЫЛОК

1) Yu Cong, Ph. D-thesis: «Molecular Recognition Studies Based on Imprinting Technology», Dept. of Pure and Applied Biochemistry, University of Lund, Sweden 1998.

2) Leif Schweitz, Ph. D-thesis: «Molecular Imprinted Matrices for Electrochromotography», Technical Analytical Chemistry, University of Lund, Sweden 2001.

3) Ioana Wärnmark-Surugiu, Ph. D-thesis: «Antibodies and Antibody Mimics in Binding Assays», Dept. of Pure and Applied Biochemistry, University of Lund, Sweden 2002.

4) Dickey FH, «The preparation of specific absorbents» Proc. Natl. Acad. Sci. 35(1949)227-229.

5) Ramström O. et al. J. Mol. Recog. 9(1996)691-696.

6) Schweitz L. et al. J. Chromatog. A 792(1997)401-409.

7) Vlatakis G. et al. «Drug Assay Using Antibody Mimics Made by Molecular Imprinting» Nature 361(1993)645-647.

8) Funke, W. et al., Adv. Polym. Sci. 136(1998)139-243.

9) Shea KJ and Dogherty TK, J. Am. Chem. Soc. 108(1986)1091-1093.

10) Shea KJ, Stoddard GJ, Shavelle DM, Wakui F and Choate RM Macromolecules 23(1990)4497-4507.

11) Wulff G and Poll HG Makromol. Chem. 188(1987)741-748.

12) Hoshino et al. (2008), JACS 130; 15242-3.

13) Hoshino et al. (2010), JACS 132; 6644-5.

14) Piletsky et al. (2006), Biopolymers and Cell 22; 63-67.

15) Guerreiro et al. (2009), Biosensors and Bioelectronics 24; 2740-2743.

Изобретение относится к способу получения нерастворимых молекулярно-импринтированных полимеров (МИП). Способ получения нерастворимых молекулярно-импринтированных полимеров (МИП) включает: a) получение растворимых или полурастворимых полимеров МИП, которые характеризуются тем, что 1) все полимеры будут связаны с матричными агентами, которыми они были импринтированы и 2) имеют размеры, которые делают возможным их разделение на хроматографической стадии при использовании хроматографии со слоем уплотненного адсорбента, где размеры растворимых или полурастворимых МИП, полученных на стадии а), являются такими, что они будут отфильтровываться через мембранный фильтр, имеющий отсечку менее или равную 900 нм, b) сшивание растворимых или полурастворимых полимеров МИП со стадии а) таким образом, чтобы получить нерастворимые МИП, которые связывают указанные матричные агенты, и c) необязательно выделение, концентрирование или очистку полимеров МИП, полученных в результате сшивания на стадии b). Технический результат – осуществление нового способа получения нерастворимых полимеров МИП, которые могут быть отделены от водного раствора, полученный материал делает его подходящим для использования при очистке при использовании хроматографии со слоем уплотненного адсорбента. 16 з.п. ф-лы, 1 пр.

1. Способ получения нерастворимых молекулярно-импринтированных полимеров (МИП), включающий:

a) получение растворимых или полурастворимых полимеров МИП, которые характеризуются тем, что 1) все полимеры будут связаны с матричными агентами, которыми они были импринтированы и 2) имеют размеры, которые делают возможным их разделение на хроматографической стадии при использовании хроматографии со слоем уплотненного адсорбента, где размеры растворимых или полурастворимых МИП, полученных на стадии а), являются такими, что они будут отфильтровываться через мембранный фильтр, имеющий отсечку менее или равную 900 нм,

b) сшивание растворимых или полурастворимых полимеров МИП со стадии а) таким образом, чтобы получить нерастворимые МИП, которые связывают указанные матричные агенты, и

c) необязательно выделение, концентрирование или очистку полимеров МИП, полученных в результате сшивания на стадии b).

2. Способ по п. 1, где размеры растворимых или полурастворимых полимеров МИП, полученных на стадии а), являются такими, что они будут отфильтровываться через мембранный фильтр, имеющий отсечку 450 нм.

3. Способ по п. 1 или 2, где растворимые или полурастворимые полимеры МИП получают в результате их получения из композиции, содержащей по меньшей мере один полимеризуемый агент в смеси с матричным агентом, при этом матричный агент связывается растворимыми или полурастворимыми полимерами МИП.

4. Способ по п. 3, где растворимые или полурастворимые полимеры МИП на стадии а) получают способом, выбранным из 1) получения полимера МИП в результате проведения полимеризации с образованием более крупных размеров частиц с последующим тонким измельчением, 2) получения полимера МИП в результате проведения полимеризационной конденсации и 3) получения полимера МИП в результате проведения полимеризации «in situ».

5. Способ по п. 3, где по существу все полимеры МИП, связывающие матричный агент, связывают один и тот же матричный агент.

6. Способ по п. 4, где по существу все полимеры МИП, связывающие матричный агент, связывают один и тот же матричный агент.

7. Способ по п. 3, где полимеры МИП, связывающие матричный агент, связывают по меньшей мере два различных матричных агента.

8. Способ по п. 4, где полимеры МИП, связывающие матричный агент, связывают по меньшей мере два различных матричных агента.

9. Способ по п. 3, где полимеризуемый агент(ы), использующийся для получения растворимых или полурастворимых полимеров МИП на стадии а), включает(ют) необязательно защищенные функциональные группы, и где с функциональных групп, в случае наличия защиты, защиту снимают после получения растворимых или полурастворимых полимеров МИП на стадии а), но перед стадией b).

10. Способ по п. 9, где сшивание на стадии b) включает функциональные группы растворимых или полурастворимых полимеров МИП.

11. Способ по п. 1, где сшивание на стадии b) не включает сшивания полей указанных МИП, которые могут связываться с указанным матричным агентом, которым они были импринтированы.

12. Способ по п. 11, где стадия b) влечет за собой блокирование полей указанных МИП, которые могут связываться с указанным матричным агентом или его имитатором во время процесса сшивания.

13. Способ по п. 1, где стадия а) после получения растворимых или нерастворимых полимеров МИП влечет за собой по меньшей мере одну стадию аффинной очистки, где на каждой стадии используют матричный агент, или целевой агент, или их имитатор в качестве агента аффинной очистки, в целях обогащения растворимых полимеров МИП, обладающих сродством к упомянутым матричному агенту, целевому агенту или их имитатору.

14. Способ по п. 13, где упомянутая стадия аффинной очистки включает по меньшей мере два последовательных раунда аффинной очистки, где агент аффинной очистки, использующийся в каждом раунде, иммобилизируют на хроматографической матрице через функциональную группу, не использующуюся в любом другом из по меньшей мере двух раундов аффинной очистки.

15. Способ по п. 13 или 14, где на стадии аффинной очистки используют хроматографическую матрицу слоя уплотненного адсорбента.

16. Способ по п. 1, где сшивание на стадии b) проводят в форме или в присутствии каркаса в целях отливки полимеров МИП, полученных с желательной формой.

17. Способ по п. 16, где полимеры МИП отливают в форме губки, сетки, волокнистого материала, фильтра или волокна.