СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ МАТРИЦЫ Российский патент 2009 года по МПК B01J20/30 B01J20/24 B01J20/291 C08B37/12 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к разделению и очистке целевых соединений, таких как биомолекулы, более конкретно к хроматографической матрице и новому способу ее получения. Данное изобретение также включает в себя применение такой матрицы в жидкостной хроматографии и хроматографическую колонку, заполненную такой матрицей.

Предшествующий уровень техники

Современные достижения в области биотехнологии требуют более быстрых и более аккуратных методов извлечения, очистки и анализа биологических и биохимических веществ, таких как белки. Электрофорез и хроматография являются двумя такими традиционно используемыми методами.

При электрофорезе заряженные частицы разделяют посредством перемещения в электрическом поле. Более конкретно, пробу помещают на среду, представляющую собой мягкую твердую основу, такую как пластина из агарозы или полиакриламидного геля, которую, в свою очередь, помещают между двумя электродами, положительно заряженным анодом и отрицательно заряженным катодом. При включении тока каждый компонент пробы перемещается с характеристической скоростью, которую определяет его результирующий заряд и его молекулярная масса. Одним существенным свойством хорошо работающего геля для электрофореза является его точка плавления, которая влияет на возможность экстрагировать перемещенные целевые компоненты из отдельных гелевых пятен. Так, низкая точка плавления геля обычно является предпочтительной. Обычно в гелях для электрофореза используют природную агарозу, но было замечено, что это сопровождается некоторыми проблемами. Например, даже хотя крупнопористая структура природной агарозы является превосходной для разделения больших макромолекул, для более мелких молекул нужно готовить агарозу с меньшей молекулярной массой. Обычно это достигается путем увеличения содержания агарозы в геле, что, однако, приводит к высоким вязкостям растворов, что осложняет формирование из них гелей. Для решения этих и других проблем для гелей для электрофореза были предложена модифицированная агароза.

Электрофорез обсуждается в US 3956273 (Guiseley), который касается агарозных и агаровых компонентов, полезных для электрофореза или диффузных взаимодействий, а также в качестве загустителей. Соединения модифицировали алкильными и алкенильными группами для того, чтобы понизить их температуру гелеобразования и плавления и увеличить их чистоту по сравнению с немодифицированным веществом. Более конкретно, агар или агарозу сначала растворяют в сильной щелочи, после чего добавляют подходящий реагент, чтобы обеспечить модификацию. Можно использовать бифункциональный агент, такой как эпихлоргидрин, но только в условиях, которые препятствуют сшиванию.

Электрофорез также обсуждается в US 5143646 (Nochumson et al), который касается композиций геля для разделения посредством электрофореза, содержащих полисахаридные гидрогели, такие как агароза, которые были достаточно дериватизированы или деполимеризованы для уменьшения их эффективной в отношении отливки вязкости. Описанные композиции не требуют никаких сшивающих или полимеризующих агентов.

Кроме того, US 5541255 (Kozulic) относится к гелям для электрофореза и более конкретно к сшитым линейным полисахаридным полимерам. Эти гели образуются путем растворения полисахарида в растворителе, таком как вода;

добавления сшивающего агента, который не заряжен и не заряжается при контакте с водой; и инкубирования смеси в состоянии покоя для одновременно взаимодействия полисахарида и сшивающего агента и для образования геля продукта в виде пластины. Согласно US 5541255, известные из уровня техники гели для электрофореза можно снова растворить в воде, в то время как в изобретении из US 5541255 предложен гель, который является нерастворимым в воде. Эти свойства достигаются за счет одновременного сшивания и гелеобразования, а также благодаря высокому отношению сшивающего агента к полисахариду.

В хроматографии проводят в контакт две взаимно несмешивающиеся фазы. Более конкретно, целевое соединение вводят в подвижную фазу, которая контактирует с неподвижной фазой. Затем целевое соединение в процессе перемещения через систему с помощью подвижной фазы претерпевает ряд взаимодействий между неподвижной и подвижной фазами. В данных взаимодействиях задействованы различия в физических или химических свойствах компонентов в пробе. В жидкостной хроматографии жидкий образец, возможно объединенный с подходящих буфером, составляет подвижную фазу, которая контактирует с неподвижной фазой, известной как сепарационная матрица. Обычно матрица содержит основу, к которой присоединены лиганды, представляющие собой группы, способные взаимодействовать с мишенью.

Сепарационные матрицы обычно основаны на носителях, выполненных из неорганических веществ, таких как оксид кремния, или органических веществ, таких как синтетические или натуральные полимеры или подобное. Синтетические полимеры, такие как стирол и дивинилбензол, часто используют для носителей, которые проявляют некоторую гидрофобность, например при гель-фильтрационной хроматографии, хроматографии гидрофобных взаимодействий (НIС) и обращенно-фазовой хроматографии (RPC). Кроме того, синтетические полимеры иногда являются более предпочтительными по сравнению с натуральными полимерами благодаря их текучим свойствам, которые могут быть более полезными, так как синтетические полимеры часто являются более жесткими и устойчивыми к давлению, чем обычно используемые природные полимерные носители.

Природные полимеры, которые обычно являются полисахаридами, такими как агароза, десятилетиями использовали в качестве основ для сепарационных матриц. Благодаря присутствию гидроксильных групп поверхности природных полимеров обычно являются гидрофильными и по существу не осуществляют неспецифического взаимодействия с белками. Другим преимуществом природных полимеров, особенно важным в очистке лекарственных средств или диагностических молекул для внутреннего употребления человеком, является их нетоксичность. Агарозу можно растворить в воде при повышенной температуре и затем, при охлаждении до определенной температуры (точки гелеобразования) получить пористый гель. При нагревании гель снова будет расплавляться при некоторой температуре (точка плавления), которая обычно значительно выше точки гелеобразования. Гелеобразование включает спираль-спиральную агрегацию полисахаридных полимеров и иногда упоминается как физическое сшивание. Для оптимизации скорости перемещения целевой массы и области, с которой взаимодействует мишень, часто желательно увеличивать пористость носителя, что может быть достигнуто посредством варьирования концентрации агарозы. Однако другим существенным параметром, который следует учитывать, являются текучие свойства носителя. Матрицу обычно используют в форме уплотненного слоя частиц (сферических или несферических). Когда через этот слой продавливают подвижную фазу, противодавление слоя будет, главным образом, контролироваться внутренними каналами между частицами. При низких скоростях течения частицы можно рассматривать как несжимаемые, и тогда противодавление возрастает в линейной зависимости от скорости потока с наклоном, зависящим от размера частиц. При более высоких скоростях частицы могут начать деформироваться под гидростатическим давлением, что приведет к уменьшению диаметра внутренних каналов и быстро возрастающему противодавлению. При определенной скорости течения, в зависимости от жесткости матрицы, слой деформируется, и противодействие стремится к бесконечности, до тех пор, пока автоматически не выключается хроматографическая система. Для увеличения жесткости и, следовательно, текучих свойств агарозы ее часто сшивают. Такое сшивание происходит между доступными гидроксильными группами и может быть получено, например, с эпихлоргидрином.

US 4973683 (Lindgren) касается сшивания пористых полисахаридных гелей и, более конкретно, способа увеличения жесткости при минимизации неспецифического взаимодействия в пористом полисахаридном геле. Этот метод включает получение агарозного геля и реагента, обозначенного как "монофункциональный", который содержит реакционноспособную группу, такую как галогеновая группа или эпоксидная группа, и двойную связь. Этот реагент связан с гелем через реакционноспособную группу; и двойную связь затем активируют в эпоксид или галогеногидрин, который в заключение реагирует с гидроксильными группами на агарозе, обеспечивая сшивание.

US 5135650 (Hjertén et al) относится к сильносжимаемым частицам хроматографической неподвижной фазы, таким как гранулы агарозы, которые являются достаточно жесткими для ВЭЖХ и непористыми в той степени, что являются непроницаемыми для растворенных веществ. Более конкретно, такие гранулы получают, начиная с пористых гранул агарозы, которые затем контактируют с органическим растворителем для стягивания пор, после чего поверхности гранул внутри стянутых пор сшивают для фиксации пор в их стянутом состоянии. Альтернативно гранулы получают путем заполнения пор полимеризуемым веществом, которое прививается к поверхностям пор и осуществляет прививочную полимеризацию. Одним из установленных преимуществ описанного изобретения является то, что одна и та же неподвижная фаза эффективна при высоких давлениях и все еще может быть использована при низких давлениях.

US 6602990 (Berg) касается способа получения пористого сшитого полисахаридного геля, при котором бифункциональный сшивающий агент добавляют к раствору полисахарида и позволяют связываться через его активный сайт с гидроксильными группами полисахарида. Из раствора затем образуется полисахаридный гель, после чего неактивный сайт сшивающего агента активируется и осуществляется сшивание геля. Таким образом, сшивающий агент вводят в полисахаридный раствор, в отличие от вышеобсуждаемых методов, где его добавляют к полисахаридному гелю. Бифункциональный сшивающий агент содержит один активный сайт, то есть сайт, способный взаимодействовать с гидроксильными группами полисахарида, например галогениды и эпоксиды, и один неактивный сайт, то есть группу, которая не взаимодействует с условиях, когда взаимодействует активный сайт, например аллильные группы. Таким образом, настоящий бифункциональный сшивающий агент соответствует "однофункциональным реагентам", используемым в соответствии с вышеобсуждаемым US 4973683 (Lindgren). Было показано, что частицы, состоящие из полученного геля, демонстрируют улучшенную способность выдерживать высокие скорости потока и противодавления. Недостатком метода из US 6602990 является то, что для активации сшитого агента требуется бром.

Наконец, US 5998606 (Grandics) касается способа синтеза хроматографической среды, при котором сшивание и функционализация матрицы происходят одновременно. Более конкретно, двойные связи, получаемые на поверхности полимерной углеводной матрицы, активируются в присутствии металлического катализатора с целью сшивания матрицы и функционализации ее галогенгидрином, карбоксилом или сульфонатными группами. Двойные связи получают на поверхности матрицы путем контакта с активирующим реагентом, который содержит атом галогена или эпоксид и двойную связь. Так, активирующий реагент из US 5998606 соответствует однофункциональному реагенту из US 4973683 и бифункциональному сшивающему агенту из US 6602990.

Таким образом, даже хотя существует ряд методик для получения сшитых полисахаридных сепарационным матриц, в связи с тем, что разные применения предъявляют разные требования к матрице, в данной области все еще остается необходимость создания альтернативных методов.

Краткое описание сущности изобретения

В одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения жесткой сшитой полисахаридной хроматографической матрицы.

В другом аспекте данного изобретения предложен способ получения высокопористой сшитой полисахаридной хроматографической матрицы.

В конкретном аспекте изобретения предложен способ получения жесткой сшитой полисахаридной хроматографической матрицы, в котором используются разные вещества и/или исходные вещества. В конкретном аспекте предложен способ, который позволяет избежать применения галогенов, таких как бром.

В еще одном аспекте изобретения предложена хроматографическая матрица, которая состоит из сшитых полисахаридных частиц и которая может выдерживать высокие скорости потока и/или противодавления.

Кроме того, в дополнительном аспекте предложена одноразовая система, содержащая сшитую полисахаридную матрицу. Одноразовая система по изобретению, которая включает хроматографическую колонку, заполненную частицами, или мембрану, является по существу стерильной и может содержать элементы, нужные для интеграции в процесс.

Этот и другие задачи могут быть достигнуты, как определено в прилагаемой формуле изобретения. Другие задачи и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из подробного описания, следующего ниже.

Определения

Термин сепарационная "матрица" означает в данном описании материал, состоящий из пористого или непористого твердого носителя, к которому присоединены лиганды. В хроматографической области матрица иногда обозначается как смола или среда.

Термин "целевое соединение" означает в данном описании любое соединение или другой объект, который является желательной целью в процессе.

Термин "лиганды" используется здесь в его общепринятом значении, то есть для химических объектов, которые способны взаимодействовать с целевым компонентом, таких как заряженные группы, способные взаимодействовать с противоположно заряженным соединением с ионообменном процессе.

K_av представляет собой параметр гель-фильтрации (эксклюзионной хроматографии), определяемый как (V_e-V₀)/(V_t-Vo), где V_e представляет собой объем элюирования для пика тестируемой молекулы, V₀ представляет собой свободный объем колонки и V_t представляет собой общий объем слоя. K_av является мерой фракции объема неподвижной фазы, доступного для конкретной тестируемой молекулы.

K_{av DX} представляет собой K_AV для молекул декстрана. В примерах использовали декстраны с молекулярной массой 110 кДа, 500 кДа и 1000 кДа.

Термин "точка гелеобразования", иногда в данном описании изобретения обозначаемый как "температура гелеобразования", означает температуру, при которой полимеры раствора физически взаимодействуют с образованием твердого геля. Термин "гелеобразующий" означает в данном описании способность образовывать физический гель.

Термин "сшивающий агент" при использовании в данном описании включает химические объекты, способные образовывать сшитые цепи между полимерами, а также агенты, способные обеспечивать сшивание полимерных цепей в присутствии подходящих реагентов, например гамма-излучения и бомбардировки электронами.

Термин "по существу стерильный" означает в данном описании, что не присутствует по существу никаких жизнеспособных микроорганизмов.

Термин "стерилизация" означает в данном описании способ получения объекта, не содержащего жизнеспособных микроорганизмов.

Подробное описание изобретения

В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения сшитой полисахаридной хроматографической матрицы, включающему

(а) получение водного раствора по меньшей мере одного гелеобразующего полисахарида, в котором по меньшей мере часть гидроксильных групп замещена группами, которые не подвержены нуклеофильной атаке;

(б) получение по существу сферических капелек раствора замещенного полисахарида;

(в) получение геля из раствора замещенного полисахарида и

(г) сшивание геля.

В конкретном воплощении данный способ включает:

(а) получение водного раствора по меньшей мере одного гелеобразующего полисахарида и замещение по меньшей мере части гидроксильных групп этого полисахарида в водном растворе группами, которые не подвержены нуклеофильной атаке;

(б) получение по существу сферических капелек раствора замещенного полисахарида;

(в) получение геля из раствора замещенного полисахарида и

(г) сшивание геля.

В указанном выше способе "не подверженный нуклеофильной атаке" относится к свойствам групп, полученных на полисахариде после замещения.

Таким образом, в первом воплощении исходное вещество представляет собой предварительно замещенный полисахарид, в то время как в конкретном воплощении изобретение также включает стадии замещения гидроксильных групп полисахарида. Как известно специалисту, доступные гидроксильные группы присутствуют на всех поверхностях полисахарида, и, соответственно, заместители будут присутствовать на поверхностях пор, а также на внутренних поверхностях матрицы. Более конкретно, полученный полисахарид был замещен группами, которые не подвержены нуклеофильной атаке. Соответственно, такие группы не вступают в реакцию с гидроксильными группами и, следовательно, иногда в данном описании обозначаются как "нереакционноспособные группы" или просто заместители. Противоположным типом групп, то есть группами, которые являются "реакционноспособными", в данном контексте являются электрофильные группы или группы, которые легко превращаются в электрофильные группы, такие как аллильные группы (легко эпоксидируемые), эпоксиды, галогенгидрины, α,β-ненасыщенные карбонилы, все из которых реагируют с гидроксильными группами. С использованием нереакционноспособных групп улучшают стабильность замещенного полимера, и становится легче контролировать последующую стадию сшивания. Часть гидроксильных групп, которые замещены в полисахариде в соответствии с настоящим изобретением, составляет приблизительно 10%, например приблизительно 5%, и более конкретно приблизительно 2%. Таким образом, в одном воплощении часть гидроксильных групп, которые являются замещенными, находится в интервале от 1 до 20%, например от 2 до 10%, и более конкретно 2-5%.

В одном воплощении данного способа нереакционноспособные заместители выбраны из группы, состоящей из простых эфиров, сложных эфиров, амидов и ксантатов. В одном воплощении заместители, присутствующие на полисахариде, представляют собой простые эфиры, такие как алкиловые эфиры, например метиловый, этиловый, пропиловый и бутиловый эфиры; гидроксильные эфиры, такие как гидроксипропиловый и гидроксибутиловый эфиры; глицерин; олигоглицерин; олигоэтиленгликоль или полиэфиры любого из вышеупомянутого. В предпочтительном воплощении часть гидроксильных групп полисахарида замещена гидроксиэтильными эфирными группами.

В другом воплощении нереакционноспособные заместители, присутствующие на полисахариде, представляют собой сложные эфиры, такие как алкиловые эфиры и гидроксилалкиловые эфиры.

В еще одном воплощении нереакционноспособные заместители, присутствующие на полисахариде, представляют собой амиды, такие как карбамиды или карбамидные производные.

В еще одном воплощении нереакционноспособные заместители, присутствующие на полисахариде, представляют собой ксантатовые соли или ксантатовые эфиры.

Предварительно замещенные полисахариды имеются в продаже, например у Cambrex Byproducts, USA. В наилучшем воплощении данного изобретения замещенный полисахарид представляет собой гидроксиэтилагарозу. Способы модификации полисахаридов легко доступны специалистам в данной области; смотри, например, US 3956273, который относится к гелям для электрофореза, состоящим из таких незамещенных полисахаридов. Как обсуждается в US 3956273, замещение полисахарида понижает его температуру гелеобразования, что, как ожидается, будет нарушать пористую структуру продукта, и, что очевидно, является признаком более слабого связывания. Однако настоящее изобретение указывает на обратное, так как хроматографические матрицы, полученные согласно изобретению, обладают улучшенными текучими свойствами по сравнению с соответствующим сшитым продуктом, полученным из незамещенного полисахарида, смотри экспериментальную часть ниже.

Сшивание геля, полученного таким образом, можно провести любым известным в данной области способом, например путем добавления сшивающего агента, который взаимодействует с гидроксильными группами полисахарида.

В первом воплощении сшивание представляет собой хорошо известный двухстадийный процесс с использованием сшивающего агента, содержащего одну реакционноспособную группу, такую как эпоксид, и одну группу, которая является активируемой, такую как аллильная группа, как описано, например, в обсуждаемом выше US 4973683.

В альтернативном воплощении сшивание осуществляют за одну стадию путем добавления сшивающего агента, который содержит две реакционноспособные группы. Таким образом, в данном воплощении нет необходимости активировать сшивающий агент.

Примеры традиционно используемых сшивающих агентов, полезных, как описано выше, включают, например, изоцианаты, эпоксиды, метилольные соединения, галогенгидрины, алкилгалогениды или акцепторы в реакции присоединения Михаэля (такие как винилсульфоны). Сшивающие агенты, которые полезны в настоящем способе, легко могут быть приобретены в торговой сети.

Как хорошо известно, для активации активируемых групп сшивающего агента можно использовать гамма-излучение или бомбардировку электронами. В конкретном воплощении гамма-излучение или бомбардировку электронами используют для обеспечения сшивания полисахаридных полимеров.

В одном воплощении нереакционноспособные заместители, то есть группы, которые не подвержены нуклеофильной атаке, после сшивания отщепляют. Очевидно, что способ отщепления таких групп будет зависеть от природы этой группы, и специалист в данной области может легко подобрать условия для каждого случая. В предпочтительном воплощении нереакционноспособные заместители представляют собой сложноэфирные группы, которые затем отщепляются посредством гидролиза. Доступные гидроксильные группы полисахарида затем дополнительно функционализируют до нужного типа хроматографической матрицы, как это обсуждалось ниже.

Однако, даже хотя основная роль нереакционноспособных заместителей полисахарида в данном способе состоит в том, чтобы позволить полисахаридному раствору образовать конкретный сшитый гель, который демонстрирует улучшенные текучие свойства, показанные в экспериментальной части, их также можно использовать для дальнейшей функционализации. В предпочтительном воплощении и нереакционноспособные заместители, и любые оставшиеся незамещенные гидроксильные группы функционализированы. Такая функционализация может быть обеспечена заряженными группами в ионообменной матрице; группами, которые проявляют биологическую аффинность в аффинной матрице; хелатными группами в матрице для аффинной хроматографии с применением иммобилизованного металла (IМАС) или гидрофобными группами в матрице для хроматографии гидрофобного взаимодействия (НIС). В конкретном воплощении функциональные группы представляют собой ионообменные лиганды, выбранные из группы, состоящей из четвертичных аммониевых (Q), диэтиламиноэтиловых (DEAE), диэтиламинопропиловых (ANX), сульфопропиловых (SP) и карбоксиметильных (СМ) групп. Таким образом, в альтернативном воплощении нереакционноспособные заместители используются на следующей стадии для присоединения хроматографических лигандов. В данном воплощении заместители предпочтительно представляют собой простые эфирные группы. Способы присоединения таких функциональных групп к носителю хорошо известны специалисту в данной области и могут включать предшествующую стадию аллилирования заместителя и применение стандартных реагентов и условий (смотри, например, Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson et al., Greg T. Hermanson, A. Krishna Mallia and Paul K. Smith, Academic Press, INC. 1992). В конкретном воплощении нереакционноспособные заместители составляют лиганды, например, обеспечивая гидрофобные взаимодействия с целевым веществом. В такой HIC хроматографии иллюстративным заместителем будут алкилэфирные группы.

В конкретном воплощении группы, которые отделяют лиганды от поверхности геля, присоединяют к полисахариду на стадии, предшествующей обсуждаемому выше связыванию лигандов. Такие отделяющие группы известны как удлинители, гибкие ветви, щупальца и так далее и могут быть линейными или разветвленными. Обычно используемый гидрофильный удлинитель, подходящий для матриц, основанных на полисахаридах, представляет собой декстран, который можно приобрести с разными молекулярными массами. Другие типы удлинителей основаны на синтетических полимерах или сополимерах. Специалист может легко присоединить лиганды через удлинители к данной хроматографической матрице, используя хорошо известные методы. Кроме того, хроматографическая матрица может содержать реагирующие на воздействия полимеры, которые представляют собой полимеры, которые, как известно, подвержены физическому или химическому изменению при физическом воздействии, таком как свет, магнитное поле, температура, рН и т.д., смотри, например, US 6641735 (Japan Chemical Innovation Institute). Как хорошо известно, такие изменения можно использовать для осуществления или улучшения связывания и/или высвобождения от лигандов.

Кроме того, в данной области хорошо известно, что точку гелеобразования полисахарида можно модифицировать путем добавления функциональных групп к полисахаридным полимерам. Таким образом, в конкретном воплощении нереакционноспособные заместители полисахарида функционализируют для того, чтобы изменить точку гелеобразования полисахарида. Путем функционализации можно добавить любую(ые) хорошо известную(ые) группу(ы), как это обсуждается выше. С этой целью можно функционализировать любой из, или оба нереакционноспособных заместителя и любые оставшиеся незамещенные гидроксильные группы. Настоящее изобретение включает любую новую форму полисахаридного геля, такую как агароза, полученную путем модификации согласно изобретению.

Полисахарид может быть выбран из группы, состоящей из агарозы, агара, целлюлозы, декстрана, пектина, крахмала, хитозана, конджака, курдлана, каррагинана, геллана и альгината. В предпочтительном воплощении настоящего способа полисахарид представляет собой агарозу. В данном контексте понятно, что термин "агароза" включает любое производное или модифицированную агарозу, которая способна обеспечивать гель улучшенной жесткости, получаемый согласно изобретению. В конкретном воплощении в данном способе используют смесь двух или более полисахаридов, приведенных выше в качестве примера.

В конкретном воплощении температура плавления и/или гелеобразования полисахарида ниже по меньшей мере приблизительно на 1°С, чем у соответствующего незамещенного полисахарида.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ получения сшитой полисахаридной хроматографической матрицы, включающий

(а) получение водного раствора по меньшей мере одного гелеобразующего полисахарида, в котором часть гидроксильных групп аллилирована;

(б) получение по существу сферических капелек раствора замещенного полисахарида;

(в) получение геля из раствора замещенного полисахарида и

(г) сшивание геля, причем в данном процессе аллильные группы со стадии (а) не участвуют.

Таким образом, как очевидно специалисту в данной области, сшивание обеспечивается путем использования гидроксильных групп, которые не аллилированы на стадии (а), предпочтительно путем реакции с подходящим сшивающим агентом, как описано выше. Таким образом, следует понимать, что термин "часть" гидроксильных групп в данном контексте означает "некоторые, но не все". Обсуждаемые выше способы сшивания одинаково применимы в данном воплощении. Выполняя стадию (г) только как сшивание геля, получают хроматографическую матрицу, у которой присутствуют обсуждаемые здесь преимущества улучшенной жесткости по сравнению с матрицами, сшитыми традиционным образом.

Соответственно, данный аспект отличается от обсуждаемого выше US 6602990 (Berg), где бифункциональный сшивающий агент добавляют к раствору полисахарида и позволяют ему связываться через его активный сайт с гидроксильными группами полисахарида. Как следует из US 6602990, указанными бифункциональными сшивающими агентами являются, например, аллильные группы.

Однако, в соответствии с данным аспектом изобретения, аллильные группы, добавленные перед гелеобразованием, не используются в сшивании геля. Вместо этого, их преимущественно превращают в гидрофильные группы, такие как гидроксильные группы, после сшивания. Таким образом, аллильные группы могут быть ликвидированы после сшивания на отдельной стадии, например путем взаимодействия с тиоглицерином или меркаптоэтанолом превращены в гидроксильные группы. Такая реакция представляет собой реакцию присоединения в свободнорадикальных условиях, которая является хорошо известной реакцией, легко осуществляемой специалистом в данной области.

В альтернативном воплощении аллильные группы, полученные на полисахариде перед гелеобразованием, которые не используются в последующем сшивании, можно функционализировать, как обсуждается выше, в контексте нереакционноспособных заместителей.

В конкретном воплощении способа по изобретению, в дополнение к аллильным группам гелеобразующие полисахариды содержат гидроксильные группы, замещенные группами, которые не подвержены нуклеофильной атаке.

Таким образом, основной общей концепцией настоящего изобретения является то, что группы добавляют на полисахарид до образования капелек и гелеобразования, причем добавленные группы обеспечивают конечный продукт со свойствами, отличающимися от соответствующего продукта, полученного без добавления таких групп. Как следует из вышеуказанных аспектов, такие группы представляют собой либо группы, которые не подвержены нуклеофильным атакам; аллильные группы; или их комбинации.

В одном воплощении настоящего способа, хроматографическая матрица состоит из пористых, по существу сферических частиц. Средний размер частиц может быть в интервале 10-300 мкм, предпочтительно 30-200 мкм или более предпочтительно 45-165 мкм, например 45 мкм в диаметре. Такие пористые полисахариды легко могут быть получены специалистами в данной области в соответствии со стандартными способами, таким как обратное гелеобразование суспензии (S.Hjertén: Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398 (1964)). Например, при приготовлении агарозы по существу сферические капельки полисахаридного раствора получают, сначала растворяя или диспергируя агарозу в водном растворителе, таком как вода или любой другой традиционно используемый растворитель, при температуре выше точки плавления конкретного полисахарида. Если требуется, для обеспечения нужной пористости, может быть добавлен пороген. В случае незамещенного полисахарида, его потом замещают, как обсуждается выше. Растворенный замещенный полисахарид затем эмульгируют в традиционно используемом органическом растворителе, таком как толуол или гептан, при перемешивании, после чего температуру понижают ниже точки гелеобразования полисахарида, например комнатной температуры. Полученные таким образом частицы можно промывать для удаления любых следов растворителя и сшивать, как обсуждается выше. Таким образом, в одном воплощении данного способа растворенный замещенный полисахарид эмульгируют в органическом растворителе. В альтернативном воплощении по существу сферические капельки полисахаридного раствора получают путем распыления в окружающий воздух композиции термически гелеобразующего полимера в водной среде и позволяя распыленной композиции образовать гель в воздухе, как описано в US 6248268 (FMC Corporation), который включен в данное описание посредством ссылки. В конкретном воплощении водный раствор полисахарида получают путем нагревания, и гель получают путем понижения температуры.

В одном воплощении данного способа пороген добавляют до гелеобразования, чтобы обеспечить подходящий размер пор. Подходящие порогены хорошо известны специалисту в данной области. В данном контексте данная хроматографическая матрица может обладать пористостью по меньшей мере 90%, например приблизительно 94% и более конкретно приблизительно 96%.

Настоящее изобретение также включает способ получения по существу стерильной колонки, заполненной сшитой полисахаридной хроматографической матрицей. Более конкретно данный способ включает

(а) получение водного раствора по меньшей мере одного гелеобразующего полисахарида;

(б) получение по существу сферических капелек раствора замещенного полисахарида;

(в) получение геля из раствора замещенного полисахарида;

(г) сшивание геля;

(д) заполнение сшитым гелем хроматографической колонки и

(е) стерилизацию заполненной колонки облучением, паром или автоклавированием.

В конкретном воплощении способ по изобретению включает стадию, на которой хроматографическую колонку заполняют сшитой хроматографической матрицей, полученной согласно настоящему изобретению. В одном воплощении заполненную колонку затем подвергают стерилизации. В альтернативном воплощении данный способ включает раздельную стерилизацию полисахаридной хроматографической матрицы и асептического комплекта в стерильной заполненной колонке. Хроматографическая колонка согласно данному аспекту представляет собой тип колонки, хорошо известный как одноразовая колонка или иногда как "хроматографическая колонка для однократного применения", и особенно предпочтительна для медицинских и/или диагностических продуктов. В данном контексте очевидно, что термин "однократное применение" означает одно применение или ограниченное число применений, например 1-3.

В альтернативном воплощении способа по изобретению стадию (б) заменяют стадией получения полисахаридной мембраны. В конкретном воплощении мембрана является стерилизованной и подходит для одноразовой хроматографии.

Вторым аспектом данного изобретения является хроматографическая матрица, полученная, как описано выше. В одном воплощении хроматографическая матрица содержит по существу сферические частицы и имеет значение K_av для декстрана массой 110 кДа по меньшей мере приблизительно 0,4, предпочтительно более 0,5.

В одном воплощении хроматографическая матрица представляет собой мембрану или фильтр. В еще одном воплощении хроматографическая матрица выполнена в виде монолита. В других воплощениях хроматографическая матрица представляет собой поверхность, чип, волокно или подобное.

В конкретном воплощении хроматографическую матрицу по изобретению получают в соответствии со стадиями (а)-(е) выше.

Третий аспект данного изобретения представляет собой хроматографическую колонку, заполненную матрицей, полученной, как описано выше. В предпочтительном воплощении колонку выполняют из любого подходящего вещества, такого как биосовместимый пластик, например полипропилен или стекло. Колонка может иметь размер, подходящий для лабораторного масштаба или крупномасштабной очистки. В конкретном воплощении колонку по изобретению снабжают адаптерами Люэра, соединителями трубок и колпачковыми гайками. Таким образом, настоящее изобретение также включает набор, состоящий из хроматографической колонки, заполненной хроматографической матрицей, как описано выше; по меньшей мере один буфер и письменные инструкции по очистке целевых соединений, в отдельных ячейках. Данное изобретение также включает хроматографическую матрицу по настоящему изобретению, находящуюся в любом другом формате, таком как ожиженный слой частиц в колонке или сосуде; в сосудах для периодического процесса; или нанесены на поверхность, такую как мембрана или чип.

Как следует из вышесказанного, в одном воплощении способ по изобретению приводит к по существу стерильной хроматографической колонке. Таким образом, конкретным воплощением данной хроматографической колонки, которая является по существу стерильной, является одноразовый или однократный формат. Стерильные или по существу стерильные форматы особенно предпочтительны для процессов медицинской промышленности, таких как очистка лекарственного средства, где чистота является критичной.

Еще одним воплощением является набор, содержащий хроматографическую колонку по изобретению. Этот набор может содержать заполненную хроматографическую колонку; трубки и буферы. Этот набор, части которого могут быть предварительно смонтированы, можно изготовить в по существу стерильной форме.

Целевыми соединениями может быть любое соединение, выбранное из группы, состоящей из пептидов; белков, таких как рецепторы и антитела; нуклеиновых кислот, таких как ДНК, например плазмид, РНК и нуклеотидов; вируса; прионов, клеток, например прокариотических или эукариотических клеток; углеводов и других органических молекул, например кандидатов в лекарственные средства. В конкретном воплощении целевое соединение представляет собой диагностический маркер. Так, целевые соединения, очищенные с использованием хроматографической матрицы по настоящему изобретению, могут, например, представлять собой лекарственные соединения, такие как лекарственные средства на основе белков и антител; диагностические соединения, такие как антигены или диагностические антитела; и клетки для применения в терапии, такие как стволовые клетки.

Последним аспектом изобретения является применение хроматографической матрицы, изготовленной, как описано выше, для очистки, выделения или удаления одного или более целевых соединений из жидкости. Так, данный аспект представляет собой способ жидкостной хроматографии, как обсуждается выше, и включает адсорбцию целевого соединения на хроматографическую матрицу согласно изобретению и возможно следующую стадию селективной десорбции мишени, традиционно известную как градиентное элюирование. Если требуется, между адсорбцией и элюированием осуществляют одну или более чем одну стадию промывания. Альтернативно, данное применение предназначено для задерживания целевого соединения, в этом случае целевое(ые) соединение(я) селективно задерживается по сравнению с другими соединениями. В этом случае нет необходимости в стадии элюирования для высвобождении мишени, если колонку не нужно регенерировать для дополнительного использования.

Как хорошо известно в хроматографии, падение давления на протяжении уплотненных слоев может быть значительной проблемой, особенно в работе крупномасштабных препаративных хроматографических колонок. Такие факторы, как форма и соотношение геометрических размеров уплотненного слоя, а также текучие свойства хроматографической матрицы, будут оказывать влияние на падение давления. Настоящее изобретение продемонстрировало, что агарозная хроматографическая матрица, приготовленная согласно изобретению, позволяет существенно увеличивать скорости потоков по сравнению с соответствующими матрицами, изготовленными в соответствии со стандартными способами. Таким образом, в одном воплощении применения по настоящему изобретению к матрице, состоящей из по существу сферических частиц, демонстрирующей K_av по меньшей мере 0,4 для декстрана с молекулярной массой 110 кДа, приложен поток жидкости по меньшей мере 300 см/ч.

Еще одним аспектом данного изобретения является применение хроматографической матрицы по настоящему изобретению для очистки и/или извлечения целевых соединений для применения в пищевой промышленности. Таким образом, применение может, например, включать очистку белков молока от сыворотки. Преимуществом использования хроматографической матрицы по настоящему изобретению по сравнению с традиционными хроматографическими матрицами является увеличенная жесткость данной матрицы, что позволяет обрабатывать большие объемы, которые обычно требуются для экономичной скорости потока и, следовательно, стоимости.

Наконец, другим конкретным применением хроматографической матрицы, полученной согласно изобретению, является удаление небольших количеств загрязнений, таких как вирусы или прионы, из технологической жидкости. В данном воплощении хроматографическая матрица может представлять собой частицы или мембрану, предпочтительно для однократного применения, чтобы позволить безопасное удаление загрязнений с помощью используемой матрицы.

Наконец, в одном воплощении матрицу, приготовленную согласно данному способу, используют в качестве основы в клеточной культуре. В предпочтительном воплощении указанная основа находится в форме по существу сферических частиц носителя, которые подходят либо для суспензионной культуры, либо для иммобилизации на поверхности. Такие культивируемые клетки можно использовать, например, в качестве лекарственного вещества в схемах лечения на основе клеточной терапии. Еще одним применением матрицы является иммобилизация ферментов с получением биокатализатора.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Данные примеры представлены исключительно для иллюстрации, и их не следует расценивать как ограничивающие настоящее изобретение, как оно определено прилагаемой формулой изобретения. Все документы, приведенные ниже и по всему описанию изобретения, включены в данное описание посредством ссылки.

Материалы/Исследуемые единицы.

Эпихлоргидрин

Натрия боргидрид

Натрия сульфат

Методы

Пример 1. Получение сшитых агарозных гранул

7 г гидроксиэтилагарозы (NuSieve™ GTG, Cambrex) растворяли при перемешивании в 200 мл дистиллированной воды в течение 30 минут в кипящей водяной бане. Раствор помещали в 1,5 л плоскодонный стеклянный сосуд, поддерживаемый при 60°С, содержащий раствор 2 г триглицериндиизостеарата (Prisorine™ 3700, Iniqema) в 300 мл толуола. Скорость перемешивания (турбинная мешалка 40 мм) составляла 400 об/мин во время загрузки и затем возрастала до 650 об/мин в течение 20 минут и до 800 об/мин в течение 20 минут. Капельки гидроксиэтилагарозы затем образовывали гель при охлаждении сосуда от 60°С до 20°С в течение промежутка времени 30 минут. Добавляли 1 л этанола и содержимое сосуда перемешивали в течение 15 минут и затем оставляли для осаждения. Супернатант декантировали и гранулы затем промывали этанолом и водой на G3 стеклянной фильтровальной воронке. Наиболее вероятный диаметр полученных гранул составлял 99 мкм при измерении с помощью светового дифракционного прибора Malvern Mastersizer.

285 г гранул, полученных, как описано выше, добавляли в сосуд и перемешивали при 200 об/мин с помощью двухлопастной мешалки. Добавляли 137 г сульфата натрия и растворяли путем нагревания до 50°С при перемешивании 200 об/мин. Перемешивание продолжали в течение 30 мин после достижения целевой температуры 50°С. Добавляли 10,7 мл 50%-ного NaOH, затем 0,4 г боргидрида натрия. Затем за 7 часов прокачивали 54 мл 50%-ного NaOH и 80 мл эпихлоргидрина, используя Dosimat™ насосы (скорости подачи: 50%-ный NaOH - 0,129 мл/мин, эпихлоргидрин - 0,190 мл/мин). Реакционную смесь затем оставляли при перемешивании со скоростью 200 об/мин в течение ночи при 50°С. Затем суспензию геля нейтрализовали до рН 5,1, используя 60%-ную уксусную кислоту, и гель промывали водой на стеклянном фильтре. Наконец, гранулы просеивали на ситах от 40 до 160 мкм.

Пример 2. Получение сшитых агарозных гранул

Гранулы, содержащие замещенную агарозу в гелевой форме, получали в соответствии с Примером 1.

Гранулы затем сшивали согласно методике, описанной в Примере 1, за исключением того, что температуру поддерживали при 70°С.

Пример 3. Создание напорного потока

Гранулами, полученными, как описано выше, заполняли колонку HR 5/5 (Amersham Bioscience, Uppsala, Sweden), которая была присоединена к насосу Р-900 (Amersham Bioscience, Uppsala, Sweden). 50%-ный этанольный раствор прокачивали через колонку с начальной скоростью потока 0,5 мл/мин. Скорость потока увеличивалась пошагово на 0,5 мл/мин каждые 30 с, пока не наблюдалось значительное увеличение противодавления. Наибольшую скорость потока перед увеличением давления отмечали как максимальный поток для рассматриваемого геля. Результаты представлены в таблице ниже.

Пример 4. Определение пористости

Гранулами заполняли HR10 колонку с высотой слоя 15 см. Колонку устанавливали в FPLC (быстрая жидкостная хроматография белков) систему с LCC Plus/FPLC управляющим устройством, насосом Р-500 и детектором MV-7 UV-M. Окрашенные образцы декстрана (0,1%-ные растворы, 0,2 мл) инъецировали и изократически элюировали 0,05 М трис 0,15 М NaCl, pH 8,0 при скорости потока 0,2 мл/мин (15 см/ч). В качестве сравнения колонку заполняли Sepharose™ 4FF (Amersham Bioscience, Uppsala, Sweden) и оценивали аналогично. Результаты представлены в таблице ниже.

Результаты

Таблица Образец Температура сшивания Максимальный поток (мл/мин) Kav* Dx 1400 кДа Kav* Dx 500 кДа Kav* Dx 110 кДа Пример 1 50°С 5,0 0,18 0,65 0,77 Пример 2 70°С 8,5 0,05 0,63 0,76 Sepharose™ 4FF - 3,5 0,06 0,56 0,69 * Kav значения определяли в соответствии с принципами и методами гель-фильтрации, Pharmacia LKB Biotechnology 1991 (ISBN 91-97-0490-2-6)

Гранулы, полученные согласно настоящему изобретению, имели поры большего размера, чем взятая для сравнения агарозная матрица Sepharose™ 4FF, и допускали значительно более высокую скорость потока.

Настоящее изобретение относится к способу получения сшитой полисахаридной хроматографической матрицы, включающему в себя получение водного раствора гелеобразующего полисахарида, в котором часть гидроксильных групп замещена группами, не чувствительными к нуклеофильной атаке; получение по существу сферических капелек раствора замещенного полисахарида; получение геля из раствора замещенного полисахарида и сшивание геля. Данное изобретение также относится к хроматографической колонке, заполненной приготовленной таким образом матрицей, а также ее применению. Хроматографические матрицы, полученные согласно изобретению, обладают улучшенными текучими свойствами. 9 н. и 17 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения сшитой полисахаридной хроматографической матрицы, включающий
(а) получение водного раствора по меньшей мере одного гелеобразующего полисахарида, где по меньшей мере часть гидроксильных групп замещена группами, которые не подвержены нуклеофильной атаке;
(б) получение по существу сферических капелек раствора замещенного полисахарида;
(в) получение геля из раствора замещенного полисахарида; и
(г) сшивание геля.

2. Способ получения сшитой полисахаридной хроматографической матрицы, включающий
(а) получение водного раствора по меньшей мере одного гелеобразующего полисахарида и замещение по меньшей мере части гидроксильных групп этого полисахарида в водном растворе группами, которые не подвержены нуклеофильной атаке;
(б) получение по существу сферических капелек раствора замещенного полисахарида;
(в) получение геля из раствора замещенного полисахарида; и
(г) сшивание геля.

3. Способ по п.1 или 2, где группы, которые не подвержены нуклеофильной атаке, выбраны из группы, состоящей из простых эфиров, сложных эфиров, амидов и ксантатов.

4. Способ получения сшитой полисахаридной хроматографической матрицы, включающий
(а) получение водного раствора по меньшей мере одного гелеобразующего полисахарида, в котором часть гидроксильных групп аллилирована;
(б) получение по существу сферических капелек раствора замещенного полисахарида;
(в) получение геля из раствора замещенного полисахарида; и
(г) сшивание геля, причем в данном процессе аллильные группы со стадии
(а) не участвуют.

5. Способ по п.4, где аллильные группы со стадии (а) превращают или удаляют перед стадией (в).

6. Способ по п.4, где в дополнение к аллильным группам гелеобразующий полисахарид содержит гидроксильные группы, которые были замещены группами, которые не подвержены нуклеофильной атаке.

7. Способ по п.6, который включает стадии, определенные в одном из пп.1-3.

8. Способ по любому из пп.1, 2 или 4, где растворенный замещенный полисахарид эмульгируют в органическом растворителе.

9. Способ по любому из пп.1, 2 или 4, где перед гелеобразованием добавляют пороген.

10. Способ по любому из пп.1, 2 или 4, где водный раствор полисахарида получают путем нагревания, а гель получают путем понижения температуры.

11. Способ по любому из пп.1, 2 или 4, где полисахарид представляет собой агарозу.

12. Способ по любому из пп.1, 2 или 4, где точка гелеобразования полисахарида ниже по меньшей мере на приблизительно 1°С чем точка гелеобразования соответствующего незамещенного полисахарида.

13. Способ по любому из пп.1, 2 или 4, где стадия сшивания включает добавление сшивающего агента.

14. Способ по любому из пп.1, 2 или 4, где группы, которые не подвержены нуклеофильной атаке, отщепляют после сшивания.

15. Способ по п.14, где группы, которые не подвержены нуклеофильной атаке, представляют собой сложноэфирные группы, отщепляемые посредством гидролиза.

16. Способ по любому из пп.1, 2 или 4, включающий последующую стадию присоединения хроматографических лигандов к гидроксильным группам гелеобразующего полисахарида после его сшивания.

17. Способ по любому из пп.1, 2 или 4, включающий последующую стадию присоединения хроматографических лигандов к аллильным группам гелеобразующего полисахарида.

18. Способ получения по существу стерильной сшитой полисахаридной хроматографической матрицы, включающий
(а) получение водного раствора по меньшей мере одного гелеобразующего полисахарида;
(б) получение по существу сферических капелек раствора замещенного полисахарида;
(в) получение геля из раствора замещенного полисахарида;
(г) сшивание геля;
(д) заполнение сшитым гелем хроматографической колонки;
(е) стерилизацию заполненной колонки облучением, паром или автоклавированием.

19. Способ получения по существу стерильной хроматографической колонки, который включает способ по любому из пп.1-18, последующее заполнение полученной таким образом сшитой хроматографической матрицей хроматографической колонки и последующую ее стерилизацию.

20. Способ по любому из пп.1, 2 или 4, где стадию (б) заменяют стадией получения полисахаридной мембраны из раствора замещенного полисахарида.

21. Способ получения по существу стерильной полисахаридной мембраны, который включает способ по п.20 с последующей ее стерилизацией.

22. Пористая сшитая полисахаридная хроматографическая матрица, полученная как описано в способе по любому из пп.1-21 и состоящая из по существу сферических частиц.

23. Матрица по п.22, где в частицах K_av для декстрана массой 110 кДа составляет по меньшей мере 0,5.

24. Хроматографическая колонка, заполненная хроматографической матрицей, полученной, как определено в любом из пп.1-18, или как она определена в пп.22, 23.

25. Применение хроматографической матрицы по п.22 или 23 для очистки, выделения или удаления целевого соединения из жидкости.

26. Применение по п.25, где к матрице, состоящей из по существу сферических частиц, которые имеют K_av для декстрана массой 110 кДа по меньшей мере приблизительно 0,5, приложен поток жидкости по меньшей мере 300 см/ч.