СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ИМПРИНТИРОВАННОГО СОРБЕНТА, СПЕЦИФИЧНОГО К МИКОТОКСИНАМ Российский патент 2024 года по МПК B01J20/02 B01J20/22 B01J20/281 B01J20/30 G01N1/28 

Область техники

Изобретение относится к области нанотехнологий и получения материалов, обладающих свойствами специфичной экстракции целевых молекул, а именно к способу получения молекулярно импринтированного сорбента на основе использования белковой молекулы глюкооксидазы (ГО) в качестве матричного полимера.

Предложен способ синтеза молекулярно импринтированного полимера (МИП) на основе ГО, специфичного к микотоксинам, на различных неорганических микро и наноразмерных носителях, в том числе модифицированных полианилином, на основе полимеризации ГО в присутствии молекул шаблонов.

Уровень техники

Микотоксины – вторичные метаболиты, продуцируемые грибами, принадлежащими к родам Aspergillus, Fusarium, Penicillium. В настоящее время зарегистрировано более 500 микотоксинов, среди которых наибольшую опасность для сельского хозяйства, здоровья человека и животных представляют группы афлатоксинов, охратоксинов, фумонизинов, а также патулин, зеараленон (ЗЕА) и вомитоксин (ДОН) [Haque M. A., Wang Y., Shen Z., Li X., Saleemi M. K., He C. Mycotoxin contamination and control strategy in human, domestic animal and poultry: A review // Microb. Pathog. 2020. V. 142. P. 104095. doi:10.1016/j.micpath.2020.1040952]. Структура микотоксинов аналогична природным эстрогенам, что обусловливает высокое сродство связывания с сайтами эстрогенных рецепторов клеток и, как результат, приводит к снижению уровня прогестерона и сывороточного тестостерона в кровотоке. Вызывающее многочисленные клеточные изменения, которые могут приводить к бесплодию или снижения частоты беременностей у животных (свиней, овец, свиней и крупного рогатого скота), а также гиперактивных эстрогенных нарушений у человека [Taranu I., Braicu C., Marin D. E., Pistol G. C., Motiu M., Balacescu L., Beridan Neagoe I., Burlacu R. Exposure to zearalenone mycotoxin alters in vitro porcine intestinal epithelial cells by differential gene expression // Toxicol. Lett. 2015. V. 232. № 1. P. 310. doi:10.1016/j.toxlet.2014.10.022].

На территории РФ контроль уровней микотоксинов проводится в зерне, используемом в пищевых и кормовых целях (Технический регламент таможенного союза “О безопасности зерна” (ТР ТС 015/2011), и продуктах питания (Единые санитарно-эпидемиологические и гигиенические требования к продукции (товарам), подлежащей санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю)). Предельно допустимое содержание микотоксинов в зерне злаковых (пшеница, ячмень, кукуруза), применяемых в пищевых целях, составляет 0,1–1 мг/кг, для зернобобовых и масличных культур предельные значения не установлены. Для всех видов зерна кормовых культур предельно допустимое содержание микотоксинов установлено на уровне не более чем 1 мг/кг.

Негативное воздействие микотоксинов и их производных на здоровье человека и животных, проявляющееся в различных иммунотоксических и генотоксических эффектах, обусловливает необходимость разработки эффективных методов их концентрирования, определения и инактивации в природных матрицах (Fleck S. C., Hildebrand A. A., Müller E., Pfeiffer E., Metzler M. Genotoxicity and inactivation of catechol metabolites of the mycotoxin zearalenone // Mycotoxin Res. 2012. V. 28. № 4. P. 267. doi:10.1007/s12550-012-0143-x; Moreau M., Lescure G., Agoulon A., Svinareff P., Orange N., Feuilloley M. Application of the pulsed light technology to mycotoxin degradation and inactivation: Destruction of mycotoxins by pulsed light // J. Appl. Toxicol. 2013. V. 33. № 5. P. 357. doi:10.1002/jat.1749).

Современным требованиям к аналитическим методам, основанным на сочетании высоких значений чувствительности и селективности к целевому аналиту, хорошо удовлетворяют природные молекулярные и рецепторные системы, к которым относят антитела и ферменты, а также селективные рецепторные зоны в клеточных оболочках. Вследствие того, что природные системы молекулярного распознавания в большинстве относятся к биомолекулам, их синтез основан на сложных биохимических процессах. При этом достигаются высокие значения чувствительности и селективности связывания с целевыми молекулами аналита. В то же время возникают серьезные ограничения на транспортировку, хранение и применение таких систем, связанные, например с невозможностью детектировать изменения концентрации аналита в биологических жидкостях, характеризующихся низкими значениями pH с помощью природных антител. Кроме того, выделение и очистка антител представляет собой трудоёмкий и многостадийный процесс, что обуславливает увеличение стоимости процесса. Одним из способов решения данной проблемы является создание синтетических аналогов природных антител. Одной из техник применяемых для создания таких систем является молекулярных импринтинг, позволяющий получать полимерные материалы, характеризующиеся наличием сайтов связывания, специфичных к различным веществам (Analytical chemistry. – 2015. – Т. 88. – №. 1. – С. 250-261). Полимерные материалы, модифицированные молекулярным импринтингом, в том числе на различных формах подложек органического и неорганического происхождения, принято называть молекулярно импринтированными полимерами (МИП). В общем случае МИП — искусственный рецептор, получаемый при полимеризации матрицы в присутствии молекул шаблона (молекулы определяемого соединения или структурного аналога) и их последующем удалении специально подобранными элюентами. Образовавшийся отпечаток представляет собой селективный сайт, который демонстрирует предпочтительное сродство к молекуле-шаблону по сравнению с другими молекулами. К основным достоинствам МИП относятся: повышенная структурная прочность, устойчивость к высокой температуре и давлению, инертность к агрессивным средам и сохранение нативных свойств при хранении в течение длительного времени. Реализация этих положительных факторов обусловлена созданием жесткой полимерной сетки, выступающей в качестве МИП-матрицы.

Одним из возможных путей создания полностью биологически совместимых селективных сорбентов для сорбции и инактивации микотоксинов является использование высокоселективных МИП сорбентов на основе импринтированных белковых молекул (ИБ). К преимуществам ИБ следует также отнести высокую селективность к молекулам-шаблонам (Gutierrez A. V. R., Hedström M., Mattiasson B. Bioimprinting as a tool for the detection of aflatoxin B1 using a capacitive biosensor // Biotechnol. Reports. 2016. V. 11. P. 12. doi:10.1016/j.btre.2016.05.006) и возможность использования доступных реагентов - белковых молекул и сшивающих мономеров.

Известен способ получения молекулярно импринтированного полимера для селективного улавливания молекул пахучих веществ (RU 2731379, МПК A61K 8/81, опубл. 02.09.2020). Используется метод радикальной полимеризации в этаноле. Анализируемое соединение (Na-гексаноилглутамин) добавляют к комбинации мономера и сшивающего агента при концентрации анализируемого соединения 200 мкМ, т.е. 200 нмоль/мл. Смесь оставляют на 12 часов при комнатной температуре (25°С), а затем остаточное количество Na-гексаноилглутамина, не связанное с сорбентом, анализируют с помощью анализа способом жидкостной хроматографии, сопряженной с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС).

Однако основными недостатком получаемого сорбента является относительно низкая емкость сорбента.

Известен способ использования ИБ для создания сорбента в иммуноанализе (Pidenko P., Zhang H., Lenain P., Goryacheva I., De Saeger S., Beloglazova N. Imprinted proteins as a receptor for detection of zearalenone // Anal. Chim. Acta. 2018. V. 1040. P. 99. doi:10.1016/j.aca.2018.07.062). Предложен способ иммуноанализа на основе ИБ для обнаружения ЗЕА. Белки использовались в качестве матричного полимера для создания связывающих сайтов с высокой специфичностью к ЗЕА. Полученные сорбенты были использованы для иммунохимического обнаружения ЗЕА в образцах, загрязненных пшеницы и кукурузы. В качестве подтверждающего метода была использована жидкостная хроматография в сочетании с тандемной масс-спектрометрией. Полученные результаты позволяют использовать разработанный способ для сорбции и анализа ЗЕА с чувствительностью, соответствующей максимально допустимому уровню содержания ЗЕА в необработанных злаках, установленному ЕК (100 мкг⋅кг^-1).

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения ИБ сорбента на микотоксины, описанный в (Beloglazova N., Lenain P., Tessier M., Goryacheva I., Hens Z., De Saeger S. Bioimprinting for multiplex luminescent detection of deoxynivalenol and zearalenone // Talanta. 2019. V. 192. P. 169. doi:10.1016/j.talanta.2018.09.042), который выбран в качестве прототипа. В качестве белковой молекулы мономера для создания ИБ использовался бычий сывороточный альбумин. В водный раствор бычьего сывороточного альбумина при перемешивании вводят раствор молекул шаблона (ЗЕА), вносят сшивающий мономер глутаровый альдегид (ГА) и очищают. Полученные ИБ иммобилизируют на поверхность микропланшета и проводят одновременное определение концентрации двух микотоксинов путем регистрации флуоресцентного сигнала на двух разных длинах волн, характерных для коньюгатов микотоксинов с квантовыми точками, флуоресцирующих в разных частях спектра. Пределы обнаружения для одновременного определения составляли 100 и 700 мкг⋅кг^-1 в обеих матрицах для ЗЕА и ДОН соответственно.

Основными недостатками аналогов являются: 1. возможность использования получаемых ИБ сорбентов исключительно в виде слоев, нанесенных на поверхность луночного микропланшета. Данное обстоятельство практически делает невозможным использование ИБ сорбентов для сорбции микотоксинов в больших объемах и делает практически невозможным использование получаемых ИБ сорбентов в технологических процессах; 2. недостаточная устойчивость получаемых ИБ к процессам со значительными механическими и динамическими воздействиями, например высокоскоростному и ультра центрифугированию, которое широко используется на этапах синтеза и использования ИБ сорбентов; 3. недостаточная удельная площади поверхности получаемых ИБ сорбентов.

Раскрытие сущности

Технической проблемой заявляемого изобретения является возможность создания ИБ сорбента с высокоразвитой поверхностью и высокой сорбционной емкостью, устойчивого к механическим и динамическим воздействиям и пригодного для многократной регенерации и использования в технологических процессах, включая стадии осаждения, фильтрации и центрифугирования.

Технический результат заявляемого изобретения заключается в получении устойчивого к механическим и динамическим воздействиям ИБ сорбента для селективной сорбции микотоксинов, с высокоразвитой поверхностью, на основе микро и наночастиц неорганических оксидов, вариативно предварительно покрытых слоем полианилина, на поверхности которых расположен слой ИБ на основе белковой молекулы с большой площадью поверхности-глюкозооксидазы (ГО).

Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения молекулярно-импринтированного сорбента, специфичного к микотоксинам, заключающемся в синтезе импринтированных белковых молекул, включающем внесение в водный раствор белковой молекулы, молекулы-шаблона микотоксина и/или его структурного аналога, сшивающего агента, очистку методом диализа, иммобилизацию, согласно решению, в качестве белковой молекулы используют молекулу глюкооксидазы, внесение в водный раствор глюкооксидазы и молекул-шаблонов проводят в диапазоне рН в диапазоне от 0,1 до 12, полученную реакционную смесь доводят до рН от 6,5 до 10, и проводят выделение сорбента из раствора путем центрифугирования после иммобилизации.

Иммобилизацию полученных импринтированных белковых молекул проводят на поверхности микро и наночастиц неорганических оксидов.

Иммобилизацию импринтированных белковых молекул проводят на поверхности модифицированных полианилином микро и наночастиц неорганических оксидов, для этого микро и наночастицы неорганических оксидов диспергируют в растворе окислительный агент - анилин или его соли, осаждают, промывают растворителями для удаления непрореагировавших компонентов, сушат.

В качестве окислительного агента выбирают пероксидисульфат аммония.

Иммобилизацию осуществляют методом физической адсорбции.

В качестве сшивающего агента используют глутаровый альдегид.

Осуществление изобретения

Для получения ИБ сорбента специфичного к сорбции микотоксинов, его синтез проводится следующим образом: на первом этапе проводится синтез ИБ, специфичных к сорбции микотоксинов. В водный раствор ГО при рН в диапазоне 0,1-12 при перемешивании вводят раствор молекулы шаблона (индивидуального микотоксина, либо смесей микотоксинов, либо структурных аналогов или смесей структурных аналогов с микотоксинами). Далее реакционную смесь доводят до рН 6,5–10 и вносят сшивающий мономер, например глутаровый альдегид (ГА).

Синтезированные ИБ, специфичные к сорбции микотоксинов, очищают методом диализа против ФСБ с pH 5,8–8 в течение не менее 1 часа с заменой диализата каждые 5–120 мин. На следующем этапе проводят иммобилизацию ИБ на поверхности микро и наночастиц неорганических оксидов методом физической адсорбции.

Вариативно проводят иммобилизацию ИБ на поверхности микро и наночастиц неорганических оксидов, модифицированных слоем полианилина. Для этого на первом этапе микро и наночастицы неорганических оксидов диспергируют в растворе анилина, либо его солей. В полученный раствор при постоянном перемешивании в течение длительного времени, но не более 72 часов вносят расчетное количество пероксидисульфата аммония, или иного окислительного агента, при этом готовый раствор выдерживают не более 72 часов после окончания введения окислительного агента. Модифицированные частицы неорганических оксидов, покрытые слоем полианилина осаждают, например центрифугированием, промывают растворителями для удаления непрореагировавших компонентов и сушат. Далее проводят иммобилизацию ИБ на поверхности полученных микро и наночастиц методом физической адсорбции.

Пример 1.

Синтез ИБ сорбента специфичного к ЗЕА проводили по следующей методике. В водный раствор ГО (1 мг/мл, 15 мкМ) вносили 0.1 М HCl до pH 3.0, перемешивали в течение 10 мин и добавляли раствор молекулы шаблона ЗЕА или структурного аналога (4-гидроксикумарин, 640 мкМ, 0.1 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин, добавляли 0.1 М раствор NaOH до pH 9.0 и вносили 0.1 мл 1% водного раствора ГА. Полученный раствор перемешивали в течение 30 мин и выдерживали 12 ч при 4°C.

Синтезированные ИБ очищали методом диализа против ФСБ с pH 6.5 в течении 6 ч с заменой диализата каждые 60 мин, затем против ФСБ с pH 7.4 в течение 18 ч.

Растворы синтезированных ИБ концентрировали центрифугированием в ультрафильтрационных пробирках (30 000 MWCO) при 3000 g и 4°C в течение 7 мин. Полученные образцы хранили в стеклянных виалах из тёмного стекла при 4°C.

ИБ иммобилизировали на поверхности частиц массой 5 мг SiO₂ методом физической адсорбции. Частицы, модифицированные ИБ, осаждали центрифугированием при 5000 g в течение 5 мин и после удаления надосадочной жидкости использовали для сорбции ЗЕА. Полученные частицы вносили в 1 мл раствора ЗЕА с концентрацией 50 мкг/мл в 0.1 М ФСБ с pH 7.4 и перемешивали на орбитальном шейкере в течение 30 мин (50 об/мин). Концентрацию ЗЕА в надосадочной жидкости определяли методом ВЭЖХ-УФ после осаждения частиц центрифугированием при 5000 g в течение 5 мин.

Предел обнаружения ЗЕА для с использованием полученного ИБ сорбента составляет 95 мкг⋅кг^-1.

Пример 2

Синтез ИБ сорбента специфичного к ДОН проводили по следующей методике. В водный раствор ГО (1 мг/мл, 15 мкМ) вносили 0.2 М HCl до pH 3.5, перемешивали в течение 15 мин и добавляли раствор молекулы шаблона ДОН (640 мкМ, 0.1 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 15 мин, добавляли 0.1 М раствор NaOH до pH 8.5 и вносили 0.2 мл 1% водного раствора ГА. Полученный раствор перемешивали в течение 40 мин и выдерживали 8ч при 4°C.

Синтезированные ИБ очищали методом диализа против ФСБ с pH 6.8 в течении 4 ч с заменой диализата каждые 120 мин, затем против ФСБ с pH 7.4 в течение 18 ч.

Растворы синтезированных ИБ концентрировали центрифугированием в ультрафильтрационных пробирках (30 000 MWCO) при 4000 g и 4°C в течение 9 мин.

Частицы TiO₂ диспергировали в 15 мл 0.01 М раствора анилина гидрохлорида в HCl (pH 4,5). В полученный раствор при постоянном перемешивании в течение 3 ч при 2°С) по каплям вносили 0.2 мл 0.05 М раствора пероксидисульфата аммония. Модифицированные частицы полианилина TiO₂ осаждали центрифугированием при 5000 g в течение 15 мин, промывали БД для удаления непрореагировавших компонентов и сушили в вакууме при 50°С. ИБ иммобилизировали на поверхности частиц массой 5 мг полианилина TiO₂ методом физической адсорбции. Частицы, модифицированные ИБ, осаждали центрифугированием при 5000 g в течение 5 мин и после удаления надосадочной жидкости использовали для сорбции ДОН. Полученные частицы вносили в 1 мл раствора ДОН с концентрацией 60 мкг/мл pH 7.2 и выдерживали при перемешивании 15 минут. Концентрацию ДОН в надосадочной жидкости определяли методом ВЭЖХ-УФ после осаждения частиц центрифугированием при 5000 g в течение 5 мин.

Предел обнаружения ДОН с использованием полученного ИБ сорбента составляет 110 мкг⋅кг^-1.

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает получение сорбента с высокой сорбционной емкостью, устойчивостью к механическим и динамическим воздействиям, пригодного для многократной регенерации и использования в технологических процессах, включая стадии осаждения, фильтрации и центрифугирования.

Изобретение относится к области нанотехнологий. Раскрыт способ получения молекулярно-импринтированного сорбента, специфичного к микотоксинам, заключающийся в синтезе импринтированных белковых молекул, включающем внесение в водный раствор белковой молекулы, молекулы-шаблона микотоксина и/или его структурного аналога, сшивающего агента, очистку методом диализа, иммобилизацию, где в качестве белковой молекулы используют молекулу глюкооксидазы, внесение в водный раствор глюкооксидазы и молекул-шаблонов проводят при значениях в диапазоне рН от 3,0 до 3,5, полученную реакционную смесь доводят до рН от 8,5 до 9,0 и проводят выделение сорбента из раствора путем центрифугирования после иммобилизации, при этом иммобилизацию полученных импринтированных белковых молекул проводят на поверхности микро- и наночастиц неорганических оксидов. Изобретение обеспечивает получение устойчивого к механическим и динамическим воздействиям сорбента на основе импринтированных белковых молекул для селективной сорбции микотоксинов с высокоразвитой поверхностью, на основе микро- и наночастиц неорганических оксидов, вариативно предварительно покрытых слоем полианилина, на поверхности которых расположен слой импринтированных белковых молекул на основе белковой молекулы с большой площадью поверхности - глюкозооксидазы (ГО). 4 з.п. ф-лы, 2 пр.

1. Способ получения молекулярно-импринтированного сорбента, специфичного к микотоксинам, заключающийся в синтезе импринтированных белковых молекул, включающем внесение в водный раствор белковой молекулы, молекулы-шаблона микотоксина и/или его структурного аналога, сшивающего агента, очистку методом диализа, иммобилизацию, отличающийся тем, что в качестве белковой молекулы используют молекулу глюкооксидазы, внесение в водный раствор глюкооксидазы и молекул-шаблонов проводят при значениях в диапазоне рН от 3,0 до 3,5, полученную реакционную смесь доводят до рН от 8,5 до 9,0 и проводят выделение сорбента из раствора путем центрифугирования после иммобилизации, при этом иммобилизацию полученных импринтированных белковых молекул проводят на поверхности микро- и наночастиц неорганических оксидов.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что микро- и наночастицы неорганических оксидов предварительно перед иммобилизацией модифицируют полианилином, для этого микро- и наночастицы неорганических оксидов диспергируют в растворе окислительный агент - анилин или его соли, осаждают, промывают растворителями для удаления непрореагировавших компонентов, сушат.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в качестве окислительного агента выбирают пероксидисульфат аммония.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что иммобилизацию осуществляют методом физической адсорбции.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве сшивающего агента используют глутаровый альдегид.