УСОВЕРШЕНСТВОВАННОЕ ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИМЕРОВ С МОЛЕКУЛЯРНЫМИ ОТПЕЧАТКАМИ Российский патент 2011 года по МПК A61K31/74 A61K31/78 C08J9/00 B01J20/26 

Область техники

Настоящее изобретение относится к усовершенствованиям в получении полимеров с молекулярными отпечатками (ПМО, МIР), и, в частности, к способам повышения связывающей способности и избирательности (специфичности) ПМО таким образом, что указанные полимеры могут быть использованы в качестве поглотителей в фармацевтических препаратах, в особенности в фармацевтических препаратах, связывающих в желудочно-кишечном тракте целевые молекулы, например холестерин, желчные кислоты и соли желчных кислот. Кроме того, предлагаемое усовершенствование получения ПМО может быть использовано в качестве средства характеристики указанных ПМО.

Предпосылки изобретения

Молекулярный импринтинг синтетических полимеров представляет собой способ, в соответствии с которым проводят сополимеризацию функциональных и сшивающих мономеров в присутствии целевой молекулы, которая действует как молекулярный шаблон. Перед началом полимеризации функциональные мономеры либо образуют комплекс с шаблоном посредством нековалентного взаимодействия, либо образуют ковалентные связи с получением полимеризуемого производного шаблона. После полимеризации функциональные группы мономеров остаются в фиксированном положении за счет образования сильно сшитой полимерной структуры. Последующее извлечение шаблона экстракцией растворителем и/или химическим отщеплением открывает центры связывания, которые соответствуют размерам и форме целевой молекулы. Таким образом, в полимер (уже называемый полимером с молекулярным отпечатком, ПМО) вводят молекулярную память, в результате чего он приобретает способность повторно связывать целевые молекулы с очень высокой избирательностью.

Первоначально ПМО использовали в качестве неподвижных фаз ЖХВР, в особенности для хирального разделения. Впоследствии их применение было расширено и теперь включает другие аналитические методики, например, тонкослойную хроматографию, капиллярный электрофорез, твердофазную экстракцию и иммуноанализ, включающий анализы на связывание. Связывающие центры часто обладают сродством и селективностью, приближающимися к соответствующим характеристикам систем антитело-антиген. Такие имитаторы (мимики) имеют ряд очевидных преимуществ перед настоящими антителами в области сенсорных технологий. Из-за высокой плотности поперечных сшивок ПМО имеют прочную и устойчивую внутреннюю структуру, что способствует их применению в агрессивных средах, например, в присутствии кислот, оснований или ионов металлов, в органических растворителях или при высоких температурах и давлениях. Кроме того, производство ПМО достаточно дешево, и полученные полимеры можно хранить в сухом состоянии при комнатной температуре в течение длительного времени.

Таким образом, в принципе, все ПМО получают следующим образом: смешивают мономеры и целевые молекулы (или молекулы шаблона), происходит самосборка, добавляют сшивающий агент, после чего может быть инициирована полимеризация. После полимеризации полимер измельчают с образованием мелких фракций и производят экстракцию целевых молекул. Если ПМО вновь помещают в раствор целевых молекул, то они встраиваются в ПМО (см. также: Yu Cong; Leif Schweitz; and loana Wärnmark-Surugiu).

Основные технологические операции приготовления ПМО схематически показаны на Фиг.1.

История ПМО

Один из первых примеров приготовления ПМО был описан еще в 1949 году Дики (Dickey), который использовал один из видов диоксида кремния (жидкое стекло) для селективного распознавания красителей. Гораздо позднее были описаны другие типы самоорганизующихся систем, образующих сетчатые структуры, которые могли специфически связывать целевые молекулы/аналиты (Ramström et al., Schweitz et al., Vlatakis et al.).

Выбор мономеров и типа полимеризации

В 1970-х и 1980-х годах (см.: Shea 1986, Shea 1990, Wulff 1987) была описана концепция ковалентного связывания шаблона/целевой молекулы непосредственно полимером, применяемым для построения каркаса. Было предположено, что непосредственное связывание приводит к более однородному распределению связывающих центров в полимере. В то же время, однако, это не решает проблему удаления шаблона после полимеризации. Для удаления шаблона необходимо провести как измельчение полимера, так и разрушение химических связей.

Приготовление ПМО без связывания шаблона с одним из мономеров, применяемых при полимеризации, часто приводит к образованию хороших ПМО, но эксперименты, описанные в литературе, показывают, что многие из полученных связывающих центров содержат связывающие центры, которые имеют тенденцию к связыванию шаблона/аналита с менее специфическими частями молекулы и, следовательно, не придают получаемым ПМО желаемой специфичности. Это очень важно для ПМО, применяемых для аналитических целей, в особенности если целью является отделение стереоизомерных форм молекул, в то время как отсутствие специфичности менее важно, если требуется усилить общую связывающую способность получаемых ПМО.

Показано, что в некоторых аналитических ситуациях шаблон должен отличаться от целевой молекулы, то есть вместо использования при получении ПМО настоящего шаблона, с целью получения ПМО, не загрязняющих анализируемый образец, приготовление производят с использованием «имитаторов». Очевидно, что нахождение имитатора шаблона, способного обеспечивать образование специфического связывания между аналитом и ПМО, является трудной задачей.

Абсолютно иной способ приготовления ПМО заключается в полимеризации смеси, в которой мономер, сшивающие агенты и шаблон (имитатор шаблона) выдерживают в особом формате в эмульсии, в которой ПМО образуется сразу же в виде частиц (Funke et al.). Размер частиц ПМО, получаемого таким способом, зависит от концентрации мономера и скорости перемешивания (определяющей размер капель эмульсии), а также от других показателей. (Для получения размера частиц, достигающего 1 мкм, перемешивание раствора следует производить при скорости 1000 об/мин). В соответствии с литературными данными, недостатком способов такого типа являются значительная продолжительность приготовления и низкие выходы.

Данные, полученные в соответствии с существующим уровнем техники обычно указывают на сложности, наблюдаемые при приготовлении воспроизводимых ПМО, в которых отсутствует компромисс между емкостью и избирательностью (т.е. оба показателя ниже необходимых). До настоящего времени в данной области техники не был описан надежный и удобный способ приготовления композиций ПМО с высокой связывающей способностью (Sellergren 1998).

Получение частиц подходящего размера

Если для приготовления ПМО используют полимеризацию в массе, то из-за высокой плотности поперечных сшивок перед экстракцией молекул шаблона необходимо измельчение полимера до очень мелких частиц. Различные способы измельчения применяют в самых разнообразных отраслях промышленности, от производства цемента (частицы миллиметрового размера) до небольших шаровых мельниц, используемых для приготовления толстопленочных паст (частицы микрометрового размера), применяемых в электрических цепях. Несмотря на то, что процесс измельчения обеспечивает ключевую часть функциональных свойств ПМО (как избирательности, так и емкости), в литературе, посвященной ПМО, так и не описан в деталях выбранный способ измельчения - имеется лишь упоминание о том, что полученную массу полимера размалывают и просеивают (сортируют по размерам частиц) перед удалением шаблона из ПМО.

Удаление шаблона

В большей части литературы удаление молекул шаблона описано не слишком подробно, несмотря на то, что эта операция является очень важной для получения функциональных свойств ПМО. Чаще всего эту операцию лишь упоминают в виде некоей процедуры промывки с использованием одного или нескольких конкретно названных растворителей. В частности, если ПМО получают для применения в твердофазной экстракции (ТФЭ), например в качестве инструмента для предварительного концентрирования аналитов, то даже остаточные количества шаблона будут ухудшать практические свойства ПМО. Отделение ПМО от матрицы, используемой для удаления шаблона, часто проводят путем фильтрования или центрифугирования.

Известные попытки усовершенствования ПМО

В патенте США 4111863 описан «Ненабухающий трехмерный полимер, включающий компонент, который представляет собой остаток оптически активного соединения, причем указанный остаток может быть удален из указанного полимера химическим способом, в результате чего в физической структуре указанного полимера остается полость, соответствующая по размерам и форме указанному остатку оптически активного соединения, и конкретное пространственное расположение функциональных групп внутри полости, образованной в указанном полимере, соответствует химической структуре указанного оптически активного соединения…», причем «оптически активное соединение» представляет собой шаблон, который впоследствии должны связывать получаемые ПМО.

В патенте США 5110833 описан «способ получения синтетических энзимов или синтетических антител, включающий ориентацию мономеров вокруг трафаретной молекулы, добавление сшивающих агентов, полимеризацию с образованием полимера и последующее удаление трафаретной молекулы, в результате чего в полимере получают полость, соответствующую указанной трафаретной молекуле», который должен усиливать избирательность ПМО по отношению к молекулам шаблона. Другими словами, улучшение технических характеристик, описанное в патенте США 5110833, основано на оптимизации контакта между шаблонной молекулой и звеньями мономера перед началом полимеризации.

В патенте США 6881804 в качестве средства улучшения технических характеристик ПМО описано создание в ПМО пористости, облегчающей доступ к полостям, которые предназначены для взаимодействия с шаблоном.

В патенте США 6638498 описаны специально выбранные мономеры, предназначенные для получения ПМО, специфичных к желчной кислоте, а в заявке US 2004/0157209 А1 предложена иммобилизация шаблонной молекулы на материале подложки перед проведением полимеризации. Все попытки улучшения технических характеристик ПМО связаны с изменением химических характеристик мономеров или архитектуры ПМО, т.е. операций, которые производят до начала или во время приготовления ПМО.

В патенте CШA 5994110 опиcaны ПМО, получаемые образованием in situ небольших полимеров/олигомеров, которые включают структуры, комплиментарные молекуле-шаблону. Полимеры или олигомеры образуют вокруг биомолекулы покрытие или изображение, затем указанное покрытие или изображение с нее снимают и получают из него отдельные частицы, которые могут быть использованы, например, в качестве терапевтических или профилактических молекул, например, медикаментов. Такой тип способа изготовления, предложенный в патенте США 5994110, позволяет исключить операцию измельчения, имеющуюся в традиционном способе получения ПМО. Патент США 5994110 предусматривает отделение ПМО от несвязывающих веществ, но все предлагаемые способы основаны на очень малом размере частиц ПМО, получаемых, например, посредством хроматографии, но только в том случае, если ПМО являются растворимыми единицами. Например, в патенте США 5994110 особо указано, что терапевтически активные ПМО представляют собой ПМО, молекулярные массы которых находятся в нижней части диапазона 1 - 200 кДа. Кроме того, в патенте США 5994110 не описаны средства разделения суспендированных нерастворимых ПМО на «хорошие связывающие вещества», с одной стороны, и «менее эффективные или несвязывающие вещества», с другой стороны.

ЗАДАЧА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей настоящего изобретения является создание усовершенствованных способов получения ПМО, обеспечивающих получение композиций ПМО, обладающих достаточно высокой связывающей способностью, позволяющей применять указанные композиции в фармацевтике в качестве альтернатив растворимых рецепторов и антител. Задачей также является получение композиций ПМО, обладающих улучшенными свойствами по сравнению с известными композициями ПМО.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Несмотря на вышеуказанные попытки усовершенствовать существующую технологию приготовления ПМО, до настоящего времени не увенчались успехом попытки приготовления композиций ПМО, которые могут быть использованы в клинической практике в качестве подходящих альтернатив, например, для антител и растворимых рецепторов, применяемых в различных видах терапии, в которых важной характеристикой является выведение из организма конкретной целевой молекулы.

Авторы настоящего изобретения связывают безуспешность этих попыток с тем фактом, что несмотря на возможность наличия очень высокого сродства индивидуальных ПМО к данному лиганду, сродство композиции, например, включающей измельченные ПМО, к данному лиганду может колебаться в широком диапазоне, в результате чего общая связывающая способность композиции оказывается неудовлетворительной и непригодной, например, для клинического применения - или, проще говоря, связывающая способность известных композиций ПМО в отношении целевого лиганда обычно слишком низка для применения ПМО в качестве подходящих альтернатив для антител и растворимых рецепторов, применяемых в терапии.

Авторы также отмечают тот факт, что до настоящего времени практически не производилось никаких исследований влияния размера частиц ПМО на общую связывающую способность композиций ПМО.

Таким образом, авторы настоящего изобретения предлагают способ дальнейшего улучшения технических характеристик ПМО посредством сортировки частиц ПМО по их способности связывать шаблон или аналог шаблона, увеличивая таким образом концентрацию ПМО, эффективно связывающих целевые молекулы. При помощи такой функциональной сортировки или способа очистки может быть отобрана фракция частиц ПМО, в которых имеются отверстия или полости со связывающей способностью, пригодной для связывания выбранного шаблона или его аналога, и, таким образом, может быть повышено среднее сродство между ПМО и шаблоном, что в свою очередь повышает связывающую способность ПМО.

Авторы также обнаружили, что технические характеристики композиций ПМО могут быть улучшены простым усовершенствованием операции измельчения, применяемой до настоящего времени, что приводит к получению частиц ПМО, имеющих меньший средний размер и, следовательно, улучшенное отношение между количеством связывающих центров и объемом.

Таким образом, первый аспект настоящего изобретения относится к способу приготовления композиции, включающей полимеры с молекулярными отпечатками (ПМО), имеющие высокую связывающую способность и избирательность по отношению к целевой молекуле, причем указанный способ включает:

а) получение суспензии нерастворимых ПМО, которые связывают целевую молекулу и которые были приготовлены с использованием целевой молекулы или ее имитатора в качестве молекулы шаблона,

б) проведение операции аффинной очистки суспендированных ПМО, при которой молекула шаблона или ее фрагмент или ее имитатор используют в качестве агента захвата (capture agent),

в) извлечение ПМО, связывающих агент захвата, при помощи операции аффинной очистки, включающей практически полное отделение агента захвата и ПМО, не связывающих агента захвата, от извлекаемого продукта, и

г) соединение извлеченных ПМО и, возможно, носителя, наполнителя или разбавителя, в результате чего получают указанную композицию.

Второй аспект настоящего изобретения относится к способу приготовления ПМО, обладающих высокой связывающей способностью по отношению к целевой молекуле, причем указанный способ включает первую операцию измельчения неочищенного ПМО, который включает молекулы шаблона, состоящие из указанных целевых молекул или их имитаторов, в результате чего получают частицы ПМО, измельченные настолько, что это позволяет удалять молекулы шаблона; по существу полное удаление молекул шаблона; и возможное проведение второй операции измельчения полученных таким образом ПМО; при этом указанная первая и, возможно, вторая операции измельчения обеспечивают получение частиц ПМО, средний диаметр которых не превышает 50 мкм.

Третий аспект настоящего изобретения относится к композиции нерастворимых ПМО, обладающих по меньшей мере одной из следующих характеристик:

1) средний диаметр частиц ПМО составляет менее 20 мкм;

2) средняя величина связывания целевой молекулы составляет по меньшей мере 1 мас. единицу целевой молекулы на 10 мас. единиц ПМО;

3) по существу все ПМО в композиции связывают одну и ту же целевую молекулу, и, возможно, композиция не включает все центры, связывающие целевую молекулу.

Четвертый аспект настоящего изобретения относится к применению композиции, предлагаемой согласно настоящему изобретению, для приготовления фармацевтического препарата, предназначенного для лечения, профилактики или облегчения сердечно-сосудистого заболевания, гипертонии, атеросклероза, желчекаменной болезни, холестатического заболевания печени, гиперхолестеринемии, ожирения, инфекций, вызываемых паразитами или микроорганизмами, например, бактериями или грибками, или отравления токсинами, введенными в организм перорально.

Наконец, пятый аспект настоящего изобретения относится к способу лечения, облегчения или снижения риска развития заболевания, выбираемого из группы, состоящей из сердечно-сосудистого заболевания, гипертонии, атеросклероза, желчекаменной болезни, холестатического заболевания печени, гиперхолестеринемии, ожирения, инфекций, вызываемых паразитами или микроорганизмами, например, бактериями или грибками, и отравления токсинами, введенными в организм перорально, включающему введение эффективного количества композиции, предлагаемой согласно настоящему изобретению, пациенту, нуждающемуся в указанном введении.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1: Схематичное изображение процедуры простого приготовления ПМО.

Фиг.2: Изображение блок-схемы рассмотренного в настоящем описании способа, предлагаемого согласно настоящему изобретению. При необходимости операции могут быть повторены несколько раз.

Фиг.3, Часть I: Очистка или сортировка при помощи абсорбции на разрыхленном слое.

ПМО, связывающие шаблон, например молекулы, подобные холестерину, связанные с частицами слоя, остаются, в то время как несвязывающие ПМО проходят сквозь слой, и их отбрасывают.

Фиг.3, Часть II: Очищенные ПМО с функциональными группами.

После связывания ПМО с молекулами шаблона, находящимся на частицах слоя, ПМО затем могут быть подвергнуты элюированию. Элюированные ПМО обладают более высокой связывающей способностью, чем неочищенный набор ПМО, содержащий как связывающие, так и несвязывающие ПМО.

Фиг.4: Частицы ПМО, полученные в Примере 4, показанные на изображении наложения.

Фиг.5: Улучшение связывающей способности по отношению к фенилааланину в зависимости от номера фракции.

Фиг.6: Наличие холестерина в надосадочной жидкости после выдержки с ПМО, очищенным с помощью абсорбции на разрыхленном слое, неочищенным ПМО (MSMI002) и контрольным ПМО (MSMI002), который был приготовлен с использованием фенила в качестве молекулы шаблона.

Изображение наложения составлено из двух изображений, полученных в видимом свете и УФ-свете, соответственно. Белые пятна представляют собой частицы, освещенные белым светом, а черные пятна представляют собой зеленые флуоресцирующие частицы, освещенные УФ-излучением.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

В следующем разделе для лучшего понимания границ и пределов настоящего изобретения приведен ряд терминов.

«Полимер с молекулярными отпечатками» (ПМО) представляет собой полимер, включающий полости (или пустоты), которые по меньшей мере частично соответствуют одной или более молекулам шаблона, которые были введены в матрицу мономера, включающую сшивающие мономеры, до начала полимеризации. Полученный полимер после полимеризации включает ряд полостей, которые соответствуют по форме молекулам шаблона. Обычно ПМО разделяют на мелкие частицы, таким образом способствуя удалению шаблона и создавая открытые полости для взаимодействия с целевой молекулой, подобной или идентичной молекуле шаблона. В настоящем описании и формуле изобретения термин «ПМО» обычно относится к дисперсной форме ПМО, то есть термин «ПМО» может означать частицу или частицы ПМО.

Следует понимать, что ПМО, применяемые согласно настоящему изобретению, представляют собой нерастворимые молекулы/частицы. Указанные ПМО особенно пригодны для фармацевтического применения в желудочно-кишечном тракте, так как их нерастворимость ограничивает или предотвращает их попадание в ткани (например, в кровеносную систему) из желудочно-кишечного тракта. Другими словами, при пероральном введении ПМО, применяемые согласно настоящему изобретению, по существу остаются в пределах желудочно-кишечного тракта, а затем выводятся с калом.

«Неочищенный ПМО» представляет собой ПМО, не подвергнутый измельчению, в полостях которого, следовательно, содержатся молекулы шаблона или по меньшей мере части молекул шаблона.

«Измельчение» означает операцию разделения ПМО, которые все еще могут содержать шаблоны, на более мелкие частицы. Для этой цели может быть использован любой способ.

В настоящем описании «целевая молекула» представляет собой любую молекулу, которую может связывать ПМО.

«Молекула шаблона» обычно идентична целевой молекуле, но также может представлять собой ее имитатор (т.е. молекулу, по меньшей мере часть трехмерной структуры и профиля, которые идентично совпадают со структурой и профилем целевой молекулы - например, «имитатор» может представлять собой часть целевой молекулы). Шаблон служит в качестве «генератора» полостей в структуре ПМО, которые впоследствии должны будут связывать целевую молекулу.

«Аффинная очистка» означает любой способ очистки вещества, в котором применяют специфическое связывание между веществом и связывающим партнером. Во многих из таких способов применяют агент захвата, связанный с твердой подложкой (например, с хроматографической матрицей), который улавливает вещество. Типичные примеры, известные в данной области техники, включают аффинную очистку, проводимую с использованием в качестве агента захвата антител, связанных с хроматографическими гранулами, для очистки антигенов, связывающихся с антителами. Следует понимать, что способы аффинной очистки, применяемые согласно настоящему изобретению, позволяют улавливать нерастворимые суспендированные частицы ПМО, размеры которых соответствуют описанным выше. Таким образом, типичный способ аффинной очистки может представлять собой абсорбцию на разрыхленном слое (АРС), известную специалистам в данной области техники.

В соответствии с настоящим описанием «твердая фаза» представляет собой любой материал, который может быть использован для закрепления агента захвата при помощи ковалентной или нековалентной связи. Таким образом, любой материал (пластические полимеры, сахара, металлы, стекло, диоксид кремния, резина и т.д.), традиционно используемый для приготовления хроматографических материалов, может служить твердой фазой. Материал твердой фазы может содержать подходящие функциональные группы, которые способствуют закреплению агента захвата на указанном материале. Подобные функционализованные материалы известны специалистам в области техники хроматографической очистки белков и других макромолекул. Кроме того, твердая фаза может находиться в любом физическом состоянии, которое позволяет улавливать относительно большие и нерастворимые частицы, например, ПМО (по сравнению с одиночными биомолекулами, например, белками). Таким образом, твердая фаза может представлять собой волокна (предпочтительно, полые), хроматографическую матрицу (предпочтительно, матрицу, пригодную для АРС), гранулы (предпочтительно, гранулы, которые могут быть отделены электромагнитным способом) или любую другую подходящую форму, как указано ниже.

Варианты реализации операций очистки, применяемых согласно настоящему изобретению

Как указано выше, первый аспект настоящего изобретения относится к способу приготовления композиции, включающей полимеры с молекулярными отпечатками (ПМО), имеющие высокую связывающую способность и избирательность по отношению к целевой молекуле, причем указанный способ включает:

а) получение суспензии нерастворимых ПМО, которые связывают целевую молекулу и которые были приготовлены с использованием целевой молекулы или ее имитатора в качестве молекулы шаблона,

б) проведение операции аффинной очистки суспендированных ПМО, при которой молекулу шаблона, или ее фрагмент, или ее имитатор используют в качестве агента захвата (capture agent),

в) извлечение ПМО, связывающих агент захвата, при помощи операции аффинной очистки, включающей практически полное отделение агента захвата и ПМО, не связывающих агента захвата, от извлекаемого продукта, и

г) соединение извлеченных ПМО и возможно носителя, наполнителя или разбавителя, с получением указанной композиции (указанные носители, наполнители и разбавители обычно выбирают из фармацевтически приемлемых веществ, которые известны специалистам в области приготовления фармацевтических композиций, включающих мелкие частицы твердого вещества).

Другими словами, этот аспект включает повышение концентрации ПМО, которые проявляют желательное, достаточно высокое сродство к целевой молекуле (или к ее суррогату, например к значимому фрагменту целевой молекулы), но этот аспект также включает удаление из композиции несвязывающих фрагментов первоначально полученного неочищенного ПМО, что в свою очередь значительно повышает связывающую способность в расчете на единицу массы композиции частиц ПМО: см. пример 4 и соответствующий фиг.4. Авторы предположительно впервые продемонстрировали, что известные композиции нерастворимых ПМО, получаемых известными способами, включают значительную долю несвязывающих частиц, и что связывающая способность на единицу массы любых таких композиций может быть значительно увеличена путем удаления несвязывающих веществ. Таким образом, следует понимать, что любое приготовление нерастворимых ПМО может включать операцию очистки (б); то есть первый аспект настоящего изобретения может включать любой известный способ приготовления нерастворимых ПМО, в особенности такие известные способы, которые включают средства получения композиций ПМО, обладающих высокой емкостью и/или высокой избирательностью.

Далее будут подробно описаны различные варианты реализации схем очистки, предлагаемых для композиций ПМО.

Первая группа схем очистки включает ковалентное или нековалентное связывание агента захвата с твердой фазой (например, хроматографической матрицей) - т.е. указанная группа схем очистки включает, помимо прочего, типичные способы хроматографической очистки. Следовательно, для проведения подобной очистки пригоден любой материал, используемый в хроматографии и подобных способах очистки, но предпочтительными твердыми фазами являются матрицы, состоящие из поперечно-сшитых углеводов, синтетических полимеров, частиц металлов или их сочетаний.

Вторая и также наиболее важная группа схем очистки включает схемы, в которых агент захвата состоит из или является частью растворимой химической единицы (например, позволяющей проводить очистку способом агглютинации, см. ниже). Предпочтительные примеры реализации указанного вида очистки включают ковалентное или нековалентное связывание агента захвата с группировкой, выбираемой из дендримера, замещенного углевода и замещенного растворимого полимера, например поливинилового спирта и полиэтиленгликоля, с целью осуществления взаимодействия нескольких агентов захвата с растворимой химической единицей.

Вне зависимости от выбора одной или другой группы схем очистки некоторые примеры реализации первого аспекта настоящего изобретения включают связывание агента захвата лишь с частью связывающих центров получаемых в операции (а) ПМО, способных связывать молекулу шаблона. Проще говоря, в этом примере реализации при выполнении очистки удерживаются только ПМО, имеющие желаемую избирательность связывания или сродство к связыванию, в то время как, например, ПМО, включающие неспецифические центры связывания или слабосвязывающие центры удаляют при проведении очистки.

Один из способов удаления неспецифических центров связывания при проведении очистки включает использование агента захвата в операции аффинной очистки, при которой агент захвата представляет собой фрагмент молекулы шаблона. При выборе такого способа можно исключить из молекулы агента захвата те части молекулы шаблона, которые могут конкурировать с другими молекулами за связывание с ПМО. Это особенно полезно в тех случаях, когда целевая молекула включает предполагаемые связывающие центры, дающие перекрестную реакцию, которые могут образовывать ПМО, связывающие ненужные мишени. Например, если необходимо приготовить композицию ПМО, связывающую лютеинизирующий гормон, для этого следует исключить α-субъединицу этой молекулы в шаблоне, поскольку α-субъединицы гормонов LH, FSH, TSH и hCG идентичны.

Альтернативой указанному подходу является использование способа, в котором агент захвата включает молекулу шаблона, или ее имитатор, или ее фрагмент, связанный с твердой поверхностью или группировкой (в зависимости от того, что приемлемо) в специфической ориентации, которая по существу исключает взаимодействие между ПМО и частью агента захвата - то есть посредством связывания агента захвата с твердой подложкой или группировкой через выбранную функциональную группу, так что ориентация связанного агента захвата становится по существу одинаковой при его связывании с любыми партнерами, часть агента захвата оказывается таким образом недоступной для связывания с ПМО, и следовательно, ПМО, способные связываться с недоступными частями агента захвата, не будут подвергаться общей процедуре очистки. Таким образом, продуктом такого способа очистки будет являться композиция, состоящая из частиц ПМО, в которой по существу все частицы ПМО связывают конкретную мишень, но в которой по меньшей мере один связывающий центр целевой молекулы не связан с частицами ПМО композиции.

Альтернативно и во всех случаях, когда нет необходимости или нет значительных преимуществ или нет ограничений связывания агента захвата и ПМО, способ очистки, предлагаемый согласно настоящему изобретению, предпочтительно представляет собой способ, в котором агент захвата включает молекулу шаблона или ее имитатор или ее фрагмент, связанный с твердой поверхностью или группировкой (в зависимости от того, что приемлемо) в неспецифической ориентации, в которой по существу все части агента захвата могут взаимодействовать с ПМО.

В тех случаях, когда агент захвата связан с твердой подложкой, процедура аффинной очистки может быть выбрана из подходящих способов очистки любого типа, включающих связывание агента захвата с твердой подложкой. Однако предпочтительно способ очистки выбирают из группы, состоящей из абсорбции на разрыхленном слое (АРС), парамагнитного разделения гранул и очистки на полых волокнах.

Абсорбция на разрыхленном слое (АРС)

Как правило, для выделения материала в виде частиц нельзя применять традиционные хроматографические способы с использованием уплотненного слоя в колонке вследствие тенденции к неспецифическому улавливанию частиц в статических пустотах слоя колонки.

Основным принципом АРС является поддержание хроматографической среды, также называемой «твердой фазой», в псевдоожиженном состоянии, что, как было указано, способствует прохождению частиц сквозь колонку. Было показано, что преимуществом использования технологии АРС является возможность извлечения растворимого материала, в большинстве случаев белков или пептидов, из сырого исходного материала или клеточной культуры без проведения операций предварительной «доколоночной» очистки, таких как фильтрование и центрифугирование, проводимое до нанесения сырого материала на колонку (van Reis & Zapata; Lihme et al.). Основная идея состоит в проведении вымывания нерастворимого или порошкообразного материала, например осколков клеток и осадков, при одновременном связывании целевых молекул с твердой фазой слоя. Таким образом, продолжительность и себестоимость обработки снижается, что позволяет считать АРС ценной и экономически выгодной методикой, рекомендуемой для очистки разнообразных молекул. Кроме того, если слой разрыхлен, увеличенный объем статических пустот слоя позволяет порошкообразному материалу проходить сквозь слой и, таким образом, обеспечивает достаточный контакт с твердой фазой слоя и, следовательно, при наличии достаточного сродства обеспечивает связывание порошкообразного материала с твердой фазой слоя. В этом случае также было показано, что АРС может быть использована для отбора клеток и другого порошкообразного материала (Ujam et al.); например, моноциты периферической крови были выделены при помощи смешивания биотинилированного антитела анти-СD14 с сырыми клетками крови и затем нанесены на систему АРС, в которой на частицы слоя был нанесен стрептавидин.

Авторы настоящего изобретения установили, что частицы, приготовленные по технологии ПМО, могут быть аналогичным образом отсортированы или очищены посредством АРС, если твердая фаза или частицы слоя системы АРС имеют химическую структуру, подобную или идентичную структуре шаблона, используемого для изготовления указанных ПМО. Заслуживает внимания тот факт, что поскольку частицы ПМО переносятся с потоком жидкостной части системы АРС, в то время как частицы слоя поддерживаются в относительно постоянном разрыхленном объеме, то в процессе на псевдоожиженном слое более эффективное отделение несвязанных ПМО от ПМО, зафиксированных на слое, может быть произведено при использовании частиц слоя с относительно высокой плотностью (>2 г/мл). Пример таких частиц, имеющих высокую плотность, приведен в Ujam et al. Также предпочтительными являются либо непористые частицы слоя, либо частицы слоя с ограниченной пористостью, см. ниже: Chase. Производят связывание молекулы шаблона, например молекулы холестерина или желчной кислоты, предпочтительно в ориентации (ориентациях), обеспечивающей максимальное взаимодействие структурных и химических характеристик молекулы шаблона и частиц слоя; затем приготовленные ПМО, предпочтительный размер частиц которых составляет 0,2-50 мкм (см. ниже), наносят на псевдоожиженный слой и спустя некоторое время, подходящее для проведения реакции, предпочтительно сопровождаемой рециркуляцией жидкой фазы, включающей несвязанные ПМО, производят вымывание несвязанных ПМО, например, путем увеличения скорости потока или простым введением в систему АРС чистого промывочного буфера, затем направляя несвязанные ПМО в отходы. Связанные ПМО могут быть высвобождены из частиц слоя путем применения растворимого шаблона, воздействием нагревания, посредством увеличения ионной силы раствора или под действием физической нагрузки на слой. Также, как указано выше, возможно применение непористых частиц слоя или частиц слоя с ограниченной пористостью (см. Chase).

В качестве альтернативы разрыхлению или псевдоожижению слоя под действием проходящего сквозь него потока может быть рассмотрено разрыхление под действием механического перемешивания, перемешивания переворачиванием, встряхивания, ультразвукового перемешивания и других способов усиления конвекции/массопереноса. Затем может быть произведено отделение частиц ПМО, связанных с частицами слоя, посредством псевдоожижения слоя под действием протекающей сквозь слой фазы. В альтернативном случае связанные и несвязанные ПМО могут быть разделены способами, включающими использование разностей плотности, размера, формы, оптических свойств, путем центрифугирования, седиментации, фильтрования, захвата или другими средствами разделения по размеру и/или массе, плотности, форме, цвету, испусканию света, рассеянию света, коэффициенту расширения.

Таким образом, в соответствии с традиционными способами очистки, частицы могут быть отсортированы или очищены при помощи АРС, и, в соответствии с настоящим изобретением, этот способ можно с успехом применять для очистки частиц, приготовленных способом ПМО, если твердая фаза или частицы слоя системы АРС имеют химическую структуру, подобную структуре шаблона, используемого для приготовления указанных ПМО.

Разделение способом связывания с магнитными частицами

Dynal (Invitrogen) и другие компании разработали методики, в которых для очистки в основном растворимых молекул, как правило, белков, пептидов или ДНК, используют парамагнитные гранулы, и, кроме того, были предложены способы выделения клеток или органелл при помощи специфического связывания, например, с антителами, иммобилизованными на парамагнитных гранулах. Для выделения такого дисперсного материала, как клетки, рекомендуют использовать более крупные гранулы М450 (450 мкм). После достаточно длительного контакта парамагнитных гранул, на которых зафиксированы иммобилизованные молекулы, обычно антитела, специфические для мембранного белка клетки, с целевыми молекулами, например клетками другого порошкообразного материала, парамагнитные частицы вместе с клетками, связанными через антитела, фиксируют посредством помещения контейнера с образцом в магнитное поле. Несвязанные клетки могут быть уделены промыванием, в то время как парамагнитные гранулы остаются фиксированными, и, после снятия магнитного поля, эти парамагнитные гранулы могут быть извлечены. Такие гранулы коммерчески доступны, например, от компании Dynal, и могут быть активированы различным образом, например включать тозилатные, эпоксидные, карбоксильные и аминогруппы, которые можно использовать для взаимодействия с антителами или другими захватываемыми молекулами, например молекулами шаблона, используемыми при синтезе ПМО.

При взаимодействии шаблонов, таких как холестерин или желчные кислоты, с указанными магнитными частицами, происходит связывание ПМО, реакционно-способных по отношению к молекулам шаблона, с этими частицами, и они могут быть отделены от ПМО, более слабо связывающих или не связывающих молекулы шаблона, при наложении магнитного поля в соответствии со способом, аналогичным рассмотренному выше для связывания клеток, включающих специфический мембранный белок.

Разделение посредством агглютинации

Агглютинация представляет собой явление, которое происходит, если молекулы и частицы или клетки вступают в многовалентные взаимодействия с образованием сетчатых структур, изменяя при этом растворимость или свойства суспензии, в результате чего сетчатую структуру можно обнаруживать, например, вследствие изменения оптических свойств системы или под микроскопом. Агглютинацию в основном используют для диагностических целей в экспресс-диагностике на месте. Растворимые элементы, способствующие образованию сшивок, например, между эритроцитами, часто представляют собой двух- или трехвалентные антитела (Pla et al.), лектины или антигены, специфичные для данного вида применения (Rogers et al.).

Для сбора ПМО, находящихся в суспензии или псевдоожиженном состоянии, поддерживаемом путем механического перемешивания, перемешивания переворачиванием, встряхивания, ультразвукового перемешивания, движения текучей фазы и других способов, могут быть использованы растворимые молекулы, включающие несколько молекул шаблона или аналога шаблона, например дендримерные структуры, содержащие, например холестерин или желчные кислоты. ПМО, реакционно-способные к молекулам шаблона, реагируют с молекулами шаблона, находящимися, например, на дендримерах, и предпочтительно образуют сетчатую структуру, в которой дендримерные структуры, включающие молекулы шаблона, действуют как сшивающие агенты.

Несшитые частицы ПМО отделяют от частиц ПМО, находящихся в агглютинате или сетчатой структуре, способами, включающими использование разностей плотности, размера, формы, оптических свойств, центрифугированием, седиментацией, фильтрованием, проточной цитометрией, захватом или другими способами разделения по размеру и/или массе, плотности, форме, цвету, испусканию света, рассеянию света, коэффициенту расширения. Затем частицы ПМО, реакционно-способные к молекулам шаблона, извлекают в виде отдельных частиц, подвергая агглютинат или сетчатую структуру воздействию напряжения, например, теплового, органического растворителя, встряхивания, или применяя избыток молекул растворимого шаблона.

Варианты реализации, относящиеся к измельчению ПМО

В известной ранее попытке приготовления ПМО, специфичных по отношению к холестерину, емкость ПМО составляла не более 17 мг холестерина на 1 г ПМО; при этом приготовленные тем же способом полимеры, не имеющие молекулярных отпечатков, могли связывать 13 мг холестерина на 1 г ПМО (Sellergren 1998). В другой попытке приготовления был получен ПМО с еще более низкой емкостью, менее 1 мг холестерина на 1 г ПМО (Whitcombe 1995).

Авторы настоящего изобретения объясняют затруднения в приготовлении полимеров с удовлетворительной связывающей способностью отсутствием операции обогащения композиций, содержащих частицы ПМО, эффективными связывающими частицами.

Самая простая модель объясняет емкость ПМО по отношению к связыванию шаблона исключительно наличием свободной площади. Площадь, занятая шаблоном (например, молекулой холестерина), как функция площади поверхности частицы ПМО может быть использована в качестве основы для определения требований, связанных с размерами частицы и эффективности связывания (процент площади поверхности ПМО, занимаемый единичными молекулами шаблона).

Теоретические положения

Нижеследующие расчеты произведены для примера, в котором в качестве шаблона взят холестерин, а в качестве частицы - сферическая частица полимера. Предполагают, что диаметр молекулы холестерина составляет 16 Å (1,6 нм).

Площадь А, занимаемая целевой молекулой Т (холестерин), может быть принята за круг. Эта площадь равна:

A_т=π×r_т ² (r_т - молекулярный радиус целевой молекулы).

Площадь сферы (частица ПМО) равна:

А_ПМО=π×d_ПMO ² (d_ПMО - диаметр сферы ПМО).

Для оценки количества (массы) ПМО, необходимого для связывания достаточного количества холестерина, необходимо знать плотность полимера. Выбираемая плотность должна находиться в некоторых пределах.

Связывающая способность ПМО равна массе целевых молекул (m_Т), которая может быть связана данной массой ПМО (m_ПМО):

где Т означает целевую молекулу, СА (Covered Area) означает площадь покрытия, то есть площадь, занимаемую на поверхности ПМО целевыми молекулами.

Это выражение может быть далее упрощено:

что математически подтверждает интуитивно очевидные результаты:

- чем меньше размер целевой молекулы, тем выше емкость,

- чем меньше размер частицы ПМО, тем выше емкость,

- чем меньше плотность ПМО, тем выше емкость.

Описание поверхности частицы ПМО с точки зрения способности связывания между отдельными частицами

Теоретически, количество молекул шаблона в частице ПМО, являющееся функцией размера частицы, может быть рассчитано исходя из предположения, что добавляемые молекулы шаблона, обычно в концентрации 50 мМ, перед началом полимеризации равномерно распределены по всему объему. Количество молекул шаблона, а следовательно, и количество возможных центров связывания в данном объеме, например, во взвешенной частице, может быть описано стандартным распределением с заданным стандартным отклонением. Теоретически, вне зависимости от конкретной частицы, стандартное отклонение между двумя центрами на одной частице s_x отвечает следующему выражению:

в котором Δr представляет собой действительное расстояние между двумя центрами, а [Δr] - заданное среднее расстояние между двумя центрами связывания, определяемое по распределению молекул шаблона в частице. Число n представляет собой количество центров связывания в каждой частице. Так как значения Δr-[Δr] и n понижаются с уменьшением размера частицы, s_x не изменяется по мере уменьшения размера частиц. Только когда частицы становятся очень мелкими, размером менее 10^-8 м (см. табл.1), так что в среднем на одну частицу приходится менее 1 молекулы шаблона, частицы становятся совершенно разными. На практике это различие должно быть «расширено», т.е. включать частицы крупнее 10^-8 м, но оно должно уменьшаться с увеличением размера дисперсных частиц и становиться незаметным в случае более крупных частиц, имеющих множество центров связывания.

С другой стороны, различие может быть вызвано ориентацией молекул шаблона. Если продольное направление молекулы шаблона ориентировано перпендикулярно поверхности частицы, то, в принципе, возможны лишь два направления ориентации этой молекулы, при условии, что она не может взаимодействовать с двумя центрами связывания, даже если молекула шаблона, находящаяся в перпендикулярном положении, вращается вокруг своей продольной оси. Однако, если продольное направление молекулы шаблона ориентировано параллельно поверхности частицы, то она может взаимодействовать с бесконечно большим количеством центров связывания при вращении вокруг своей продольной оси. Другими словами, количество степеней свободы (возможных положений, которые может занимать молекула шаблона) в этой ситуации бесконечно, и каждая новая ориентация, полученная при вращении вокруг продольной оси молекулы, будет, в принципе, создавать центр связывания, отличный от всех других. Таким образом, это означает, что ориентация молекулы шаблона создает бесконечное количество различных центров связывания.

Указанные центры связывания могут быть охарактеризованы константами связывания Kd с молекулой шаблона. Некоторые ориентации, несмотря на их различия, будут создавать центры связывания с одинаковыми Kd, но при этом, как показано в дальнейшем изложении, также будут существовать центры связывания с весьма различными Kd.

Анализ результатов

В таблице 1 показаны:

Зависимость теоретического количества молекул шаблона на сферической оболочке толщиной 0,9 нм от размера частиц.

Расчет общего количества центров связывания, которые могут образовываться.

Расчет ожидаемого количества центров связывания, имеющих высокое сродство к связыванию.

Цифры двух последних колонок рассчитаны на основании опубликованных наблюдений (Кеmре и Mosbach 1991, Ramström et al. 1994, 1996 I и 1996 II, Liu, Mosbach 1997 и 1998, Andersson et al. 1995). Выбранная толщина сферической оболочки равна радиусу динамического объема, который предположительно занимает молекула длиной 1,8 нм, например, молекула холестерина (Davidson и Hayes, 2002). Обычно ПМО содержат 20 микромоль центров связывания на 1 грамм ПМО (Кеmре и Mosbach 1991, Ramström et al. 1994 и 1996 I, Liu и Mosbach 1997 и 1998), но диапазон значений констант связывания (Kd) очень велик, от 10^-3 до 10^-9 М, что хорошо согласуется с изложенными выше соображениями; доля центров связывания, имеющих высокое сродство к связыванию, обычно составляет менее 1% от общего количества центров связывания (Ramström et al. 1996 II, Andersson et al. 1995). Например, по данным Ramström et al. 1996 II, исследовавшим связывание на ПМО различных кортикостероидов (например, молекул, структурно подобных холестерину), доля центров связывания, имеющих высокое сродство к связыванию (<10^-6 М), составляет, соответственно, 0,075% и 0,28%. При расчетах данных таблицы 1 количество центров связывания, имеющих высокое сродство к связыванию, принято 0,5%. В упомянутых в настоящем описании статьях размер частиц обычно составлял 25 мкм. Этот размер относительно легко получить растиранием полимера вручную в ступке.

Таблица 1 Зависимость количества центров связывания на тонкой сферической оболочке от размера частиц Диаметр частиц (м) Количество молекул шаблона на сферической оболочке толщиной 0,9 нм при 50 нМ концентрации шаблона Ожидаемое количество центров связывания на сферической оболочке Ожидаемое количество центров связывания, имеющих высокое сродство к связыванию на сферической оболочке 1,0×10^-4 847784740 373025285 1865126 1,0×10^-5 8476474 3729649 18648 5,0×10^-6 2118737 932244 4661 1,0×10^-6 84627 37236 186 5,0×10^-7 21119 9292 46 1,0×10^-7 833 366 2 1,0×10^-8 7 3 0

На практике было показано, что максимальное количество центров связывания, которое может быть получено на частице размером 10 мкм, составляет 3,7 миллиона (таблица 1). Если частицу размером 10 мкм раздробить на частицы размером 1 мкм, то каждая новая частица размером 1 мкм будет содержать 37000 центров связывания, т.е. 1% от первоначального количества, содержащегося в частице размером 10 мкм. В принципе, центры связывания частицы размером 10 мкм теперь распределены по 100 частицам размером 1 мкм. Поскольку имеется огромное количество возможных центров связывания, полученные 1-мкм частицы должны различаться, поскольку они содержат только 1% «непохожих» центров связывания, которые находились в частице размером 10 мкм. Тот же результат будет получен, если используют только часть центров связывания, имеющих высокое сродство к связыванию, т.е. 0,5% от общего количества. Однако, так как количество центров связывания уменьшается, эффект наличия лишь нескольких центров связывания (описанный в разделе 1) также будет вносить свой вклад в различия между индивидуальными частицами.

Предельное определение в частице параметров «полости», которая может быть определена как центр связывания, неоднозначно, но центры связывания с Kd, превышающей 10^-5 М, вряд ли могут быть пригодны для терапевтического применения. Моноклональные антитела, допущенные в качестве фармацевтических препаратов на рынок медикаментов США, имеют значения Kd, составляющие менее 10^-7 М (Carter 2006).

Кроме того, распределение молекул шаблона в частицах (с учетом соответствующего стандартного отклонения) зависит от таких параметров, как температура смеси во время полимеризации, вязкость, размер молекул шаблона, взаимодействие с растворителем и другими мономерами, но эти параметры не настолько универсальны, как описанные выше положение и ориентация. По мнению авторов, изменение этих параметров процесса важно для создания различий между измельченными частицами.

В соответствии с приведенным выше обсуждением, количество степеней свободы относится исключительно к положению индивидуальной молекулы шаблона; количество степеней свободы, связанное с ориентацией молекулы шаблона, по-видимому, непосредственно отражается на распределении центров связывания, имеющих низкое и высокое сродство. Поскольку целью изобретателей было получение композиций, содержащих частицы, имеющие высокую емкость и избирательность, тщательность разделения частиц была достаточно высока, так что при этом в основном сортировали и отбирали центры связывания, имеющие высокое сродство. Сложно сказать, когда количество значимых центров связывания, то есть имеющих высокое сродство, достигает такого значения, что этот параметр (количество) также вносит серьезный вклад в различие между центрами, но разумная оценка этого параметра, вероятно, составляет приблизительно 1 мкм.

Если необходимо создать большее количество центров связывания, чем то количество, которое уже имеется на внешней поверхности частицы, то существуют способы получения очень твердых частиц, содержащих достаточно широкие каналы, через которые может протекать жидкость со скоростью, не ограниченной диффузией. Этот способ используют для изготовления хроматографических систем (например, поставляемых Applied Biosystem), известных как матрицы Poros™; через них можно пропускать быстрый поток среды, что не сказывается на качестве разделения, поскольку поток жидкости через частицу равен потоку жидкости вокруг частиц. В более традиционных хроматографических матрицах (т.е. не для ЖХВР) поток ограничен скоростью диффузии в индивидуальных частицах матрицы.

Если для увеличения степени контакта с ПМО, связывающими холестерин или желчные кислоты, желательно использовать перистальтику желудочно-кишечного тракта, то в этом случае удобно использовать частицы, содержащие каналы. Если применяют гель, то скорость «обмена» желудочно-кишечной жидкости, вероятно, будет лимитирована диффузией жидкости внутрь геля. Приготовлены гели ПМО, в основном, для изготовления систем высвобождения медикамента (например, высвобождения инсулина), которые начинают действовать путем раскрытия геля, происходящего при связывании глюкозы со специфическим центром. Это свидетельствует о реальной возможности изготовления ПМО с гелевой структурой (Wizeman, Kofinas 2001, Seong et al. 2002).

Практическое выполнение операции измельчения

Таким образом, из вышеизложенного ясно, что второй аспект настоящего изобретения относится к способу приготовления ПМО, обладающих высокой связывающей способностью и избирательностью по отношению к целевым молекулам, причем указанный способ включает первую операцию измельчения неочищенного ПМО (т.е. полимеризованного сшитого ПМО, структуру которого еще не подвергали экстракции шаблона или измельчению), который включает молекулы шаблона, состоящие из указанных целевых молекул или их имитаторов, в результате чего получают частицы ПМО, измельченные настолько, что это позволяет извлекать/удалять молекулы шаблона; по существу полное извлечение/удаление молекул шаблона; и возможное проведение второй операции измельчения полученных таким образом ПМО; при этом указанная первая и, возможно, вторая операции измельчения обеспечивают получение частиц ПМО, средний диаметр которых не превышает 25 мкм. Таким образом, используя этот подход, получают ПМО с улучшенным отношением между объемом и количеством доступных центров связывания. Обычно для получения мелких частиц ПМО желаемого размера достаточно (и проще всего) провести первую операцию измельчения, после которой можно удалять молекулы шаблона, но в некоторых случаях отделение шаблона от ПМО проводят при помощи двух операций измельчения, между которыми производят удаление шаблона.

После проведения операции (операций) измельчения средний диаметр ПМО предпочтительно составляет менее 20 мкм, например, менее 15 мкм, менее 10 мкм, менее 5 мкм, менее 1 мкм, менее 900 нм, менее 800 нм, менее 700 нм, менее 600 нм, и даже менее 500 нм, 400 нм, 300 нм и 200 нм.

В любом случае предпочтительно, чтобы ПМО данной композиции после измельчения по существу не содержали частиц, диаметр которых составляет более 50 мкм (например, более 40, 30, 20, 10 или 1 мкм).

Измельчение может быть произведено любым подходящим способом уменьшения размеров частиц ПМО, т.е. такими способами, как дробление, размалывание, взрывание, обработка молотом, шаровой помол, криоизмельчение и ударная гомогенизация, а также при помощи любого сочетания указанных способов.

Из вышеизложенного очевидно, что один из очень важных примеров реализации настоящего изобретения включает сочетание первого и второго аспектов настоящего изобретения, т.е. первое приготовление ПМО, которое включает измельчение ПМО с образованием мелких частиц в соответствии с настоящим изобретением, с последующим проведением аффинной очистки, подробно рассмотренной в описании первого аспекта настоящего изобретения.

В большинстве случаев ПМО используют для аналитических целей в хроматографических системах или в качестве заменителей белков в датчиках. Размер частиц ПМО, используемых для указанных целей, обычно составляет от 25 до 100 мкм. Как указано выше, такие размеры частиц ПМО слишком велики и не позволяют достичь желаемой связывающей емкости, необходимой для композиций ПМО, предназначенных, например, для перорального введения, и, кроме того, крупные частицы ПМО невозможно подвергнуть отбору/очистке традиционными методами клеточной очистки.

Таким образом, выбор размера частиц ПМО критичен для получения необходимой емкости полимеров. Самый простой способ увеличения емкости данной массы ПМО включает, как указано выше, увеличение отношения площадь/объем, т.е. уменьшение размера частиц ПМО и/или увеличение «активной» площади (площади ПМО, способной связывать целевой аналит). Отношение площадь/объем возрастает обратно пропорционально диаметру, т.е. уменьшение диаметра в два раза позволяет удвоить отношение площадь/объем. Это означает, что 64-кратное увеличение связывающей способности может быть достигнуто за счет уменьшения диаметра частиц с 25 мкм до 0,4 мкм на единицу массы ПМО.

Таблица 2 Увеличение отношения площадь/объем в зависимости от диаметра частиц. Увеличение нормировано по диаметру частиц, равному 25 мкм Диаметр частиц (мкм) Индекс 25,0 1 12,5 2 6,3 4 3,1 8 1,6 16 0,8 32 0,4 64 0,2 128

В соответствии с настоящим изобретением, емкость частиц ПМО диаметром порядка 0,5 мкм может быть далее оптимизирована (за счет связывающей площади) применением функционального отбора/очистки в системе АРС с использованием частиц слоя, связанных с шаблоном, как описано выше при обсуждении первого аспекта настоящего изобретения. Размер таких частиц ПМО находится в том же диапазоне, что и клетки, которые, как известно, могут быть извлечены системами АРС с определенными поверхностными характеристиками. Для получения мелких частиц желаемого размера измельчение/помол следует производить различными способами, поскольку для получения различных интервалов размеров частиц оптимальными являются разные способы, см. ниже.

Часто для измельчения блока полимера до мелких частиц желаемого размера бывает нужно использовать не один, а несколько способов измельчения. В настоящее время не существует универсальной технологии измельчения миллиметровых частиц любого полимера до частиц субмикронного диапазона.

Эффективное измельчение полимера до более мелких частиц, размер которых составляет приблизительно 200 мкм, может быть произведено при помощи способа, включающего введение в полимер совместимых с ним набухающих в воде материалов и при использовании способа смачивания/замораживания (например, технологии Cryo-Grind™). Для облегчения измельчения в полимере могут быть созданы пористые структуры путем добавления в полимер волокон (например, целлюлозы, ацетата целлюлозы).

Использование высоких концентраций шаблона позволяет получать небольшие полимерные домены, обеспечивающие как высокую связывающую способность, так и рыхлую структуру полимера, способствующую его легкому измельчению.

Дальнейшее измельчение до частиц субмикронного диапазона может быть произведено способом наноизмельчения/помола (например, при помощи шаровых мельниц Netzsch), представляющим собой нисходящий способ помола частиц размером 20 мкм до частиц размером от 40 до 200 нм (Частицы такого размера часто используют для изготовления фармацевтических препаратов).

Также возможный способ измельчения ПМО может включать ускорение полимера при помощи воздушной струи, струи жидкости или подобных средств с последующим направлением полученной высокоскоростной струи ПМО и носителя на твердую мишень, в результате чего под действием силы удара происходит измельчение ПМО с образованием более мелких частиц.

Наконец, как показано в примерах, для измельчения ряда ПМО оказалось эффективным физическое измельчение ПМО в простой ступке.

Другие аспекты изобретения

Выбор полимеров для ПМО

Для создания сильной адгезии между двумя веществами натяжение смачивания должно быть низким, т.е. никакие силы отталкивания не должны противодействовать адсорбции лиганда на поверхности полимера. При выборе материалов, пригодных для изготовления ПМО, в частности, подходящих мономеров, следует учитывать параметры растворимости Гансена (Hansen Solubility Parameters, HSP) (см. Hansen С.М.).

В случае холестерина, для соединения определяют HSP, и по таблицам свойств полимеров определяют, что для изготовления ПМО, способных связывать холестерин, подходят чрезвычайно гидрофобные полимеры. HSP для холестерина составляет (δD, δР, δН, R)=(20,4; 2,8; 9,4; 12,6), и список полимеров, перекрывающих сферу HSP холестерина, выглядит следующим образом: полиэтилен высокой плотности (ПЭВП) > поливинилхлорид (ПВХ) > полиакрилонитрил (ПАН) > полипропилен (ПП) > тефлон (ПТФЭ) > поливинилацетат (ПВА) > полистирол (ПС) > полибутилметакрилат (ПБМА) > поликарбонат (ПК) > полистирол-полиметакриловая кислота (сополимер ПС/ПМАК) > полиэтилентерефталат (ПЭТФ) > полиуретан (ПУ) > полистирол-акрилонитрил (ПСАН) > полиметилметакрилат (ПММА) > полиамид, например, нейлон 66 > поливинилиденфторид (ПВДФ) > поливиниловый спирт (ПВС). Не каждый из перечисленных полимеров легко подвергается полимеризации вместе со сшивающим агентом и шаблоном, но, тем не менее, вышеуказанный список может служить удобной отправной точкой для выбора мономеров и сшивающих агентов, из которых может быть получен наиболее подходящий полимер. Кроме того, для изготовления полимеров, HSP которых подходит к данному конкретному лиганду, могут быть использованы сополимеры, блок-полимеры и блок-сополимеры, и т.д.

Извлечение шаблона

Удаление шаблона из ПМО должно быть произведено после измельчения, но перед началом очистки. Если для проведения измельчения требуется охлаждение, то наилучшим вариантом охлаждающей среды является растворитель, способный растворять шаблон.

Извлечение шаблона может быть произведено экстракцией растворителями или смесью растворителей как при нагревании, так и в его отсутствие, а также при пониженной или повышенной ионной силе. Одним из обычно используемых способов является экстракция Сокслета, при проведении которой ПМО промывают свежеперегнанным растворителем (или азеотропной смесью в случае использования смесей) в полунепрерывном режиме. Если полученный (и сшитый) полимер термически стабилен (а молекула шаблона - нет), то для разрушения шаблона и, следовательно, для облегчения удаления шаблона, например, экстракцией растворителями, обычно не используемыми для удаления шаблона, может быть использована пирогенетическая обработка.

Общие положения препаративных аспектов изобретения

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что для приготовления ПМО, имеющих высокую емкость, следует использовать тщательно выбранное сочетание способа приготовления ПМО, измельчения, извлечения шаблона и отбора пригодных для использования ПМО, причем особенное внимание следует уделить методикам измельчения и отбора.

Таким образом, при использовании сочетания традиционных способов приготовления и очистки ПМО с методами отбора и очистки, известными в области техники клеточной технологии и/или технологии белка, можно получить более высокие результаты.

В качестве примера можно привести данные из технологии ПМО «Выбор мономеров»: измельчение, экстракцию и просеивание можно произвести в сочетании с функциональной очисткой, например, способом АРС. Сортировка частиц ПМО по их способности связываться с функционализированной матрицей/поверхностью разрыхленного слоя позволяет сочетать традиционное приготовление ПМО «в начале способа» с операциями отбора и очистки, производимыми «в конце способа».

Очень простая схема выполнения комбинированного способа, описанного выше, представлена на фиг.2.

Типичные примеры целевых молекул (или молекул шаблона), пригодных для изготовления композиций ПМО, предлагаемых согласно настоящему изобретению, включают молекулы, находящиеся в желудочно-кишечном тракте, например, в желудочно-кишечном тракте человека. Особенно предпочтительными целевыми молекулами являются молекулы, связанные с патологическими состояниями. Особенно предпочтительными целевыми молекулами являются молекулы, выбираемые из холестерина, или желчной кислоты, или соли желчной кислоты; кроме того, токсичные вещества, токсины (включая бактериальные, вирусные, грибковые и паразитарные токсины), а также антигены и рецепторы, относящиеся к патогенам, например, бактериям, вирусам, грибкам и паразитам, также являются интересными целями/шаблонами для приготовления композиций ПМО в соответствии с настоящим изобретением.

Композиции и фармацевтическое применение согласно настоящему изобретению

Полагают, что по меньшей мере некоторые из композиций ПМО, получаемых согласно настоящему изобретению, являются новыми композиционными веществами. Таким образом, настоящее изобретение также относится к композициям ПМО, имеющим по меньшей мере следующие характеристики:

1) средний диаметр ПМО составляет менее 20 мкм;

2) средняя величина связывания целевой молекулы составляет по меньшей мере 1 мас. единицу целевой молекулы на 10 мас. единиц ПМО;

3) по существу все ПМО в композиции связывают одинаковые целевые молекулы, но композиция не включает все центры связывания, связывающие целевую молекулу.

Предпочтительно, характеристики композиции, предлагаемой согласно настоящему изобретению, соответствуют любому из вышеперечисленных пунктов 1, 2 или 3, то есть композиция может иметь только характеристику 1, характеристику 1 и одну из характеристик 2 или 3, только характеристику 2, характеристики 2 и 3, только характеристику 3 или все три характеристики 1, 2 и 3.

Средний диаметр ПМО предпочтительно составляет менее 15 мкм, например, менее 10 мкм, менее 5 мкм, менее 1 мкм, менее 900 нм, менее 800 нм, менее 700 нм, менее 600 нм, и даже менее 500 нм, 400 нм, 300 нм и 200 нм.

В любом случае предпочтительно, чтобы ПМО данной композиции состава после измельчения по существу не содержали частиц диаметром более 50 мкм (например, диаметром более 40, 30, 20, 10 или 1 мкм).

Предпочтительные композиции, предлагаемые согласно настоящему изобретению, связывают любую из целевых молекул, описанных выше, т.е. указанные выше «типичные примеры подходящих целевых молекул».

Композиции, предлагаемые согласно настоящему изобретению (и композиции, приготовленные в соответствии со способами, предлагаемыми согласно настоящему изобретению), пригодны для изготовления фармацевтических препаратов и могут быть использованы в тех же целях, в которых применяют композиции антител. Однако, благодаря своей стабильности, композиции ПМО пригодны для перорального введения, при котором они, в отличие от антител и многих растворимых белковых рецепторов, устойчивы по отношению к протеолитическому разложению в тонком кишечнике. Кроме того, поскольку ПМО могут быть приготовлены из материалов, неспособных проникать через эпителий желудочно-кишечного тракта, они могут быть использованы для взаимодействия с молекулами/веществами, отвечающими патологическим состояниям и находящимися в желудочно-кишечном тракте. Подходящими целевыми молекулами являются молекулы холестерина, желчной кислоты и солей желчной кислоты, а также, возможно, различные токсические вещества или антигены/лиганды патогенов, находящихся в желудочно-кишечном тракте.

Однако, если ПМО приготовлены из подходящего, биосовместимого и/или биоразлагаемого полимера (например, полилактида, полигликолида), то они также пригодны для использования в качестве парентеральных фармацевтических препаратов с пониженным риском возникновения нежелательной иммунной ответной реакции на фармацевтический препарат по сравнению с реакцией на введение, например, антител и растворимых рецепторов. В таких вариантах реализации практически любая целевая молекула, являющаяся подходящей целью для антитела или растворимого рецептора, может представлять собой целевую молекулу для композиции ПМО, предлагаемой согласно настоящему изобретению.

Таким образом, в предпочтительном варианте воплощения настоящее изобретение относится к способу лечения, облегчения или снижения риска развития заболевания, выбираемого из группы, состоящей из сердечно-сосудистого заболевания, гипертонии, атеросклероза, сердечных заболеваний, желчекаменной болезни, холестатического заболевания печени, гиперхолестеринемии, ожирения, инфекций, вызываемых паразитами, вирусами или микроорганизмами, например бактериями или грибками, отравления токсинами, введенными в организм перорально, включающему введение эффективного количества композиции, предлагаемой согласно настоящему изобретению, или композиции, приготовленной в соответствии со способами, предлагаемыми согласно изобретению, пациенту, нуждающемуся в указанном введении. Указанный вариант воплощения настоящего изобретения также включает использование указанных композиций для приготовления фармацевтических препаратов, предназначенных для лечения, профилактики или облегчения сердечно-сосудистого заболевания, гипертонии, атеросклероза, желчекаменной болезни, холестатического заболевания печени, гиперхолестеринемии, ожирения, инфекций, вызываемых паразитами, вирусами или микроорганизмами, например бактериями или грибками, или отравления токсинами, введенными в организм перорально. Обычно применяют пероральное введение медикамента.

Максимальная ожидаемая суточная дозировка композиции ПМО, предлагаемой согласно настоящему изобретению или приготовленной в соответствии со способами, предлагаемыми в настоящем изобретении, составляет 40 г в сутки, но благодаря высокой целевой избирательности композиций ПМО возможно применение более малых максимальных суточных дозировок, например, 30 г в сутки, 20 г в сутки, 10 г в сутки, 5 г в сутки и 1 г в сутки.

Рецептуры с использованием ПМО могут быть приготовлены в соответствии со стандартными способами, известными специалистам в данной области, в частности, они могут быть приготовлены в виде пероральных препаратов, при помощи которых ПМО могут быть введены в виде порошков, эмульсий, капсулированных эмульсий, пилюль и таблеток, а также в виде добавок в пищевые продукты, при помощи которых ПМО могут быть диспергированы практически в любой пище или в любом пищевом продукте.

Для приготовления указанных композиций, содержащих ПМО, приведена ссылка на публикацию Mark Gibson, CRC press, 2001, полностью включенную в настоящее описание путем ссылки.

Разумеется, композиции ПМО согласно настоящему изобретению или приготовленные в соответствии со способами, предлагаемыми в настоящем изобретении, могут быть использованы для любых областей применения, где предлагается использование ПМО в качестве специфических связывающих агентов в известных технических решениях. Таким образом, несмотря на то, что настоящее изобретение, в основном, относится к медицинскому применению композиций ПМО, получаемых согласно настоящему изобретению, изобретение не исключает использование описанных композиций ПМО в известных аналитических устройствах и методах. Таким образом, настоящее изобретение также включает способ качественного или количественного определения целевой молекулы в образце, причем указанный способ включает контакт образца с композицией ПМО согласно изобретению или приготовленной способами, предлагаемыми согласно изобретению, причем ПМО указанной композиции специфически связывают целевую молекулу, и последующее проведение качественного или количественного определения целевой молекулы, связанной указанной композицией. В соответствии с этим аспектом, все вышеизложенное, относящееся к общим способам приготовления и применения ПМО, полностью включено в указанный аспект путем ссылки.

ВВЕДЕНИЕ К ПРИМЕРАМ

Общий способ приготовления полимеров с молекулярными отпечатками

Приготовление ПМО проводят в соответствии с общим реакционным способом, включающим смешивание функционального мономера с молекулами, создающими отпечаток, и сшивание мономера в подходящем растворителе. Способ выбора мономера известен специалистам в данной области техники и зависит от способности мономера координировать молекулы, создающие отпечаток. Полимеризацию начинают добавлением инициатора в подходящей концентрации с последующим наложением возмущающего воздействия, например, воздействием УФ-излучения (для УФ-инициаторов) или нагреванием (для инициаторов, способных разлагаться при нагревании).

После полимеризации полученный полимер, (часто) жесткий и хрупкий, измельчают до образования частиц нужного размера, а затем молекулы, создающие отпечаток, несвязанные мономеры, сшивающие агенты и остатки инициатора удаляют экстракцией либо при помощи непосредственного промывания и/или при кипячении в растворителе в течение заданного времени.

ПРИМЕР 1

Получение ПМО с применением флуоресцеина в качестве шаблона

В колбе емкостью 100 мл, находящейся на горячей водяной бане (приблизительно 40°С), смешивали в течение 30 минут 1,4 мл мономера -метакриловой кислоты (МАК), 9,5 мл этиленгликольдиметакриловой кислоты (ЭГДМАК), 50 мг флуоресцеина и 10 мл тетрагидрофурана (ТГФ). Затем медленно добавили 2 г 1,1-азобис(циклогексанкарбонитрила) (АЦГКН). После растворения раствор продували Аr (насыщенным ТГФ) в течение 15 минут. Полимеризацию инициировали непрерывным облучением УФ-излучением (365 нм, 9 Вт) в течение 48 часов. Получали хрупкий полимер желтого цвета, который измельчали вручную в ступке до получения частиц размером от 10 мкм до 25 мкм. Полученный порошок кипятили в ТГФ в течение 30 минут, несколько раз промывали в смеси этанол/ТГФ (75:25) и фильтровали. Белый порошок оставляли сушиться на воздухе.

ПРИМЕР 2

Получение ПМО с применением холевой кислоты в качестве шаблона

В колбе емкостью 100 мл, находящейся на горячей водяной бане, смешивали в течение 30 минут 1,4 мл мономера - метакриловой кислоты (МАК), 9,5 мл этиленгликольдиметакриловой кислоты (ЭГДМАК), 2 г холевой кислоты и 12 мл тетрагидрофурана (ТГФ). Затем медленно добавили 0,2 г 2,2'-азобисизобутиронитрила/2,2'-азобис(2-метилпропионитрила) (АИБН). После растворения раствор продували Аr в течение 15 минут. Полимеризацию инициировали непрерывным облучением УФ-излучением (365 нм, 9 Вт) в течение 24 часов на ледяной бане. Получали хрупкий, твердый полимер желтоватого цвета, который измельчали вручную в ступке до получения частиц размером от 25 мкм до 50 мкм. Полученный порошок один раз кипятили в ТГФ в течение 30 минут и четыре раза промывали в смеси этанол/ТГФ (75:25) и фильтровали. Беловатый порошок оставляли сушиться на воздухе в течение ночи.

ПРИМЕР 3

Получение ПМО с применением холевой кислоты в качестве шаблона

В колбе емкостью 100 мл, находящейся на горячей водяной бане, смешивали в течение 30 минут 2,8 мл мономера - 2-(диметиламино)этил-метакриловой кислоты (ДМА-ЭМАК), 9,5 мл этиленгликольдиметакриловой кислоты (ЭГДМАК), 2 г холевой кислоты и 12 мл тетрагидрофурана (ТГФ). Затем медленно добавили 0,8 г 2,2'-азо-бис-изобутиронитрила/2,2'-азобис(2-метилпропионитрила) (АИБН). После растворения раствор продували Аr в течение 15 минут.Полимеризацию инициировали непрерывным облучением УФ-излучением (365 нм, 9 Вт) в течение 24 часов на ледяной бане. Получали беловатый хрупкий полимер, который измельчали вручную в ступке до получения частиц размером от 10 мкм до 25 мкм. Полученный порошок дважды кипятили в ТГФ в течение 30-60 минут и три раза промывали в смеси этанол/ТГФ (75:25) и фильтровали. Беловатый порошок оставляли сушиться на воздухе в течение ночи.

ПРИМЕР 4

Связывающая способность индивидуальных частиц ПМО

Для оценки различий в связывающей способности/избирательности частиц ПМО, находящихся в порошке, был проведен простой эксперимент. Исследовали связывающую способность ПМО, полученных в примере 1, по отношению к флуоресцеину.

1,9 мг ПМО, связывающих флуоресцеин, суспендировали в 380 мкл этанола (96%), содержащего 5 мкл раствора флуоресцеина (0,05 мг/мкл этанола), и перемешивали в течение 5 минут. Суспензию центрифугировали и сливали жидкость над осадком. Затем частицы 3 раза промывали 300 мкл этанола. Промытые частицы распределяли по стеклянной пластинке - предметному столику микроскопа и проводили анализ связывающей способности, визуально подсчитывая частицы в ахроматическом свете (все частицы) и частицы, флуоресцирующие зеленым (частицы, связанные с ПМО) в УФ-облучении (365 нм). УФ-облучение позволяло не использовать-эмиссионные фильтры при исследовании зеленой флуоресценции.

На фиг.4 показано наложение картинок, полученных в ахроматическом (белом) свете и при УФ-облучении. Белые пятнышки представляют собой частицы, освещенные ахроматическим светом, а черные пятнышки представляют собой флуоресцирующие зеленым частицы, облученные УФ-излучением. Из фиг.4 видно, что частиц, освещенных ахроматическим светом (белые пятнышки), больше, чем флуоресцирующих зеленым частиц, облученных УФ-излучением (черные пятнышки). Разность количеств частиц, видимых при разном освещении, показывает, что измельчение ПМО приводит к получению некоторого количества связывающих частиц ПМО и несвязывающих частиц ПМО (= осколки); таким образом, отбор связывающих частиц ПМО на основании сродства эффективно повышает связывающую способность полимера, измеряемую как способность единицы массы применяемого ПМО связывать используемый шаблон.

На изображении не удалось показать, что флуоресценция зеленых флуоресцирующих частиц имеет разную интенсивность, не связанную с размером частиц. Это наблюдение подтверждает положение о различии связывающей способности различных связывающих частиц ПМО. Разность в интенсивности (флуоресценции) вновь показывает, что частицы ПМО на самом деле имеют различные связывающие способности; таким образом, связывающая способность ПМО может быть повышена за счет отбора частиц ПМО, имеющих (в этом примере) наибольшую интенсивность флуоресценции.

В заключение следует сказать, что приведенный выше пример показывает возможность повышения связывающей способности композиции, включающей частицы ПМО, посредством удаления несвязывающих частиц. Связывающая способность может быть еще более усилена путем обогащения композиции частицами ПМО, имеющими высокое сродство к молекулам целевого вещества и/или множество полостей, пригодных к взаимодействию с молекулами целевого вещества.

Разделение частиц полимера с молекулярным отпечатком (ПМО) путем хроматографии с использованием абсорбции на разрыхленном слое сорбента (АРС) описано в примерах 5 и 6.

ПРИМЕР 5

Специфичный в отношении фенилаланина МПО (Фе-ПМО) получали с использованием акроил-бетациклодекстрина и 2-акриламидо-2-метилпропансульфоновой кислоты в качестве конкретных мономеров, и N, N'-дикакрилоилпиперазина в качестве сшивающего агента. L-фенилаланин использовали в качестве молекулы шаблона. Полимер измельчали, просеивали и промывали, с отбором частиц размером менее 10 мкм. Хроматографическую матрицу, пригодную для АРС (Steamline-NHS, GE Biosciences, Упсала, Швеция), подготавливали путем прикрепления к матрице фенилаланина. 1 г ПМО и матрицу АРС с фенилаланином (20 мл) перемешивали в смеси воды и ацетонитрила (3:7) в пробирке емкостью 50 мл и выдерживали на вибростоле в течение ночи, после чего переносили в пустую хроматографическую колонку. В нижнюю часть колонки подавали смесь воды и ацетонитрила (3:7) с расходом 0,3 мл/мин, и отбирали фракции по 5 мл элюированного ПМО. Отобранные фракции ПМО сушили и определяли связывающую способность по фенилаланину путем суспендирования частиц в 0,2 мМ фенилаланина в смеси воды и ацетонитрила (3:7) (приблизительно 20 мг ПМО в 0,5 мл растворителя), а затем выдерживали в течение 2 часов в барабанном смесителе вертикального типа. Образцы центрифугировали и 50 мкл надосадочной жидкости исследовали с использованием имеющегося в продаже комплекта для количественного определения фенилаланина (BioVision, K572-100). Улучшение связывающей способности показано на Фиг.5 в зависимости от номера фракции.

ПРИМЕР 6

Специфичный в отношении холестерина ПМО приготавливали, как описано Witcombe er. al (J. Am. Gem. Soc., 1995, 117, 7105-7111). Полимер измельчали, просеивали и промывали, с отбором частиц размером менее 10 мкм. Хроматографическую матрицу, пригодную для АРС (Steamline-NHS, GE Biosciences, Упсала, Швеция), подготавливали путем прикрепления к матрице амино-ПЭГ, выделенного из холестерина. Отмытую н-гептаном матрицу АРС с холестерином, приблизительно 1 мл, добавляли к суспензии частиц ПМО (MSMI002), для которых целевой молекулой являлся холестерин, 200 мг в 15 мл н-гептана, в цилиндрическом мерном стакане емкостью 25 мл, при перемешивании с помощью магнитной мешалки. Перемешивание регулировали таким образом, что наиболее плотные частицы все же поддерживали во взвешенном состоянии. После перемешивания в течение ночи кластеры подвергнутых АРС частиц были расположены в самой нижней части стакана, и их удаляли с помощью пипетки. Частицы постепенно перемешали в 2-пропанол, а потом в ацетонитрил. При этом было сформировано два слоя, и верхний слой, содержащий ПМО, отбирали пипеткой и сушили. Выход продукта составлял приблизительно 40 мг. 20 мг ПМО, очищенного, неочищенного (MSMI002) или контрольного (MSMI003), добавляли к 500 мкл н-гептана, содержащего 10 мкг/мл холестерина, и выдерживали в барабанном смесителе вертикального типа при скорости вращения 20 об/мин в течение 1,5 ч при комнатной температуре (30°С - жаркий день). После центрифугирования (13000 об/мин, 5 мин), 200 мкл надосадочной жидкости переносили в пробирки Эппендорфа и оставляли для естественного испарения в течение ночи, после чего подвергали вакуумированию в течение 1 ч. Оставшийся после сушки холестерин определяли количественно с помощью промышленного комплекта (BioVision, K603-100). Холестерин растворяли в аналитическом буферном растворе, 100 мкл, путем интенсивного перемешивания в вихревом смесителе, 2800 мин - 1,1 мин. Впоследствии, к 100 мкл аналитического буферного раствора, содержащего пробу холестерина, добавляли ферментную смесь и образцы выдерживали в течение 1 ч при 37°С. Поглощение измеряли при 570 нм на спектрофотометре. Результаты представлены на Фиг.6. Очевидно, что очищенные с помощью АРС частицы ПМО связывали значительно большее количество холестерина, чем неочищенный и контрольный ПМО.

Один аспект изобретения относится к усовершенствованному способу получения частиц, состоящих из полимера с молекулярными отпечатками (ПМО), который включает обогащение первоначально полученных композиций, включающих нерастворимые частицы ПМО, частицами ПМО, связывающими конкретные целевые молекулы, таким образом исключая из исходной композиции несвязывающие и слабосвязывающие частицы. Обогащение обычно выполняют при помощи хроматографических способов, пригодных для отделения порошкообразного материала или при помощи агглютинации. Другой аспект изобретения относится к приготовлению усовершенствованных нерастворимых ПМО при помощи усиленного измельчения частиц неочищенного ПМО с целью создания большого количества центров связывания на единицу массы частиц ПМО. Предпочтительные аспекты изобретения включают сочетание указанных двух аспектов. Полученные усовершенствованные ПМО могут быть использованы для диагностических, аналитических и терапевтических целей, в частности в качестве перорально вводимых медикаментов, которые могут связывать вещества, например холестерин, желчные кислоты и соли желчных кислот, находящиеся в желудочно-кишечном тракте. 4 н. и 13 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл.

1. Способ получения композиции, включающей полимеры с молекулярными отпечатками (ПМО), имеющие высокую связывающую способность и избирательность по отношению к целевой молекуле, причем указанный способ включает:
а) получение суспензии нерастворимых ПМО, которые связывают целевую молекулу и которые были приготовлены с использованием целевой молекулы или ее имитатора в качестве молекулы шаблона,
б) проведение операции аффинной очистки суспендированных ПМО, при которой молекулу шаблона, или ее фрагмент, или ее имитатор используют в качестве агента захвата,
в) извлечение ПМО, связывающих агент захвата, при помощи операции аффинной очистки, включающей, по существу, полное отделение агента захвата и ПМО, не связывающих агент захвата, от извлекаемого продукта, и
г) соединение извлеченных ПМО и, возможно, носителя, наполнителя или разбавителя с получением указанной композиции.

2. Способ по п.1, в котором агент захвата связан ковалентной или нековалентной связью с твердой фазой, такой как твердая фаза, выбранная из группы, состоящей из матриц поперечно-сшитых углеводов, синтетических полимеров или их сочетаний.

3. Способ по п.1, в котором агент захвата состоит из растворимой химической единицы или является ее частью.

4. Способ по п.3, в котором агент захвата связан ковалентной или нековалентной связью с группировкой, выбираемой из дендримера, замещенного углевода и растворимого замещенного полимера, такого как поливиниловый спирт и полиэтиленгликоль, с целью осуществления взаимодействия нескольких агентов захвата с растворимой химической единицей.

5. Способ по п.1, в котором связывание агента захвата происходит лишь с частью связывающих центров ПМО стадии (а), связывающих молекулу шаблона, например, когда агент захвата представляет собой фрагмент молекулы шаблона.

6. Способ по п.1, в котором агент захвата включает молекулу шаблона, или ее имитатор, или их фрагмент, связанные с твердой поверхностью или группировкой, в зависимости от того, что приемлемо, в специфической ориентации, так чтобы, по существу, исключить взаимодействие части агента захвата с ПМО, или альтернативно, в неспецифической ориентации, так что, по существу, все части агента захвата взаимодействуют с ПМО.

7. Способ по пп.1-6, в котором способ аффинной очистки выбирают из группы, состоящей из абсорбции на разрыхленном слое (АРС), парамагнитного разделения гранул, очистки на полых волокнах и агглютинации.

8. Способ получения ПМО, обладающих высокой связывающей способностью по отношению к целевой молекуле, включающий первую стадию измельчения неочищенного ПМО, который включает молекулы шаблона, состоящие из указанных целевых молекул или их имитаторов, с получением частиц ПМО достаточно малых размеров для обеспечения удаления молекул шаблона; по существу, полное удаление молекул шаблона и возможное проведение второй стадии измельчения полученных таким образом ПМО; при этом указанные первая и, возможно, вторая стадии измельчения обеспечивают получение частиц ПМО, средний диаметр которых не превышает 50 мкм; с последующей обработкой полученных указанным способом ПМО в соответствии со способом по любому из пп.1-7.

9. Способ по п.8, в котором целевая молекула представляет собой молекулу, находящуюся в желудочно-кишечном тракте, например в желудочно-кишечном тракте человека.

10. Способ по п.8 или 9, в котором целевую молекулу выбирают из холестерина, желчной кислоты и соли желчной кислоты.

11. Композиция нерастворимых ПМО, в которой, по существу, все ПМО в композиции связывают одну и ту же целевую молекулу, и, возможно, композиция не включает все центры, связывающие целевую молекулу.

12. Композиция по п.11, в которой средний диаметр частиц ПМО составляет менее 20 мкм.

13. Композиция по п.11, в которой ПМО, находящиеся в композиции, связывают холестерин, желчную кислоту или соль желчной кислоты.

14. Композиция по любому из пп.11-13, предназначенная для применения в качестве фармацевтического препарата.

15. Композиция по любому из пп.11-13, предназначенная для применения в лечении, профилактики или облегчении сердечно-сосудистого заболевания, гипертонии, атеросклероза, желчекаменной болезни, холестатического заболевания печени, гиперхолестеринемии, ожирения, инфекций, вызываемых паразитами, вирусами или микроорганизмами, например бактериями или грибками, или лечении отравления токсинами, введенными в организм перорально.

16. Композиция по п.15, предназначенная для перорального введения.

17. Способ качественного или количественного определения целевой молекулы в образце, включающий контакт образца с композицией по любому из пп.11-14 или с композицией, полученной согласно любому из пп.1-10, причем ПМО в указанной композиции специфически связывают целевую молекулу, и последующее проведение качественного или количественного определения целевой молекулы, связанной с указанной композицией.