СПОСОБ АКТИВАЦИИ ПРОЦЕССА ФОТОПОЛИМЕРИЗАЦИИ БЛИЖНИМ ИНФРАКРАСНЫМ ИЗЛУЧЕНИЕМ Российский патент 2017 года по МПК A61L27/00 C09K9/00 C08J3/28 B82B1/00 

Изобретение относится к аддитивным технологиям, биотехнологии и медицине, созданию скаффолдов для регенеративной медицины, а именно к способу активации процесса фотополимеризации непрерывным ближним инфракрасным (ИК) излучением, включая выбор фотоактиватора, состоящего из апконвертируемых, обладающих антистоксовой люминесценцией наночастиц (ΑΚΗ) и фотоинициатора, причем фотоинициатор возбуждается при безызлучательной передаче энергии от линии антистоксовой люминесценции ΑΚΗ. Изобретение может быть использовано для создания различных тканеинженерных конструкций, матриц для индивидуальных биоактивных имплантов и искусственных органов.

К способам прецизионного изготовления индивидуальных скаффолдов для тканевой инженерии и регенеративной медицины предъявляются весьма жесткие требования. Прежде всего, материал скаффолда должен быть биосовместимым. Материал должен обеспечивать механическую прочность и устойчивость структуры как в процессе ее имплантации, так и при дальнейшем ремоделировании требуемого типа ткани. В идеале, по своей форме, составу, структуре и биомеханическим свойствам скаффолд для тканеинженерной конструкции должен быть максимально приближен к природному межклеточному матриксу требуемого типа ткани или органа [Хенч Л., Джонс Д. "Биоматериалы, искусственные органы и инжиниринг тканей" // Серия «Мир биологии и медицины», Москва, Техносфера (2007)]. В настоящее время наибольших успехов в решении тканеинженерных задач удалось достичь при использовании синтетических жидких, твердых и гидрогелевых полимерных композиций с помощью способов быстрого прототипирования. Эти способы базируются на послойном синтезе твердых копий трехмерных компьютерных образов и позволяют оперативно и с высокой точностью (порядка 0,1 мм) изготавливать объемные структуры практически любой сложности.

Для разработки и создания прочных полимерных конструкций используются три известных способа быстрого прототипирования - лазерная стереолитография, селективное лазерное спекание и многофотонная стереолитография.

Известный способ лазерной стереолитографии основан на фотоинициированной лазерным излучением реакции полимеризации фотополимеризующейся композиции (ФПК). С помощью этого способа созданная на компьютере трехмерная модель объекта выращивается последовательно тонкими (0,1-0,2 мм) слоями, формируемыми под действием лазерного излучения на подвижной платформе, погружаемой в ванну с ФПК 100-200 мкм. Недостатком лазерной стереолитографии (ЛС) является токсичность исходных акриловых или эпоксидных мономеров, низкомолекулярных олигомеров, а также большинства фотоинициаторов и ингибиторов (следы которых, как правило, всегда присутствуют в конечном объекте) [Leong K.F., Cheah C.M., Chua С.К. "Solid free form fabrication of three-dimensional scaffolds for engineering replacement tissues and organs" // Biomaterials, 24, 2363-2378 (2003)]. Вторым недостатком способа ЛС является ограниченный набор исходных компонентов (мономеров) для изготовления биорезорбируемых матриксов [Liska R, Schuster M, Infuhr R, Tureeek C, Fritscher C, Seidl B, et al. "Photopolymers for rapid prototyping" // J. Coat. Technol. Res., 4, 505-510 (2007)]. Третьим недостатком является необходимость использования цитотоксичного ультрафиолетового (УФ) излучения для активации фотополимеризации, что не позволяет использовать способ для полимеризации сред, содержащих клеточные структуры.

Другим известным способом создания трехмерных полимерных структур является способ лазерного спекания (ЛС), в основе которого лежит послойное лазерное формирование спеченных слоев по заданной программе. Элементарным шагом в этом процессе является связывание (спекание, сварка) между собой двух предварительно не связанных полимерных частиц, вызванное плавлением нагретого лазером материала частиц на границе их соприкосновения. Этот способ подходит только для изготовления полимерных структур и изделий из термопластичных материалов [Cruz F., Simoes J., Coole T., Bocking C. "Direct manufacturing of hydroxyapatite based bone implants by selective laser sintering" // in: Bartolo P. ed. Virtual Modeling and Rapid Manufacturing. Leiria, Portugal: CRC Press; 119-125 (2005)]. Объемное поглощение и полный расплав полимерных частиц позволяют использовать этот метод для спекания термоустойчивых систем, так как сильный лазерный перегрев приводит к деструкции с возможностью образования токсичных компонентов. Необходимость наличия высокой температуры процесса исключает возможность использования клеток в исходной полимерной композиции. Модернизированный способ ЛС описан в патенте РФ 100948, где используются светопоглощающие добавки, которые наносятся на поверхность структуры для каждого элементарного шага. К недостаткам способа следует отнести цитотоксичность добавок и высокий локальный нагрев материала структуры, что исключает возможность использовать способ для полимеризации сред, содержащих клеточные структуры.

Наиболее близким к заявляемому способу получения трехмерных структур является двухфотонная стереолитография. US Patent US 2005/0156147 A1 Akiba et al. «Two-photon polymerizable composition and process for polymerization thereof». При помощи этого способа в объеме ФПК последовательной, «поточечной», записью сфокусированным излучением фемтосекундного лазера могут формироваться произвольные трехмерные структуры с пространственным разрешением около 200 нм. Двухфотонный характер поглощения излучения позволяет добиться того, что этот процесс локализован в объеме, определяемом перетяжкой лазерного луча, что обеспечивает формирование трехмерных структур с высоким пространственным разрешением. Однако такой двухфотонный процесс имеет малое сечение поглощения типичных фотоинициаторов и, как следствие, требует высоких интенсивностей излучения (порядка 10⁹-10¹³ Вт/см²), что снижает эффективность процесса, требует использования оптики с большой числовой апертурой, высокой частоты повторения импульсов для обеспечения производительности способа. Для снижения тепловой нагрузки на материал ФПК под действием высокоинтенсивного излучения в указанном способе применяются фемтосекундные лазерные импульсы. Изготовление больших структур требует временных затрат, и практически способ двухфотонной стериолитографии для этих целей не используется.

Предлагаемый способ активации процесса фотополимеризации ближним инфракрасным (ИК) излучением лишен указанных недостатков.

Цель изобретения состоит в реализации способа активации фотоинициатора, который легко осуществлять в объеме полимеризуемого материала непрерывным ИК-излучением и который исключает наличие цитотоксичного УФ-излучения.

С этой целью способ согласно изобретению включает:

- выбор фотоактиваторов, состоящих из апконвертирующих наночастиц и фотоинициатора, способного инициировать процесс полимеризации;

- облучение фотоктиватора глубоко проникающим в полимеризуемую композицию непрерывным источником света ближнего ИК-диапазона.

Фотоинициаторы относятся к классам веществ, активирующих полимеризацию при воздействии светового излучения. Типичные фотоинициаторы процесса полимеризации, применяемые на практике в биотехнологии и медицине, это: Irgacure 2959, Camphorquinone, Isopropyl thioxanthone, Eosin Y, Рибофлавин и т.п. Цитотоксичность фотоинициатора и фотопродуктов зависит от типа клеток [NE Fedorovich, MN Oudshoorn, etc "The effect of photopolymerization on stem cells embedded in hydrogels " Biomaterials 30 (209) 344-353]. Главный недостаток существующих методов фотополимеризации заключается в необходимости использования света УФ или видимого спектрального диапазона для возбуждения фотоинициаторов. К сожалению, такой свет проникает в ткани в десятки раз хуже, чем свет в ближней ИК-области спектра, и фотополимеризация возможна в достаточно тонком слое. Так, если излучение 365 нм проникает в среду на глубину менее 100 мкм, то излучение на 975 нм - на несколько сантиметров. Второе ограничение применения фотоинициаторов - это цитотоксичность самого УФ-излучения. Указанных недостатков, лишены предлагаемые в данном изобретении фотоактиваторы. Создание комплекса, способного активировать процесс полимеризации при возбуждении непрерывным светом в ближней РЖ области спектра, где существует окно прозрачности биологической ткани, имеет реальную практическую значимость.

В частности, в этом случае фотоактивацию процесса полимеризации можно осуществлять в присутствии клеточных культур в полимеризумой композиции.

Для активации реакции фотополимеризации ИК излучением были синтезированы новые комплексы, содержащие Рибофлавин в качестве фотоинициатора и апконвертирующие наночастицы типа NaYF₄: Yb³⁺Tm³⁺ в качестве первичного акцептора ИК-излучения.

Эффективность полимеризации зависит от эффективности передачи энергии от возбужденных апконвертирующих наночастиц к фотоинициатору. Для резонансной безызлучательной передачи энергии по ферстеровскому механизму (FRET, Forster Resonance Energy Transfer) необходимо, прежде всего, чтобы донор (наночастица) и акцептор (Рибофлавин) находились на малом расстоянии друг от друга, т.к. эффективность FRET обратно пропорциональна шестой степени расстояния между ними. Кроме того, линии фотолюминесценции донора должны попадать в полосу поглощения акцептора.

На фиг. 1 приведена структура фотоактиватора и схема фотоактивации процесса полимеризации с использованием фотоактиватора. Фотоактиватор (3) состоит из апконвертирующей наночастицы (1) и фотоинициатора (2). ИК-излучение (4) возбуждает апконвертирующую наночастицу активатора. Энергия возбуждения переносится безызлучательным резонансным способом (5) на фотоинициатор. Возбужденный фотоинициатор способен активировать процесс полимеризации (6).

В качестве фотоинициатора может быть использован рибофлавин, являющийся эндогенным фотоинициатором, а в качестве апконвертирующей наночастицы NaYF₄:Yb³⁺Tm³⁺.

На фиг. 2 дан спектр антистоксовой люминесценции NaYF₄:Yb³⁺Tm³⁺ при возбуждении излучением полупроводникового лазера на длине волны 975 нм (7) и спектр излучения фотоактиватора NaYF₄:Yb³⁺Tm³⁺/Рибофлавин (8). В спектре фотоактиватора при возбуждении ИК-излучением регистрируется широкая полоса флуоресценции Рибофлавина с максимумом на 540 нм, а линии антистоксовой люминесценции апконвертирующих наночастиц, попадающие в полосу возбуждения Рибофлавина, практически отсутствуют. Люминесценция Рибофлавина при ИК-возбуждении свидетельствует об эффективном безызлучательном переносе энергии в фотоактиваторе. Возбуждение фотоинициатора в фотоактиваторе активирует процесс полимеризации.

На фиг. 3 представлена фотография образца заполимеризованной ИК светом структуры, полученного с использованием фотоактиватора, состоящего из ΑΚΗ типа NaYF₄:Yb³⁺, Tm³⁺ и эндогенного фотоинициатора рибофлавина в водорастворимой форме флавин мононуклеотида, который вводился в раствор метакрилированной гиалуроновой кислоты.

Для рисования 3D полимерной структуры применялся ИК полупроводниковый лазер (975 нм), излучение которого фокусировалось в объем фотоотверждаемой композиции объективом с фокусным расстоянием 10 см. Отклонение луча в плоскости XY обеспечивалось гальванозеркалами, подвижка с микрометрическим винтом позволяла перемещать образец по Ζ координате.

Таким образом, предложенный способ позволяет создавать трехмерные конструкции с использованием непрерывного излучения в ближней ИК-области спектра для возбуждения антистоксовой люминесценции апконвертирующих наночастиц и активации процесса фотополимеризации при резонансной безызлучательной передачи энергии инициатору. При этом исключается цитотоксическое действие УФ-излучения, так как в этом процессе отсутствуют кванты УФ-излучения.

Изобретение относится к аддитивным технологиям, биотехнологии и медицине, а именно к cпособу получения трехмерных конструкций в объеме полимеризуемого материала. Способ характеризуется тем, что осуществляют облучение фотоктиватора глубоко проникающим в полимеризуемую композицию непрерывным источником света ближнего ИК-диапазона, что приводит к активации процесса полимеризации посредством безызлучательного резонансного переноса энергии от наночастицы на фотоинициатор, при этом фотоактиватор представляет собой молекулярный комплекс, состоящий из апконвертирующей наночастицы NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺, обладающей антистоксовой люминесценцией в ультрафиолетовой (УФ) и синей области спектра. Способ позволяет исключить радиационную нагрузку цитотоксичного ультрафиолетового излучения и применять фотоактиватор для создания полимерных композиций в объеме, содержащем клеточные культуры. Изобретение может быть использовано для создания различных тканеинженерных конструкций, матриц для индивидуальных биоактивных имплантов и искусственных органов. 3 ил.

Способ получения трехмерных конструкций в объеме полимеризуемого материала, отличающийся тем, что осуществляют облучение фотоктиватора глубоко проникающим в полимеризуемую композицию непрерывным источником света ближнего ИК-диапазона, что приводит к активации процесса полимеризации посредством безызлучательного резонансного переноса энергии от наночастицы на фотоинициатор, при этом фотоактиватор представляет собой молекулярный комплекс, состоящий из апконвертирующей наночастицы NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺, обладающей антистоксовой люминесценцией в ультрафиолетовой (УФ) и синей области спектра, в качестве фотоинициатора используется рибофлавин в водорастворимой форме флавин мононуклеотида, в качестве полимеризуемого материала используется раствор метакрилированной гиалуроновой кислоты.