СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АНАПЛАЗМОЗА РОГАТОГО СКОТА МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 2017 года по МПК G01N33/50 C12Q1/68 

Предлагаемое изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики кровепаразитарных болезней животных, научных исследований в ветеринарии и молекулярной биотехнологии.

Анаплазмоз рогатого скота - трансмиссивная лихорадочная болезнь, протекающая с явлениями анемии и истощения, вызываемая внутриэритроцитарными паразитами из рода Anaplasma (Rickettsia). У крупного рогатого скота возбудитель - Anaplasma marginale Theiler, 1910, у овец и коз - A. ovis Lestoquard, 1924. В Российской Федерации и странах СНГ смертность от анаплазмоза среди больного скота составляет 25% и более (Степанова Н.И., Дьяконов Л.П., 1973; Георгиу X., 1997). За рубежом смертность среди крупного рогатого скота достигает 50-80% (Seifert Н., 1960), а иногда и 96-100% (Lubrihi А., 1969).

В комплексе мероприятий по оздоровлению хозяйств от анаплазмоза ведущее место принадлежит диагностике. В настоящее время при постановке диагноза учитывают эпизоотологические данные, симптоматику и результаты микроскопии мазков крови. Рекомендованы серологические методы диагностики - РНГА, РДСК и ИФА (Георгиу Х., 1997). Отсутствие коммерчески доступных диагностикумов на отечественном рынке вызвало необходимость создания тест-системы для диагностики анаплазмоза рогатого скота методом полимеразной цепной реакции.

В настоящее время совершенствование методов диагностики анаплазмоза крайне необходимо, поскольку традиционные методы световой микроскопии не всегда позволяют достоверно диагностировать возбудителя.

Принцип полимеразной цепной реакции (ПЦР) заключается в многократном увеличении (амплификации) определенного участка ДНК выявляемого объекта путем его копирования с помощью фермента ДНК-полимеразы и специфических праймеров. Специфические праймеры (прямой и обратный) ограничивают определенный фрагмент нуклеотидной последовательности таким образом, что элонгация новой цепи ДНК при амплификации в ПЦР происходит только между ними. Основными параметрами эффективного прохождения реакции амплификации, обеспечивающими специфичность и чувствительность, являются правильный выбор области генома идентифицируемого агента, структура и температурный режим отжига олигонуклеотидных праймеров.

Известен способ выявления фрагмента генома Anaplasma marginale методом «гнездовой» ПЦР (nested-PCR) с использованием одной пары праймеров к гену MSP5 (Major Surface Protein 5) [1]. Также описан способ выявления Anaplasma marginale методом ПЦР с использованием одной пары праймеров к гену MSP1a (major surface antigen protein 1a) [2]. Прототип.

В задачу исследований входило - разработка эффективного способа обнаружения фрагментов генома Anaplasma marginale и Anaplasma ovis методом ПЦР с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров.

Авторами изобретения было выявлено, что для выявления Anaplasma marginale и Anaplasma ovis целесообразно использовать праймеры к специфичному для обоих возбудителей участку гена MSP4 (Major Surface Protein 4) как наиболее консервативной области генома. При конструировании праймеров и оценке их специфичности использовали нуклеотидные последовательности и программу BLAST, доступные в Интернете на сайте NCBI.

Предложенный способ заключается в следующем: с помощью компьютерной программы DNASTAR (Lasergene Co., USA) на основании программы, предоставленной в базах данных Интернет ресурсов GenBank (CLUA), по генотипам возбудителей выбирают рефернс - последовательность. Праймеры проверяют на отсутствие гомологии с последовательностями других микроорганизмов и генома человека программой BLAST с помощью веб-ресурса Национального центра биотехнологической информации (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). На основании проведенного компьютерного анализа были подобраны 10 пар праймеров, которые являются главным компонентом ПЦР и обеспечивают ее специфичность и чувствительность.

Праймеры имеют следующую характеристику: комлементарность выбранной области гена, отсутствие самокомлементарных участков внутри каждого праймера и между прямым и обратным, фланкируют область фрагментов гена MSP4. Синтез разработанных олигонуклеотидных праймеров заказывается в коммерческом сервисном центре.

Амплификация специфических фрагментов ДНК анаплазм с помощью разработанных праймеров для диагностики анаплазмоза рогатого скота

В процессе проведения практических экспериментов подбирают оптимальные условия прохождения полимеразной цепной реакции с разработанными праймерами. ДНК прогревают при 95° в течение 3 минут и используют для постановки ПЦР. Состав реакционной смеси указан в таблице 3. В качестве положительного контроля и ПЦР используют референтный тюменский штамм Anaplasma ovis. Предварительно штамм был исследован серологическими методами (РДСК, РНГА, ИФА). В качестве отрицательного контроля используют дистиллированную воду.

Полимеразную цепную реакцию проводят в объеме реакционной смеси 25 мкл на 1 пробу ДНК. Температурно-временной режим проведения реакции для амплификатора «Терцик» («ДНК-технология», Россия) представлен в таблице 2.

После проведения реакции амплификации продукты ПЦР анализируют методом электрофоретического разделения в 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия.

В процессе ПЦР были получены продукты амплификации ДНК фрагмента специфичного участка гена MSP4, кодирующего ДНК анаплазм. При обнаружении амплифицируемых фрагментов нуклеотидной последовательности соответствующей длины на электрофореграмме в исследуемом образце диагностируют наличие в крови животного кровепаразитов Anaplasma marginale или Anaplasma ovis.

При учете результатов ПЦР в первую очередь оценивали контрольные образцы. В электрофоретической дорожке с положительным контрольным образцом (К+) присутствовала светящаяся полоса на уровне, соответствующем фрагменту длиной 860 или 240 пн. В отрицательных пробах полоса отсутствовала.

Опытные пробы оценивали по наличию в соответствующей дорожке специфической полосы, которая в положительных образцах располагалась на том же уровне, что и полоса в положительной контрольной пробе.

Специфичность праймеров проверяли на образцах крови от животных, содержащих анаплазмы. Специфическая полоса была выявлена только в случае наличия в пробе Anaplasma marginale или Anaplasma ovis.

Предложенный вариант апробирован с положительным результатом и регулярной воспроизводимостью в 2013-2015 годах на 150 пробах, полученных из крови крупного рогатого скота и овец, поступивших из различных регионов.

Предлагаемое изобретение найдет применение в диагностических исследованиях в научно-исследовательских институтах, ветеринарных лабораториях, животноводческих хозяйствах.

Источники информации

1. Torioni De Echaide S, Knowles DP, McGuire TC et al. Detection of Cattle Naturally Infected with Anaplasma marginale ina Region of Endemicity by Nested PCR and a Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Using Recombinant Major Surface Protein 5 // J. Clin. Mlicrobiol, Vol. 36, № 3. 1998, p. 777-782.

2. Ybanez AP, Ybanez RHD et al. High Genetic Diversity of Anaplasma marginale Detected from Philippine Cattle // J. Vet. Med. Sci. 2014. 76(7): 1009-1014.

Сущность изобретения поясняется таблицами, в которых отображается следующая информация:

Изобретение относится к области ветеринарии и молекулярной биотехнологии и предназначено для диагностики анаплазмоза рогатого скота методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Осуществляют выявление фрагмента гена MSP4, кодирующего ДНК анаплазм, с использованием 10 различных пар прямых и обратных олигонуклеотидных праймеров. Проводят электрофоретическое определение размера амплифицируемого фрагмента нуклеотидной последовательности. По наличию на электрофореграмме фрагментов соответствующей длины диагностируют в крови животного кровепаразитов Anaplasma marginale или Anaplasma ovis. Изобретение обеспечивает эффективный способ обнаружения фрагментов генома Anaplasma marginale и Anaplasma ovis методом ПЦР с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров. 3 табл.

Способ диагностики анаплазмоза рогатого скота методом полимеразной цепной реакции, при котором используют 10 различных пар прямых и обратных олигонуклеотидных праймеров (ACGAAGTGGCTTCTGAAGG и AGCTAATCCCAACCTTGCC, AGGAGGAGCCAGAGTGGA и CCAGAGATTCCGCACCACT, CATTCCCGCACACAACAGT и TGCTCCAAGGTTAAGCCGT, ATTACCCGCGACGCTACAT и AGCACGTCATAGCAGCCATT, TGGCTTCTGAAGGGGAGTA и TCCGCCAAAGTACAAACCT, AATGGCTGCTATGACGTGCT и TACACTGTTGTGTGCGGGAA, TTACCCGCGACGCTAACATT и TTGTGTGCGGGAATGTCCTT, GTTTGCTACTTTGGCGGACG и TTACACTGTTGTGTGCGGGA, TTACCTCGTTCGACATGCGT и CGTCCGCCAAAGTAGCAAAC, GAAGTGGCTTCTGAAGGGGG и ACGCATGTCGAACGAGGTAA) для выявления фрагмента специфичного участка гена MSP4, кодирующего ДНК анаплазм, с последующим электрофоретическим определением размера амплифицируемого фрагмента нуклеотидной последовательности, где по наличию на электрофореграмме фрагментов соответствующей длины в исследуемом образце диагностируют наличие в крови животного кровепаразитов Anaplasma marginale или Anaplasma ovis.