ШТАММ ANAPLASMA OVIS LESTOQUARD, 1924, KADOM_1, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА СРЕДСТВ ДИАГНОСТИКИ И СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ АНАПЛАЗМОЗА РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 A61K39/02 C12R1/01 

Изобретение относится к области биотехнологии. Новый эпизоотический штамм "Anaplasma ovis Kadom_1" может быть использован при производстве инактивированных иммунобиологических средств, предназначенных для диагностики и специфической профилактики инфекции рогатого скота, вызванной анаплазмами. Разработка может быть использована специалистами ветеринарных лабораторий и биофабрик. На основании изучения фенотипических и генотипических признаков штамм отнесен к порядку Rickettsiales семейству Anaplasmatacea роду Anaplasma.

Анаплазмоз - кровепаразитарное, трансмиссивное, сезонное, природно-очаговое заболевание, протекающее с признаками анемии, лихорадки и истощения, вызываемое альфапротеобактериями из рода Anaplasma.

Анаплазмы являются грамотрицательными, неподвижными облигатными внутриклеточными патогенами, переносимыми клещами и обнаруживаемыми исключительно в паразитофорных вакуолях в цитоплазме клетки-хозяина.

Возбудителем анаплазмоза овец является Anaplasma ovis, F. Lestoquard 1924. Они представляют собой круглые, размером 0,2-1,2 мкм включения в эритроцитах. В окрашенных мазках крови по Романовскому-Гимзе они представляют включения темно фиолетового или красного цвета на периферии эритроцитов, но иногда ближе к центру. Паразитемия составляет до 40-60%.

Возбудитель был впервые описан у овец в 1912 году в Зимбабве (Bevan, 1912) и широко распространен в Азии, Африке, Европе, Америке, Австралии, в Армении, Грузии, Азербайджане, Молдавии, Таджикистане, Узбекистане, Казахстане, Туркмении, Украине, Белоруссии и Российской Федерации [Лощинин М.Н. Молекулярно-генетическая и серологическая диагностика анаплазмоза овец. Ветеринария №9, 2022 С. 40-44. DOI: 10.30896/0042-4846.2022.25.9.40-44; Han R, Yang J, Liu Z, Gao S, Niu Q, Hassan MA, Luo J, Yin H. Characterization of Anaplasma ovis strains using the major surface protein la repeat sequences. Parasit Vectors. 2017 Sep 29; 10(1): 447. doi: 10.1186/s13071-017-2363-6. PMID: 28962625; PMCID: РМС5622584]. К возбудителю анаплазмоза овец восприимчивы козы, архары, муфлоны, сайгаки, козероги.

Уровень техники

Известен Штамм "Anaplasma speciosus Omsk" нового генотипа рода Anaplasma (коллекция Всероссийского музея риккетсиозных культур ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, регистрационный №138), используемый для идентификации анаплазм и получения диагностических препаратов. Патент № RU 2393211 Рудаков Николай Викторович (RU), Кумпан Людмила Валерьевна (RU), Самойленко Ирина Евгеньевна (RU), Бейсембаев Канатжан Каиргельдинович (RU), Красиков Александр Пантелеевич (RU) Штамм анаплазм "Anaplasma speciosus Omsk" нового генотипа, используемый для идентификации анаплазм и получения диагностических препаратов.

Технической проблемой является необходимость расширения арсенала штаммов, предназначенных для производства и контроля средств диагностики и специфической профилактики анаплазмоза рогатого скота.

Раскрытие сущности изобретения

Технический результат - расширение арсенала штаммов, предназначенных для производства и контроля средств диагностики и специфической профилактики анаплазмоза рогатого скота.

Новый эпизоотический штамм "Anaplasma ovis Kadom_1" депонирован в ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН, под номером №В-1329

- родовое и видовое название штамма (на латинском языке):

порядок Rickettsiales, семейство Anaplasmatacea, род Anaplasma, вид Anaplasma ovis.

- происхождение (источник выделения, родословная):

Штамм "Anaplasma ovis Kadom_1" выделен в 2021 году от барана с клиническими проявлениями анаплазмоза в Кадомском районе Рязанской области.

- генно - и хемотаксономическая характеристика:

Изолированный штамм относят к роду Anaplasma, новому генотипу "Anaplasma ovis Kadom_1". Получена последовательность нуклеотидов гена msp-4 длиной 613 п.о. (номер в GenBank Anaplasma ОР557971)

- морфологическая, физиологическая (в том числе культуральная) характеристика:

Типична для анаплазм В, окрашенных по Романовскому-Гимзе, мазках из периферической крови от больного животного анаплазмы обнаруживаются в виде одного-двух в одном эритроците розовато-фиолетовых точкоподобных включений округлой или овальной формы. Расположение в эритроците преимущественно периферическое, иногда эксцентричное. Грамотрицательны.

- биотехнологическая характеристика (условия культивирования; название и свойства полезного вещества, продуцируемого штаммом; уровень активности (продуктивности):

Не культивируется на питательных средах. Штамм поддерживается в стерильной дефибрированной крови овец в течение 4 недель при 36°С.

- вирулентность, антигенная структура, серологические свойства (для штаммов микроорганизмов медицинского и ветеринарного назначения):

гибель мышей при внутрибрюшинном заражении штаммом "Anaplasma ovis Kadom_1" в дозе 5×10⁷ анаплазм/ животное и объеме 0,5 мл не наступает.

Штамм вызывает клинические проявления анаплазмоза у овец и коз, зараженных в дозе содержащей 5×10⁷ анаплазм/животное из расчета 1 мл на 1 кг живого веса. Для заражения используются животные после спленэктомии. У не спленэктомированных животных заболевание проявляется в виде носительства с низким уровнем паразитемии.

Морфологические признаки. Типичны для анаплазм. В окрашенных по Романовскому - Гимзе мазках из периферической крови от больного животного анаплазмы обнаруживаются в виде одного-двух в одном эритроците розовато-фиолетовых точкоподобных включений округлой или овальной формы. Расположение в эритроците преимущественно периферическое, иногда эксцентричное. Грамотрицательны.

Антигенные свойства. Антигенные детерминанты выявляются в реакции связывания комплемента и реакции непрямой гемагглютинации с гомологичной кроличьей иммунной сывороткой к штамму.

Вирулентные свойства. Вызывает клинические проявления анаплазмоза у овец и коз, зараженных штаммом в дозе содержащей 5×10⁷ анаплазм/животное из расчета 1 мл на 1 кг живого веса. Для заражения используются животные после спленэктомии.

Генотипические характеристики. Получена последовательность нуклеотидов гена msp-4 длиной 613 п.о. (номер в GenBank Anaplasma ОР557971):

При идентификации в Genbank приведенная последовательность нуклеотидов является уникальной. На основании филогенетических данных штамм "Anaplasma ovis Kadom_1" является наиболее близким к Anaplasma marginale и Anaplasma centrale (степень гомологии 99,7%). На основании морфологических, антигенных и генетических признаков изолированный эпизоотический штамм "Anaplasma ovis Kadom_1" относят к роду Anaplasma.

Осуществление изобретения

Приведенные ниже примеры являются иллюстративными и тем самым не ограничивают рамки настоящего изобретения.

Пример 1. Авторский штамм микроорганизма "Anaplasma ovis Kadom_1".

1. Номер штамма во «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: В-1329.

2. Вид микроорганизма: Anaplasma ovis Lestoquard, 1924, Kadom_1.

3. Номер в других коллекциях: GenBank - Anaplasma ОР557971.

4. Основание для депонирования: штамм анаплазм для производства и контроля средств диагностики и специфической профилактики анаплазмоза рогатого скота.

5. Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов -возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности санитарных правил 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» бактериальные агенты вида Anaplasma ovis не относится ни к одной из четырех групп опасности.

6. Дата, источник и место выделения: из крови больного анаплазмозом барана в 2021 году в Кадомском районе Рязанской области.

7. Где идентифицирована культура: лаборатория вирусологии ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН.

8. Методы идентификации: микроскопия и определение нуклеотидной последовательности гена msp-4.

9. Морфологические признаки: круглые включения в эритроцитах, располагаются преимущественно на периферии, редко ближе к центру. Размер 0,2…1,2 мкм. В одном эритроците от одного до трех паразитов. Паразитемия составляет 20%.

10. Культуральные особенности: не культивируется на питательных средах.

11. Вирулентность для лабораторных животных: гибель мышей при внутрибрюшинном заражении штаммом "Anaplasma ovis Kadom_1" в дозе 5×10⁷ анаплазм/животное и объеме 0,5 мл не наступает.

Штамм вызывает клинические проявления анаплазмоза у овец и коз, зараженных в дозе содержащей 5×10⁷ анаплазм/животное из расчета 1 мл на 1 кг живого веса. Для заражения используются животные после спленэктомии. У не спленэктомированных животных заболевание проявляется в виде носительства с низким уровнем паразитемии.

12. Условия хранения: в виде замороженной в криопротективной среде цельной крови в ампулах. Хранение в жидком азоте.

13. Организация-депозитор: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный научный центр - всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук», (ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН). Адрес: 109428, г. Москва, Рязанский проспект, д. 24, корпус 1, Тел./факс (495) 970-03-69. E-mail: admin@viev.ru

14. Авторы: Алексеенкова Светлана Валерьевна, Мальцева Ольга Евгеньевна, Журавлева Евгения Анатольевна, Лощинин Максим Николаевич, Гулюкин Алексей Михайлович.

Пример 2. Идентификация на основании генотипических признаков.

ДНК выделяли из крови мелкого рогатого скота на спин-колонках с компонентами коммерческого набора «K-Сорб» (ЗАО «Синтол») по протоколу фирмы-изготовителя. Количество и чистоту выделенной ДНК определяли на спектрофотометре. Для исследования отбирали ДНК с чистотой 1,8…1,9 по соотношению А260/А280 в количестве 500 нг.

Реакцию амплификации для выявления полноразмерной копии гена msp-4 Anaplasma ovis проводили по методу, предложенному A. Torina. et al. 2010. Фрагмент msp-4 амплифицировали с олигонуклеотидами-праймерами 5'-GGGAGCTCCTATGAATTACAGAGAATTGTTTAC-3' и 5'-CCGGATCCTTAGCTGAACAGGAATCTTGC-3' в конечном объеме реакционной смеси 35 мкл, которая включала 3,5 мкл 10-кратного стандартного реакционного буфера, 7 мкл 5-кратного раствора энхансера, 0,7 мкл смеси 10 мМ dNTP (200 мкМ конечная концентрация каждого dNTP), 1,6 мкл каждого праймера в концентрации 10 мкМ (0,46 мкМ конечная концентрация каждого праймера) и 0,175 мкл Taq-полимеразы в концентрации 5 ЕД/мкл (конечная концентрация 0,025 ЕД/мкл). Алгоритм ПЦР состоял из начальной стадии денатурации в течение 1 мин при 94°С, за которой следовали 35 циклов денатурации в течение 30 с при 94°С, отжиг в течение 30 с при 60°С и элонгация в течение 1 мин при 68°С. Продукт амплификации длиной 870 п.о. анализировали с помощью электрофореза в 1,5%-м агарозном геле, содержащем бромид этидия в концентрации 0,5 мкг/мл. Результаты учитывали на среднечастотном трансиллюминаторе в ультрафиолетовом свете с длиной волны 312 нм [Torina, A., R.С. Galindo, J. Vicente, V. Di Marco, M. Russo, V. Aronica, M. Fiasconaro, S. Scimeca, A. Alongi, S. Caracappa, K.M. Kocan, C. Gortazar, and J. de la Fuente, 2010: Characterization of Anaplasma phagocytophilum and A. ovis infection in a naturally infected sheep flock with poor health condition. Trop. Anim. Health Prod. 42, 1327-1331].

Пример 3. Изготовление высокоактивного анаплазменного антигена после заражения мелкого рогатого скота. Получение гипериммунной сыворотки.

Для изготовления анаплазменного антигена применяемого в серологических реакциях используют кровь от больных животных. После разрушения эритроцитов выделяется бактериальная масса анаплазм с последующей дезинтеграцией. В качестве животных для спленэктомии были выбраны козы, как наиболее реактогенные с целью наработки препаративных количеств целевых бактерий. На второй день после спленэктомии вводили кровь от барана донора, содержащей 5×10⁷ анаплазм/животное из расчета 1 мл на 1 кг живого веса. За животными вели ежедневные наблюдения. Спленэктомированных животных заражали в течение первой недели после операции, так как через три недели уровень паразитемии будет низким за счет роста добавочных селезенок. Через 15 дней после спленэктомии на высоте паразитемии (50-60%) коз обескровили. Активность анаплазменного антигена устанавливали в РСК с положительными и отрицательными сыворотками.

Ранее исследователями было установлено, что чем выше паразитемия, тем активнее анаплазменный антиген. Максимальный уровень паразитемии при такой дозе анаплазм составил 50-60% к 10-15 дню после заражения (Таб. 1). Благодаря усовершенствованной схеме приготовления антигена, которая включает этапы дезинтеграции и концентрации даже при низком уровне паразитемии 20-30% удалось изготовить антиген в рабочих титрах. Более высокие рабочие титры антигенов 1:128-1:256 в РСК можно получить при среднем уровне паразитемии 50-60% к 10-15 дню после заражения коз. Этот метод имеет преимущества перед предложенной ранее методикой получения антигена, при которой получали титры 1:32-1:64 при высокой паразитемии 65-90%.

В качестве антигена для гипериммунизации используют культуру штамма "Anaplasma ovis Kadom_1", полученную из крови зараженного козла. По усовершенствованной нами методике кровь смешивали в 20-и кратном объеме физиологического раствора (рН 6,8-7,2) без предварительного отделения плазмы крови от эритроцитов. Для максимального выхода анаплазм из клеток применяют метод попеременного замораживания (при температуре -10°С) и размораживания при комнатной температуре. Затем центрифугировали при 25 тыс об/мин на рефрижераторной центрифуге Thermo scientific Sorval Evolution RC, ротор SA 300 в течение 30 минут.

В рекомендациях от 1984 г предлагается центрифугировать при 5500-6000 об/мин, а затем разбивать с бусами, что является недостаточным для высвобождения бактерий.

Полученную массу трехкратно подвергали обработке ультрозвуковым дезинтегратором по 10 мин с пульсацией 5 сек. Затем полученную бактериальную массу трехкратно фильтровали и концентрировали на ПЭГ 40 тыс в мешке с размером пор 12 кД. Антиген доводили до концентрации 10×10⁹ микробных тел в 1 мл по ОСО мутности ФГБУ «НЦЭСМП».

С целью получения специфической анаплазменной сыворотки для РСК проводили гипериммунизацию кролика массой 5,3 кг, в возрасте 6 месяцев породы хеколь по схеме, приведенной в таблице 2.

Титры антител учитывали на 7, 14, 22 и 30 сутки после введения антигена. Иммунизация проводилась 36 дней, использовали 9 см³ антигена, животному ввели 3500 мкг/см³ белка на животное. Полученные данные показали, что титры антител после пятой иммунизации были 1:20. После шестой иммунизации проводили тотальное обескровливание. Полученную из крови сыворотку консервировали 1-2% перекристаллизованной борной кислотой, а затем лиофильно высушивали.

Пример 4. Криоконсервация производственного штамма "Anaplasma ovis Kadom_1"

При замораживании инвазированной крови штаммом "Anaplasma ovis Kadom_1" в качестве криозащитного вещества использовали DMSO, в объеме конечной концентрации в материале 10%.

Полученную смесь расфасовывали по 10,0 мл в криопробирки вручную с использованием автоматических дозаторов. Фасовку проводили в ламинарном потоке стерильного воздуха с соблюдением правил асептики. Емкость с расплодкой перед розливом обтирали салфеткой, смоченной 2%-ным раствором хлорамина. Перед розливом и в его процессе фасуемый материал периодически перемешивался.

Использовали трехступенчатый режим замораживания, при котором скорость охлаждения материала от плюс 20°С до минус 20°С составляла один градус в минуту, в диапазоне температур от минус 20 до минус 40° - полтора градуса в минуту и четыре градуса в минуту при дальнейшем охлаждении материала до минус 70°С.

Криопробирки после фасовки помещали в термос с этиловым спиртом. Для контроля скорости снижения температуры в спирт опускали термометр, а затем подбрасывали маленькие кусочки сухого льда с такой частотой, чтобы температура спирта равномерно понижалась с заданной скоростью. Затем криопробирки распределялись на специальные металлические кассеты, которые помещали в морозильные камеры с температурой не выше минус 70°С. Охлажденные до минус 70°С пробирки с материалом помещали на хранение в сосуд Дьюара с жидким азотом при - 196°С в специальных кассетах.

Оттаивание замороженного материала проводили быстро. Для этого криопробирки прямо из сосуда Дьюара помещали в водяную баню, где поддерживали температуру 38-39°С.

Пример 5. Контроль внешнего вида, цвета, наличия посторонних примесей, полученной расплодки производственного штамма "Anaplasma ovis Kadom_1".

Внешний вид, цвет, наличие посторонней примеси, плесени, следов оттаивания, трещин, правильность маркировки определяли визуально по каждой пробирке всей серии штамма. Все несоответствующие по данному параметру пробирки подвергались выбраковке методом автоклавирования.

Пример 6. Использование анаплазменного антигена и специфической сыворотки в реакции связывания комплемента.

Полученные антигены титровали в РСК в разведениях от 1:4 до 1:256. Изготовленный антиген был испытан на специфичность и чувствительность с сыворотками крови от больных овец, коз, крупного рогатого скота и зараженных кроликов, а также с сыворотками от здоровых животных.

Активность позитивной сыворотки устанавливают в РСК с использованием контрольной (стандартной) серии анаплазменного антигена.

Для проверки активности позитивную сыворотку разводят физиологическим раствором 1:5 и инактивируют при 60-62°С в течение 30 мин. Остальные компоненты, участвующие в реакции связывания комплемента (антиген анаплазменный, комплемент, гемосистема, позитивная и негативная сыворотки), берут в рабочих дозах.

Титром позитивной сыворотки называется наибольшее ее разведение, вызывающее полную задержку гемолиза эритроцитов барана в РСК при рабочем разведении антигена.

Сыворотку выпускают с титром 1:20 и выше.

Примерный результат испытания анаплазменного антигена и позитивной сыворотки на специфичность, активность, антикомплементарность, определение титров, гемотоксичность приведены в таблице 3.

Для проведения реакции связывания комплемента используются положительные, отрицательные и испытуемые сыворотки, специфический анаплазменный антиген, комплемент и гемолизин после титрования. Испытуемые сыворотки исследуют в разведении 1:5 (доза сыворотки 0,04 см³+0,16 см³ физиологического раствора) и 1:10 (доза сыворотки 0,02 см³+0,18 см³ физиологического раствора) со специфическим антигеном и 1:5 без антигена с физиологическим раствором (на антикомплементарность).

Испытуемые и контрольные сыворотки инактивируют в день постановки реакции в разведенном виде при 60-62°С в течение 30 мин.

Оба этапа реакции проводят в водяной бане или в термостате микрометодом при 37-38°С, бактериолитическую систему выдерживают 30 мин., второй этап реакции (с гемолитической системой) - 20 мин или 30 мин микрометодом.

Используют следующие контроли главного опыта РСК:

- позитивная и негативная сыворотка в разведении 1:5 без антигена; в разведении 1:5 и 1:10 со специфическим антигеном;

- антиген специфический в двойной дозе - на антйкомплементарность (комплемент+) и на гемотоксичность (комплемент -);

- гемолитическая система на гемотоксичность.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Anaplasma ovis Lestoquard, 1924, Kadom_1, вызывающий клинические проявления анаплазмоза у овец и коз, депонирован в ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН под номером В-1329. Изобретение обеспечивает расширение арсенала штаммов для производства инактивированных иммунобиологических средств, предназначенных для специфической профилактики и диагностики инфекции рогатого скота, вызванной анаплазмами. 3 табл., 6 пр.

Штамм Anaplasma ovis Lestoquard, 1924, Kadom_1 депонирован в ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН под номером В-1329 для производства инактивированных иммунобиологических средств, предназначенных для специфической профилактики и диагностики инфекции рогатого скота, вызванной анаплазмами.