СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА) ПРИ АНАПЛАЗМОЗЕ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2009 года по МПК A61K39/02 

Способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) относится к методам лабораторной диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота и может быть использован в ветеринарной медицине.

Известен способ получения эритроцитарного диагностикума, ранее используемый для диагностики микоплазмоза свиней в РНГА (Андросик, Н.Н. // Ветеринария, 2000 №3).

Но данный способ имеет недостатки: трудоемкий метод фиксации эритроцитов, проводится танизация, неэкономичные и сложные методы сенсибилизации эритроцитов сенситином.

Наиболее близким к заявляемому способу является бруцеллезный эритроцитарный диагностикум (Красиков, А.П. Новые механизмы исскуственной регуляции паразитохозяинных отношений: дис. доктора вет. наук.: 16.00.03./А.П.Красиков; - Новосибирск - 1996. - С.97-101), который готовится по следующей схеме:

В качестве клеточной основы для приготовления диагностикума применяются эритроциты барана. При формалинизации эритроцитов используется свежая дефибринированная кровь барана - донора, которую разводят 1:1 буферным физиологическим раствором рН - 7,2 (0,137 М хлористый натрий и 0,001 М двузамещенный фосфорнокислый калий на 1 литр дистиллированной воды).

Фиксацию эритроцитов проводят по методу Фили в модификации Красикова А.П., которая заключается в более щадящем способе воздействия раствора формальдегида на эритроциты и одновременно обеспечивающая хорошую их фиксацию. Для чего к 100 мл разведенной крови раствор формальдегида добавлялся не сразу, а порциями в возрастающих объемах, через определенный промежуток времени.

Так, к 100 мл 50% взвеси эритроцитов барана добавляют 20%-й раствор формальдегида порциями в возрастающих объемах, через каждые 15 мин: 6, 7, 8, 9 и 10 мл. После каждого внесения смесь перемешивают на водяной бане при 70°С до получения темно-коричневого цвета. Взвесь эритроцитов 4-кратно отмывают фосфатно-буферным раствором рН - 7,2 путем центрифугирования при 3 тыс.об/мин 2-5 мин и ресуспендируют в 400 мл того же буфера. Из осадка готовят 10% рабочую взвесь на буферном физиологическом растворе, содержащем 0,3% двадцати процентного раствора формальдегида. При данном способе фиксации эритроциты сохраняют свои сорбционные свойства в течение 5 лет.

Второй этап приготовления эритроцитарного диагностикума - получение антигена, который обладает способностью адсорбироваться на эритроцитах. С этой целью используется глубокодиссоциированный вакцинный штамм В. abortus 16/4. Антиген готовят по методике ВНИИБТЖ - ИЭВСиДВ. Для этого девитализированную бактериальную массу центрифугируют при 3 тыс.об/мин в течение 20-30 мин, надосадочную жидкость сливают, а на сырую бактериальную массу воздействуют расплавленным концентрированным фенолом (ХЧ) в соотношении 1:1.

Бактериальную массу с фенолом выдерживают 30-40 мин при Т 80-85°С на водяной бане. Затем добавляют дистиллированную воду, нагретую до 70°С, в таком количестве, чтобы остаточная концентрация фенола в растворе составила 5%. После фильтрации смеси проводят ее диализ при комнатной температуре в целлофановых мешочках против десяти объемов дистиллированной воды в течение 48 часов. Диализат используют в качестве антигена.

Танизацию эритроцитов исключают из цикла приготовления эритроцитарного диагностикума в связи с низким содержанием белка в полученном антигене.

Для нагрузки формалинизированных эритроцитов бруцеллезный антиген разводят 1:10 буферным раствором с рН 6,4. Данной дозой антигена сенсибилизируют эритроциты в соотношении 2:1 (2 объема антигена, 1 объем эритроцитов). Сенсибилизация проводится на водяной бане при температуре 70°С, в течение 30 мин при перемешивании взвеси через каждые 5 мин. За 10 мин до конца сенсибилизации для закрепления сенситина на эритроцитах добавляют 1% сорока процентного раствора формальдегида. Полученный эритроцитарный диагностикум трехкратно отмывают буферным раствором с рН - 7,2 с добавлением отрицательной на бруцеллез нормальной кроличьей сыворотки в соотношении 1:250 путем центрифугирования при 3 тыс. об/мин в течение 5 мин и доводят тем же буфером до 3%-й концентрации эритроцитов с добавлением 1% формальдегида с целью закрепления антигена на эритроцитах.

Целью нашего изобретения является получение анаплазмозного эритроцитарного диагностикума (АЭД) для выявления антител в сыворотке крови крупного рогатого скота в РИГА.

Поставленная цель достигается: дробной формалинизацией эритроцитов барана, получением антигена из Anaplasma sp.Omsk, сенсибилизацией формалинизированных эритроцитов барана, без предварительной танизации анаплазмозным антигеном, при 70°С в течение 30 мин., с последующим трехкратным отмыванием эритроцитарного диагностикума буферным раствором с рН -7,2 без добавления нормальной кроличьей сыворотки.

Описание метода

При формалинизации эритроцитов используют свежую дефибринированную кровь барана-донора, которую разводят 1:1 буферным физиологическим раствором РН - 7,2 (0,137 М NaCl и 0,001 М двузамещенный фосфорно-кислый калий на 1 л дистиллированной воды). Фиксацию эритроцитов проводят по методу Фили в модификации Красикова А.П. Для этого к 100 мл 50%-й взвеси эритроцитов барана добавляют 20%-й раствор формальдегида порциями в возрастающих объемах, через каждые 15 мин: 6, 7, 8, 9 и 10 мл. После каждого внесения смесь перемешивают на водяной бане при 70°С до получения темно-коричневого цвета. Взвесь эритроцитов 4-кратно отмывают фосфатно-буферным раствором РН - 7,2 путем центрифугирования при 3 тыс. об/мин в течение 2-5 мин и ресуспензируют в 400 мл того же буфера. Из осадка готовят 10%-ю рабочую взвесь на буферном физиологическом растворе, содержащем 0,3% двадцатипроцентного раствора формальдегида. При данном способе фиксации эритроциты сохраняют свои сорбционные свойства в течение 5 лет.

В качестве сенситина используется корпускулярный антиген Anaplasma sp.Omsk (штамм анаплазм «Омск/2004» депонирован во Всероссийском музее риккетсиозных культур НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН под инвентарным №138 от 19.09.2005).

Для этого выращивали культуру клеток Vera в стеклянных флаконах в концентрации 150 тыс. на 1 мл. В качестве питательной среды использовали среду Игла MEM с двойным набором аминокислот, с добавлением 10%-й эмбриональной сыворотки и антибиотиков (пенициллин в дозе 1 млн ед. и стрептомицин в дозе 500 тыс ед. на 1 мл). На следующие сутки после образования монослоя проводили замену среды роста на среду поддержки (Игла MEM с добавлением 1%-й эмбриональной сыворотки). Подготовленные флаконы заражали суспензией анаплазм, полученной из селезенки, в дозе 0,5 мл на флакон. Флаконы с зараженными клетками Vero центрифугировали при 800 об/мин при температуре 22°С в течение 1 часа, после центрифугирования среду меняли на свежую среду поддержки. Флаконы помещали при анаэробных условиях и 36°С на 8 суток. После завершения инкубации все флаконы промораживали при -20°С в течение 30 мин, а затем оттаивали при +18°С. После оттаивания клеточную взвесь центрифугировали при 3 тыс. об/мин в течение 15 мин и для дальнейшей работы отбирали супернатант. Для накопления антигенной биомассы анаплазмы пассировались до 8 раз.

Для выделения анаплазм из клеток использовали указанный выше способ попеременного замораживания, и размораживания, и центрифугирования клеточной взвеси. Для дальнейшей работы использовали супернатант, который дополнительно центрифугировали при 6 тыс.об/мин в течение часа. Полученный осадок трижды отмывали стерильным физиологическим раствором, центрифугируя в том же режиме, и доводили этим же раствором до концентрации 1:1. Для нагрузки формалинизированных 2,5-3% эритроцитов делали различные разведения (1:1, 1:2, 1:4, 1:8) инактивированного при 70°С - 30 мин антигена на буферном физ. растворе рН - 6,4. Данными дозами антигена сенсибилизировали эритроциты в соотношении 2:1 (2 обьема антигена : 1 обьем эритроцитов). При этом сенсибилизацию проводили на водяной бане при +70°С в течение 30 мин, при перемешивании взвеси через каждые 5 мин. За 10 мин до конца сенсибилизации для закрепления антигена на эритроцитах добавляли 1% формальдегида.

Эритроциты, нагруженные антигеном, трехкратно отмывают от несвязавшихся сенситинов фосфатно-буферным солевым раствором с рН - 7,2 путем центрифугирования при 3 тыс. об/мин, ресуспендируют в этом же растворе, доводя до первоначальной 3%-й концентрации, и используют для постановки РИГА макрометодом в объеме 0,5 мл на полистироловых планшетах.

Испытуемые сыворотки после освобождения от неспецифических гемагглютининов путем инактивации в течение 20 мин при 56°С разводят в двукратной последовательности фосфатно-буферным раствором (рН - 6,4), начиная с 1:10. К каждому разведению добавляют по одной капле (0,05 мл) эритроцитарного диагностикума, тщательно перемешивают встряхиванием и оставляют при комнатной температуре на 1,5-2 часа. Реакция оценивается по четырехкрестной системе. Конечным титром считают последнее разведение сыворотки, дающее гемагглютинацию на три креста. Для определения активности полученного эритроцитарного диагностикума проводили постановку РНГА. Реакцию ставили макрометодом, в обьеме 0,5 мл в полистироловых пластинках положительную анаплазмозную сыворотку разводили с 1:10 до 1:160. В качестве разбавителя применяли фосфатный буфер рН - 6,4.

Контроль на специфичность и активность АЭД в РНГА

Для контроля специфичности полученных серий анаплазмозных эритроцитарных диагностикумов ставят РНГА с гетерологичными сыворотками. АЭД в РНГА не вызывает перекрестных реакций с бруцеллезной, лептоспирозной, листериозной и хламидиозной гетерологичными сыворотками, во всех разведениях РНГА отрицательная при четко выраженной положительной реакции с гомологичной анаплазмозной сывороткой.

Поэтому за диагностический (патологический) титр принимается разведение сыворотки 1:10 и выше (табл.1).

Таблица 1 Активность и специфичность эритроцитарного анаплазмозного диагностикума Разведение анаплазмозной сыворотки Разведение эритроцитарного диагностикума 1:1 1:2 1:4 1:8 1:10 - - ++++ + 1:20 - - +++ + 1:40 - - ++ + 1:80 - - ++ - 1:160 - - - - Разведение эритроцитарного диагностикума Стандартные диагностические сыворотки (1:10). бруцеллезная лептоспирозная листериозная хламидиозная 1:4 - - - -

Наиболее показательным является эритроцитарный диагностикум, сенсибилизированный анаплазмозным антигеном в разведении 1:4, который выявлял антитела в сыворотке кролика в титре 1:20 на +++. При этом полученный диагностикум обладал высокой специфичностью и не давал перекрестных реакций с лептоспирозной, листериозной и хламидиозной стандартными диагностическими сыворотками животных.

Определены специфичность и активность трех серий АЭД в РНГА (табл.2).

Преимущество данного эритроцитарного диагностикума в специфичности и активности в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) при анаплазмозе крупного рогатого скота.

Контроль на специфичность АЭД в РНГА

Для контроля специфичности полученных серий анаплазмозных эритроцитарных диагностикумов ставят РНГА с гетерологичными сыворотками. АЭД в РНГА не вызывает перекрестных реакций с бруцеллезной, лептоспирозной, листериозной и хламидиозной гетерологичными сыворотками, во всех разведениях РНГА отрицательная при четко выраженной положительной реакции с гомологичной анаплазмозной сывороткой. Поэтому за диагностический (патологический) титр принимается разведение сыворотки 1:10 и выше (табл.2).

Контроль на активность АЭД в РНГА

Для контроля активности полученного эритроцитарного диагностикума проводят постановку РНГА. Реакцию ставят макрометодом, в объеме 0,5 мл в полистироловых пластинках с анаплазмозными сыворотками в разведениях с 1:10 до 1:640. В качестве разбавителя применяют фосфатный буфер с рН - 6,4, так как при разведении исследуемой сыворотки этим буфером результаты реакции более демонстративны, чем при применении физиологического раствора. В качестве контроля используют фосфатный буферный раствор (ФБР) рН - 6,4 и заведомо отрицательные и положительные на анаплазмоз сыворотки крупного рогатого скота в разведениях 1:25-1:1600 и кроликов в разведениях 1:10-1:640.

С анаплазмозными кроличьими сыворотками различной активности полученный диагностикум реагирует на три креста до разведения 1:160, на два креста 1:320, а с анаплазмозной сывороткой крупного рогатого скота (крс) до разведении 1:400 и 1:800 соответственно. В контроле с отрицательными (кроличьей и крс) сыворотками и с буферным раствором отмечается четко выраженная отрицательная реакция (табл.3).

Таблица 3 Активность (АЭД) в РНГА Анаплазмозные кроличьи сыворотки Негативная сыв-ка кролика Анаплазмозная сыворотка крупного рогатого скота Негативная сыв-ка крс ФБР титр сыв-ки а б в титр сыв-ки г 1:10 ++++ ++++ ++++ - 1:50 ++++ - - 1:20 +++ ++++ ++++ - 1:100 ++++ - - 1:40 +++ ++++ ++++ - 1:200 ++++ - - 1:80 ++ +++ +++ - 1:400 +++ - - 1:160 - +++ ++ - 1:800 ++ - - 1:320 - ++ + - 1:1600 + - - 1:640 - - - - 1:3200 - - - Примечание: а, б, в, г - сыворотки различной активности, ФБР - фосфатный буферный раствор рН - 6,4

Способ относится к методам лабораторной диагностики анаплазмоза и может быть использован в ветеринарной медицине. Способ состоит из дробной формалинизации эритроцитов барана и сенсибилизации их антигеном при 70°С в течение 30 минут. При этом в качестве антигена используют антиген, полученный путем культивирования культуры Anaplasma sp.Omsk на клетках Vero и питательной среде поддержки роста Игла MEM с добавлением эмбриональной сыворотки, аминокислот и антибиотиков, извлечения после восьмисуточной инкубации путем попеременного замораживания и оттаивания, прогревания на водяной бане при 70°С в течение 30 минут и трехкратного отмывания без добавления к нему на последнем этапе приготовления 0,4% нормальной кроличьей сыворотки. Полученный диагностикум обладает высокой специфичностью и активностью в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) при анаплазмозе крупного рогатого скота. 3 табл.

Способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) при анаплазмозе крупного рогатого скота, состоящий из дробной формалинизации эритроцитов барана и сенсибилизации их антигеном при 70°С в течение 30 мин, отличающийся тем, что в качестве антигена используют антиген, полученный путем культивирования культуры Anaplasma sp.Omsk на клетках Vero и питательной среде поддержки роста Игла MEM с добавлением эмбриональной сыворотки, аминокислот и антибиотиков, извлечения после восьмисуточной инкубации путем попеременного замораживания и оттаивания, прогревания на водяной бане при 70°С в течение 30 мин и трехкратного отмывания без добавления к нему на последнем этапе приготовления 0,4% нормальной кроличьей сыворотки.