Способ определения индивидуального генетического риска развития ишемического инсульта Российский патент 2017 года по МПК C12N15/00 C12Q1/68 

Изобретение относится к молекулярной биологии и медицине, а именно к способам выявления и идентификации наиболее перспективных полиморфизмов генов, определяющих повышенный риск развития ишемического инсульта (РР ИИ).

Заболеваемость инсультом остается одной из наиболее значимых медицинских и социальных проблем не только в Российской Федерации, но и во многих других экономически развитых странах. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), в большинстве стран мира ежегодно регистрируется 100-300 случаев инсульта на 100000 населения. В Российской Федерации этот показатель оценивается в 350-400 случаев инсульта в год на 100000 населения. Летальность при инсульте довольно высока: из 100 больных в остром периоде инсульта умирают 35-40 человек, к концу года общее число умерших достигает 50. Первичный инсульт составляет в среднем 75%, повторный - около 25% от всех случаев инсульта. Инсульт нередко оставляет после себя тяжелые последствия в виде двигательных, речевых и иных нарушений. По данным регистра инсульта Научного центра неврологии РАМН (г. Москва), среди выживших больных двигательные нарушения наблюдаются к концу острого периода инсульта у 85%, к концу первого года - у 70%, речевые нарушения (афазия) к концу острого периода - у 36%, к концу первого года - у 18% больных.

В настоящее время очевидно, что различные факторы предрасположенности определяют риск развития инсульта не в равной степени. Концепция гетерогенных причин инсульта предполагает деление его на типы и подтипы. Так, геморрагический инсульт встречается в 20% случаев инсульта, в том числе гематома мозга - в 15%, субарахноидальное кровоизлияние - в 5%; ишемический инсульт - в 80% [Верещагин Н.В., 2004].

Индивидуализация профилактики инсульта обладает несомненными преимуществами. Несмотря на огромное число доказательств клинической значимости факторов риска развития инсульта, их своевременная коррекция проводится далеко не в полном объеме. Основанное на свидетельствах доказательной медицины информирование пациента о том, что его личный риск развития инсульта превышает средний популяционный риск, в том числе и в связи с наличием объективных генетических факторов предрасположенности, должно усилить его приверженность профилактическим и лечебным мероприятиям.

В настоящий момент представляется несомненным, что в риск развития инсульта существенный вклад вносит генетическая предрасположенность пациента. Если рассматривать предрасположенность к инсульту как фенотип, следует допустить, что он складывается в результате сложной сети взаимодействий генетических и негенетических факторов [Ковалева и др., 2013; Титов и др. 2012].

На элементарном уровне каждый фактор предполагается независимым и характеризуется своим собственным показателем риска, который в первом приближении можно оценить по величине отношения шансов (ОШ). В случае генетического фактора это будет соответственно ОШ инсульта в группе носителей минорного аллеля (риска или протективного) и инсульта в группе носителей нормального (дикого) аллеля. При этом риск гомозигот и гетерозигот по мутантному аллелю может оцениваться по различным моделям: доминантной, рецессивной или кодоминантной (мультипликативной, аддитивной или более сложной). Можно надеяться, что чем больше факторов риска принято во внимание, тем надежнее оценка риска.

Из уровня техники известен способ генетической диагностики подверженности к сердечно-сосудистым заболеваниям (RU 2376372, C12N 15/00, 20.12.2009), основанный на определении генотипов по полиморфным вариантам А1166С гена AGTR1, А-240Т и A2350G гена АСЕ, С677Т гена MTHFR, T174M гена AGT, C825T гена GNB3, VNTR4a/b и G894T гена NOS3, G1691A гена F5, PLA1/A2 гена ITGB3, G20210A гена F2 и оценке риска путем суммирования количества баллов, присвоенных каждому генотипу. При этом генотипам «низкого» риска сердечно-сосудистой патологии присваивается 0 баллов, к ним относятся генотипы 1166АА гена AGTR1, -240АА, 2350АА гена АСЕ, 677СС гена MTHFR, 174TT гена AGT, 825CC гена GNB3, VNTR4bb и 894GG гена NOS3, 1691GG гена F5, PLA1/A1 гена ITGB3, 20210GG гена F2. Генотипам «среднего» риска присваивается 0,5 баллов, к ним относятся генотипы 1166АС гена AGTR1, -240АТ и 2350AG гена АСЕ, 677СТ гена MTHFR, 174TM гена AGT, 825CT гена GNB3, VNTR4ab и 894GT гена NOS3. Генотипам «высокого» риска присваивается 1 балл, к ним относятся генотипы 1166СС гена AGTR1, -240ТТ и 2350GG гена АСЕ, 677ТТ гена MTHFR, 174MM гена AGT, 825TT гена GNB3, VNTR4aa и 894GT гена NOS3, 1691GA и 1691АА гена F5, PLA1/A2 и PLA2/A2 гена ITGB3, 20210GA и 20210АА гена F2. Риск сердечно-сосудистых болезней считается «низким» при сумме баллов от 0 до 3, средним - от 3,5 до 6, высоким - от 6,5 до 11 баллов.

Патент RU 2422523 (27.06.2011, МПК C12N 15/00) описывает применение аллеля SNP41 гена PDE4D для прогнозирования индивидуальной предрасположенности к инсульту в русской популяции, применение молекулярно-генетического маркера индивидуальной предрасположенности к инсульту и способ прогнозирования индивидуальной предрасположенности к инсульту.

Патент RU 2453606 (20.06.2012; МПК C12Q 1/68, G01N 33/48) раскрывает способ расширенного скрининга предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям на основании обнаружения точечных нуклеотидных замен в генах человека, ответственных за предрасположенность и развитие сердечно-сосудистых заболеваний. Способ включает стадию выделения геномной ДНК из клинического образца, амплификацию участков генов АСЕ, АРОА4, АРОА5, АРОВ, EDN1, MEF2A, FGA, ADRB1, TNBS4, АРОЕ, FBN1, AGXT, MTHFR, CCR2, F5, F2, F7, АВСА1, ITGB3, AGTR2, B2R, DES, TLR4, NOS3, KDR, MMP9, THBS2, LPL, МРО, содержащих последовательности полиморфных локусов и получение одноцепочечного флюоресцентно меченого продукта методом ник-трансляции и рестрикции. Интерпретируют результаты гибридизации путем сравнения интенсивности флюоресцентных сигналов, полученных при совершенной и несовершенной гибридизации.

Существующие способы определения генетического риска развития сердечнососудистых заболеваний и, в частности, вышеописанные способы предполагают исследование лишь нескольких генетических маркеров (SNP). В настоящем изобретении впервые предлагается способ оценки генетического риска развития инсульта, основанный на 48 SNP, распределенных по шести группам в соответствии с их патофизиологической связью с инсультом или статистически значимой связи с определенным подтипом инсульта, выявленной в мета-анализе или GWAS-исследовании.

Задачей настоящего изобретения является создание принципиально нового более информативного способа оценки генетического риска развития инсульта, а также классификация SNP в соответствии с их патофизиологическим значением и создание алгоритма оценки и интерпретации индивидуального риска развития инсульта.

Технический результат изобретения заключается в повышение достоверности и информативности результатов оценки генетического риска развития инсульта.

Поставленная задача решается, а технический результат достигается тем, что способ определения генетического риска развития инсульта основывается на определении однонуклеотидных полиморфизмов и включает:

(а) выделение полногеномной ДНК обследуемого пациента;

(б) определение в образце ДНК аллелей однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), относящихся к следующим группам генов:

«Гемостаз» (Г-ИИ), - группа генов, имеющих отношение к гемостазу и тромбообразованию, включающая гены: F2 (rs1799963), F5 (rs6025), F7 (rs6046), F13A1 (rs5958), SERPINE1 (rs1799768), FGB (rs1800790), GP1BA (rs6065) и ITGB3 (rs5918),

«Липидный обмен» (ЛО-ИИ) - группа генов, имеющих отношение к метаболизму, включающая гены и локусы: АРОЕ (rs429358), APOE (rs7412), APOA5 (rs662799), LPA (rs10455872), LPL (rs328), MTHFR (rs1801133), PON1 (rs662) и 9р21.3 (rs2383207),

«Клеточные взаимодействия» (В-КЛ-ИИ), - группа генов, участвующих в межклеточном взаимодействиями, включающая гены: CELSR1 (rs6007897), ICAM1 (rs1799969), IL1B (rs1694), LTA (rs909253), LTC4S (rs730012), LTC4S (rs3776944) и SELE (rs5355),

«Инсульт-1» (ИИ-1), - группа SNP, которая является индикатором показателя отношения шансов заболеть инсультом, полученные при сопоставлении больных с кардиогенным эмболическим инсультом и лиц, без указаний на инсульт в анамнезе, включающая гены и локусы: CELSR1 (rs4044210), NOS3 (rs1799983), PDE4D (rs702553), 16q22.3 (rs7193343), 16q22.3 (rs12932445), 22ql2.3 (rs5998322), 6p21.1 (rs556512) и 4q25 (rs2200733),

«Инсульт-2» (ИИ-2) - группа SNP, которая является индикатором показателя отношения шансов заболеть инсультом, полученные при сопоставлении больных с атеротромботическим инсультом и лиц, без указаний на инсульт в анамнезе, включающая гены и локусы: LPL (rs328), AGTR1 (rs5186), HDAC9 (rs11984041), LPA (rs10455872), 9р21.3 (rs1537378), 6p21.1 (rs556621), 22ql2.3 (rs4479522) и 4q25 (rs1906591),

«Артериальная гипертензия» (АГ) - группа SNP, значимо ассоциированных с развитием артериальной гипертонии в виде одного из клинических факторов риска развития инсульта, включающая гены и локусы 12р12 (rs7961152), 12q23 (rs11110912), 13q21 (rs1937506), 15q26 (rs2398162), lq43 (rs2820037), 8q24 (rs6997709), FGF5 (rs16998073), MTHFR (rs17367504), NOS3 (rs3918226), CSK (rs1378942) и cl0orf107 (rs1530440);

(в) определение индивидуального генетического риска развития инсульта на основании анализа выявленных аллелей в тестируемых SNP, при котором:

(i) рассчитывают средний популяционного риск (APR) для каждого SNP по формуле

APR=F₁×OR₁+F₂×OR₂+F₃×OR₃,

где F₁ - частоты гомозигот по «дикому» аллелю,

F₂ - частоты гетерозигот,

F₃ - частоты гомозигот по мутантному аллелю,

OR₁ - показатель отношения шансов для гомозиготного генотипа по дикому аллелю, равный 1,

OR₂ - показатель отношения шансов для гетерозиготного генотипа,

OR₃ - показатель отношения шансов для гомозиготного генотипа по мутантному аллелю;

(ii) рассчитывают относительные риски (RR) по каждому SNP исходя из генотипа исследуемого пациента по следующим формулам:

для гомозиготного генотипа по дикому аллелю: RR=1/APR,

для гетерозиготного генотипа: RR=OR₂/APR,

для гомозиготного генотипа по мутантному аллелю RR=OR₃/APR;

(iii) рассчитывают обобщенные относительные риски (GRR), обусловленные комбинацией аллелей в генах, объединенных в упомянутые группы по формуле:

GRR_{комбинации}=RR¹×RR²×RR³…×RRⁱ,

где RR¹…RRⁱ - относительные риски по каждому SNP, включенному в соответствующую группу,

(г) оценка индивидуального генетического риска развития инсульта по каждой из упомянутых групп генов на основании значений обобщенных относительных рисков GRR_{комбинации}: при значении GRR_{комбинации}<1 риск является пониженным по отношению к среднему обобщенному относительному риску популяции и при значении GRR_{комбинации}>1 риск является повышенным по отношению к указанному среднему значению.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, исходя из полученных значений обобщенных относительных рисков GRR_{комбинации}, степень генетического риска по каждой из упомянутой групп генов относят к одной из категорий: «низкий риск», «пониженный риск», «средний риск», «повышенный риск» «высокий риск» и «очень высокий риск» следующим образом:

для группы Г-ИИ: при значении GRR_{комбинации} 0,43-0,76 устанавливают категорию «низкий риск», при 0,76-0,89 - «пониженный риск», при 0,89-1,02 - «средний риск», при 1,02-1,23 - «повышенный риск», при 1,23-1,55 - «высокий риск», при >1,55 - «очень высокий риск»;

для группы ЛО-ИИ: при значении GRR_{комбинации} 0,64-0,79 устанавливают категорию «низкий риск», при 0,79-0,85 - «пониженный риск», при 0,85-0,91 - «средний риск», при 0,91-1,15 - «повышенный риск», при 1,15-1,75 - «высокий риск», при >1,75 - «очень высокий риск»;

для группы В-КЛ-ИИ: при значении СКВ-комбинации 0,30-0,53 устанавливают категорию «низкий риск», при 0,53-0,66 - «пониженный риск», при 0,66-0,83 - «средний риск», при 0,83-1,16 - «повышенный риск», при 1,16-2,30 - «высокий риск», при >2,30 - «очень высокий риск»;

для группы ИИ-1: при значении GRR_{комбинации} в диапазоне 0,58-0,70 устанавливают категорию «низкий риск», при 0,70-0,78 - «пониженный риск», при 0,78-0,93 - «средний риск», при 0,93-1,22 - «повышенный риск», при 1,22-1,83 - «высокий риск», при >1,83 - «очень высокий риск»;

для группы ИИ-2: при значении GRR_{комбинации} 0,21-0,53 устанавливают категорию «низкий риск», при 0,53-0,77 - «пониженный риск», при 0,77-0,96 - «средний риск», при 0,96-1,34 - «повышенный риск», при 1,34-2,16 - «высокий риск», при >2,16 - «очень высокий риск»;

для группы АГ: при значении GRR_{комбинации} 0,18-0,65 устанавливают категорию «низкий риск», при 0,65-0,81 - «пониженный риск», при 0,81-0,99 - «средний риск», при 0,99-1,27 - «повышенный риск», при 1,27-1,84 - «высокий риск», при >1,84 - «очень высокий риск».

Также в предпочтительных вариантах осуществления изобретения оценка генетического риска производится на основании предполагаемого распределения значений GRR_{комбинации} по каждой из групп генов в соответствии с рассчитанными значениями обобщенных показателей генетически обусловленного риска путем разбиения области возможных значений GRR_{комбинации} на 5 диапазонов, по 20% персентилей: 1-й диапазон «низкого риска» - 20%; 2-й диапазон «пониженного риска» - 20%; 3-й диапазон «среднего риска» - 20%; 4-й диапазон «повышенного риска» - 20% и 5-й диапазон, включающий области «высокого риска» - 15% и «очень высокого риска» - 5%.

Также в предпочтительных вариантах осуществления изобретения:

- результаты оценки генетического риска представляют в виде лепестковой диаграммы в которой на шести осях, соответствующих упомянутым шести группам генов и образованных лучами, проведенными из центра правильного шестиугольника к его вершинам, откладывают шкалы значений GRR_{комбинации}; наносят линии, соединяющие точки на шкалах, соответствующие граничным значениям GRR_{комбинации} для каждой из упомянутых категорий риска в соответствующей группе, и формируют индивидуальный профиль генетической предрасположенности пациента путем нанесения на шкалы точек, соответствующих рассчитанным значениям GRR_{комбинации} для данного пациента и соединения этих точек линиями;

- полногеномную ДНК выделяют из клеток крови или буккального эпителия;

выявление наличия аллельных однонуклеотидных полиморфизмов осуществляют методом ПЦР в реальном времени или с помощью пиросеквенирования.

В отличие от аналогов в предлагаемом способе в качестве индикаторов генетического риска используется не несколько (5-10), а 48 SNP. При этом указанные SNP разделены по группам генов, отвечающие за определенные факторы, что позволяет оценивать риск развития инсульта отдельно по каждой группе генов. Указанные отличия позволяют повысить достоверность и информативность результатов оценки риска.

В предлагаемом способе рассматриваются комбинации из 48 генетических факторов риска. В связи с чем, на следующем уровне факторы риска объединены в группы на основании сходства их патофизиологической связи с инсультом (например, группу факторов, способствующих развитию тромбофилических состояний), или статистически значимой связи с определенным подтипом инсульта. Для каждой группы может быть вычислен некий обобщенный показатель риска. При этом абсолютная величина такого показателя не принципиальна. Важно отнесение конкретного индивидуума к лицам, характеризующимся повышенным или пониженным риском в сопоставлении с распределением показателя риска в популяции. На третьем уровне шесть обобщенных показателей риска формирует «статус предрасположенности к инсульту»: «низкого риска», «пониженного риска», «среднего риска», «повышенного риска», «высокого риска» и «очень высокого риска».

Результаты генетического обследования могут позволить уточнить и дополнительно обосновать лечебную или профилактическую тактику, выбранную с учетом всего комплекса применяемых инструментальных и лабораторных методик.

«Повышенный риск» по одной группе факторов риска является настораживающим обстоятельством и требует рассмотрения необходимости профилактических мероприятий с целью профилактики первичного инсульта и интенсификацию профилактических мероприятий при необходимости профилактики повторного инсульта. В первую очередь, внимания заслуживает «повышенный риск» по одной из трех наиболее информативных групп факторов: «Инсульт-1», «Инсульт-2» и «Клеточные взаимодействия». При выявлении «повышенного риска» по группам факторов «Липидный обмен», «Гемостаз» и «Артериальная гипертензия» профилактические мероприятия могут быть, в первую очередь, направлены на устранение ведущей причины риска.

«Высокий» и «очень высокий» риск по одной из групп факторов или «повышенный риск» по двум и более группам факторов являются прогностически неблагоприятными показателями.

«Высокий» и «очень высокий» риски по двум и более группам факторов статистически достоверно указывают на риск развития инсульта и, несомненно, требуют профилактических мероприятий с целью профилактики первичного инсульта и интенсификацию профилактических мероприятий при необходимости профилактики повторного инсульта.

Способ определения генетического риска развития инсульта основан на определении аллелей SNP, представленных в таблице (см. табл. 1). Для отбора SNP использовали данные GWAS-исследований [Bellenguez С., 2012; Gudbjartsson D.F., 2009; Holliday E.G., 2012; Newton-Cheh С., 2009; Salvi E., 2012; WTCCC, 2007]. В большинстве случаев отбор SNP и оценка связанных с ними ОШ для разработки предлагаемой комплексной методологии был проведен на основе результатов метаанализа [Bentley Р., 2010; Casas JP, 2004; Holmes M.V., 2011; Liu H., 2013; Pi Y., 2012; Tao Н.М., 2009; Wang С., 2011; Wang X., 2009; Xin X.Y., 2009; Ye F., 2012; Yoon D., 2011].

Таблица 1. SNP, используемые в способе определения генетического риска развития инсульта

Индивидуальный генетический риск рассчитывается по группам SNP. Для каждого генотипа при расчете используются частоты генотипов и ОШ, приведенные в табл. 2.

Обозначения групп:

Г-ИИ - группа генов, имеющих отношение к гемостазу и тромбообразованию.

ЛО-ИИ - группа генов, имеющих отношение к метаболизму, в первую очередь, к липидному обмену.

В-КЛ-ИИ - группа генов, участвующих в межклеточных взаимодействиях, в первую очередь, в межклеточных взаимодействиях при воспалительном процессе.

Для этих групп используемые отношения шансов получены при сопоставлении больных с ишемическим инсультом и лиц, без указаний на инсульт в анамнезе.

ИИ-1 - группа SNP, патофизиологическое значение которых может быть неясным. Для этих групп по возможности используются отношения шансов развития инсульта, полученные при сопоставлении больных с кардиогенным эмболическим инсультом и лиц, без указаний на инсульт в анамнезе.

ИИ-2 - группа SNP, патофизиологическое значение которых может быть неясным. Для этих групп по возможности используются отношения шансов развития инсульта, полученные при сопоставлении больных с атеротромботическим инсультом и лиц, без указаний на инсульт в анамнезе.

АГ - группа SNP, значимо ассоциированных с развитием артериальной гипертонии, то есть одного из клинических факторов риска развития инсульта.

Далее эти группы будут условно обозначаться как «Гемостаз», «Липидный обмен», «Клеточные взаимодействия», «Инсульт-1», «Инсульт-2» и «Артериальная гипертензия», соответственно.

В зависимости от выявленного спектра генотипов у пациента для соответствующих групп SNP проводится расчет индивидуального генетического риска развития инсульта по следующей методике.

1) Подсчет среднего популяционного риска (APR) для каждого SNP

Для каждого используемого в настоящей методологии SNP предполагается известными ОШ гетерозиготы (OR₂) и гомозиготы (OR₃) по мутантному аллелю относительно гомозиготы по "дикому" аллелю и частоты встречаемости генотипов в популяции (F₁, F₂, и F₃, то есть частоты гомозигот по "дикому" аллелю, гетерозигот и гомозигот (OR₃) по мутантному аллелю, соответственно). Величины OR₂ и OR₃ берутся непосредственно из публикаций, приведенных в табл. 1 в столбце «основной источник»; величины F₁, F₂, и F₃ для популяции европеоидов (Caucasian) берутся из базы данных NCBI [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/].

Средний популяционный риск (average population risk, APR) по отдельному SNP вычисляется по формуле

По определению средний популяционный риск больше 1, если мутантный аллель является аллелем риска, и меньше 1, если мутантный аллель протективен (снижает РР инсульта).

2) Подсчет относительного риска (RR) для каждого SNP

Относительный риск каждого из трех генотипов по отдельному SNP вычисляется по формулам:

для гомозиготного генотипа по "дикому" аллелю: RR=1/APR,

для гетерозиготного генотипа: RR=OR₂/APR,

для гомозиготного генотипа по мутантному аллелю RR=OR₃/APR.

При таком определении величина относительного риска генотипа нормирована на средний популяционный риск по рассматриваемому SNP, иначе говоря, средняя величина относительного риска по каждому SNP в популяции равна 1.

3) Подсчет относительных рисков различных генотипов по группе SNP Относительный риск, обусловленный комбинацией аллелей от семи до одиннадцати SNP, объединенных в группу, невозможно оценить путем исследований случай-контроль, поскольку в группе из 7 SNP возможно 3⁷, то есть 2187, вариантов комбинаций аллелей, а в группе из 11 SNP возможно 3¹¹ (177147) вариантов комбинаций аллелей. Таким образом, в исследование надо было бы включить миллионы людей. Даже самый частый вариант комбинаций ("дикий", то есть наиболее распространенный, аллель по всем 7-11 SNP и, как следствие, наиболее распространенная комбинация) встречался бы приблизительно лишь у 1-5% испытуемых. Поэтому в предлагаемой методологии обобщенный относительный риск (GRR), обусловленный комбинацией аллелей, объединенных в группу, определяется в соответствии с мультипликативной моделью по формуле:

где RR¹…RRⁱ - относительные риски по каждому из SNP, включенному в соответствующую группу.

Аналогичным образом может быть посчитан и суммарный относительный риск (SRR), обусловленный комбинацией аллелей всех 48 SNP:

где RR¹…RR⁴⁸ - относительные риски по каждому из 48 SNP.

Распределение возможных значений обобщенного относительного риска в популяции

Обобщенный относительный риск также является нормированным показателем, то есть его величина более 1 соответствует значениям выше среднего обобщенного относительного риск в популяции, а величина менее 1, соответственно, значениям ниже среднего. При этом распределение значений обобщенного относительного риска в популяции определяется частотами встречаемости соответствующих генотипов в популяции. Анализ показывает, что эти распределения имеют не-гауссовский («не нормальный») характер и отличаются скошенностью в область больших и очень больших значений. Вид распределений для шести выделенных групп факторов риска показан на фиг. 1.

Вычисление обобщенных относительных рисков, проведено по мультипликативной модели, в то время как реальные закономерности накопления риска при наличии двух и более формально независимых факторов риска (генетически не сцепленных SNP), неизвестно. Поэтому не следует полагать, что индивидуум с показателем GRR равным 5 имеют в пять раз более высокую вероятность развития инсульта, чем лица с GRR=1. Используя статистическую терминологию, можно сказать, что переменная GRR не описывается интервальной (interval) шкалой, но является порядковой или ранжируемой (ordinal). Иными словами, значение GRR=5 больше, чем значение GRR=2, a GRR=2, в свою очередь, больше, чем значение GRR=0.8, но вопрос «во сколько раз больше?» не имеет смысла. Поэтому для каждой из шести групп факторов проводится разбиение всей области возможных значений GRR на 5 диапазонов (20% персентилей). Таким образом, в диапазон «низкого риска» попадает 20% наименьших значений GRR, в диапазон «пониженного риска» - 20% следующих по величине значений, и так далее. Внутри наивысшего 20% персентиля выделены диапазоны «высокого риска» (15%) и «очень высокого риска» - 5% наибольших значений (наглядно диапазоны значений рисков показаны на фиг. 2). Границы диапазонов для шести групп генетических полиморфизмов - факторов риска указаны в таблице 3.

Оценка и интерпретация индивидуального риска

Результаты анализа расчетов показателей РР инсульта по каждому из 48 SNP и обобщенных показателей риска по 6 группам факторов риска. Группы условно обозначены как «Гемостаз», «Липидный обмен», «Клеточные взаимодействия», «Инсульт-1», «Инсульт-2» и «Артериальная гипертензия» (см. фиг. 1).

Интерпретация количественных значений обобщенных показателей риска производится на основании предполагаемого распределения этих значений в популяции и представляется графически в виде лепестковой диаграммы (фиг. 3). По каждому из 6 обобщенных показателей генетически обусловленного риска индивид формально относится к одной из шести категорий: «низкого риска», «пониженного риска», «среднего риска», «повышенного риска», «высокого риска» и «очень высокого риска» развития инсульта, для каждого из которых обозначены границы диапазонов. Максимально возможные количественные показатели риска варьируют от 5 по группе факторов «Гемостаз» до 85 по группе факторов «Клеточные взаимодействия».

Серыми линиями показаны определенные значения обобщенных показателей риска (0,5; 1; 1,5 и 2); эти линии предназначены для дополнительной ориентировки при нанесении индивидуальных значений риска на лепестковую диаграмму.

Далее приводится пример осуществления изобретения со ссылками на прилагаемые фигуры.

Пример осуществления изобретения

Клинический пример 1

Проведено исследование индивидуального генетического риска пациентки в возрасте 73 лет. Выделена ДНК и, с помощью, технологии ПЦР в режиме реального времени определены аллели по каждому из 48 SNP. Результаты определения генотипов представлены в таблице 4.

Последовательность расчета индивидуального риска.

1. Расчет среднего популяционного риска для каждого SNP (APR) проводили с использованием значений из таблицы 2 следующим образом.

Для rs3918226 APR равен частота гомозиготы (СС) 0,833×1 + частота гетерозиготы (СТ) 0,133 × 1,34 + частота гомозиготы (ТТ) 0,034×2,68=0.833+0,17822+0,9112=1,10234.

Для rs11110912 APR равен частота гомозиготы (СС) 0,611×1 + частота гетерозиготы (CG) 0,354 × 1,33 + частота гомозиготы (GG) 0,035×1,34=0,611+0,47082+0,0469=1,12872.

Аналогично проводили расчет для всех остальных SNP.

2. После вычисления среднего популяционного риска (APR) для всех SNP проводили расчет относительного риска (RR) по каждому SNP, используя результаты генотипирования пациентки (табл. 4). Относительный риск определяли как отношение индивидуального риска выявленного генотипа SNP (OR) к его среднему популяционному риску (APR). Так, для генотипа СС локуса rs3918226 RR=1/1,10234=0,90716; для генотипа GG локуса rs11110912 RR=1,33/1,12872=1,178326.

Аналогичным образом вычисляли относительный риск для всех SNP.

3. Далее производили расчет обобщенного относительного риска (GRR) для каждой группы SNP (в соответствие с Таблицей 2) путем перемножения всех значений относительного риска (RR) локусов одной группы. Таким образом, для группы «АГ» GRR=0,90716×1,178326×0,845208×1,10166×0,76979×0,86505×0,9006×1,0382×0,96238×1,01636×1,03292=0,6261.

Для групп «ИИ-1», «ИИ-2», «ЛО-ИИ», «Г-ИИ» и «В-КЛ-ИИ» рассчитанный аналогичным образом обобщенный риск (GRR), составил 0,6264; 4,9856; 0,8318; 0,9342; 1,4726 соответственно.

4. Суммарный относительный риск (SRR) вычисляли как произведение всех групповых значений обобщенного относительного риска (GRR), и в представленном случае он составил 0,6264×4,9856×0,8318×0,9342×1,4726×0,6261=2,24 (выраженный случай предрасположенности).

«Очень высокий» риск по группе факторов «Инсульт-2», «высокий» риск по группе факторов «Клеточные взаимодействия», по остальным группам факторов показатели риска в области средних популяционных значений или ниже. Риск обусловлен совокупным вкладом полиморфизмов в генах AGTR1, HDAC9, 6р21.1, 22q12.3/APOL2.

Профиль генетической предрасположенности по шести группам факторов риска развития инсульта приведен на фиг. 4.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлены гистограммы распределения значений относительного риска инсульта в популяции для шести групп SNP:

а) распределение значений относительного риска инсульта в популяции для группы ИИ-1, высчитанное по группе факторов риска, связанных в большей степени с кардиогенным эмболическим инсультом;

б) распределение значений относительного риска инсульта в популяции для группы ИИ-2, высчитанное по группе факторов риска, связанных в большей степени с атероскеротическим инсультом;

в) распределение значений относительного риска инсульта в популяции для группы В-КЛ-ИИ, высчитанное по группе факторов риска «Клеточные взаимодействия »;

г) распределение значений относительного риска инсульта в популяции для группы ЛО-ИИ, высчитанное по группе факторов риска «Липидный обмен»;

д) распределение значений относительного риска инсульта в популяции для группы Г-ИИ, высчитанное по группе факторов риска «Гемостаз»;

е) распределение значений относительного риска инсульта в популяции для группы АГ, высчитанное по группе факторов риска «Артериальная гипертензия».

На фиг. 2 представлена гистограмма распределения значений относительного риска инсульта в популяции для группы ИИ-2, с наглядным указанием диапазонов значений рисков.

На фиг. 3 представлен профиль генетической предрасположенности по шести группам факторов риска развития инсульта.

На фиг. 4 представлен пример индивидуального профиля генетической предрасположенности по шести группам факторов риска развития инсульта.

Изобретение относится к молекулярной биологии и медицине. Способ представлен выявлением и идентификацией наиболее перспективных полиморфизмов генов, определяющих повышенный риск развития ишемического инсульта (РР ИИ). Изобретение позволяет создать принципиально новый способ оценки генетического риска развития инсульта, основанного не на нескольких, а на 48 SNP, а также классификацию SNP в соответствии с их патофизиологическим значением и создать алгоритм оценки и интерпретации индивидуального риска развития инсульта. 5 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 табл., 1 пр.

1. Способ определения генетического риска развития ишемического инсульта, основанный на определении однонуклеотидных полиморфизмов, включающий:

(а) выделение полногеномной ДНК обследуемого пациента;

(б) определение в образце ДНК аллелей однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), относящихся к следующим группам генов:

«Гемостаз» (Г-ИИ), - группа генов, имеющих отношение к гемостазу и тромбообразованию, включающая гены: F2 (rs1799963), F5 (rs6025), F7 (rs6046), F13A1 (rs5958), SERPINE1 (rs1799768), FGB (rs1800790), GP1BA (rs6065) и ITGB3 (rs5918),

«Липидный обмен» (ЛО-ИИ) - группа генов, имеющих отношение к метаболизму, включающая гены и локусы: АРОЕ (rs429358), APOE (rs7412), APOA5 (rs662799), LPA (rs10455872), LPL (rs328), MTHFR (rs1801133), PON1 (rs662) и 9p21.3(rs2383207),

«Клеточные взаимодействия» (В-КЛ-ИИ), - группа генов, участвующих в межклеточном взаимодействии, включающая гены: CELSR1 (rs6007897), ICAM1 (rs1799969), IL1B (rs1694), LTA (rs909253), LTC4S (rs730012), LTC4S (rs3776944) и SELE (rs5355),

«Инсульт-1» (ИИ-1), - группа SNP, которая является индикатором показателя отношения шансов заболеть инсультом, полученные при сопоставлении больных с кардиогенным эмболическим инсультом и лиц, без указаний на инсульт в анамнезе, включающая гены и локусы: CELSR1 (rs4044210), NOS3 (rs1799983), PDE4D (rs702553), 16q22.3 (rs7193343), 16q22.3 (rs12932445), 22q12.3 (rs5998322), 6p21.1 (rs556512) и 4q25 (rs2200733),

«Инсульт-2» (ИИ-2) - группа SNP, которая является индикатором показателя отношения шансов заболеть инсультом, полученные при сопоставлении больных с атеротромботическим инсультом и лиц, без указаний на инсульт в анамнезе, включающая гены и локусы: LPL (rs328), AGTR1 (rs5186), HDAC9 (rs11984041), LPA (rs10455872), 9р21.3 (rs1537378), 6p21.1 (rs556621), 22q12.3 (rs4479522) и 4q25 (rs1906591),

«Артериальная гипертензия» (АГ) - группа SNP, значимо ассоциированных с развитием артериальной гипертонии в виде одного из клинических факторов риска развития инсульта, включающая гены и локусы 12р12 (rs7961152), 12q23 (rs11110912), 13q21 (rs1937506), 15q26 (rs2398162), 1q43 (rs2820037), 8q24 (rs6997709), FGF5 (rs16998073), MTHFR (rs17367504), NOS3 (rs3918226), CSK (rs1378942) и c10orfl07 (rs1530440);

(в) определение индивидуального генетического риска развития инсульта на основании анализа выявленных аллелей в тестируемых SNP, при котором:

(i) рассчитывают средний популяционный риск (APR) для каждого SNP по формуле

APR=F₁×OR₁+F₂×OR₂+F₃×OR₃,

где F₁ - частоты гомозигот по «дикому» аллелю,

F₂ - частоты гетерозигот,

F₃ - частоты гомозигот по мутантному аллелю,

OR₁ - показатель отношения шансов для гомозиготного генотипа по дикому аллелю, равный 1,

OR₂ - показатель отношения шансов для гетерозиготного генотипа,

OR₃ - показатель отношения шансов для гомозиготного генотипа по мутантному аллелю;

(ii) рассчитывают относительные риски (RR) по каждому SNP исходя из генотипа исследуемого пациента по следующим формулам:

для гомозиготного генотипа по дикому аллелю: RR=1/APR,

для гетерозиготного генотипа: RR=OR₂/APR,

для гомозиготного генотипа по мутантному аллелю RR=OR₃/APR;

(iii) рассчитывают обобщенные относительные риски (GRR), обусловленные комбинацией аллелей в генах, объединенных в упомянутые группы по формуле

GRR_{комбинации}=RR¹×RR²×RR³…×RRⁱ,

где RR¹…RRⁱ - относительные риски по каждому SNP, включенному в соответствующую группу;

(г) оценку индивидуального генетического риска развития инсульта по каждой из упомянутых групп генов на основании значений обобщенных относительных рисков GRR_{комбинации}: при значении GRR_{комбинации}<1 риск является пониженным по отношению к среднему обобщенному относительному риску популяции и при значении GRR_{комбинации}>1 риск является повышенным по отношению к указанному среднему значению.

2. Способ по п. 1, в котором, исходя из полученных значений обобщенных относительных рисков GRR_{комбинации}, степень генетического риска по каждой из упомянутой групп генов относят к одной из категорий: «низкий риск», «пониженный риск», «средний риск», «повышенный риск», «высокий риск» и «очень высокий риск» следующим образом:

для группы Г-ИИ: при значении GRR_{комбинации} 0,43-0,76 устанавливают категорию «низкий риск», при 0,76-0,89 - «пониженный риск», при 0,89-1,02 - «средний риск», при 1,02-1,23 - «повышенный риск», при 1,23-1,55 - «высокий риск», при >1,55 - «очень высокий риск»;

для группы ЛО-ИИ: при значении GRR_{комбинации} 0,64-0,79 устанавливают категорию «низкий риск», при 0,79-0,85 - «пониженный риск», при 0,85-0,91 «средний риск», при 0,91-1,15 - «повышенный риск», при 1,15-1,75 - «высокий риск», при >1,75 - «очень высокий риск»;

для группы В-КЛ-ИИ: при значении GRR_{комбинации} 0,30-0,53 устанавливают категорию «низкий риск», при 0,53-0,66 - «пониженный риск», при 0,66-0,83 - «средний риск», при 0,83-1,16 - «повышенный риск», при 1,16-2,30 - «высокий риск», при >2,30 - «очень высокий риск»;

для группы ИИ-1: при значении GRR_{комбинации} в диапазоне 0,58-0,70 устанавливают категорию «низкий риск», при 0,70-0,78 - «пониженный риск», при 0,78-0,93 - «средний риск», при 0,93-1,22 - «повышенный риск», при 1,22-1,83 - «высокий риск», при >1,83 - «очень высокий риск»;

для группы ИИ-2: при значении GRR_{комбинации} 0,21-0,53 устанавливают категорию «низкий риск», при 0,53-0,77 - «пониженный риск», при 0,77-0,96 - «средний риск», при 0,96-1,34 - «повышенный риск», при 1,34-2,16 - «высокий риск», при >2,16 - «очень высокий риск»;

для группы АГ: при значении GRR_{комбинации} 0,18-0,65 устанавливают категорию «низкий риск», при 0,65-0,81 - «пониженный риск», при 0,81-0,99 - «средний риск», при 0,99-1,27 - «повышенный риск», при 1,27-1,84 - «высокий риск», при >1,84 - «очень высокий риск».

3. Способ по п. 2, в котором оценка генетического риска производится на основании предполагаемого распределения значений GRR_{комбинации} по каждой из групп генов в соответствии с рассчитанными значениями обобщенных показателей генетически обусловленного риска путем разбиения области возможных значений GRR_{комбинации} на 5 диапазонов, по 20% персентилей: 1-й диапазон «низкого риска» - 20%; 2-й диапазон «пониженного риска» - 20%; 3-й диапазон «среднего риска» - 20%; 4-й диапазон «повышенного риска» - 20% и 5-й диапазон, включающий области «высокого риска» - 15% и «очень высокого риска» - 5%.

4. Способ по п. 2 или 3, в котором результаты оценки генетического риска представляют в виде лепестковой диаграммы, в которой на шести осях, соответствующих упомянутым шести группам генов и образованных лучами, проведенными из центра правильного шестиугольника к его вершинам, откладывают шкалы значений GRR_{комбинации}, наносят линии, соединяющие точки на шкалах, соответствующие граничным значениям GRR_{комбинации} для каждой из упомянутых категорий риска в соответствующей группе, и формируют индивидуальный профиль генетической предрасположенности пациента путем нанесения на шкалы точек, соответствующих рассчитанным значениям GRR_{комбинации} для данного пациента и соединения этих точек линиями.

5. Способ по любому из пп. 1-3, в котором полногеномную ДНК выделяют из клеток крови или буккального эпителия.

6. Способ по любому из пп. 1-3, в котором выявление наличия аллельных однонуклеотидных полиморфизмов осуществляют методом ПЦР в реальном времени или с помощью пиросеквенирования.