Способ прогнозирования риска развития ишемического инсульта у женщин Центральной России на основе генотипирования полиморфизма rs8140505 (A>G) гена GGT5 Российский патент 2024 года по МПК G01N33/52 G01N33/49 C12Q1/6804 C12Q1/6827 C12Q1/6876 C12Q1/6883 

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития ишемического инсульта (ИИ) у женщин Центральной России.

По экспертным оценкам Всемирной организации здравоохранения, мозговой инсульт занимает второе место в мире среди причин смертности и является лидирующей причиной стойкой утраты нетрудоспособности. В течение первого месяца с момента развития церебрального инсульта умирают 15-20% пациентов, до 75% пациентов, перенёсших ОНМК, остаются инвалидами, 10% из которых становятся тяжёлыми инвалидами и требуют постоянного круглосуточного ухода и наблюдения. И только 10-12 % больных способны вернуться к прежней трудовой деятельности [Болотова, Э. Г. Факторы риска неблагоприятного клинического течения раннего восстановительного периода ишемического инсульта у пациентов молодого и среднего возраста / Э. Г. Болотова, В. В. Шпрах, И. М. Михалевич // Acta Biomedica Scientifica. - 2022. - Т. 7, № 6. - С. 174-180. - DOI 10.29413/ABS.2022-7.6.17. - EDN MTDKYQ].

После острого нарушения мозгового кровообращения по ишемическому типу происходит активация апоптоза нейронов головного мозга. Она реализуется под воздействием ряда процессов, а именно: гипоксии, продуктов перекисного окисления липидов, избыточной генерации свободных кислородных радикалов, оксида азота, эксайтотоксичности, внутриклеточного ацидоза, (особенно при обширном ишемическом поражении тканей и клеток головного мозга), нейротоксинов, повышенной продукции провоспалительных цитокинов в результате развития постишемического нейровоспаления и других токсичных для нейронов веществ, образующихся в головном мозге при возникновении патологических условий. В связи со значимостью окислительного стресса для патогенеза ишемического инсульта целесообразным является изучение состояния молекулярно-генетических механизмов регуляции редокс-гомеостаза и метаболизма глутатиона [Бочарова Ю.А. Исследование ассоциаций трёх полиморфных вариантов гена глутатионсинтазы (GSS) c риском развития ишемического инсульта. Научные результаты биомедицинских исследований. 2020; 6(4):476-487. DOI:10.18413/2658-6533-2020-6-4-0-4]. Известно, что поступление аминокислот-предшественников для внутриклеточного синтеза глутатиона (цистеина, глицина и глутаминовой кислоты) регулируется под влиянием мембран-ассоциированных ферментов, одним из которых является гамма-глутамилтрансфераза, которая расщепляет внеклеточный восстановленный глутатион на глутамат и дипептид цистеинил-глицин, которые после аминопептидазной реакции транспортируются в клетку для de novo синтеза глутатиона [Александрова Л. А., Субботина Т. Ф., Жлоба А. А. Взаимосвязь дефицита фолатов, гипергомоцистеинемии и метаболизма глутатиона у больных артериальной гипертензией. Артериальная гипертензия. 2020; 26(6): 656-664. - DOI 10.18705/1607-419X-2020-26-6-656-664].

Увеличение восстановленного глутатиона и его полезного использования в реакциях глутатионтрансферразы (ГТ) и глутатионпероксидазы (ГПО) реализуют антиоксидантные эффекты, а главный фермент катаболизма гамма-глутамилтранспептидаза (ГГТ) -прооксидантные [Кулинский, В. И. Система глутатиона. II. Другие ферменты, тиол-дисульфидный обмен, воспаление и иммунитет, функции / В. И. Кулинский, Л. С. Колесниченко // Биомедицинская химия. - 2009. - Т. 55, № 4. - С. 365-379. - EDN KWROGP].

Анализ данных функционального аннотирования исследованного полиморфизма гена GGT5 с использованием геномно-транскриптомных данных портала GTEx позволил обнаружить, что носительство генотипа rs8140505-G/G ассоциировано с экспрессией генов, отражающих изменения внутриклеточного метаболизма глутатиона, аутофагии и протеасомной деградации белков - патологических изменений, обнаруживающихся при атеросклерозе и ишемическом инсульте.

Известен способ прогнозирования риска развития инсульта у больных с транзиторной ишемической атакой (ТИА) - согласно шкале ABCD (Age, Blood pressure, Clinical features, Duration of symptoms, Diabetes mellitus) [Sciolla, R. Быстрое выявление пациентов с транзиторными ишемическими атаками с высоким риском развития ишемического инсульта. Проспективная оценка по шкале ABCD / R. Sciolla, F. Melis // Журнал Национальной ассоциации по борьбе с инсультом /Stroke/ Российское издание. - 2008. - № 3. - С. 12-18]. Для оценки вероятности используются данные об основных фактора риска и динамические характеристики болезни: продолжительность клинических проявлений. Возраст более 60 лет - 1 балл. Артериальное давление при поступлении выше 140/90 мм рт ст - 1 балл. Клинические симптомы: слабость конечностей с одной стороны - 2 балла, речевые расстройства без слабости в конечностях - 1 балл. Длительность существования симптомов: 10-60 минут - 1 балл и более 60 минут - 2 балла. Сахарный диабет - 1 балл. Итог 0-3 балла: Низкий риск(Риск инсульта в течение 2 дней: 1.0%; Риск инсульта в течение 1 недели: 1.2%; Риск инсульта в течение 3 месяцев: 3.1%). Итог 4-5 баллов: Умеренный риск (Риск инсульта в течение 2 дней: 4.1%; Риск инсульта в течение 1 недели: 5.9%; Риск инсульта в течение 3 месяцев: 9.8%). Итог 6-7 баллов: Высокий риск (Риск инсульта в течение 2 дней: 8.1%; Риск инсульта в течение 1 недели: 11.7%; Риск инсульта в течение 3 месяцев: 17.8%). Таким образом, у больных с явными признаками декомпенсации мозгового кровообращения (ТИА) шкала ABCD довольно точно выводит на прогноз инсульта.

Недостаток метода заключается в том, что он нацелен только на пациентов с ТИА и не может быть использован для людей без данной патологии.

Известен способ определения индивидуального генетического риска развития ишемического инсульта по патенту RU 2612630 C2 (дата публикации: 09.03.2017), рассматривающий комбинации из 48 генетических факторов риска. Производится выделение геномной ДНК обследуемого пациента. Определяются в образце ДНК аллели однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), относящихся к следующим группам генов: «Гемостаз» (Г-ИИ), - группа генов, имеющих отношение к гемостазу и тромбообразованию, включающая гены: F2 (rs1799963), F5 (rs6025), F7 (rs6046), F13A1 (rs5958), SERPINE1 (rs1799768), FGB (rs1800790), GP1BA (rs6065) и ITGB3 (rs5918); «Липидный обмен» (ЛО-ИИ) - группа генов, имеющих отношение к метаболизму, включающая гены и локусы: АРОЕ (rs429358), APOE (rs7412), APOA5 (rs662799), LPA (rs10455872), LPL (rs328), MTHFR (rs1801133), PON1 (rs662) и 9р21.3 (rs2383207); «Клеточные взаимодействия» (В-КЛ-ИИ), - группа генов, участвующих в межклеточном взаимодействиями, включающая гены: CELSR1 (rs6007897), ICAM1 (rs1799969), IL1B (rs1694), LTA (rs909253), LTC4S (rs730012), LTC4S (rs3776944) и SELE (rs5355); «Инсульт-1» (ИИ-1), - группа SNP, которая является индикатором показателя отношения шансов заболеть инсультом, полученные при сопоставлении больных с кардиогенным эмболическим инсультом и лиц, без указаний на инсульт в анамнезе, включающая гены и локусы: CELSR1 (rs4044210), NOS3 (rs1799983), PDE4D (rs702553), 16q22.3 (rs7193343), 16q22.3 (rs12932445), 22ql2.3 (rs5998322), 6p21.1 (rs556512) и 4q25 (rs2200733); «Инсульт-2» (ИИ-2) - группа SNP, которая является индикатором показателя отношения шансов заболеть инсультом, полученные при сопоставлении больных с атеротромботическим инсультом и лиц, без указаний на инсульт в анамнезе, включающая гены и локусы: LPL (rs328), AGTR1 (rs5186), HDAC9 (rs11984041), LPA (rs10455872), 9р21.3 (rs1537378), 6p21.1 (rs556621), 22ql2.3 (rs4479522) и 4q25 (rs1906591); «Артериальная гипертензия» (АГ) - группа SNP, значимо ассоциированных с развитием артериальной гипертонии в виде одного из клинических факторов риска развития инсульта, включающая гены и локусы 12р12 (rs7961152), 12q23 (rs11110912), 13q21 (rs1937506), 15q26 (rs2398162), lq43 (rs2820037), 8q24 (rs6997709), FGF5 (rs16998073), MTHFR (rs17367504), NOS3 (rs3918226), CSK (rs1378942) и cl0orf107 (rs1530440); Все факторы риска объединены в группы на основании сходства их патофизиологической связи с инсультом или статистически значимой связи с определенным подтипом инсульта. Для каждой группы может быть вычислен некий обобщенный показатель риска. В дальнейшем шесть обобщенных показателей риска формируют «статус предрасположенности к инсульту»: «низкого риска», «пониженного риска», «среднего риска», «повышенного риска», «высокого риска» и «очень высокого риска».

Недостаток метода заключается в том, что для расчета степени риска заболевания требуется определение большого количества лабораторных показателей, что является трудоемким процессом. Кроме того, обращает на себя внимание сложность статистических подсчетов.

Из области техники известен «Способ прогнозирования развития острого ишемического инсульта» по Патенту RU 2012 134 988 A (дата публикации: 20.02.2014). Способ включает учет показателей ферментов антиокислительной защиты в периферической крови, при этом в качестве ферментов антиокислительной защиты определяют каталазу, пероксидазу и показатель перекисного окисления липидов. При увеличении показателей пероксидазы и перекисной резистентности эритроцитов и снижении показателя каталазы более чем на 70% от референсных значений судят о высоком риске развития ишемического инсульта. Данный способ не включает генетические маркеры, поэтому не является достаточно персонифицированным.

Наиболее близок по результату исследования способ прогнозирования риска развития ишемического инсульта с учетом генетических факторов по патенту на изобретение RU 2653450 C 1 (дата публикации 08.05.2018), включающий забор периферической венозной крови пациента, анализ полиморфизмов генов матриксных металлопротеиназ rs3025058 MMР-3 и rs11568818 MMР-7 и прогнозирование высокого риска развития ишемического инсульта при выявлении сочетания генотипа 6А/6А по локусу rs3025058 MMР-3 с генотипом АА по локусу rs11568818 MMР-7.

Недостатком указанного способа является то, что он не учитывает пол пациента.

Технический результат заключается в получении критериев оценки риска развития ишемического инсульта у женщин Центральной России по данным о генетическом полиморфизме rs8140505 (A>G) гена GGT5.

Технический результат достигается тем, что после экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта rs8140505 (A>G) гена GGT5 и прогнозируют повышенный риск формирования ишемического инсульта у женщин в случае выявления генотипа rs8140505-G/G.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37°C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл.

2. Подготовка образцов ДНК к масс-спектрометрическому анализу. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 10 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.

3. Анализ полиморфизма гена GGT5 - генотипирование методом матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF. Использовали следующие последовательности праймеров: прямой F: 5`-ACGTTGGATGGGCAATGTAGCAAGATCACG-3`, обратный R: 5`-ACGTTGGATGCTGGGACTATAAGCACAGGG-3`, праймер удлинения E: 5`-GGGACGCACAGGGCCACCACA-3`. Для приготовления ПЦР-микса (в расчете на один спектральный чип) в центрифужную микропробирку вносили 80,6 мкл ddH2O, 50,4 мкл 10x буфера, 40,3 мкл MgCl2 (концентрация 25 ммоль/л), 10,1 мкл смеси дНТФ (концентрация 25 ммоль/л), 100,8 мкл смеси ПЦР-праймеров (концентрация 0,5 мкмоль/л) и 20,16 мкл HotStartTaq полимеразы (концентрация 5 ЕД/мкл). Смесь вортексировали и раскапывали в 96-луночный ПЦР-планшет по 3 мкл в лунку, после чего с помощью восьмиканального дозатора вносили по 2 мкл ДНК (концентрация 10 нг/мкл). Планшет заклеивали, центрифугировали 20 сек при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 125 мин при следующем режиме: денатурация 2 мин при 95°С, амплификация 44 цикла, состоящая из денатурации 30 сек при 95°С, отжига 30 сек при 56°С и элонгации 60 сек при 72°С. После чего пробы инкубировали 5 мин при 72°С. Не прореагировавшие в ходе ПЦР дНТФ удаляли с помощью реакции SAP (shrimp alkaline phosphatase), в ходе которой щелочная фосфатаза креветки гидролизовала дНТФ до нуклеозидов и фосфатов. Для приготовления SAP-микса в микропробирке смешивали 161,6 мкл ddH2O, 18 мкл 10хTS буфера и 31,7 мкл SAP фермента. Далее вносили по 2 мкл SAP-смеси в каждую лунку, планшет заклеивали, центрифугировали 20 сек при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 55 мин при следующем режиме: 45 мин при 37°С и 10 мин при 85°С. Для проведения третьей реакции iPLEX готовили Е-праймер-микс из расчета 8,8 мкл праймеров Е1-Е9, 11,7 мкл праймеров Е10-Е18, 14,6 мкл праймеров Е19-Е27, 17,5 мкл праймеров Е28-Е35 и 45,1 мкл ddH2O. После масс-спектрометрической оценки интенсивности пиков Е-праймеров в полученной смеси, в микс добавляли Е-праймеры в количествах, необходимых для достижения одинаковой интенсивности сигнала. Для приготовления iPLEX-микса в микропробирке смешивали 65,4 мкл ddH2O, 21,2 мкл iPLEX буфера, 21,2 мкл терминирующей смеси, 99,3 мкл Е-праймер-микса и 4,33 мкл iPLEX-фермента, вортексировали и раскапывали в лунки по 2 мкл. Планшет заклеивали, центрифугировали 20 секунд при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 135 мин при следующем режиме: денатурация 30 сек при 94°С, затем 40 циклов, состоящие из денатурации 5 сек при 94°С, отжига 5 сек при 52°С, элонгации 5 сек при 80°С, с последующим инкубированием в течение 3 мин при 72°С. По завершении реакции iPLEX, планшет охлаждали до +4°С, добавляли по 30 мкл воды во все лунки, центрифугировали 1 мин при 1000 об/мин и загружали в масс-спектрометр. Ввиду того, что небольшие полярные молекулы и положительно заряженные катионы натрия и калия могут образовывать аддукты с олигонуклеотидами и создавать серию контаминантных пиков, ампликоны были подвергнуты роботизированному обессоливанию путем их обработки смолой SpectroCLEAN (Agena Bioscience). Перенос образцов на спектральный чип с матрицей для ионизации осуществлялся в автоматическом режиме на рабочей станции Nanodispenser. Статистические расчеты проводили с помощью программы SNPStats (E., Valls, J., Iniesta, R., & Moreno, V. (2006). SNPStats: a web tool for the analysis of association studies. Bioinformatics, 22(15), 1928-1929).

4. Прогнозирование повышенного риска формирования ишемического инсульта в случае выявления генотипа rs8140505-G/G GGT5 у женщин.

Возможность использования предложенного способа для определения риска развития ишемического инсульта подтверждает анализ результатов наблюдений 600 пациентов с диагнозом инфаркт мозга, находящихся на базе неврологического отделения регионального сосудистого центра Курской областной многопрофильной клинической больницы (330 мужчин и 270 женщин). В исследование включались лица славянской национальности Центральной России. Диагноз ишемический инсульт верифицировался опытными врачами-неврологами с использованием данных инструментального обследования пациентов (компьютерная томография и ядерно-магнитная резонансная томография головного мозга). Протокол исследования (№ 6 от 14.05.2018) был одобрен региональным этическим комитетом ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России. От всех участников исследования было получено добровольное информированное согласие на участие в данном научном исследовании. Контрольная группа для исследования была сформирована из образцов ДНК биобанка научно-исследовательского института генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ и включала 688 относительно людей без какой-либо хронической соматической патологии (366 мужчин и 322 женщины). Установлено, что носительство генотипа rs8140505-G/G GGT5 ассоциировалось с повышенным риском развития ишемического инсульта у женщин Центральной России, OR=2,51, 95% CI 1,17-5,36, P=0,034 (таблица 1).

Таблица 1

Ассоциации полиморфного варианта rs8140505 (A>G) гена GGT5 с риском развития ишемического инсульта у женщин Центральной России

Генотип, аллель rs8140505 GGT5 Контроль
(n=688) Больные ИИ
(n=600) Р OR (95% CI) A/A 159 (50,6%) 130 (49,2%) 0,034 1,00 A/G 144 (45,9%) 111 (42%) 0,95 (0,67-1,33) G/G 11 (3,5%) 23 (8,8%) 2,51 (1,17-5,36) G 26% 30% 0,213 1,18(0,91-1,52) ИИ - ишемический инсульт. Жирным выделены статистически значимые уровни P и отношения шансов.

В качестве примеров конкретного применения разработанного способа приведено генетическое обследование женщин Центральной России, не являющихся родственниками между собой, по локусу rs8140505 (A>G) гена GGT5.

Пример 1. Женщина А., 63 лет, впервые в течение нескольких часов почувствовала неловкость в левых руке, ноге, но с работой (продавец) справлялась, за медпомощью обратилась на следующий день, когда сила полностью восстанавливалась. Произведен забор венозной крови, при генотипировании полиморфного варианта rs8140505 (A>G) был выявлен генотип G/G GGT5, что позволило отнести пациентку в группу лиц с высоким риском развития ишемического инсульта. Через 2 месяца у женщины в течение дня вновь возникла слабость в левых конечностях, начальник заметил "какую-то заторможенность", доставил в приемное отделение КОМКБ. Дальнейшее наблюдение и обследование пациентки выявили ишемический инсульт по атеротромботическому типу в бассейне правой средней мозговой артерии с левосторонней пирамидной симптоматикой.

Пример 2. Женщина Е., 55 лет, не включалась в группу больных с высоким риском развития ишемического инсульта, поскольку после забора венозной крови из локтевой вены при профилактическом осмотре и последующего генотипирования по локусу rs8140505 (A>G) GGT5 выявлен генотип А/А. Дальнейшее наблюдение и обследование не выявило у пациентки клинических симптомов, лабораторных и инструментальных данных, свидетельствующих об ишемическом инсульте.

Пример 3. У женщины Н., 48 лет, произведен забор венозной крови во время ежегодного профилактического осмотра. При генотипировании выявлен генотип rs8140505-A/G гена GGT5. По данным генотипирования пациентка Н. не была включена в группу больных с высоким риском развития инсульта. При последующих профилактических осмотрах и обследованиях не было зафиксировано данных, свидетельствующих об ишемическом инсульте.

Применение данного способа позволит на доклиническом этапе формировать среди женщин Центральной России группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития ишемического инсульта.

Резюме

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что носительство генотипа rs8140505-G/G гена GGT5 у женщин является генетическим фактором риска развития ишемического инсульта (OR=2,51).

Использование предложенного способа позволит прогнозировать предрасположенность к ишемическому инсульту у женщин Центральной России, что даст возможность осуществлять мероприятия по профилактике данного заболевания в группе лиц высокого риска - диспансерное наблюдение, контроль уровня АД и ритма сердца, глюкозы, холестерина и его фракций, нормализацию массы тела, достаточную физическую активность, правильное питание с ежедневным включением в рацион свежих овощей и фруктов и ограничением рафинированных углеводов и жиров.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской диагностике, и может быть использовано для прогнозирования риска развития ишемического инсульта у женщин Центральной России. Осуществляют забор образца периферической венозной крови. После экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта rs8140505 (A>G) гена GGT5. В случае выявления генотипа rs8140505-G/G прогнозируют повышенный риск развития ишемического инсульта. Способ обеспечивает получение новых критериев оценки риска развития ишемического инсульта у женщин Центральной России по данным о генетическом полиморфизме rs8140505 (A>G) гена GGT5. 1 табл., 3 пр.

Способ прогнозирования риска развития ишемического инсульта у женщин Центральной России, включающий забор образца периферической венозной крови, отличающийся тем, что после экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта rs8140505 (A>G) гена GGT5 и прогнозируют повышенный риск развития ишемического инсульта в случае выявления генотипа rs8140505-G/G гена GGT5.