СРЕДСТВО ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ ФЕРМЕНТА ТИРОЗИЛ-ДНК-ФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ 1 ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2017 года по МПК C12N9/16 C07D311/22 C07D311/94 C07C13/42 

Изобретение относится к молекулярной биологии, биохимии и биотехнологии, конкретно к соединениям, представляющим собой производные хроменона общей формулы I:

где, n=1 или 2,

или II:

у которых выявлена биологическая активность, заключающаяся в способности ингибировать действие фермента тирозил-ДНК-фосфодиэстеразы 1 человека (Tdp1).

В последние годы ведутся активные поиски ингибиторов фермента тирозил-ДНК-фосфодиэстеразы 1 (Tdp1), который рассматривается как перспективный фермент-мишень при создании лекарственных препаратов для лечения онкологических и нейродегенеративных заболеваний [Cortes Ledesma, 2009].

Tdp1 относится к классу фосфодиэстераз - ферментов, расщепляющих фосфодиэфирные связи [Interthal, 2001]. Tdp1 играет важную роль в удалении повреждений ДНК, создаваемых топоизомеразой 1 (Top1) в присутствии ее ингибитора камптотецина. Таким образом, Tdp1 противостоит ингибиторам Top1, которые являются достаточно эффективными противоопухолевыми препаратами [см. обзоры Pommier, 2010; Pommier, 2006]. Предполагается, что именно Tdp1 ответственна за лекарственную устойчивость некоторых видов рака [Dexheimer, 2008; Beretta, 2010]. Эта гипотеза подтверждается рядом исследований: мыши, нокаутные по Tdp1, и человеческие клеточные линии, имеющие мутацию SCAN1, гиперчувствительны к камптотецину [El-Khamisy, 2009; Das, 2009; Katyal, 2007; Hirano, 2007]. И, наоборот, в клетках с повышенным уровнем экспрессии Tdp1 камптотецин и этопозид вызывают меньше повреждений ДНК [Barthelmes, 2004; Nivens, 2004]. Таким образом, сочетание препаратов, воздействующих на Top1 и Tdp1, может существенно повысить эффективность химиотерапии. Терапевтическим эффектом ингибиторов Tdp1 может быть селективное увеличение активности ингибиторов Top1 в опухолях с нарушениями в процессах репарации ДНК и контроля клеточного цикла.

Кроме того, показано, что подавление активности Tdp1 делает опухолевые клетки гиперчувствительными к противораковом препаратам с другими механизмами действия: темозоломиду (метилирование пуринов) [Alagoz, 2013], метилметансульфонату (образование апуриновых/апиримидиновых сайтов), блеомицину (одноцепочечные/двухцепочечные разрывы с 3'-фосфогликолятами), перекиси водорода и ионизирующему излучению (разрывы и др. виды повреждений) [Murai, 2012].

В литературе описано немного ингибиторов Tdp1, и, как правило, они обладают умеренным ингибирующим действием (в диапазоне 100-1 мкМ) [Antony, 2007; Nguyen, 2012; Dexheimer, 2008; Zakharenko, 2015].

Наиболее близким к заявляемому средству – прототипом - является фурамидин, представляющий собой гетероциклический диамидин [Antony, 2007] общей формулы III:

Недостатком известного средства являются неудовлетворительные ингибиторные характеристики (IС₅₀ для одноцепочечной ДНК порядка 100 мкМ).

Задачей изобретения является создание более эффективного ингибитора Tdp1.

Поставленная техническая задача решается применением соединений, представляющих собой производные хроменона общей формулы I или II, у которых выявлена биологическая активность, заключающаяся в подавлении активности Tdp1.

Соединения I и II могут быть синтезированы взаимодействием бромида IV с замещенными кумаринами V и VI в соответствии со следующей схемой:

Соединение IV может быть синтезировано, например, из монотерпеноида миртеналя VII в соответствии со следующей схемой:

Для получения обоих энантиомеров соединения IV в качестве исходных соединений использовались (+)- и (-)-миртеналь (VII).

Соединения Va, b и VI могут быть синтезированы, например, взаимодействием резорцина VIII с эфирами соответствующих β-кетокислот по следующей схеме:

Структура полученных соединений I и II подтверждена данными ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии.

Результаты тестирования соединений Ia (n=1), Ib (n=2) и II приведены в таблице.

Технический результат: получен класс эффективных ингибиторов Tdp1 с хорошими ингибирующими характеристиками (IС₅₀ для одноцепочечной ДНК от 0.13 до 1.6 мкМ).

В случае соединений Ia и II производные (+)-миртеналя оказались более активны, чем соответствующие (-)-энантиомеры, в то же время оба энантиомера соединения Ib проявили одинаковую активность.

Соединения общей формулы I и II, после проведения углубленных фармакологических исследований, могут использоваться для дальнейшей разработки новых высокоэффективных противораковых средств.

Ниже приводятся конкретные примеры реализации заявляемого технического решения.

Пример 1. Синтез 7-(((1R,5S)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)метокси)-2,3-дигидроциклопента[с]хромен-4(1H)-она ((-)-Iа)

К 0.101 г (0.5 ммоль) соединения Va в 5 мл этанола прибавили 0.104 г (0.75 ммоль) K₂СО₃ и 0.161 г (0.75 ммоль) бромида (-)-IV при 25°С и перемешивании. Перемешивали при комнатной температуре 15 минут, затем нагревали при 80°С в течение 5 часов. Горячий раствор отфильтровали, фильтрат выдерживали при -10°С в течение 48 часов. Продукт (-)-Iа выделили перекристаллизацией из этанола, выход составил 0.067 г (40%).

Т_пл=145°С, =-20.5 (EtOH, с=0.5). Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м. д, J, Hz): 0.80 (с, 3Н, С²²Н₃); 1.16 (д, 1H, ²J=8.6, Н^20а); 1,28 (с, 3Н, С²¹Н₃); 2.10 (ддддд, 1Н, J_17,19=J_17,20s=5.6, J_17,16a=J_17,16s=2.9, J_17,15=1.3, Н¹⁷); 2.13-2.20 (м, 2Н, 2Н¹¹); 2.20 (ддд, 1Н, J_19,17=J_19,20s=5.6, J_19,15=1.4, Н¹⁹); 2.25 (д. м, 1Н, ²J=18.0, H^16s); 2.32 (д. м, 1Н, ²J=18.0, Н^16а); 2.40 (ддд, 1Н, ²J=8.6, J_20s,17=J_20s,19=5.6, H^20s); 2.84-2.88 (м, 2Н, 2Н¹⁰); 2.99-3.03 (м, 2Н, 2Н¹²); 4.42 (д. м, 1Н, ²J=12.4, другие J≤2.0, Н¹³); 4.44 (д. м, 1Н, ²J=12.4, другие J≤2.0, Н^13'); 5.60-5.63 (м, 1Н, Н¹⁵), 6.82 (дд, 1Н, J_7,6=8.6, J_7,9=2.4, Н⁷); 6.85 (д, 1Н, J_9,7=2.4, Н⁹); 7.29 (д, 1Н, J_6,7=8.6, Н⁶). Спектр ЯМР ¹³С (CDCl₃), δ, м. д.: 155.60 (с, С¹); 160.48 (с, С²); 124.28 (с, С³); 156.23 (с, С⁴); 112.21 (с, С⁵); 125.28 (д, С⁶); 112.85 (д, С⁷); 161.29 (с, С⁸); 101.67 (д, С⁹); 30.24 (т, С¹⁰); 22.47 (т, С¹¹); 31.93 (т, С¹²); 71.00 (т, С¹³); 143.07 (с, С¹⁴); 121.22 (д, С¹⁵); 31.17 (т, С¹⁶); 40.69 (д, С¹⁷); 37.99 (с, С¹⁸); 43.07 (д, С¹⁹); 31,39 (т, С²⁰); 26.01 (к, С²¹); 20.97 (к, С²²). Найдено: m/z=336.1722 [М]⁺ (С₂₂Н₂₄O³)⁺ Вычислено: m/z=336.1720.

Пример 2. Синтез 7-(((1S,5R)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)метокси)-2,3-дигидроциклопента[с]хромен-4(1H)-она ((+)-Ia)

К 0.101 г (0.5 ммоль) соединения Va в 5 мл этанола прибавили 0.104 г (0.75 ммоль) K₂CO₃ и 0.161 г (0.75 ммоль) бромида (+)-IV при 25°С и перемешивании. Перемешивали при комнатной температуре 15 минут, затем нагревали при 80°С в течение 5 часов. Горячий раствор отфильтровали, фильтрат выдерживали при -10°С в течение 48 часов. Продукт (+)-Ia выделили перекристаллизацией из этанола, выход составил 0.093 г (55%).

Т_пл=140°С. =+27.6 (EtOH, с=0.65). Спектры ЯМР ¹Н и ¹³С соединения (+)-Ia соответствуют спектрам энантиомера (-)-Ia. Найдено: m/z=336.1718 [М]⁺ (С₂₂Н₂₄O₃)⁺ Вычислено: m/z=336.1720.

Пример 3. Синтез 3-(((1R,5S)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)метокси)-7,8,9,10-тетрагидро-6H-бензо[с]хромен-6-она ((-)-Ib)

К 0.108 г (0.5 ммоль) соединения Vb в 5 мл этанола прибавили 0.104 г (0.75 ммоль) K₂СО₃ и 0.161 г (0.75 ммоль) бромида (-)-IV при 25°С и перемешивании. Перемешивали при комнатной температуре 15 минут, затем нагревали при 80°С в течение 5 часов. Горячий раствор отфильтровали, фильтрат выдерживали при -10°С в течение 48 часов. Продукт (-)-Ib выделили перекристаллизацией из этанола, выход составил 0.067 г (38%).

Т_пл=110°С. =-25.0 (EtOH, с=0.75). Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м. д, J, Hz): 0.80 (с, 3Н, С²³Н₃); 1.16 (д, 1Н, ²J=8.7, Н^21а); 1,27 (с, 3Н, С²²Н₃); 1.74-1.85 (м, 4Н, 2Н¹¹, 2Н¹²); 2.09 (ддддд, 1Н, J_18,20=J_18,21s=5.6, J_18,17a=J_18,17s=2.8, J_18,16=1.3, Н¹⁸); 2.20 (ддд, 1Н, J_20,18=J_20,21s=5.6, J_20,16=1.4 Н²⁰); 2.24 (д. м, 1Н, ²J=18.0, H^17s); 2.32 (д. м, 1Н, ²J=18.0, Н^17а); 2.39 (ддд, 1Н, ²J=8.7, J_21s,18=J_21s,20=5.6, H^21s); 2.53 (т. м, 2Н, J_10,11=6.3, 2Н¹⁰); 2.72 (т. м, 2Н, J_13,12=6.3, 2Н¹³); 4.41 (д. м, 1Н, ²J=12.4, другие J≤2.0, Н¹⁴); 4.43 (д. м, 1Н, ²J=12.4, другие J≤2.0, Н¹⁴); 5.59-5.62 (м, 1H, Н¹⁶), 6.79 (д, 1Н, J_9,7=2.4, Н⁹); 6.81 (дд, 1H, J_7,6=8.7, J_7,9=2.4, Н⁷); 7.40 (д, 1H, J_6,7=8.7, Н⁶). Спектр ЯМР ¹³С (CDCl₃), δ, м. д.: 153.30 (с, С¹); 162.12 (с, С²); 120.29 (с, С³); 147.17 (с, С⁴); 113.54 (с, С⁵); 123.79 (д, С⁶); 112.62 (д, С⁷); 160.69 (с, С⁸); 101.49 (д, С⁹); 23.72 (т, С¹⁰); 21.60 (т, С¹¹); 21.29 (т, С¹²); 25.10 (т, С¹³); 70.93 (т, С¹⁴); 143.12 (с, С¹⁵); 121.12 (д, С¹⁶); 31,16 (т, С¹⁷); 40.69 (д, С¹⁸); 37.98 (с, С¹⁹); 43.06 (д, С²⁰); 31.38 (т, С²¹); 26.01 (к, С²²), 20.96 (к, С²³). Найдено: m/z=350.1875 [М]⁺ (С₂₃Н₂₆O₃)⁺ Вычислено: m/z=350.1877.

Пример 4. Синтез 3-(((1S,5R)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)метокси)-7,8,9,10-тетрагидро-6H-бензо[с]хромен-6-она ((+)-Ib)

К 0.108 г (0.5 ммоль) соединения Vb в 5 мл этанола прибавили 0.104 г (0.75 ммоль) K₂СO₃ и 0.161 г (0.75 ммоль) бромида (+)-IV при 25°С и перемешивании. Перемешивали при комнатной температуре 15 минут, затем нагревали при 80°С в течение 5 часов. Горячий раствор отфильтровали, фильтрат выдерживали при -10°С в течение 48 часов. Продукт (+)-Ib выделили перекристаллизацией из этанола, выход составил 0.067 г (38%).

=+32.6 (EtOH, с=0.65). Спектры ЯМР ¹Н и ¹³С соединения (+)-Ib соответствуют спектрам энантиомера (-)-Ib. Найдено: m/z=350.1872 [М]⁺ (С₂₃Н₂₆О₃)⁺ Вычислено: m/z=350.1876.

Пример 5. Синтез 7-(((1R,5S)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)метокси)-4-метил-2H-хромен-2-она ((-)-II)

К 0.108 г (0.5 ммоль) соединения VI в 5 мл этанола прибавили 0.104 г (0.75 ммоль) K₂СO₃ и 0.132 г (0.75 ммоль) бромида (-)-IV при 25°С и перемешивании. Перемешивали при комнатной температуре 15 минут, затем нагревали при 80°С в течение 5 часов. Горячий раствор отфильтровали, фильтрат выдерживали при -10°С в течение 48 часов, упарили. Продукт (-)-II выделили колоночной хроматографией на силикагеле, элюент - раствор, содержащий от 25 до 100% хлороформа в гексане. Выход составил 0.084 г (54%).

Т_пл=70°С. =-36 (EtOH, с=0.8). Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м. д, J, Hz): 0.80 (с, 3Н, С²⁰Н₃); 1.17 (д, 1Н, ²J=8.7, Н^18а); 1,28 (с, 3Н, С¹⁹Н₃); 2.08-2.13 (м, 1Н, Н¹⁵); 2.20 (ддд, 1Н, J_17,15=J_17,18s=5.6, J_17,13=1.4, Н¹⁷); 2.25 (д. м, 1Н, ²J=18.0, H^14s); 2.33 (д. м, 1Н, ²J=18.0, Н^14а); 2.35 (д, 3Н, J_10,3=1.2, С¹⁰Н₃); 2.40 (ддд, 1H, ²J=8.7, J_18s,17=J_18s,17=5.6, H^18s); 4.43 (д. м, 1H, ²J=12.4, другие J≤2.0, Н¹¹); 4.45 (д. м, 1Н, ²J=12.4, другие J≤2.0, Н^11'); 5.60-5.63 (м, 1Н, Н¹³), 6.10 (к 1H, J_3,10=1.2, Н³); 6.80 (д, 1H, J_9,7=2.4, Н⁹); 6.83 (дд, 1Н, J_7,6=8.7, J_7,9=2.4, Н⁷); 7.44 (д, 1Н, J_6,7=8.7, Н⁶). Спектр ЯМР ¹³С (CDCl₃), δ, м. д.: 155.10 (с, С¹); 161.28 (с, С²); 111.74 (с, С³); 152.44 (с, С⁴); 113.37 (с, С⁵); 125.21 (д, С⁶); 112.91 (д, С⁷); 161.96 (с, С⁸); 101.75 (д, С⁹); 18.51 (к, С¹⁰); 71.06 (т, С¹¹); 142.96 (с, С¹²); 121.30 (д, С¹³); 31.18 (т, С¹⁴); 40.70 (д, С¹⁵); 37.99 (с, С¹⁶); 43.10 (д, С¹⁷); 31.39 (т, С¹⁸); 26.01 (к, С¹⁹); 20.96 (к, С²⁰). Найдено: m/z=310.1564 [М]⁺ (С₂₀Н₂₂О₃)⁺ Вычислено: m/z=310.1563.

Пример 6. Синтез 7-(((1S,5R)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)метокси)-4-метил-2H-хромен-2-она ((+)-II)

К 0.108 г (0.5 ммоль) соединения VI в 5 мл этанола прибавили 0.104 г (0.75 ммоль) K₂СO₃ и 0.132 г (0.75 ммоль) бромида (+)-IV при 25°С и перемешивании. Перемешивали при комнатной температуре 15 минут, затем нагревали при 80°С в течение 5 часов. Горячий раствор отфильтровали, фильтрат выдерживали при -10°С в течение 48 часов, упарили. Продукт (+)-II выделили колоночной хроматографией на силикагеле, элюент - раствор, содержащий от 25 до 100% хлороформа в гексане. Выход составил 0.047 г (30%).

=+36 (EtOH, с=0.8). Т_пл=85°С. Спектры ЯМР ¹Н и ¹³С соединения (+)-II соответствует спектрам энантиомера (-)-П. Найдено: m/z=310.1559 [М]⁺ (С₂₀Н₂₂О₃)⁺ Вычислено: m/z=310.1563,

Пример 7. Исследование влияния предлагаемых соединений на активность Tdp1

Рекомбинантная тирозил-ДНК-фосфодиэстераза 1 человека (КФ 3.1.4.) была экспрессирована в системе Escherichia coli (плазмида рЕТ 16B-Tdp1 любезно предоставлена доктором Кальдекотт К.У., Университет Сассекса, Великобритания) и выделена, как описано [Interthal, 2001].

В качестве тест-системы для определения ингибирующих свойств предлагаемых соединений использована реакция удаления тушителя флуоресценции Black Hole Quencher 1 (BHQ1) с 3'-конца олигонуклеотида, катализируемая Tdp1. На 5'-конце олигонуклеотида находится (5,6)-FAM - флуорофор, интенсивность флуоресценции которого возрастает при удалении тушителя. Для измерения флуоресценции использовался флуориметр POLARstar OPTIMA производства BMG LABTECH.

Реакционные смеси объемом 200 мкл содержали буфер (50 мМ Tris-HCl, рН 8.0; 50 мМ NaCl; 7 мМ меркаптоэтанол), 50 нМ олигонуклеотид и различные концентрации ингибиторов. Реакция запускалась добавлением Tdp1 до конечной концентрации 1.3 нМ. Измерения проводились в линейном диапазоне зависимости скорости реакции от времени (до 8 минут) через каждые 55 секунд. Влияние предлагаемых соединений оценивали по величине IC₅₀ (концентрация ингибитора, при которой активность фермента снижена наполовину). Обсчет значений IC₅₀ проводился с помощью программы MARS Data Analisys 2.0 (BMG LABTECH).

Величины IC₅₀ для изученных соединений приведены в таблице.

Использованная литература

- Alagoz М, et al., Nucleic Acids Res., 2013, [Epub ahead of print].

- Antony, S et al., Nucleic Acids Res. 2007, 35, 4474-4484.

- Barthelmes HU, et al., J Biol Chem. 2004, 279, 55618-25565.

- Beretta GL, et al., Curr. Med. Chem. 2010, 17, 1500-1508.

- Cortes Ledesma F, et al., Nature, 2009, 461, 674-678.

- Das BB, et al., The EMBO Journal., 2009, 28, 3667-3680.

- Dexheimer TS, et al., Anticancer Agents Med Chem. 2008, 8, 381-389.

- El-Khamisy SF, et al., DNA Repair (Amst)., 2009, 8 760-766.

- Hirano R, et al., EMBO J., 2007, 26, 4732-4743.

- Interthal H, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001, 98, 12009-12014.

- Katyal S, et al, EMBO J., 2007, 26, 4720-4731.

- Khomenko TM, et al., Letters in Drug Design & Discovery, 2009, 6, 464-467.

- Kutuzov MM, et al., Biopolym. and Cell, 2012, 28, 239-241.

- Nguyen TX, et al., J. Med. Chem., 2012, 55, 4457-4478.

- Nivens MC, et al., Cancer Chemother Pharmacol., 2004, 53, 107-115.

- Murai J, et al., J Biol Chem. 2012, 287,12848-12857.

- Pommier Y. Nat. Rev. Cancer, 2006, 6, 789-802.

- Pommier Y, et al. Chem Biol., 2010, 17, 421-433.

- Zakharenko A, et al., Bioorg. Med. Chem., 2015, 23, 2044-2052.

Изобретение относится к молекулярной биологии, биохимии и биотехнологии. Предложено средство, представляющее собой производное хроменона:

, где n=1 или 2,

или

проявляющее способность ингибировать действие фермента тирозил-ДНК-фосфодиэстеразы 1 человека. Предлагаемое средство расширяет арсенал ингибиторов фермента тирозил-ДНК-фосфодиэстеразы 1 человека и может быть использовано для разработки противораковых лекарственных препаратов. 1 табл., 7 пр.

Средство, представляющее собой производное хроменона общей формулы I:

где n=1 или 2,

или II:

проявляющее ингибирующее действие в отношении фермента тирозил-ДНК-фосфодиэстеразы 1 человека.