Средство для ингибирования фермента тирозил-ДНК-фосфодиэстеразы 1 человека на основе фенилкумаринов, сенсибилизирующее опухоли к действию противоопухолевых агентов Российский патент 2020 года по МПК A61K31/352 C07D311/16 A61P35/00 

Изобретение относится к молекулярной биологии, биохимии и биотехнологии, конкретно к соединениям, представляющим собой производные фенилкумаринов общей формулы I:

где R¹ может быть атомом водорода, галогеном или алкокси группой, a R² может быть бензилом, 3,7-диметилокта-2,6-диен-1-илом, (6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)метилом или (6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)этилом, у которых выявлена биологическая активность, заключающаяся в способности ингибировать действие фермента тирозил-ДНК-фосфодиэстеразы 1 человека и сенсибилизировать опухоли к действию противоопухолевых агентов.

Традиционная химиотерапия онкологических заболеваний направлена на повреждение ДНК злокачественных клеток, и одним из факторов, влияющих на ее результат, является эффективность систем репарации ДНК. Во многих раковых клетках отдельные ферменты репарации ДНК гиперэкспрессированы, что в сочетании с ускоренной клеточной пролиферацией приводит к резистентности таких опухолей к лекарственным препаратам. Развитие молекулярной биологии привело к принципиальному изменению подходов к созданию новых противоопухолевых препаратов. Важным стратегическим направлением лечения онкологических заболеваний является избирательное подавление активности ряда ферментов, вовлеченных в регуляцию жизнедеятельности клеток. В последнее время соединения - ингибиторы репарации ДНК рассматриваются как потенциальные лекарства [Hosoya N., Miyagawa K., Targeting DNA damage response in cancer therapy. // Cancer Sci. 2014, 105, 370-388]. При лишении раковой клетки способности к восстановлению поврежденной ДНК, существенно возрастает эффективность традиционных методов лечения. Поиск ингибиторов ключевых ферментов репарации ДНК относится к перспективным направлениям медицинской химии и является одним из путей создания эффективной терапии сердечно-сосудистых, нейродегенеративных и онкологических заболеваний [Laev S.S., Salakhutdinov N.F., Lavrik O.I., Tyrosyl-DNA phosphodiesterase inhibitors: Progress and potential // Bioorg. Med. Chem. 2016, 24, 5017-5027].

К числу перспективных мишеней относится фермент тирозил-ДНК-фосфодиэстераза1 (Tdp1). Этот фермент является важной мишенью в случае противоопухолевой терапии, основанной на применении ингибиторов топоизомеразы 1 (Top1) [Negrini S., Gorgoulis V.G., Halazonetis T.D., Genomic instability-an evolving hallmark of cancer. // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2010, 11, 220-228]. Tdp1 играет ключевую роль в удалении аддуктов Top1-ДНК, стабилизированных ингибиторами Top1, такими как камптотецин и его клинические производные. Мутация в гене Tdp1 делает клетки гиперчувствительными к камптотецину - каноническому ингибитору Top1 [El-Khamisy S.F., Masutani М., Suzuki Н., Caldecott K.W., A requirement for PARP-1 for the assembly or stability of XRCC1 nuclear foci at sites of oxidative DNA damage. // Nucleic Acids Res., 2003, 31, 5526-5533]. Мыши, нокаутные по Tdp1, гиперчувствительны к камптотецину и его производным. Также при подавлении экспрессии Tdp1 с помощью миноциклина усиливается антиметастатический эффект иринотекана и увеличивается продолжительность жизни экспериментальных животных [Huang Н.-С., Liu J., Baglo Y., Rizvi I., Anbil S., Pigula M., Hasan Т., Mechanism-informed Repurposing of Minocycline Overcomes Resistance to Topoisomerase Inhibition for Peritoneal Carcinomatosis. // Mol. Cancer Ther., 2018, 17, 508-520]. И, наоборот, гиперэкспрессия Tdp1 приводит к защите клеток от повреждений ДНК, вызванных камптотецином [Nivens М.С., Pouliot J.J., Felder Т., Pena М.М.О., Spencer Н.Т., Galloway, А.Н., Engineered resistance to camptothecin and antifolates by retroviral coexpression of tyrosyl DNA phosphodiesterase-I and thymidylate synthase. // Cancer Chemother. Pharmacol., 2004, 53, 107-115; Alagoz M., Gilbert D.C., El-Khamisy S., Chalmers A.J., DNA Repair and Resistance to Topoisomerase I Inhibitors: Mechanisms, Biomarkers and Therapeutic Targets. // Curr. Med. Chem., 2012, 19, 3874-3885]. Более того, в опухолях кишечника с гиперэкспрессией Tdp1 снижен ответ на терапию иринотеканом [Meisenberg С., Gilbert D.C., Chalmers A., Haley V., Gollins S., Ward S.E., El-Khamisy, S.F., Clinical and Cellular Roles for TDP1 and TOP1 in Modulating Colorectal Cancer Response to Irinotecan. // Mol. Cancer Ther. 2015, 14, 575-585]. Следовательно, подавление активности Tdp1 может значительно усилить терапевтический эффект ингибиторов Top1.

В литературе имеются данные о некоторых ингибиторах Tdp1, эффективных при различных концентрациях в диапазоне значений IC₅₀ 0.15-100 мкМ. Известны ингибиторы производные гликозидов: неомицина, нетилмицина, спектиномицина [Liao Z., Thibaut L., Jobson A., Pommier Y., Inhibition of Human Tyrosyl-DNA Phosphodiesterase by Aminoglycoside Antibiotics and Ribosome Inhibitors // Mol. Pharmacol. 2006, 70, 366-372]. Однако для ингибирования необходимы достаточно высокие концентрации, кроме того, селективность ингибирования данного фермента очень низкая. В том же диапазоне концентраций ингибируют тирозил-ДНК-фосфодиэстеразу 1 диамидины [Huang S.N., Pommier Y., Marchand С., Tyrosyl-DNA Phosphodiesterase 1 (Tdp1) inhibitors // Expert Opin. Ther. Pat. 2011, 9, 1285-1292]. Активно изучается способность ингибировать Tdp1 производных инденоизохинолина [Elsayed M.S.A., Su Y., Wang P., Sethi Т., Agama K., Ravji A., Redon C.E., Kiselev E., Horzmann K.A., Freeman J.L., Yves Pommier Y., Cushman M., Design and Synthesis of Chlorinated and Fluorinated 7 Azaindenoisoquinolines as Potent Cytotoxic Anticancer Agents That Inhibit Topoisomerase, I // J. Med. Chem. 2017, 60, 5364-5376]. Исследована ингибирующая активность в отношении Tdp1 производных 2-циано-3-фенилпроп-2-ентиоамида. Соединения ингибируют фермент со значениями IC₅₀=0.9-100 мкМ [Sirivolu V.R., Vernekar S.K., Marchand С., Naumova A., Chergui A., Renaud А., Stephen A.G., Chen F., Sham Y.Y., Pommier Y., Wang Z., 5-Arylidenethioxothiazolidinones as inhibitors of tyrosyl-DNA phosphodiesterase I // J. Med. Chem. 2012, 55, 8671-8684]. Были обнаружены такие новые классы ингибиторов как аналоги бензопентатиепина [Zakharenko A., Khomenko Т., Zhukova S., Koval О., Zakharova О., Anarbaev R., Lebedeva N., Korchagina D., Komarova N., Vasiliev V., Reynisson J., Volcho K., Salakhutdinov N., Lavrik O. // Bioorg. Med. Chem. 2015, 23, 2044-2052], производные кумаринов [Khomenko Т., Zakharenko A., Odarchenko Т., Arabshahi H.J., Sannikova V., Zakharova O., Korchagina D., Reynisson J., Volcho K., Salakhutdinov N., Lavrik O. // Bioorg. Med. Chem. 2016, 24, 5573-5581] и производные усниновой кислоты [Zakharenko A., Luzina О., Koval О., Nilov D., Gushchina I., Dyrkheeva N., V., Salakhutdinov N., Lavrik O. // J. Nat. Prod. 2016, 79, 2961-2967].

Наиболее близким по свойствам к заявляемым соединениям - прототипом, является инденоизохинолин, представляющий собой полициклическую структуру формулы II [Nguyen ТХ, Morrell A, Conda-Sheridan М, Marchand С, Agama K, Bermingham A, Stephen AG, Chergui A, Naumova A, Fisher R, O'Keefe BR, Pommier Y, Cushman M. // J Med Chem. 2012, 23, 55, 7297]. Недостатками известного соединения являются невысокая активность в отношении очищенного фермента Tdp1 (IC₅₀ 29.5 мкМ) и значительная цитотоксичность.

Задачей изобретения является выявление нового эффективного ингибитора фермента Tdp1, обладающего высокой активностью и низкой токсичностью и проявляющего синергетический эффект с противоопухолевыми препаратами, например, топотеканом в отношении опухолевых клеток.

Технический результат: повышение эффективности ингибирования фермента Tdp1, расширение ассортимента ингибиторов фермента Tdp1 и усиление цитотоксического действия химиопрепарата топотекана на опухолевые клетки.

Поставленная задача решается применением производных 7-гидрокси-4-фенил-2H-хромен-2-она общей формулы I, у которых выявлена высокая ингибирующая активность в отношении фермента репарации Tdp1 (IC₅₀ 0.4-4.3 мкМ), низкая токсичность в отношении ряда опухолевых клеток и усиление эффективности действия топотекана в отношении карциномы Кребс-2 мышей.

Соединения общей формулы I могут быть синтезированы взаимодействием фенилзамещенных кумаринов III с соответствующими алкилирующими агентами, например, бромидами IV-VI в соответствии со следующей схемой:

Соединения III могут быть синтезированы, например, взаимодействием резорцина VII с эфирами соответствующих β-кетокислот VIII по следующей схеме:

Эфиры β-кетокислот VIII (R=F, OMe, Br) могут быть синтезированы из 4-метокси(или 4-фтор)ацетофенонов IX и диэтилкарбоната в присутствии гидрида натрия по следующей схеме:

Соединения IV и Vb (n=2) могут быть синтезированы, например, из монотерпеноидов гераниола X и нопола XI в соответствии со следующей схемой:

Соединение Va (n=1) может быть синтезировано, например, из монотерпеноида миртеналя XII в соответствии со следующей схемой:

Для получения обоих энантиомеров соединения Va в качестве исходных соединений использовались (+)- и (-)-миртенали (+)- и (-)-XII.

Структура полученных соединений I подтверждена данными ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии.

Результаты тестирования соединений общей структуры I на способность ингибировать фермент Tdp1 приведены в таблице. Все представленные соединения проявили высокую ингибирующую активность в отношении фермента Tdp1, с IC₅₀ в субмикромолярном или нижнем микромолярном диапазонах.

Анализ цитотоксичности предлагаемых соединений проводили на линиях клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 и рака шейки матки человека HeLa. Показано, что для всех испытанных соединений цитотоксичность отсутствовала или была незначительна во всем диапазоне изученных концентраций (до 100 мкМ), что делает принципиально возможным использование их как сенсибилизаторов опухолей к применяющимся в настоящее время противоопухолевым препаратам без привнесения дополнительной токсичности.

Изучение влияния соединения Ia на противоопухолевый эффект ингибитора Top1 топотекана проводили с использованием модельной опухоли карцинома Кребс-2 мышей. Совместное применение Ia с топотеканом приводило к достоверному снижению веса асцитической опухоли по сравнению с применением только топотекана. Использование Ia в отсутствие топотекана влияния на рост опухоли не оказывало.

Технический результат: получен класс эффективных ингибиторов Tdp1 с хорошими ингибирующими характеристиками (IC₅₀ от 0.4 до 4.3 мкМ), обладающих незначительной цитотоксичностью и способных усиливать противоопухолевый эффект ингибиторов Top1.

Соединения общей формулы I, после проведения углубленных фармакологических исследований, могут использоваться для дальнейшей разработки новых высокоэффективных противораковых средств.

Ниже приводятся конкретные примеры реализации заявляемого технического решения.

Пример 1. Синтез (Е)-7-(3,7-диметилокта-2,6-диенилокси)-4-(4-фторофенил)-2Н-хромен-2-она Ia

К 0.228 г (1.05 ммоль) бромида IV в 5 мл диметилформамида прибавили 0.182 г (0.71 ммоль) соединения III и 0.320 г (2.10 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена (ДБУ) и при 25°C и перемешивании. Перемешивали при комнатной температуре 15 минут, затем нагревали при 60°C в течение 5 часов. Добавили 5 мл воды и 5 мл этилацетата. Этилацетатный слой отделили, водный - экстрагировали этилацетатом (2×5 мл), объединенный экстракт промыли водой и высушили Na₂SO₄, упарили. Продукт Ia выделили кристаллизацией из этанола, выход составил 0.086 г (31%).

Т_пл=72°С. Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м. д, J, Hz): 1.58 (с, 3Н, С²⁴Н₃); 1.64 (с, 3Н, С²³Н₃); 1.74 (с, 3Н, С²⁵Н₃); 2.02-2.16 (м, 4Н, 2Н¹⁹, 2Н²⁰); 4.60 (д, 2Н, J_16,17=6.5, 2Н¹⁶); 5.06 (тм, 1Н, J_21,20=6.8, другие J<2, Н²¹); 5.45 (тм, J_17,16=6.5, другие J<2, 1Н, Н¹⁷); 6.16 (с, 1Н, Н³); 6.78 (дд, 1H, J_7,6=8.9, J_7,9=2.5, Н⁷); 6.87 (д, 1H, J_9,7=2.5, Н⁹); 7.19 (дд, 2Н, J_12,11=J_14,15=8.7, J_12(14),F=8.7, Н¹², Н¹⁴); 7.30 (д, 1H, J_6,7=8.9, Н⁶); 7.41 (дд, 2Н, J_11,12=J_15,14=8.7, J_11(15),F=5.3, Н¹¹, Н¹⁵). Спектр ЯМР ¹³С (CDCl₃, δ, м. д.): 155.86 (с, С¹); 160.98 (с, С²); 111.77 (д, С³); 154.66 (с, С⁴); 112.17 (с, С⁵); 127.51 (д, С⁶); 112.95 (д, С⁷); 162.12 (с, С⁸); 101.84 (д, С⁹); 131.52 (с, ⁴J=3.4, С¹⁰); 130.18 (д, ³J=8.3, С¹¹, С¹⁵); 115.89 (д, ²J=21.4, С¹², С¹⁴); 163.35 (с, ¹J=250.0, С¹³); 65.43 (т, С¹⁶); 118.29 (д, С¹⁷); 142.30 (с, С¹⁸); 39.39 (т, С¹⁹); 26.13 (т, С²⁰); 123.49 (д, С²¹); 131.82 (с, С²²); 25.51 (к, С²³); 17.57 (к, С²⁴); 16.64 (к, С²⁵). Найдено: m/z=392.1778 [М]⁺ (C₂₅H₂₅O₃F)⁺ Вычислено: m/z=392.1782.

Пример 2. Синтез (Е)-7-(3,7-диметилокта-2,6-диенилокси)-4-(4-метоксифенил)-2Н-хромен-2-она Ib

К 0.240 г (1.05 ммоль) бромида IV в 5 мл диметилформамида прибавили 0.190 г (0.71 ммоль) соединения III и 0.320 г (2.10 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена (ДБУ) и при 25°С и перемешивании. Перемешивали при комнатной температуре 15 минут, затем нагревали при 60°С в течение 5 часов. Добавили 5 мл воды и 5 мл этилацетата. Этилацетатный слой отделили, водный - экстрагировали этилацетатом (2×5 мл), объединенный экстракт промыли водой и высушили Na₂SO₄, упарили. Выделили хроматографией на SiO₂ 0.082 г продукта Ib (29%).

Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м. д, J, Hz): 1.58 (с, 3Н, С²⁴Н₃); 1.64 (м, 3Н, все J<2.0, С²³Н₃); 1.74 (м, 3Н, все J<1.5, С²⁵Н₃); 2.03-2.15 (м, 4Н, 2Н¹⁹, 2Н²⁰); 3.86 (с, 3Н, С²⁶Н₃); 4.59 (д, 2Н, J_16,17=6.6, 2Н¹⁶); 5.06 (тм, 1Н, J_21,20=6.8, другие J<1.5, Н²¹); 5.45 (тм, 1H, J_17,16=6.6, другие J<1.5, Н¹⁷); 6.16 (с, 1Н, Н³); 6.78 (дд, 1Н, J_7,6=8.9, J_7,9=2.5, Н⁷); 6.86 (д, 1Н, J_9,7=2.5, Н⁹); 7.00 (ш.д, 2Н, J_12,11=J_14,15=8.7, Н¹², Н¹⁴); 7.37 (ш.д, 2Н, J_11,12=J_15,14=8.7, Н¹¹, Н¹⁵); 7.41 (д, 1H, J_6,7=8.9, Н⁶). Спектр ЯМР ¹³С (CDCl₃, δ, м. д.): 155.85 (с, С¹); 161.34 (с, С²); 111.08 (д, С³); 155.40 (с, С⁴); 112.39 (с, С⁵); 127.78 (д, С⁶); 112.74 (д, С⁷); 161.87 (с, С⁸); 101.70 (д, С⁹); 127.74 (с, С¹⁰); 129.73 (д, С¹¹, С¹⁵); 114.12 (д, С¹², С¹⁴); 160.60 (с, С¹³); 65.34 (т, С¹⁶); 118.31 (д, С¹⁷); 142.21 (с, С¹⁸); 39.38 (т, С¹⁹); 26.10 (т, С²⁰); 123.48 (д, С²¹); 131.80 (с, С²²); 25.52 (к, С²³); 17.57 (к, С²⁴); 16.63 (к, С²⁵); 55.28 (к, С²⁶). Найдено: m/z=404.1980 [М]⁺ (C₂₆H₂₈O₄)⁺ Вычислено: m/z=404.1982.

Пример 3. Синтез 4-(4-бромофенил)-(E)-7-(3,7-диметилокта-2,6-диенилокси)-2Н-хромен-2-она (-)-Ic

К 0.228 г (1.05 ммоль) бромида IV в 5 мл диметилформамида прибавили 0.226 г (0.71 ммоль) соединения III и 0.320 г (2.10 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена (ДБУ) и при 25°С и перемешивании. Перемешивали при комнатной температуре 15 минут, затем нагревали при 60°С в течение 5 часов. Добавили 5 мл воды и 5 мл этилацетата. Этилацетатный слой отделили, водный - экстрагировали этилацетатом (2×5 мл), объединенный экстракт промыли водой и высушили Na₂SO₄, упарили. Продукт Ic выделили кристаллизацией из этанола, выход составил 0.127 г (40%).

Т_пл=80°C. Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м. д, J, Hz): 1.58 (ш.с, 3Н, С²⁴Н₃); 1.64 (м, 3Н, все J<1.5, С²³Н₃); 1.74 (ш.с, 3Н, С²⁵Н₃); 2.03-2.14 (м, 4Н, 2Н¹⁹, 2Н²⁰); 4.59 (д, 2Н, J_16,17=6.6, 2Н¹⁶); 5.06 (тм, 1Н, J_21,20=6.7, другие J<1.5, Н²¹); 5.44 (тм, J_17,16=6.6, другие J<1.5, 1Н, Н¹⁷); 6.16 (с, 1Н, Н³); 6.78 (дд, 1Н, J_7,6=8.9, J_7,9=2.5, Н⁷); 6.87 (д, 1Н, J_9,7=2.5, Н⁹); 7.28 (д, 1Н, J_6,7=8.9, Н⁶); 7.29 (ш.д, 2Н, J_11,12=J_15,14=8.5, Н¹¹, Н¹⁵); 7.63 (ш.д, 2Н, J_12,11=J_14,15=8.5, Н¹², Н¹⁴). Спектр ЯМР ¹³С (CDCl₃, δ, м. д.): 155.82 (с, С¹); 160.92 (с, С²); 111.65 (д, С³); 154.52 (с, С⁴); 111.83 (с, С⁵); 127.43 (д, С⁶); 112.99 (д, С⁷); 162.13 (с, С⁸); 101.78 (д, С⁹); 134.31 (с, С¹⁰); 129.84 (д, С¹¹, С¹⁵); 131.98 (д, С¹², С¹⁴); 123.87 (с, С¹³); 65.39 (т, С¹⁶); 118.16 (д, С¹⁷); 142.38 (с, С¹⁸); 39.37 (т, С¹⁹); 26.08 (т, С²⁰); 123.45 (д, С²¹); 131.84 (с, С²²); 25.54 (к, С²³); 17.59 (к, С²⁴); 16.65 (к, С²⁵). Найдено: m/z=452.0979 [М]⁺ (C₂₅H₂₅O₃Br)⁺ Вычислено: m/z=452.0982.

Пример 4. Синтез (Е)-7-(3,7-диметилокта-2,6-диенилокси)-4-фенил-2Н-хромен-2-она Id

К 0.119 г (0.5 ммоль) соединения III в 5 мл этанола прибавили 0.104 г (0.75 ммоль) K₂CO₃ и 0.163 г (0.75 ммоль) бромида IV при 25°С и перемешивании. Перемешивали при комнатной температуре 15 минут, затем нагревали при 60°С в течение 5 часов. Горячий раствор отфильтровали, фильтрат выдерживали при -10°С в течение 48 часов. Продукт Id выделили кристаллизацией из этанола, выход составил 0.105 г (56%).

Т_пл=54°С. Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м. д, J, Hz): 1.58 (ш.с, 3Н, С²⁴Н₃); 1.64 (м, 3Н, все J<1.5, С²³Н₃); 1.74 (м, 3Н, все J<1.5, С²⁵Н₃); 2.03-2.15 (м, 4Н, 2Н¹⁹, 2Н²⁰); 4.60 (д, 2Н, J_16,17=6.6, 2Н¹⁶); 5.06 (тм, 1Н, J_21,20=6.8, другие J<1.5, Н¹⁷); 5.45 (тм, J_17,18=6.6, другие J<1.5, 1Н, Н¹⁷); 6.18 (с, 1H, Н³); 6.77 (дд, 1Н, J_7,6=8.9, J_7,9=2.5, Н⁷); 6.87 (д, 1Н, J_9,7=2.5, Н⁹); 7.34 (д, 1H, J_6,7=8.9, Н⁶); 7.39-7.43 (м, 2Н, Н¹¹, Н¹⁵); 7.46-7.51 (м, 3Н, Н¹², Н¹³, Н¹⁴). Спектр ЯМР ¹³С (CDCl₃, δ, м. д.): 155.85 (с, С¹); 161.12 (с, С²); 111.61 (д, С³); 155.70 (с, С⁴); 112.28 (с, С⁵); 127.75 (д, С⁶); 112.81 (д, С⁷); 161.99 (с, С⁸); 101.75 (д, С⁹); 135.52 (с, С¹⁰); 128.23 (д, С¹¹, С¹⁵); 128.66 (д, С¹², С¹⁴); 129.40 (д, С¹³); 65.38 (т, С¹⁶); 118.34 (д, С¹⁷); 142.19 (с, С¹⁸); 39.37 (т, С¹⁹); 26.11 (т, С²⁰); 123.49 (д, С²¹); 131.78 (с, С²²); 25.50 (к, С²³); 17.56 (к, С²⁴); 16.63 (к, С²⁵). Найдено: m/z=374.1879 [М]⁺ (C₂₅H₂₆O₃)⁺ Вычислено: m/z=374.1877.

Пример 5. Синтез 7-(((1R,5S)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)метокси)-4-(4-фторофенил)-2Н-хромен-2-она (-)-Ie

К 0.128 г (0.5 ммоль) соединения III в 5 мл этанола прибавили 0.104 г (0.75 ммоль) K₂CO₃ и 0.161 г (0.75 ммоль) бромида (-)-Va при 25°С и перемешивании. Перемешивали при комнатной температуре 15 минут, затем нагревали при 60°С в течение 5 часов. Горячий раствор отфильтровали, фильтрат выдерживали при -10°С в течение 48 часов. Выделили хроматографией на SiO₂ 0.084 г исходного кумарина (конверсия 34%) и 0.035 г продукта (-)-Ie, выход с учетом конверсии (53%).

(с=0.68, CHCl₃). Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м. д, J, Hz): 0.81 (с, 3Н, С²⁵Н₃); 1.17 (д, 1Н, J_23a,23c=8.7, Н^23а); 1.28 (с, 3Н, С²⁴Н₃); 2.11 (ддтд, 1Н, J_20,22=J_20,23s=5.6, J_20,19=2.9, J_20,18=1.3, H²⁰); 2.20 (ддд, 1H, J_22,20=J_22,23s=5.6, J_22,18=1.4, H²²); 2.26 (д. м, 1H, J_19,19'=18.0, другие J<3.5, H¹⁹); 2.33 (д.м, 1H, ²J_19',19=18.0, другие J<3.5, H^19'); 2.40 (ддд, 1H, J_23s,23a=8.7, J_23s,20=J_23s,22=5.6, H^23s); 4.41-4.49 (м, 2H, 2H¹⁶); 5.61-5.64 (м, 1H, H¹⁸); 6.16 (с, 1H, Н³); 6.78 (дд, 1Н, J_7,6=8.9, J_7,9=2.5, Н⁷); 6.88 (д, 1Н, J_9,7=2.5, Н⁹); 7.16-7.21 (м, 2Н, J_12,11=J_14,15=8.8, J_12(14),F=8.6, Н¹², Н¹⁴); 7.29 (д, 1Н, J_6,7=8.9, Н⁶); 7.38-7.43, (м, 2Н, J_11,12=J_15,14=8.8, J_11(15),F=5.3, Н¹¹, Н¹⁵). Спектр ЯМР ¹³С (CDCl₃, δ, м. д.): 155.80 (с, С¹); 161.02 (с, С²); 111.78 (д, С³); 154.66 (с, С⁴); 112.18 (с, С⁵); 127.42 (д, С⁶); 113.03 (д, С⁷); 162.23 (с, С⁸); 102.07 (д, С⁹); 131.52 (с, ⁴J=3.5, С¹⁰); 130.19 (д, ³J=8.3, С¹¹, С¹⁵); 115.88 (д, ²J=21.8, С¹², С¹⁴); 71.14 (т, С¹⁶); 142.86 (с, С¹⁷); 121.39 (д, С¹⁸); 31.18 (т, С¹⁹); 40.69 (д, С²⁰); 38.00 (с, С²¹); 43.09 (д, С²²); 31.39 (т, С²³); 26.00 (к, С²⁴); 20.97 (к, С²⁵). Найдено: m/z=390.1624 [М]⁺ (C₂₅H₂₃O₃F)⁺ Вычислено: m/z=390.1626.

Пример 6. Синтез 7-(((1R,5S)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)метокси)-4-(4-метоксифенил)-2Н-хромен-2-она (-)-If

К 0.134 г (0.5 ммоль) соединения III в 5 мл этанола прибавили 0.104 г (0.75 ммоль) K₂CO₃ и 0.161 г (0.75 ммоль) бромида (-)-Va при 25°С и перемешивании. Перемешивали при комнатной температуре 15 минут, затем нагревали при 60°С в течение 5 часов. Горячий раствор отфильтровали, фильтрат выдерживали при -10°С в течение 48 часов. Выделили хроматографией на SiO₂ 0.060 г исходного кумарина (конверсия 55%) и 0.065 г продукта (-)-If, выход с учетом конверсии (59%).

Т_пл=124°С. (с=0.82, CHCl₃). Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м. д, J, Hz): 0.81 (с, 3Н, С²⁶Н₃); 1.17 (д, 1Н, ²J_24a,24s=8.7, Н^24а); 1.28 (с, 3Н, С²⁵Н₃); 2.10 (ддтд, 1H, J_21,24s=J_21,23=5.6, J_21,20=2.8, J_21,19=1.3, H²¹); 2.20 (ддд, 1Н, J_23,21=J_23,24s=5.6, J_23,19=1.4, H²³); 2.25 (дм, 1H, J_20,21'=18.0, другие J<3.0, H²⁰); 2.33 (дм, 1H, J_20',20=18.0, другие J<3.5, H^20'); 2.40 (ддд, 1H, J_24s,24a=8.7, J_24s,21=J_24s,23=5.6, H^24s); 3.85 (с, 3H, C¹⁶H₃); 4.40-4.48 (м, 2H, 2H¹⁷); 5.60-5.63 (м, 1H, H¹⁹); 6.14 (с, 1H, H³); 6.77 (дд, 1H, J_7,6=8.9, J_7,9=2.5, H⁷); 6.86 (д, 1H, J_9,7=2.5, H⁹); 7.00 (ш.д, 2Н, J_12,11=J_14,15=8.8, H¹², H¹⁴); 7.36 (ш.д, 2H, J_11,12=J_15,14=8.8, H¹¹, H¹⁵); 7.39 (д, 1H, J_6,7=8.9, H⁶). Спектр ЯМР ¹³C (CDCl₃, δ, м. д.): 155.80 (с, С¹); 161.30 (с, С²); 111.11 (д, С³); 155.36 (с, С⁴); 112.41 (с, С⁵); 127.67 (д, С⁶); 112.79 (д, С⁷); 161.99 (с, С⁸); 101.96 (д, С⁹); 127.77 (с, С¹⁰); 129.72 (д, С¹¹, С¹⁵); 114.13 (д, С¹², С¹⁴); 160.62 (с, С¹³); 55.27 (к, С¹⁶); 71.06 (т, С¹⁷); 142.91 (с, С¹⁸); 121.26 (д, С¹⁹); 31.15 (т, С²⁰); 40.67 (д, С²¹); 37.97 (с, С²²); 43.07 (д, С²³); 31.37 (т, С²⁴); 25.99 (к, С²⁵); 20.94 (к, С²⁶). Найдено: m/z=402.1820 [М]⁺ (C₂₆H₂₆O₄)⁺ Вычислено: m/z=402.1827.

Пример 7. Синтез 4-(4-бромофенил)-7-(((1R,5S)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)метокси)-2Н-хромен-2-она (-)-IIg

К 0.228 г (1.05 ммоль) бромида (-)-Va в 5 мл диметилформамида прибавили 0.226 г (0.71 ммоль) соединения III и 0.320 г (2.10 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена (ДБУ) и при 25°С и перемешивании. Перемешивали при комнатной температуре 15 минут, затем нагревали при 60°С в течение 5 часов. Добавили 5 мл воды и 5 мл этилацетата. Этилацетатный слой отделили, водный - экстрагировали этилацетатом (2×5 мл), объединенный экстракт промыли водой и высушили Na₂SO₄, упарили. Продукт (-)-Ig выделили кристаллизацией из этанола, выход составил 0.116 г (36%).

Т_пл=130°C. (c=0.52, CHCl₃). Спектр ЯМР ¹H (CDCl₃, δ, м. д, J, Hz): 0.80 (с, 3Н, С²⁵Н₃); 1.16 (д, 1Н, ²J_23a,23s=8.7, Н^23а); 1.28 (с, 3Н, С²⁴Н₃); 2.11 (ддтд, 1H, J_20,22=J_20,23s=5.6, J_20,19=2.9, J_20,18=1.3, H²⁰); 2.08-2.12 (м, 1Н, Н-20), 2.19 (ддд, 1Н, J_22,20=J_22,23s=5.6, J_22,18=1.3, Н²²); 2.25 (дм, 1Н, J_19,19'=18.0, другие J<3.5, Н¹⁹); 2.33 (дм, 1H, ²J_19',19=18.0, другие J<3.5, Н^19'); 2.40 (ддд, 1Н, J_23s,23a=8.7, J_23s,20=J_23s,22=5.6, H^23s); 4.43-4.48 (м, 2Н, 2Н¹⁶); 5.60-5.63 (м, 1Н, Н¹⁸); 6.16 (с, 1Н, Н³); 6.78 (дд, 1Н, J_7,6=8.9, J_7,9=2.5, Н⁷); 6.88 (д, 1Н, J_9,7=2.5, Н⁹); 7.27 (д, 1Н, J_6,7=8.9, Н⁶); 7.30 (д, 2Н, J_11,12=J_15,14=8.5, Н¹¹, Н¹⁵); 7.63 (д, 2Н, J_12,11=J_14,15=8.5, Н¹², Н¹⁴). Спектр ЯМР ¹³С (CDCl₃, δ, м. д.): 155.76 (с, С¹); 160.97 (с, С²); 111.67 (д, С³); 154.53 (с, С⁴); 111.85 (с, С⁵); 127.33 (д, С⁶); 113.10 (д, С⁷); 162.25 (с, С⁸); 102.02 (д, С⁹); 134.32 (с, С¹⁰); 129.85 (д, С¹¹, С¹⁵); 131.98 (д, С¹², С¹⁴); 123.87 (с, С¹³); 71.12 (т, С¹⁶); 142.77 (с, С¹⁷); 121.43 (д, С¹⁸); 31.15 (т, С¹⁹); 40.60 (д, С²⁰); 37.99 (с, С²¹); 43.00 (д, С²²); 31.37 (т, С²³); 25.98 (к, С²⁴); 20.96 (к, С²⁵). Найдено: m/z=450.0826 [М]⁺ (C₂₅H₂₃O₃Br)⁺ Вычислено: m/z=450.0825.

Пример 8. Синтез 7-(((1R,5S)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)метокси)-4-фенил-2Н-хромен-2-она (-)-Ih

К 0.119 г (0.5 ммоль) соединения III в 5 мл этанола прибавили 0.104 г (0.75 ммоль) K₂CO₃ и 0.161 г (0.75 ммоль) бромида (-)-Va при 25°С и перемешивании. Перемешивали при комнатной температуре 15 минут, затем нагревали при 60°С в течение 5 часов. Горячий раствор отфильтровали, фильтрат выдерживали при -10°С в течение 48 часов. Продукт (-)-Ih выделили хроматографией на SiO₂, выход составил 0.074 г (40%). Т_пл=106°С. (с=1.02, EtOH). Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м. д, J, Hz): 0.82 (с, 3Н, С²⁵Н₃); 1.18 (д, 1Н, ²J=8.7, Н^23а); 1.28 (с, 3Н, С²⁴Н₃); 2.08-2.14 (м, 1H, Н²⁰); 2.20 (ддд, 1Н, J_22,20=J_22,23s=5.6, J_22,18=1.4, Н²²); 2.26 (д. м, 1H, ²J=18.1, H^19s); 2.33 (д. м, 1Н, ²J=18.1, Н^19а); 2.41 (ддд, 1H, ²J=8.7, J_23s,20=J_23s,22=5.6, H^23s); 4.44 (д. м, 1Н, ²J=12.4, другие J≤2.0, Н¹⁶); 4.47 (д. м, 1Н, ²J=12.4, другие J≤2.0, Н^16'); 5.61-5.64 (м, 1H, Н¹⁸); 6.19 (с, 1Н, Н³); 6.77 (дд, 1Н, J_7,6=8.9, J_7,9=2.5, Н⁷); 6.89 (д, 1Н, J_9,7=2.5, Н⁹); 7.33 (д, 1H, J_6,7=8.9, Н⁶); 7.40-7.43 (м, 2Н, H¹¹, Н¹⁵); 7.47-7.51 (м, 3Н, Н¹², Н¹³, Н¹⁴). Спектр ЯМР ¹³С (CDCl₃, δ, м. д.): 155.81 (с, С¹); 161.24 (с, С²); 111.65 (д, С³); 155.76 (с, С⁴); 112.32 (с, С⁵); 127.68 (д, С⁶); 112.94 (д, С⁷); 162.14 (с, С⁸); 102.00 (д, С⁹); 135.55 (с, С¹⁰); 128.27 (д, С¹¹, С¹⁵); 128.68 (д, С¹², С¹⁴); 129.42 (д, С¹³); 71.12 (т, С¹⁶); 142.92 (с, С¹⁷); 121.34 (д, С¹⁸); 31.18 (т, С¹⁹); 40.71 (д, С²⁰); 38.00 (с, С²¹); 43.11 (д, С²²); 31.40 (т, С²³); 26.02 (к, С²⁴); 20.97 (к, С²⁵). Найдено: m/z=372.1717 [М]⁺ (C25H24O3)⁺ Вычислено: 372.1720.

Пример 9. Синтез 7-(((1S,5R)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)метокси)-4-(4-фторофенил)-2Н-хромен-2-она (+)-Ie

К 0.128 г (0.5 ммоль) соединения III в 5 мл этанола прибавили 0.104 г (0.75 ммоль) K₂CO₃ и 0.161 г (0.75 ммоль) бромида (+)-Va при 25°С и перемешивании. Перемешивали при комнатной температуре 15 минут, затем нагревали при 60°С в течение 5 часов. Горячий раствор отфильтровали, фильтрат выдерживали при -10°С в течение 48 часов. Продукт (+)-Ie выделили кристаллизацией из этанола, выход составил 0.065 г (33%).

Т_пл=129°С. (CHCl₃, с=0.53). Спектры ЯМР ¹Н и ¹³С соответствуют спектрам энантиомера (-)-Ie. Найдено: m/z=390.1628 [М]⁺ (C₂₅H₂₃O₃F)⁺ Вычислено: m/z=390.1626.

Пример 10. Синтез 7-(((1S,5R)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)метокси)-4-(4-метоксифенил)-2Н-хромен-2-она (+)-If

К 0.225 г (1.05 ммоль) бромида (+)-Va в 5 мл диметилформамида прибавили 0.190 г (0.71 ммоль) соединения III и 0.320 г (2.10 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена (ДБУ) при 25°С и перемешивании. Перемешивали при комнатной температуре 15 минут, затем нагревали при 60°С в течение 5 часов. Добавили 5 мл воды и 5 мл этилацетата. Этилацетатный слой отделили, водный - экстрагировали этилацетатом (2×5 мл), объединенный экстракт промыли водой и высушили Na₂SO₄, упарили. Продукт (+)-If выделили кристаллизацией из этанола, выход составил 0.070 г (25%).

Т_пл=112°C. (с=0.72, CHCl₃). Спектры ЯМР ¹H и ¹³С соответствуют спектрам энантиомера (-)-If. Найдено: m/z=402.1823 [М]⁺ (C₂₆H₂₆O₄)⁺ Вычислено: m/z=402.1827.

Пример 11. Синтез 4-(4-бромофенил)-7-(((1S,5R)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)метокси)-2Н-хромен-2-она (+)-Ig

К 0.228 г (1.05 ммоль) бромида (+)-Va в 5 мл диметилформамида прибавили 0.226 г (0.71 ммоль) соединения III и 0.320 г (2.10 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена (ДБУ) и при 25°С и перемешивании. Перемешивали при комнатной температуре 15 минут, затем нагревали при 60°С в течение 5 часов. Добавили 5 мл воды и 5 мл этилацетата. Этилацетатный слой отделили, водный - экстрагировали этилацетатом (2×5 мл), объединенный экстракт промыли водой и высушили Na₂SO₄, упарили. Продукт (+)-Ig выделили кристаллизацией из этанола, выход составил 0.125 г (39%).

(с=0.58, CHCl₃). Спектры ЯМР ¹Н и ¹³С соответствуют спектрам энантиомера (-)-Ig. Найдено: m/z=450.0825 [М]⁺ (C₂₅H₂₃O₃Br)⁺ Вычислено: m/z=450.0820.

Пример 12. Синтез 7-(((1S,5R)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)метокси)-4-фенил-2Н-хромен-2-она (+)-Ih

К 0.119 г (0.5 ммоль) соединения III в 5 мл этанола прибавили 0.104 г (0.75 ммоль) K₂CO₃ и 0.161 г (0.75 ммоль) бромида (+)-Va при 25°С и перемешивании. Перемешивали при комнатной температуре 15 минут, затем нагревали при 60°С в течение 5 часов. Горячий раствор отфильтровали, фильтрат выдерживали при -10°С в течение 48 часов. Продукт (+)-Ih выделили хроматографией на SiO₂, выход составил 0.079 г (42%).

(с=1.02, EtOH). Спектры ЯМР ¹Н и ¹³С соответствуют спектрам энантиомера (-)-Ih. Найдено: m/z=372.1718 [М]⁺ (C25H24O3)⁺ Вычислено: 372.1720.

Пример 13. Синтез 7-(2-((1R,5S)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)этокси)-4-(4-фторофенил)-2Н-хромен-2-она (-)-Ii

К 0.240 г (1.05 ммоль) бромида Vb в 5 мл диметилформамида прибавили 0.179 г (0.70 ммоль) соединения III и 0.320 г (2.10 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена (ДБУ) и при 25°С и перемешивании. Перемешивали при комнатной температуре 15 минут, затем нагревали при 60°С в течение 5 часов. Добавили 5 мл воды и 5 мл этилацетата. Этилацетатный слой отделили, водный - экстрагировали этилацетатом (2×5 мл), объединенный экстракт промыли водой и высушили Na₂SO₄, упарили. Выделили хроматографией на SiO₂ 0.100 г исходного кумарина III и 0.046 г продукта (-)-Ii (с учетом конверсии 37%).

(с=0.78, CHCl₃). Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м. д, J, Hz): 0.81 (с, 3Н, С²⁶Н₃); 1.16 (д, 1Н, ²J_24a,24c=8.6, Н^24а); 1.26 (с, 3Н, С²⁵Н₃); 2.06-2.10 (м, 2Н, Н^21, Н²³); 2.20 (дм, 1Н, J_20,20'=17.7, Н²⁰); 2.27 (дм, 1Н, J_20',20=17.7, Н^20'); 2.36 (ддд, 1H, J_24s,24a=8.6, J_24s,21=J_24s,23=5.6, H^24s); 2.40-2.51 (м, 2Н, 2Н¹⁷); 4.02 (т, 2Н, J_16,17=7.0, 2Н¹⁶); 5.32-5.36 (м, 1H, Н¹⁹); 6.16 (с, 1Н, Н³); 6.75 (дд, 1Н, J_7,6=8.9, J_7,9=2.5, Н⁷); 6.84 (д, 1Н, J_9,7=2.5, Н⁹); 7.16-7.21 (м, 2Н, J_12,11=J_14,15=8.7, J_12(14),F=8.7, Н¹², Н¹⁴); 7.30 (д, 1Н, J_6,7=8.9, Н⁶); 7.38-7.43 (м, 2Н, J_11,12=J_15,14=8.7, J_11(15),F=5.3, H¹¹, Н¹⁵). Спектр ЯМР ¹³С (CDCl₃, δ, м. д.): 155.90 (с, С¹); 160.94 (с, С²); 111.76 (д, С³); 154.64 (с, С⁴); 112.16 (с, С⁵); 127.54 (д, С⁶); 112.74 (д, С⁷); 162.18 (с, С⁸); 101.57 (д, С⁹); 131.51 (с, ⁴J=3.5, С¹⁰); 130.18 (д, ³J=8.3, С¹¹, С¹⁵); 115.88 (д, ²J=21.8, С¹², С¹⁴); 66.93 (т, С¹⁶); 36.05 (т, С¹⁷); 143.86 (с, С¹⁸); 119.02 (д, С¹⁹); 31.27 (т, С²⁰); 40.64 (д, С²¹); 37.97 (с, С²²); 45.79 (д, С²³); 31.54 (т, С²⁴); 26.17 (к, С²⁵); 21.08 (к, С²⁶). Найдено: m/z=404.1774 [М]⁺ (C₂₆H₂₅O₃F)⁺ Вычислено: m/z=404.1782.

Пример 14. Синтез 7-(2-((1R,5S)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)этокси)-4-(4-метоксифенил)-2Н-хромен-2-она (-)-Ij

К 0.240 г (1.05 ммоль) бромида Vb в 5 мл диметилформамида прибавили 0.188 г (0.71 ммоль) соединения III и 0.320 г (2.10 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена (ДБУ) и при 25°С и перемешивании. Перемешивали при комнатной температуре 15 минут, затем нагревали при 60°С в течение 5 часов. Добавили 5 мл воды и 5 мл этилацетата. Этилацетатный слой отделили, водный - экстрагировали этилацетатом (2×5 мл), объединенный экстракт промыли водой и высушили Na₂SO₄, упарили. Выделили хроматографией на SiO₂ 0.159 г исходного кумарина III (конверсия 16%) и 0.037 г продукта (-)-Ij (выход с учетом конверсии 65%).

(с=0.75, CHCl₃). Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м. д, J, Hz): 0.81 (с, 3Н, С²⁷Н₃); 1.16 (д, 1Н, ²J_25a,25s=8.6, Н^25а); 1.26 (с, 3Н, С²⁶Н₃); 2.05-2.11 (м, 2Н, Н²¹, Н²⁴); 2.19 (дм, 1Н, ²J=17.6, Н²¹); 2.26 (дм, 1Н, ²J=17.6, Н^21'); 2.36 (ддд, 1H, J_25s,25a=8.6, J_25s,22=J_25s,24=5.6, H^25s); 2.40-2.51 (м, 2Н, 2Н¹⁸); 3.86 (с, 3Н, С¹⁶Н₃); 4.02 (т, 2Н, J_17,18=7.0, 2Н¹⁷); 5.32-5.36 (м, 1Н, Н²⁰); 6.15 (с, 1H, Н³); 6.75 (дд, 1H, J_7,6=8.9, J_7,9=2.5, Н⁷); 6.83 (д, 1H, J_9,7=2.5, H⁹); 7.01 (ш.д, 2Н, J_12,11=J_14,15=8.7, Н¹², Н¹⁴); 7.37 (ш.д, 2Н, J_11,12=J_15,14=8.7, Н¹¹, Н¹⁵); 7.40 (д, 1Н, J_6,7=8.9, Н⁶). Спектр ЯМР ¹³С (CDCl₃, δ, м. д.): 155.93 (с, С¹); 161.28 (с, С²); 111.12 (д, С³); 155.38 (с, С⁴); 112.43 (с, С⁵); 127.81 (д, С⁶); 112.54 (д, С⁷); 161.97 (с, С⁸); 101.49 (д, С⁹); 127.79 (с, С¹⁰); 129.74 (д, С¹¹, С¹⁵); 114.16 (д, С¹², С¹⁴); 160.62 (с, С¹³); 55.30 (к, С¹⁶); 66.88 (т, С¹⁷); 36.07 (т, С¹⁸); 143.90 (с, С¹⁹); 118.97 (д, С²⁰); 31.27 (т, С²¹); 40.64 (д, С²²); 37.97 (с, С²³); 45.79 (д, С²⁴); 31.54 (т, С²⁵); 26.17 (к, С²⁶); 21.08 (к, С²⁷). Найдено: m/z=415.1906 [М-Н]⁺ (C₂₇H₂₇O₄)⁺ Вычислено: m/z=415.1904.

Пример 15. Синтез 4-(4-бромофенил)-7-(2-((1R,5S))-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)этокси)-2Н-хромен-2-она (-)-Ik

К 0.240 г (1.05 ммоль) бромида (-)-Vb в 5 мл диметилформамида прибавили 0.226 г (0.71 ммоль) соединения III и 0.320 г (2.10 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена (ДБУ) и при 25°С и перемешивании. Перемешивали при комнатной температуре 15 минут, затем нагревали при 60°С в течение 5 часов. Добавили 5 мл воды и 5 мл этилацетата. Этилацетатный слой отделили, водный - экстрагировали этилацетатом (2×5 мл), объединенный экстракт промыли водой и высушили Na₂SO₄, упарили. Выделили хроматографией на SiO₂ 0.031 г исходного кумарина III (конверсия 86%) и 0.042 г продукта (-)-Ik (выход с учетом конверсии 15%).

(с=0.58, CHCl₃). Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м. д, J, Hz): 0.80 (с, 3Н, С²⁶Н₃); 1.15 (д, 1Н, ²J_24a,24s=8.6, Н^24а); 1.25 (с, 3Н, С²⁵Н₃); 2.06-2.09 (м, 2Н, Н^21, Н²³); 2.19 (дм, 1Н, J_20,20'=17.6, Н²⁰); 2.26 (дм, 1Н, J_20',20=17.6, Н^20'); 2.36 (ддд, 1Н, J_24s,24a=8.6, J_24s,21=J_24s,23=5.6, H^24s); 2.40-2.51 (м, 2Н, 2Н¹⁷); 3.98-4.04 (м, 2Н, 2Н¹⁶); 5.33-5.36 (м, 1Н, Н¹⁹); 6.16 (с, 1Н, Н³); 6.75 (дд, 1H, J_7,6=8.9, J_7,9=2.5, Н⁷); 6.84 (д, 1H, J_9,7=2.5, Н⁹); 7.28 (д, 1Н, J_6,7=8.9, H⁶); 7.28-7.31 (м, 2Н, J_11,12=J_15,14=8.4, Н¹¹, Н¹⁵); 7.61-7.64 (м, 2Н, J_12,11=J_14,15=8.4, Н¹², Н¹⁴). Спектр ЯМР ¹³С (CDCl₃, δ, м. д.): 155.86 (с, С¹); 160.87 (с, С²); 111.65 (д, С³); 154.49 (с, С⁴); 112.81 (с, С⁵); 127.44 (д, С⁶); 112.79 (д, С⁷); 162.19 (с, С⁸); 101.50 (д, С⁹); 134.30 (с, С¹⁰); 129.84 (д, С¹¹, С¹⁵); 131.97 (д, С¹², С¹⁴); 123.86 (с, С¹³); 66.87 (т, С¹⁶); 36.01 (т, С¹⁷); 143.78 (с, С¹⁸); 119.03 (д, С¹⁹); 31.23 (т, С²⁰); 40.54 (д, С²¹); 37.95 (с, С²²); 45.65 (д, С²³); 31.51 (т, С²⁴); 26.14 (к, С²⁵); 21.08 (к, С²⁶). Найдено: m/z=464.0988 [М]⁺ (C₂₆H₂₅O₃Br)⁺ Вычислено: m/z=464.0982.

Пример 16. Синтез 7-(2-((1R,5S)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)этокси)-4-фенил-2Н-хромен-2-она I1

К 0.240 г (1.05 ммоль) бромида (-)-Vb в 5 мл диметилформамида прибавили 0.169 г (0.71 ммоль) соединения III и 0.320 г (2.10 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена (ДБУ) и при 25°С и перемешивании. Перемешивали при комнатной температуре 15 минут, затем нагревали при 60°С в течение 5 часов. Добавили 5 мл воды и 5 мл этилацетата. Этилацетатный слой отделили, водный - экстрагировали этилацетатом (2×5 мл), объединенный экстракт промыли водой и высушили Na₂SO₄, упарили. Выделили двукратным хроматографированием на SiO₂ 0.032 г продукта (-)-I1 (12%).

(с=0.53, CHCl₃). Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м. д, J, Hz): 0.81 (с, 3Н, С²⁶Н₃); 1.16 (д, 1Н, ²J_24a,24s=8.6, Н^24а); 1.26 (с, 3Н, С²⁵Н₃); 2.05-2.11 (м, 2Н, Н²¹, Н²³); 2.20 (д.м, 1Н, J_20,20'=17.6, другие J<3.5, Н²⁰); 2.26 (д. м, 1Н, J_20',20=17.6, другие J<3.5, Н^20'); 2.37 (ддд, 1Н, ²J=8.7, J_24s,24a=8.6, J_24s,21=J_24s,23=5.6, H^24s); 2.40-2.52 (м, 2H, 2Н¹⁷); 3.98-4.06 (м, 2Н, 2Н¹⁶); 5.32-5.36 (м, 1H, Н¹⁹); 6.18 (с, 1Н, Н³); 6.74 (дд, 1Н, J_7,6=8.9, J_7,9=2.5, Н⁷); 6.85 (д, 1Н, J_9,7=2.5, Н⁹); 7.34 (д, 1Н, J_6,7=8.9, Н⁶); 7.39-7.44 (м, 2Н, Н¹¹, Н¹⁵); 7.46-7.51 (м, 3Н, Н¹², Н¹³, Н¹⁴). Спектр ЯМР ¹³С (CDCl₃, δ, м. д.): 155.91 (с, С¹); 161.11 (с, С²); 111.63 (д, С³); 155.71 (с, С⁴); 112.30 (с, С⁵); 127.80 (д, С⁶); 112.63 (д, С⁷); 162.07 (с, С⁸); 101.50 (д, С⁹); 135.54 (с, С¹⁰); 128.25 (д, С¹¹, С¹⁵); 128.68 (д, С¹², С¹⁴); 129.42 (д, С¹³); 66.90 (т, С¹⁶); 36.07 (т, С¹⁷); 143.89 (с, С¹⁸); 118.99 (д, С¹⁹); 31.27 (т, С²⁰); 40.64 (д, С²¹); 37.97 (с, С²²); 45.79 (д, С²³); 31.54 (т, С²⁴); 26.18 (к, С²⁵); 21.08 (к, С²⁶). Найдено: m/z=386.1872 [М]⁺ (C₂₆H₂₆O₃)⁺ Вычислено: m/z=386.1877.

Пример 17. Синтез 7-(бензилокси)-4-(4-метоксифенил)-2Н-хромен-2-она Im

К 0.180 г (1.05 ммоль) бромида VI в 5 мл диметилформамида прибавили 0.182 г (0.71 ммоль) соединения III и 0.320 г (2.10 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена (ДБУ) и при 25°С и перемешивании. Перемешивали при комнатной температуре 15 минут, затем нагревали при 60°С в течение 5 часов. Добавили 5 мл воды и 5 мл этилацетата. Этилацетатный слой отделили, водный - экстрагировали этилацетатом (2×5 мл), объединенный экстракт промыли водой и высушили Na₂SO₄, упарили. Выделили хроматографией на SiO₂ 0.084 г продукта Im (33%).

Т_пл=143°С. Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м. д, J, Hz): 3.86 (с, 3Н, С¹⁶Н₃); 5.12 (с, 2Н, 2Н¹⁷); 6.16 (с, 1Н, Н³); 6.85 (дд, 1H, J_7,6=8.9, J_7,9=2.5, Н⁷); 6.93 (д, 1Н, J_9,7=2.5, Н⁹); 7.01 (дм, 2Н, J_12,11=J_14,15=8.7, Н¹², Н¹⁴); 7.30-7.35 (м, 1H, Н²¹); 7.35-7.45 (м, 7Н, Н⁶, Н¹¹, Н¹⁵, Н¹⁹,Н²⁰, Н²², Н²³). Спектр ЯМР ¹³С (CDCl₃, δ, м. д.): 155.82 (с, С¹); 161.18 (с, С²); 111.34 (д, С³); 155.30 (с, С⁴); 112.75 (с, С⁵); 127.90 (д, С⁶); 112.72 (д, С⁷); 161.61 (с, С⁸); 102.07 (д, С⁹); 127.68 (с, С¹⁰); 129.72 (д, С¹¹, С¹⁵); 114.16 (д, С¹², С¹⁴); 160.65 (с, С¹³); 55.29 (к, С¹⁶); 70.37 (т, С¹⁷); 135.70 (с, С¹⁸); 127.36 (д, С¹⁹, С²³); 128.61 (д, С²⁰, С²²); 128.22 (д, С²¹). Найдено: m/z=358.1198 [М]⁺ (C₂₃H₁₈O₄)⁺ Вычислено: m/z=358.1200.

Пример 18. Синтез 7-(бензилокси)-4-(4-бромофенил)-2Н-хромен-2-она In

К 0.180 г (1.05 ммоль) бромида VI в 5 мл диметилформамида прибавили 0.225 г (0.71 ммоль) соединения III и 0.320 г (2.10 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена (ДБУ) и при 25°С и перемешивании. Перемешивали при комнатной температуре 15 минут, затем нагревали при 60°С в течение 5 часов. Добавили 5 мл воды и 5 мл этилацетата. Этилацетатный слой отделили, водный - экстрагировали этилацетатом (2×5 мл), объединенный экстракт промыли водой и высушили Na₂SO₄, упарили. Продукт In выделили кристаллизацией из этанола, выход составил 0.060 г (21%).

Т_пл=128°C. Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м. д, J, Hz): 5.13 (с, 2Н, 2Н¹⁶); 6.17 (с, 1H, Н³); 6.86 (дд, 1Н, J_7,6=8.9, J_7,9=2.5, Н⁷); 6.94 (д, 1Н, J_9,7=2.5, Н⁹); 7.29 (дм, 2Н, J_11,12=J_15,14=8.5, Н¹¹, Н¹⁵); 7.31 (д, 1Н, J_6,7=8.9, Н⁶); 7.32-7.35 (м, 1Н, Н²⁰); 7.37-7.43 (м, 4Н, Н¹⁸, Н¹⁹, Н²¹, Н²²); 7.63 (дм, 2Н, J_12,11=J_14,15=8.5, Н¹², Н¹⁴). Спектр ЯМР ¹³С (CDCl₃, δ, м. д.): 155.79 (с, С¹); 160.81 (с, С²); 111.92 (д, С³); 154.46 (с, С⁴); 112.18 (с, С⁵); 127.56 (д, С⁶); 113.02 (д, С⁷); 161.86 (с, С⁸); 102.14 (д, С⁹); 134.24 (с, С¹⁰); 129.83 (д, С¹¹, С¹⁵); 132.01 (д, С¹², С¹⁴); 123.92 (с, С¹³); 70.42 (т, С¹⁶); 135.54 (с, С¹⁷); 127.38 (д, С¹⁸, С²²); 128.66 (д, С¹⁹, С²¹); 128.30 (д, С²⁰). Найдено: m/z=406.0204 [М]⁺ (C₂₂H₁₅O₃Br)⁺ Вычислено: m/z=406.0199.

Пример 19. Синтез 7-(бензилокси)-4-фенил-2Н-хромен-2-она Io

К 0.180 г (1.05 ммоль) бромида VI в 5 мл диметилформамида прибавили 0.169 г (0.71 ммоль) соединения III и 0.320 г (2.10 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена (ДБУ) при 25°С и перемешивании. Перемешивали при комнатной температуре 15 минут, затем нагревали при 60°С в течение 5 часов. Добавили 5 мл воды и 5 мл этилацетата. Этилацетатный слой отделили, водный - экстрагировали этилацетатом (2×5 мл), объединенный экстракт промыли водой и высушили Na₂SO₄, упарили. Выделили хроматографией на SiO₂ 0.107 г продукта Io (46%).

Т_пл=92°С. Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м. д, J, Hz): 5.13 (с, 2Н, 2Н¹⁶); 6.19 (с, 1Н, Н³); 6.85 (дд, 1Н, J_7,6=8.9, J_7,9=2.5, Н⁷); 6.94 (д, 1Н, J_9,7=2.5, Н⁹); 7.31-7.35 (м, 1H, Н²⁰); 7.35-7.44 (м, 7Н, Н⁶, Н¹¹, Н¹⁵, Н¹⁸, Н²², Н¹⁹, Н²¹); 7.46-7.52 (м, 3Н, Н¹², Н¹³, Н¹⁴). Спектр ЯМР ¹³С (CDCl₃, δ, м. д.): 155.80 (с, С¹); 161.00 (с, С²); 111.86 (д, С³); 155.62 (с, С⁴); 112.62 (с, С⁵); 127.88 (д, С⁶); 112.80 (д, С⁷); 161.71 (с, С⁸); 102.09 (д, С⁹); 135.44 (с, С¹⁰); 128.23 (д, С¹¹, С¹⁵); 128.68 (д, С¹², С¹⁴); 129.44 (д, С¹³); 70.39 (т, С¹⁶); 135.67 (с, С¹⁷); 127.35 (д, С¹⁸, С²²); 128.62 (д, С¹⁹, С²¹); 128.23 (д, С²⁰). Найдено: m/z=328.1093 [М]⁺ (C₂₂H₁₆O₃)⁺ Вычислено: m/z=328.1094 404.1982.

Пример 20. Влияние производных фенилкумаринов на активность фермента Tdp1.

Рекомбинантная тирозил-ДНК-фосфодиэстераза 1 человека (КФ 3.1.4.-) была экспрессирована в системе Escherichia coli (плазмида рЕТ любезно предоставлена доктором Кальдекотт К.У., Университет Сассекса, Великобритания) и выделена как описано [Interthal Н, Pouliot JJ, Champoux JJ. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001, 98, 12009-12014].

В качестве тест-системы для определения ингибирующих свойств предлагаемых соединений использована реакция удаления тушителя флуоресценции Black Hole Quencher 1 (BHQ1) с 3'-конца олигонуклеотида, катализируемая . На 5'-конце олигонуклеотида находится (5,6)-FAM - флуорофор, интенсивность флуоресценции которого возрастает при удалении тушителя. Для измерения флуоресценции использовался флуориметр POLARstar OPTIMA производства BMG LABTECH.

Реакционные смеси объемом 200 мкл содержали буфер (50 мМ Tris-HCl, рН 8.0; 50 мМ NaCl; 7 мМ меркаптоэтанол), 50 нМ олигонуклеотид и различные концентрации ингибиторов. Реакция запускалась добавлением до конечной концентрации 1.3 нМ. Измерения проводились в линейном диапазоне зависимости скорости реакции от времени (до 8 минут) через каждые 55 секунд. Влияние предлагаемых соединений оценивали по величине IC₅₀ (концентрация ингибитора, при которой активность фермента снижена наполовину). Обсчет значений IC₅₀ проводился с помощью программы MARS Data Analisys 2.0 (BMG LABTECH).

Величины IC₅₀ для изученных соединений приведены в таблице 1.

Пример 21. Цитотоксичность предлагаемых соединений.

Анализ цитотоксичности предлагаемых соединений проводили на линиях клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 и рака шейки матки человека HeLa. Индуцированную соединениями клеточную гибель оценивали с помощью стандартного МТТ-теста [Mosmann Т // J Immunol Methods. 1983, 65, 55-63] путем колориметрического измерения количества формазана, конвертированного из 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромида (МТТ) клетками, подвергшимися воздействию соединений. Клетки выращивали в среде IMDM, с 40 мкг/мл гентамицина, 100 ед/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл амфотерицина и в присутствии 10% эмбриональной бычьей сыворотки производства фирмы "Биолот" в атмосфере с 5% CO₂.

После формирования 50% монослоя в культуральную среду добавляли исследуемые препараты (объем добавляемых реагентов составляет 1/100 общего объема культуральной среды, объем DMSO 1% от конечного объема) и следили за ростом клеточной культуры в течение 3 сут. В качестве контроля использовали клетки, которые выращивали в присутствии 1% DMSO.

Токсичность соединений отсутствовала или была незначительна во всем диапазоне изученных концентраций (до 100 мкМ), Фиг. 1.

Пример 22. Влияние соединения Ia на развитие асцитной карциномы Кребс-2 у мышей

Использованы мыши самцы линии BALB/C в возрасте 3-4 недели. Мышам внутрибрюшинно привили карциному Кребс-2 (по 0,2 мл в разведении 1/20). Через сутки мышей разделили на группы и оставили без лечения (группа 1, контроль); ввели топотекан 0,5 мг/кг внутрибрюшинно (группа 2); ввели топотекан как выше и соединение Ia 40 мг/кг внутрибрюшинно (группа 3); ввели топотекан как выше и соединение Ia 80 мг/кг внутрибрюшинно (группа 4); ввели только соединение Ia 80 мг/кг внутрибрюшинно (группа 5).

Применение топотекана в виде монопрепарата снизило вес асцитной опухоли приблизительно вдвое с 9,3 г до 4,5 г (Фиг. 2). Использование комбинации топотекана с предлагаемым соединением привело к еще большему снижению веса опухоли, более выраженному при дозе соединения 80 мг/кг до 1,3 г. Разница между весом опухоли в группах, получавших только топотекан или топотекан + 80 мг/кг соединение Ia, достоверна (р=0,044). Вес опухоли в группе, получавшей только предлагаемое соединение, достоверно не отличался от контроля.

Таким образом, применение предлагаемого соединения Ia в разовой дозе 80 мг/кг внутрибрюшинно в сочетании с топотеканом приводит к достоверному снижению веса асцитной опухоли Кребс-2.

Изобретение относится к применению соединений, представляющих собой производные фенилкумаринов общей формулы I, в которой R¹ = Н, F, Br, -OMe, R² = бензил; 3,7-диметилокта-2,6-диен-1-ил; (6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)метил или (6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)этил, в качестве ингибитора фермента тирозил-ДНК-фосфодиэстеразы 1 (Tdp1) человека, сенсибилизирующего опухоли к действию противоопухолевых агентов. Технический результат - обнаружена новая область применения производных фенилкумаринов общей формулы I, которые могут использоваться в молекулярной биологии, биохимии и медицине для разработки лекарственных препаратов. 2 ил., 1 табл., 22 пр.

Применение соединений, представляющих собой производные фенилкумаринов общей формулы I

,

где R¹ = Н, F, Br, -OMe,

R² = бензил; 3,7-диметилокта-2,6-диен-1-ил; (6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)метил или (6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)этил,

в качестве ингибитора фермента тирозил-ДНК-фосфодиэстеразы 1 (Tdp1) человека, сенсибилизирующего опухоли к действию противоопухолевых агентов.