[0001] Изобретение в целом относится к устройствам и способам культивирования клеток.
[0002] Существует несколько распространенных способов культивирования эукариотических клеток. Некоторые из данных способов были разработаны для культивирования относительно небольших количеств клеток, а другие были разработаны для выработки и сбора белков, секретируемых клетками в окружающую среду. Однако несколько систем были разработаны для увеличения масштаба коммерческого использования клеточной культуры для получения больших количеств клеток.
[0003] Наиболее обычный способ культивирования эукариотических клеток состоит в размножении в двухмерных колбах или лотках, например NUNCLON™ Δ CELL FACTORY, который содержит стопки колб для культивирования клеток. Данный способ имеет несколько недостатков, включая невозможность непрерывного мониторинга и регулирования параметров окружающей среды, например DO, pH и подачи ингредиентов/удаления продуктов выделения; низкую эффективность в показателях отношений площади поверхности к объему; потребность в инкубаторах большого объема; потребность в трудоемком манипулировании колбами для культивирования; и продолжительные периоды для посева и культивирования, которые могут быть дорогостоящими и неблагоприятными для жизнеспособности клеток.
[0004] В дополнение, клетки можно культивировать в трехмерных матрицах. Подобные матрицы могут содержать пористые, нетканые/тканые волокнистые и губчатые материалы, которые могут быть помещены на уплотненный слой внутри биореактора. Данные носители используются главным образом для выработки и сбора секретируемых белков, в то время как клетки остаются прикрепленными к матрице, а не для культивирования клеток, которые в конечном итоге удаляют и используют в качестве терапевтических средств. Примерами подобных носителей являются FIBRA-CELL®DISKS (New-Brunswick), и пористые керамические носители. См. Wang, G., W. Zhang, с соавт., «Modified CelliGen-packed bed bioreactors for hybridoma cell cultures». Cytotechnology 9(1-3): 41-9 (1992); и Timmins, N.E., A. Scherberich, с соавт., «Three-dimensional cell culture and tissue engineering in a T-CUP (tissue culture under perfusion)». Tissue Eng 13(8): 2021-8 (2007).
[0005] Однако культивирование в трехмерных матрицах может иметь некоторые недостатки. Например, может быть относительно трудно удалять клетки из матриц, а процессы удаления могут повреждать клетки. Продуцирование при использовании подобных устройств может быть трудным вследствие того, что поврежденные клетки нельзя легко прикреплять к поверхностям системы культивирования. Различия в типе и свойствах материалов, используемых в матрицах и колбах, также может вызывать изменение во взаимодействиях клеток.
[0006] В итоге, клетки можно культивировать в биореакторе при использовании непористых микроносителей в суспензии или в псевдоожиженном слое. Данный способ обеспечивает возможность клеточного роста в монослое на поверхности микроносителей. Однако использование данного способа требует отделения носителей от среды путем осаждения или фильтрации, которые не являются простыми процессами и могут не приводить к высокой степени извлечения клеток. Кроме того, микроносители имеют отклонения на поверхностях в клеточном масштабе, в результате чего получается культуральная среда, которая отличается от двухмерных систем культивирования.
[0007] Представленное раскрытие предоставляет устройства и способы двухмерного культивирования эукариотических клеток.
[0008] Согласно различным вариантам осуществления, предоставлено устройство для культивирования клеток. Устройство может содержать трехмерный корпус, содержащий множество двухмерных поверхностей, продолжающихся внутрь от периферии трехмерного корпуса в направлении внутренней части трехмерного корпуса, при этом множество двухмерных поверхностей выполнено с возможностью поддержки однослойного роста эукариотических клеток по меньшей мере на большей части или всей площади поверхности множества двухмерных поверхностей, и при этом трехмерный корпус имеет максимальный параметр, колеблющийся от приблизительно 1 мм до приблизительно 50 мм. В отличие от общепринятых способов, двухмерное культивирование клеток (где клетки выращивают в контейнере, который предоставляет двухмерную поверхность), устройства, описанные в данном документе, вводят в сосуд, содержащий среду для клеточного роста. Например, устройства, описанные в данном документе, могут образовать часть системы для культивирования клеток, как описано ниже. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления устройства погружают в культуральную среду внутри подходящего контейнера. При предоставлении двухмерного роста клеток в монослоях устройства, описанные в данном документе, обеспечивают условия для регулируемого роста с целью получения урожая клеток, имеющих характеристики, ассоциируемые с клетками, выращенными в двухмерной окружающей среде.
[0009] Согласно различным вариантам осуществления, предоставлена система для культивирования клеток. Система может содержать контейнер и группу трехмерных корпусов. Каждый трехмерный корпус может содержать множество двухмерных поверхностей, продолжающихся внутрь от периферии трехмерного корпуса в направлении внутренней части каждого трехмерного корпуса, при этом множество двухмерных поверхностей выполнено с возможностью поддержки однослойного роста эукариотических клеток по меньшей мере на большей части или всей площади поверхности множества двухмерных поверхностей, и при этом трехмерный корпус имеет максимальный параметр, колеблющийся от приблизительно 1 мм до приблизительно 50 мм.
[0010] Согласно различным вариантам осуществления, предоставлен способ культивирования клеток. Способ может включать выбор группы эукариотических клеток и введение эукариотических клеток в контакт по меньшей мере с одним трехмерным корпусом, при этом по меньшей мере один трехмерный корпус имеет множество двухмерных поверхностей, продолжающихся внутрь от периферии трехмерного корпуса в направлении внутренней части по меньшей мере одного трехмерного корпуса, при этом множество двухмерных поверхностей выполнено с возможностью поддержки однослойного роста эукариотических клеток по меньшей мере на большей части или всей площади поверхности множества двухмерных поверхностей, и при этом трехмерный корпус имеет максимальный параметр, колеблющийся от приблизительно 1 мм до приблизительно 50 мм.
[0011] Согласно некоторым вариантам осуществления, предоставлено устройство для культивирования клеток. Устройство может содержать трехмерный корпус, содержащий множество двухмерных поверхностей, продолжающихся внутрь от периферии трехмерного корпуса в направлении внутренней части трехмерного корпуса, при этом множество двухмерных поверхностей выполнено с возможностью поддержки однослойного роста эукариотических клеток по меньшей мере на большей части или всей площади поверхности множества двухмерных поверхностей, и при этом трехмерный корпус имеет отношение площади поверхности к объему между приблизительно 3 см2/см3 и приблизительно 1000 см2/см3.
[0012] Согласно различным вариантам осуществления, предоставлено устройство для культивирования клеток. Устройство может содержать трехмерный корпус, содержащий лист материала, образованного по существу со спиральной конфигурацией. Лист материала может содержать по меньшей мере две двухмерные поверхности, при этом двухмерные поверхности могут быть выполнены с возможностью поддержки однослойного роста эукариотических клеток по меньшей мере на большей части или всей площади поверхности множества двухмерных поверхностей, и при этом трехмерный корпус имеет отношение площади поверхности к объему между приблизительно 3 см2/см3 и приблизительно 1000 см2/см3.
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0013] Фиг. 1А представляет собой перспективное изображение устройства для двухмерного культивирования клеток согласно некоторым вариантам осуществления.
[0014] Фиг. 1B представляет собой изображение в поперечном разрезе устройства Фиг. 1А.
[0015] Фиг. 2A представляет собой перспективное изображение устройства для двухмерного культивирования клеток® согласно некоторым вариантам осуществления.
[0016] Фиг. 2B представляет собой вид сбоку в перспективе устройства Фиг. 2A.
[0017] Фиг. 2C представляет собой вид сверху устройства Фиг. 2A.
[0018] Фиг. 2D представляет собой изображение в поперечном разрезе устройства Фиг. 2A.
[0019] Фиг. 3A представляет собой перспективное изображение устройства для двухмерного культивирования клеток согласно некоторым вариантам осуществления.
[0020] Фиг. 3B представляет собой перспективное изображение устройства для двухмерного культивирования клеток согласно некоторым вариантам осуществления.
[0021] Фиг. 4A представляет собой перспективное изображение устройства для двухмерного культивирования клеток согласно некоторым вариантам осуществления.
[0022] Фиг. 4B представляет собой перспективное изображение устройства для двухмерного культивирования клеток согласно некоторым вариантам осуществления.
[0023] Фиг. 5 представляет собой перспективное изображение устройства для двухмерного культивирования клеток согласно некоторым вариантам осуществления.
[0024] Фиг. 6 представляет собой перспективное изображение устройства для двухмерного культивирования клеток согласно некоторым вариантам осуществления.
[0025] Фиг. 7 представляет собой перспективное изображение устройства для двухмерного культивирования клеток согласно некоторым вариантам осуществления.
[0026] Фиг. 8A представляет собой перспективное изображение устройства для двухмерного культивирования клеток согласно некоторым вариантам осуществления.
[0027] Фиг. 8B представляет собой изображение в поперечном разрезе устройства Фиг. 8A.
[0028] Фиг. 9 представляет собой перспективное изображение системы для двухмерного культивирования клеток согласно некоторым вариантам осуществления.
[0029] Фиг. 10 представляет собой гистограмму, показывающую результаты культивирования клеток в колбах или при использовании двухмерных устройств для культивирования представленного раскрытия, как описано в примере 1.
[0030] Фиг. 11 представляет собой гистограмму, показывающую число удвоения популяции клеток, культивируемых в колбах или при использовании двухмерных устройств для культивирования представленного раскрытия, как описано в примере 1.
[0031] Фиг. 12 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую эффективность крепления клеток для клеток, выращенных при использовании двухмерных устройств для культивирования с различными скоростями перемешивания среды (RPM), как описано в эксперименте 1.
[0032] Фиг. 13 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую эффективность крепления клеток для клеток, выращенных при использовании двухмерных устройств для культивирования, как описано в эксперименте 1.
[0033] Фиг. 14 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую эффективность крепления клеток для клеток, выращенных при использовании двухмерных устройств для культивирования с различными покрытиями, как описано в эксперименте 1.
[0034] Фиг. 15 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую эффективность крепления клеток для клеток, выращенных при использовании двухмерных устройств для культивирования с предварительным инкубированием культуральной среды, как описано в эксперименте 1.
[0035] Фиг. 16 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую эффективность крепления клеток для клеток, выращенных при использовании двухмерных устройств для культивирования с различными покрытиями с плазменной обработкой поверхности устройств или без нее, как описано в эксперименте 1.
[0036] Фиг. 17 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую сравнение PDD (удвоение популяции в сутки) между колбами 175 см2 и 2D-носителями, как описано в эксперименте 3.
ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
[0037] Далее будет сделана подробная ссылка на некоторые иллюстративные варианты осуществления согласно представленному раскрытию, некоторые примеры которых проиллюстрированы на сопровождающих чертежах. Везде, где возможно, одинаковые ссылочные номера будут использоваться на всех чертежах для обозначения одинаковых или аналогичных деталей.
[0038] В данной заявке применение единственной формы включает множественную, если конкретно не утверждается иное. Также в данной заявке применение «или» означает «и/или», если не утверждается иное. Кроме того, применение термина «включая», а также других форм, например, «включает» и «включенный», не являются ограничивающим. Любой диапазон, описанный в данном документе, необходимо понимать как включение конечных точек и всех значений между конечными точками.
[0039] Устройства согласно изобретению обеспечивают возможность двухмерного роста эукариотических клеток. «Двухмерный рост» следует понимать как включение роста эукариотических клеток вдоль поверхности, при этом большая часть клеточного роста происходит в монослое. «Большая часть клеточного роста в монослое» подразумевает включение клеточного роста по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99% клеток в монослое. «Двухмерный рост» может включать рост вдоль плоскости (т.е. плоских поверхностей) и/или рост вдоль поверхностей, имеющих некоторую степень искривления, как описано более подробно ниже. Таким образом, «двухмерную поверхность» следует понимать как включение поверхности, которая представляет собой плоскость и/или поверхность, которая имеет некоторое искривление. В дополнение, как используется в данном описании, фраза «трехмерный рост» относится к росту в условиях, которые сопоставимы с клеточным ростом на скаффолде, который обеспечивает возможность контакта клетки с клеткой в трех измерениях.
[0040] Для обеспечения двухмерного роста, устройства представленного раскрытия предусматривают высокие отношения площади поверхности к объему, обеспечивая за счет этого возможность роста больших количеств клеток в низких объемах, по сравнению с двухмерным ростом в колбах. Кроме того, устройства представленного раскрытия могут быть выполнены с возможностью облегчения извлечения клеток после вырастания и/или переноса клеток в другие среды для хранения, коммерческого использования (например, в качестве терапевтических средств), или для роста дополнительных клеток. Кроме того, устройства, описанные в данном документе, могут быть выполнены с возможностью обеспечения высококачественного клеточного роста, который по меньшей мере настолько же хорош, как рост, достигаемый при использовании стандартных систем культивирования клеток в показателях жизнеспособности, способности прикрепления клеток, и/или поддержания или регулирования других клеточных свойств.
[0041] Устройства представленного раскрытия могут быть использованы для культивирования множества различных типов эукариотических клеток. Устройства подходят для выращивания стволовых клеток, зависимых от культуральной подложки клеток, мезенхимальных клеток и прилипающих клеток. Как используется в данном описании, фраза «прилипающие клетки» относится к клеткам, которые зависят от культуральной подложки, т.е. требуют прикрепления к поверхности для того, чтобы расти in vitro. Подходящие прилипающие клетки могут включать мезенхимальные стромальные клетки, которые представляют собой гетерогенную популяцию клеток, полученных, например, из костного мозга, жировой ткани, плаценты и крови, и которые могут быть способны или не способны к дифференцированию на различные типы клеток (например, ретикулоэндотелиальные клетки, фибробласты, адипоциты, остеогенные клетки-предшественники) в зависимости от влияний различных биоактивных факторов.
[0042] Эффективный рост различных типов прилипающих клеток может сильно зависеть от окружающей среды или взаимодействий, испытываемых клетками в процессе роста. Например, прилипающие клетки самопроизвольно могут входить в контакт с другими прилипающими клетками. Если один монослой клеток самопроизвольно входит в контакт с другим монослоем клеток, два монослоя могут слипаться друг с другом. Подобное взаимодействие между монослоями различных устройств может приводить к прикреплению устройств друг к другу. Взаимодействие может быть опосредовано внеклеточной матрицей, секретируемой клетками. Вследствие того, что устройства, описанные в данном документе, могут ограничивать подобные нежелательные взаимодействия клеток с клетками, может быть в общем ограничено слипание или агрегирование. В дополнение, представленные устройства могут обеспечивать эффективную доставку питательных веществ, среды и газов через культуру для предоставления стабильной окружающей среды для роста монослоев прилипающих клеток и эффективного сбора клеток. Устройства также могут способствовать более согласованному росту клеток за счет ограничения субпопуляций клеток, которые растут в трехмерных условиях по сравнению с двухмерными условиями.
[0043] В одном аспекте устройства, описанные в данном документе, могут быть выполнены с возможностью ограничения контакта между поверхностями, выполненными для клеточного роста. В связи с этим, устройства могут быть в общем круглыми, закругленными или дугообразными для минимизации в общем контакта между поверхностями соседних устройств. Отдельные устройства могут быть выполнены с возможностью контакта с соседними устройствами на протяжении относительно небольшой площади. Подобный ограниченный контакт между устройствами может обеспечивать ростовые поверхности, которые подвергают растущие клетки относительно небольшим взаимодействиям с другими клетками, растущими на других устройствах. Множество устройств в единственном инкубационном сосуде таким образом может обеспечивать окружающую среду для более эффективного, регулируемого и стабильного роста для прилипающих клеток.
[0044] В некоторых вариантах осуществления устройства, описанных в данном документе, могут иметь в общем круглое поперечное сечение. Например, наружная форма устройств может быть сферической, цилиндрической и с другими в общем закругленными объемами. Подобные устройства могут обеспечивать площади контакта менее чем приблизительно 10% относительно суммарной наружной площади поверхности устройства. В других вариантах осуществления площадь контакта может составлять менее чем приблизительно 5%, 2% или 1% суммарной площади поверхности. Также могут быть использованы другие формы, если может быть существенно минимизирован контакт между соседними устройствами.
[0045] Способы клеточного роста, описанные в данном документе, также могут быть выполнены с возможностью применения с устройствами, описанными в данном документе. С данными устройствами могут быть использованы сосуды, выполненные с возможностью в общем сопротивления клеточному прикреплению. Например, могут быть использованы сосуды, образованные из стекла или пластмассы или с покрытием из них, которые, как известно, ограничивают клеточную адгезию. Подобные сосуды могут стимулировать подходящий рост монослоев прилипающих клеток на устройствах, описанных в данном документе. Подобные сосуды также могут ограничивать возможные нежелательные клеточные взаимодействия, которые могут приводить к непреднамеренным слипаниям клеток с клетками, как описано выше.
[0046] Согласно различным вариантам осуществления предоставлены устройства для культивирования клеток. Устройства могут содержать трехмерный корпус, содержащий множество двухмерных поверхностей, продолжающихся внутрь от периферии трехмерного корпуса в направлении внутренней части трехмерного корпуса, при этом множество двухмерных поверхностей выполнено с возможностью поддержки однослойного роста эукариотических клеток по меньшей мере на большей части или всей площади поверхности множества двухмерных поверхностей. В некоторых вариантах осуществления множество двухмерных поверхностей могут поддерживать или не поддерживать однослойный рост эукариотических клеток по меньшей мере на большей части или всей площади поверхности множества двухмерных поверхностей. «Множество» двухмерных поверхностей означает «более чем одну» двухмерную поверхность и включает по меньшей мере две, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять или по меньшей мере десять двухмерных поверхностей. Также предусматривается более чем десять двухмерных поверхностей, например, 50, 100, 500 или более поверхностей. Следует понимать, что «большая часть площади поверхности» включает по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99% площади поверхности. В различных вариантах осуществления, устройства имеют максимальный параметр, который меньше чем приблизительно 50 мм и/или отношение площади поверхности к объему между приблизительно 3 см2/см3 и приблизительно 1000 см2/см3. Следует понимать, что «максимальный параметр» включает наибольшую наружную высоту, ширину, длину, пространственную диагональ, расстояние между вершинами, поперечный диаметр, диаметр, пролет в поперечном сечении или любой другой наибольший наружный пространственный размер трехмерного корпуса.
[0047] Устройства культивирования клеток согласно изобретению могут иметь ряд различных форм и конфигураций, могут быть образованы из любых из ряда подходящих материалов и могут содержать множество обработок и/или покрытий поверхностей для облегчения клеточного роста. Фиг. 1A-8B иллюстрируют устройства культивирования клеток согласно различным вариантам осуществления, которые описаны более подробно ниже. В дополнение, Фиг. 9 иллюстрирует приведенную для примера систему культивирования клеток, содержащую контейнер и группу устройств культивирования клеток. Необходимо принимать во внимание, что устройства и системы, показанные на фигурах и описанные ниже, являются иллюстративными, и различные признаки из различных вариантов осуществления, описанных в данном документе, могут быть объединены или взаимозаменены.
[0048] Фиг. 1А представляет собой перспективное изображение устройства 10 для двухмерного культивирования клеток, согласно некоторым вариантам осуществления; а Фиг. 1B представляет собой изображение в поперечном разрезе устройства 10 Фиг. 1A. Как показано, устройство 10 содержит множество двухмерных поверхностей 12, продолжающихся от внешней части устройства 10 в направлении внутренней части устройства 10. Как показано, поверхности образованы группой ребер 14, которые разделены промежутками с образованием отверстий 16, размеры которых могут обеспечивать возможность прохождения клеток и культуральной среды в процессе использования. Устройство 10 также может содержать одну или более боковых плоскостей, продолжающихся от центральной оси устройства 10 и проходящих в общем перпендикулярно ребрам 14.
[0049] В некоторых вариантах осуществления наружный диаметр устройства 10 может колебаться от приблизительно 1 мм до приблизительно 50 мм. В других вариантах осуществления, наружный диаметр может колебаться от приблизительно 2 мм до приблизительно 20 мм и от приблизительно 4 мм до приблизительно 10 мм. В зависимости от общего размера устройства 10, ребра 14 и отверстия 16 могут иметь различные размеры. Например, толщина ребер 14 может колебаться от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 2 мм и от приблизительно 0,2 мм до приблизительно 1 мм. В частности, ребра 14 могут быть приблизительно 0,5 мм, приблизительно 0,6 мм или приблизительно 0,7 мм в толщину. Отверстия 16 могут колебаться по ширине от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 1 мм и от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 0,5 мм. В частности, отверстия 16 могут быть приблизительно 0,3 мм, приблизительно 0,4 мм, или приблизительно 0,5 мм по ширине.
[0050] В варианте осуществления, показанном на Фиг. 1A-1B, ребра 14 по существу плоские и продолжаются параллельно друг другу от центра устройства к периферии устройства. Однако, ребра могут включать множество конфигураций. Например, Фиг. 2A-2D иллюстрируют устройство 20, имеющее множество двухмерных поверхностей 22, образованных ребрами 24 в различных конфигурациях. Фиг. 2A представляет собой перспективное изображение устройства 20 для двухмерного культивирования клеток, согласно некоторым вариантам осуществления; Фиг. 2B представляет собой вид сбоку в перспективе устройства Фиг. 2A; Фиг. 2C представляет собой вид сверху устройства Фиг. 2A; а Фиг. 2D представляет собой изображение устройства Фиг. 2A в поперечном разрезе. Устройство 20 Фиг. 2A-2D аналогично устройству 10 Фиг. 1А-1B, но форма ребер 24 устройства 20 подобрана таким образом, чтобы образовать отверстия 26, которые расположены по окружности устройства 20. Отверстия 26 могут быть в общем клинообразными. Ребра 24 могут продолжаться в общем радиально от центральной оси устройства 20 к периферийной поверхности устройства 20. Устройство 20 также может содержать одну или более боковых плоскостей, продолжающихся от центральной оси устройства 20 и продолжающихся в общем перпендикулярно ребрам 24. Кроме того, устройство 20 содержит отверстие 36, проходящее через центр устройства и образующее дополнительные поверхности 32, которые могут поддерживать однослойный рост эукариотических клеток.
[0051] Как описано выше для устройства 10, параметры устройства 20 могут иметь различные размеры. Например, наружный диаметр устройства 20 может колебаться от приблизительно 1 мм до приблизительно 50 мм. В других вариантах осуществления, наружный диаметр может колебаться от приблизительно 2 мм до приблизительно 20 мм и от приблизительно 4 мм до приблизительно 10 мм. В зависимости от общего размера устройства 20, ребра 24 и отверстия 26 могут иметь различные размеры. Например, толщина ребер 24 может колебаться от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 2 мм и от приблизительно 0,2 мм до приблизительно 1 мм. В частности, ребра 24 могут быть приблизительно 0,5 мм, приблизительно 0,6 мм или приблизительно 0,7 мм в толщину. Как показано на Фиг. 2A-2C, отверстия 26 могут колебаться по ширине от минимальной ширины в общем расположенной вокруг центральной оси, проходящей через устройство 20 или отверстие 36, до максимальной ширины в общем расположенной вокруг периферии устройства 20. минимальная ширина отверстий 26 может колебаться от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 1 мм и от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 0,5 мм. Конкретно, минимальная ширина отверстий 26 может быть приблизительно 0,3 мм, приблизительно 0,4 мм или приблизительно 0,5 мм. В дополнение, диаметр отверстия 36 может колебаться от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 5 мм и от приблизительно 0,5 мм до приблизительно 2 мм. Более точно, отверстие 36 может иметь диаметр, составляющий приблизительно 0,8 мм, приблизительно 1 мм или приблизительно 1,2 мм.
[0052] Как показано, устройства 10, 20 по существу сферические и имеют диаметр 18, который образует наибольшие размер устройств. Устройства, описанные в данном документе, могут иметь множество различных форм и конфигураций при условии, что устройства обеспечивают двухмерные поверхности для прикрепления и однослойного роста по меньшей мере на большей части или всей площади поверхности множества двухмерных поверхностей 12, 22.
[0053] Устройства культивирования клеток представленного раскрытия могут включать множество форм и конфигураций. Например, хотя устройства, описанные выше относительно Фиг. 1A-2D, по существу сферические, могут быть использованы другие подходящие формы. Например, Фиг. 3A-3B представляют собой перспективные изображения устройств 10', 20' для двухмерного культивирования клеток. Устройства 10', 20' аналогичны устройствам 10, 20 Фиг. 1A-2D за исключением того, что устройства 10', 20' имеют по существу яйцевидные формы, но аналогичным образом обеспечивают множество двухмерных поверхностей 12,' 22', образованных ребрами 14', 24' или отверстиями 36'. Кроме того, могут быть использованы другие подходящие формы, включая другие многогранные и/или неправильные многогранные формы.
[0054] Как обсуждалось выше, устройства представленного раскрытия могут включать множество двухмерных поверхностей, выполненных с возможностью поддержки однослойного роста эукариотических клеток по меньшей мере на большей части или всей площади поверхности множества двухмерных поверхностей. В некоторых вариантах осуществления, множество двухмерных поверхностей выполнено с возможностью поддержки однослойного роста по существу по всей их площади поверхности. Например, Фиг. 4A-4B представляют собой перспективные изображения устройств для двухмерного культивирования клеток, согласно некоторым вариантам осуществления, которые выполнены с возможностью поддержки однослойного роста по существу по всей их площади поверхности. Устройства 10'', 20'' Фиг. 4A-4B аналогичны другим устройствам, описанным выше и содержат поверхности 12', 22', образованные ребрами 14', 24'. Однако, устройства 10'', 20'' имеют отверстия 16', 26' с поверхностями 12', 22', которые образуют плавные изгибы вдоль всех их площадей, устраняя или уменьшая за счет этого области острого искривления, где может происходить трехмерный рост. Например, как показано, устройства 10'', 20'' имеют плавно изогнутые нижние поверхности 40, 42, в отличие от более острых изгибов, как проиллюстрировано относительно устройств Фиг. 1А-2D.
[0055] В различных вариантах осуществления специфическое искривление и конфигурация множества двухмерных поверхностей могут быть модифицированы, например, для предоставления более больших площадей поверхности и/или для регулирования клеточного роста. Например, Фиг. 5 представляет собой перспективное изображение устройства 50 для двухмерного культивирования клеток, согласно некоторым вариантам осуществления. Устройство 50 содержит ребра 54, которые продолжаются от периферии устройства 50 в направлении внутренней части устройства с образованием отверстий 56 и множества двухмерных поверхностей 52 для однослойного роста. Как показано, ребра 54 и поверхности 52 являются изогнутыми. Изогнутая форма поверхностей 52 может дополнительно увеличивать площадь поверхности множества двухмерных поверхностей 52, по сравнению с плоскими поверхностями, обеспечивая за счет этого дополнительную площадь для прикрепления клеток и однослойного роста.
[0056] Фиг. 6 представляет собой перспективное изображение устройства 60 для двухмерного культивирования клеток, согласно некоторым вариантам осуществления. Как показано, устройство 60 содержит ребра 64, продолжающиеся от внутренней части устройства 60 в направлении периферии устройства 60. Ребра 64 могут включать спиральную конфигурацию, которая продолжается по меньшей мере частично вдоль диаметра устройства 60 с образованием по меньшей мере двух двухмерных поверхностям 62, 62' для двухмерного роста эукариотических клеток. Как показано, ребра продолжаются от участка 68 сердечника в направлении периферии устройства 60.
[0057] В каждом из вариантов осуществления, описанных выше, множество двухмерных поверхностей продолжаются от внутренней части сердечника. Однако, согласно другим вариантам осуществления, поверхности могут продолжаться внутрь в пределах направления в сторону центрального сердечника. Например, Фиг. 7 иллюстрирует еще одно устройство 70, согласно некоторым вариантам осуществления. Устройство 70 содержит по меньшей мере один лист материала в виде по существу спиралеобразной стенки 74 с отверстием 76, и имеющий по меньшей мере первую поверхность 72 и вторую поверхность 72', выполненные с возможностью обеспечения двухмерного роста эукариотических клеток. Однако необходимо принимать во внимание, что могут быть использованы другие формы, и нет необходимости, чтобы устройство 70 представляло собой непрерывную спираль, но может содержать другие конфигурации.
[0058] Также предполагается, что устройство 90 может содержать один или более отсоединяемых составных элементов, как показано на Фиг. 8A, 8B. Например, устройство 90 может содержать один или более отсоединяемых дисков 92. Каждый диск 92 может содержать один или более коннекторов 94, выполненных с возможностью соединения с другим структурным элементом устройства 90. В связи с этим, множество дисков 92 могут быть соединены вместе с образованием узла 96. Узел 96 может содержать любое количество дисков 92 или коннекторов различных форм или размеров, включая варианты осуществления, показанные выше на Фиг. 1-7.
[0059] Диск 92 может иметь любую форму и может содержать соединение с внутренней резьбой (не показано), выполненное с возможностью соединения с коннектором 94. Соединение между диском 92 и коннектором 94 может быть постоянным или отсоединяемым. В других вариантах осуществления, множество дисков 92 могут быть соединены с единственным коннектором 94, выполненным с возможностью приема множества дисков 92 и сохранения подходящего расстояния между множеством дисков 92.
[0060] Различные устройства культивирования клеток, описанные выше, могут быть образованы с множеством форм. Тогда как многие варианты осуществления изображают устройства закругленными, устройства также могут быть кубическими, прямоугольными или являться комбинацией линейных и дугообразных форм. Кроме того, с данными устройствами могут быть использованы дополнительные стабилизирующие, соединительные или другие структурные детали. Например, нитевидный элемент может соединять множество устройств вместе, адгезионный элемент может соединять устройство со стенкой инкубационного сосуда или плавающий элемент может обеспечивать устройству возможность оставаться на плаву в текучей среде для ограничения непреднамеренного контакта клеток с другими поверхностями. Подобные элементы могут повышать манипулирование при использовании ручной или автоматизированной технологий. Например, магнитный материал может быть включен в устройства для помощи на стадиях сбора и обработки. Устройства также могут быть выполнены с возможностью непрерывного воздействия текучей среды для инкубирования или для прерывистого воздействия текучей среды.
[0061] Устройства культивирования клеток, описанные в данном документе, могут быть изготовлены при использовании множества различных подходящих материалов. В целом, устройства могут быть изготовлены за счет использования материалов, которые имеют широкий диапазон признаков, выбранных для предоставления возможности культивирования клеток для фармацевтических целей. В различных вариантах осуществления материалы могут относиться к утвержденному 6 классу USP (VI классу Фармакопейной Конвенции США), могут противостоять высоким температурам и способны выдерживать автоклавную обработку, поддаются плазменной обработке или обработке коронным разрядом для улучшения прикрепления клеток, могут противостоять широкому диапазону pH, не выделяют вредные вещества в процессе клеточного роста и/или могут подвергаться ферментативным и физическим нагрузкам при извлечении клеток без деградирования или оставления нежелательных остатков в продукте. В дополнение, материал, использованный для получения любых устройств, описанных в данном документе, может быть сплошным или иметь полую или пористую внутреннюю часть. Кроме того, устройства, описанные в данном документе, могут быть изготовлены из одного куска материала или из двух или более деталей, которые прикрепляют друг другу (например, посредством химического или физического связывания). Материал может быть жестким или гибким по требованию варианта применения.
[0062] материал, используемый для получения любых устройств культивирования клеток, описанных в данном документе, может включать металлы (например, титан), оксиды металлов (например, титановые оксидные пленки), стекло, борсиликат, углеродные волокна, керамику, биодеградируемые материалы (например, коллаген, желатин, PEG, гидрогели) и/или полимеры. Подходящие полимеры могут включать полиамиды, например, GRILAMID® TR 55 (EMS-grivory); поликарбонаты, например, LEXAN® (Sabic) и Makrololon® (Bayer); полисульфонаты, например, RADEL® PPSU (Solvay) и UDEL® PSU (Solvay); полиэфиры, например TRITAN® (Polion) и PBT®HX312C; полиацетали, например, CELON® (Ticana) и поливинилхлорид.
[0063] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть устройств может быть образована при использовании полистиролого полимера. Полистирол может быть дополнительно модифицирован при использовании коронного разряда, газовой плазмы (роллерных флаконов и культуральных пробирок) или других аналогичных способов. Данные способы могут генерировать высокоэнергетические ионы кислорода, которые прививают на цепи полистирола на поверхности, так что когда среду добавляют, поверхность становится гидрофильной и отрицательно заряженной (Hudis, 1974; Amstein и Hartman, 1975; Ramsey с соавт., 1984). Кроме того, любые устройства могут быть по меньшей мере частично изготовлены из комбинаций материалов. Материалы устройств могут иметь дополнительное покрытие или быть обработаны для поддержки прикрепления клеток. Подобное покрытие и/или предварительная обработка могут включать использование коллагена I, коллагена IV, желатина, поли-d-лизина, фибронектина, ламинина, aмина и карбоксила.
[0064] В некоторых вариантах осуществления материалы, использованные для изготовления устройств, выбирают таким образом, чтобы обеспечить возможность непосредственного прикрепления эукариотических клеток. Устройства, описанные в данном документе, могут быть изготовлены при использовании множества подходящих способов изготовления. Например, в некоторых вариантах осуществления устройства могут быть изготовлены посредством инжекционного формования при использовании, например, одного или более полимерных материалов.
[0065] В дополнение, свойства материалов и искривление на протяжении большей части или всей площади поверхности двухмерных поверхностей могут быть выбраны для регулирования некоторых биологических свойств. Например, материал может быть выбран, чтобы иметь некоторые упругие модули и искривление для получения желательных биологических свойств. Например, подходящие упругие модули могут быть между приблизительно 0,1-100 кПа.
[0066] В различных вариантах осуществления устройства имеют размер, выбранный для облегчения сбора (например, посредством фильтрации, вычерпывания, удаления среды), и минимизации объема пустот между устройствами. Например, трехмерные корпуса могут иметь максимальный параметр между приблизительно 1 мм и 50 мм, между приблизительно 1 мм и 20 мм или между приблизительно 2 мм и 10 мм. В некоторых вариантах осуществления, устройства сферические и имеют максимальный диаметр, который составляет между приблизительно l мм и 50 мм, между приблизительно 1 мм и 20 мм или между приблизительно 2 мм и 10 мм.
[0067] В некоторых вариантах осуществления устройства выполнены с возможностью предотвращения повреждения или извлечения клеток из двухмерных поверхностей в процессе культивирования. Например, как показано на Фиг. 1A-8B, устройства могут содержать отверстия 16, 26, 16', 26' и 76, а двухмерные поверхности расположены внутри отверстий. В различных вариантах осуществления множество двухмерных поверхностей отделены друг от друга расстоянием, выбранным для предотвращения контакта объектов, примыкающих к трехмерному корпусу, с клетками, растущими на множестве двухмерных поверхностей. Конкретно, отверстия 16, 26, 16', 26' или 76 могут иметь такие размеры, что двухмерные поверхности не будут входить в контакт с соседними устройствами внутри системы культивирования и/или не будут входить в контакт со стенкой контейнера или культурального сосуда. В связи с этим, однослойный рост клеток вдоль двухмерных поверхностей не будет нарушаться за счет механического контакта. Кроме того, двухмерные поверхности могут быть разнесены достаточно далеко друг от друга для предотвращения контакта между клетками на соседних поверхностях.
[0068] В различных вариантах осуществления устройства культивирования клеток согласно изобретению могут быть выполнены с возможностью предоставления желательного отношения площади поверхности к объему. Например, отношение площади поверхности к объему любых устройств культивирования клеток, описанных в данном документе, может быть между приблизительно 3 см2/см3 и 30 см2/см3, между приблизительно 5 см2/см3 и 20 см2/см3, или между приблизительно 10 см2/см3 и 15 см2/см3. В других вариантах осуществления, отношение площади поверхности к объему может колебаться вплоть до приблизительно 50, 100, 200, 500 или 1000 см2/см3.
[0069] В различных вариантах осуществления устройства, раскрытые в данном описании, дополнительно могут быть покрыты одним или более покрытиями. Подходящие покрытия могут быть выбраны для регулирования прикрепления клеток или изменений в биологии клеток. Подходящие покрытия могут включать, например, пептиды, белки, углеводы, нуклеиновую кислоту, липиды, полисахариды, глюкозоаминогликаны, протеогликаны, гормоны, молекулы внеклеточного матрикса, молекулы клеточной адгезии, природные полимеры, ферменты, антитела, антигены, полинуклеотиды, факторы роста, синтетические полимеры, полилизин, лекарственные средства и/или другие молекулы или их комбинации или фрагменты.
[0070] Кроме того, в различных вариантах осуществления поверхности устройств, описанных в данном документе, могут быть обработаны или изменены иным образом для регулирования прикрепления клеток и или других биологических свойств. Варианты обработки поверхностей включают химическую обработку, плазменную обработку и/или обработку коронным разрядом. Кроме того, в различных вариантах осуществления, материалы могут обрабатываться для введения функциональных групп в или на материал, включая группы, содержащие углеводороды, кислород, азот. В дополнение, в различных вариантах осуществления, материал может быть получен или изменен, чтобы иметь текстуру для облегчения прикрепления клеток или регулирования других свойств клеток. Например, в некоторых вариантах осуществления, материалы, используемые для изготовления устройств культивирования клеток, имеют шероховатость в нанометровом или микрометровом масштабе, что облегчает прикрепление клеток и/или регулирует другие свойства клеток.
[0071] Согласно различным вариантам осуществления, предоставлена система для культивирования клеток. Система может содержать контейнер и группу трехмерных корпусов. Трехмерные корпусы могут содержать множество двухмерных поверхностей, продолжающихся внутрь от периферии каждого трехмерного корпуса в направлении внутренней части каждого трехмерного корпуса, при этом множество двухмерных поверхностей выполнено с возможностью поддержки однослойного роста эукариотических клеток по меньшей мере на большей части или всей площади поверхности множества двухмерных поверхностей.
[0072] Фиг. 9 представляет собой перспективное изображение системы 100 для двухмерного культивирования клеток, согласно некоторым вариантам осуществления. Как показано, система 100 содержит контейнер 110 и одно или более устройств 110 культивирования клеток, которые могут быть помещены внутрь контейнера 100 наряду со средой 120 и/или другими материалами для обеспечения двухмерного роста клеток на поверхности контейнера 110.
[0073] Как показано, контейнер 100 содержит обычную колбу для культивирования клеток, имеющую отверстие 130 для введения клеток, устройств 110 культивирования клеток, среды и/или других материалов. Однако, необходимо учитывать, что могут быть выбраны другие контейнеры. Например, контейнер может быть значительно больше, например, выбран с возможностью содержания дюжин, сотен, тысяч, сотен тысяч или миллионов устройств культивирования клеток. Специальные размер и конфигурация могут быть выбраны на основании количества клеток, которые должны быть выращены, и/или других критериев, например, потребности в интегрированных системах для регулирования условий культивирования, например, температуры, pH, уровней окружающего газа и т.д.
[0074] В различных вариантах осуществления, система может содержать биореактор-контейнер, например, реактор с уплотненным слоем, реактор на флюидизированном топливе или суспензионный реактор. Например, система может содержать одно или более устройств для предоставления возможности двухмерного роста, которые затем могут быть помещены в контейнер биореактора. Примеры подобных биореакторов включают, но без ограничения, поршневой проточный биореактор, биореактор с непрерывно перемешиваемым резервуаром, биореактор с неподвижным слоем (биореактор с уплотненным слоем) и биореактор с псевдоожиженным слоем.
[0075] Примером подходящего биореактора является биореактор Celligen (New Brunswick Scientific), который допускает распространение прилипающих клеток в регулируемых условиях (например, уровни pH, температуры и кислороды) и с постоянной перфузией среды для клеточного роста. Кроме того, можно проводить мониторинг клеточных культур на уровни концентрации глюкозы, лактата, глютамина, глютамата и аммония. Скорость потребления глюкозы и скорость образования лактата прилипающих клеток обеспечивают возможность измерения скорости клеточного роста и определения времени сбора.
[0076] Другие трехмерные биореакторы, которые могут быть использованы, включают, но без ограничения, биореактор с непрерывно перемешиваемым резервуаром, где культуральная среда непрерывно подается в биореактор, а использованная среда непрерывно отсасывается для поддержания постоянного во времени стационарного состояния внутри биореактора. Биореактор с перемешиваемым резервуаром может использоваться с псевдоожиженным слоем (взвешенными носителями) или с корзиной с волокнистым слоем (которая выпускается, например, компанией New Brunswick Scientific Co., Edison, N.J), биореактор со стационарным слоем, биореактор с воздушным подъемом, где воздух обычно подается в нижнюю часть центральной вытяжной трубки, проходя вверх с образованием пузырьков и выпуская выходной газ на верхушке колонны, биореактор с полиактивными пенами [как описано в публикации Wendt, D. С соавт., Biotechnol Bioeng 84: 205-214, (2003)], пористыми каркасами в биореакторе с перфузией в радиальном потоке [как описано в публикации Itagawa с соавт., Biotechnology and Bioengineering 93(5): 947-954 (2006)], биореактор радиального потока с каркасом или носителями, половолоконный биореактор и микроносители. Другие биореакторы, которые могут использоваться с описанными сейчас устройствами, описаны в патентах США №№ 6277151, 6197575, 6139578, 6132463, 5902741 и 5629186.
[0077] Представленное раскрытие также предоставляет способы культивирования клеток при использовании любых устройств или систем, обсуждавшихся в данном документе. Согласно различным вариантам осуществления, способ может включать выбор группы эукариотических клеток и введение эукариотических клеток в контакт по меньшей мере с одним трехмерным корпусом, при этом по меньшей мере один трехмерный корпус имеет множество двухмерных поверхностей, продолжающихся внутрь от периферии трехмерного корпуса в направлении внутренней части по меньшей мере одного трехмерного корпуса, при этом множество двухмерных поверхностей выполнено с возможностью поддержки однослойного роста эукариотических клеток по меньшей мере на большей части или всей площади поверхности множества двухмерных поверхностей. В различных вариантах осуществления, устройства имеют максимальный параметр, который меньше чем приблизительно 50 мм и/или отношение площади поверхности к объему между приблизительно 3 см2/см3 и приблизительно 1000 см2/см3.
[0078] В дополнение, необходимо принимать во внимание, что различные стадии обработки могут выполняться для регулирования или усиления прикрепления и роста клеток. Например, клетки могут вводиться в контакт с трехмерными корпусами за счет помещения клеток и корпусов наряду с культуральной средой внутрь контейнера или культурального сосуда. Кроме того, клетки и/или среда могут быть перемешаны или подготовлены иным образом для перемещения, например, за счет вращения контейнера, взбалтывания культуральной среды (например, за счет встряхивания), и подачи потока текучей среды в контейнер и из него.
[0079] Неограничивающие примеры основных сред, используемых при культивировании при использовании с устройствами и системами, описанными в данном документе, включают минимальную эссенциальную среду Игла, ADC-1, LPM (бычья сыворотка, лишенная альбумина), F10 (HAM), F12 (HAM), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, среда BGJ (в модификации Fitton-Jackson и без нее), основная среда Игла (BME с добавлением основной соли Игла), модифицированная по Дульбекко среда Игла (DMEM без сыворотки), Yamane, IMEM-20, модифицированная по Глазгов среда Игла (GMEM), среда Leibovitz L-15, среда McCoy 5A, среда M199 (M199E- с основной солью Ирла), среда M199 (M199H- с основной солью Хенка), минимальная эссенциальная среда Игла (MEM-E- с основной солью Ирла), минимальная эссенциальная среда Игла (MEM-H- с основной солью Хенка) и минимальная эссенциальная среда Игла (MEM-NAA с незаменимыми аминокислотами), среди многочисленных других, включая среду 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713, DM 145, Williams G, Neuman & Tytell, Higuchi, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MDBC 153. Предпочтительной средой для использования в изобретении является DMEM. Эти и другие полезные среды выпускаются, среди прочих, компаниями GIBCO, Grand Island, N.Y., USA, and Biological Industries, Bet Haemek, Israel. Ряд указанных сред обобщен в публикациях Methods in Enzymology, Volume LVIII, "Cell Culture", pp.62-72, edited by William B. Jakoby, and Ira H. Pastan, опубликованных в Academic Press, Inc.
[0080] В среду может добавляться сыворотка, такая как фетальная сыворотка коров, или людей, или других видов, и, необязательно или в качестве альтернативы, факторы роста, витамины (например, аскорбиновой кислоты), цитокины, соли (например, B-глицерофосфат), стероиды (например, дексаметазон) и гормоны, например гормон роста, эритропоэтин, тромбропоэтин, интерлейкин 3, интерлейкин 6, интерлейкин 7, фактор, стимулирующий колонии макрофагов, c-набор лиганда/фактора стволовых клеток, лиганд остеопротегерина, инсулин, подобный инсулину фактор роста, эпидермальный фактор роста, фактор роста фибробластов, фактор роста нервов, цилиарный нейротропный фактор, фактор роста, полученный из тромбоцитов, и костный морфогенетический белок в концентрациях на уровнях от пикрограммов/мл до миллиграммов/мл.
[0081] После вырастания клеток при использовании устройств и систем, описанных в данном документе, клетки могут быть собраны с помощью множества различных путей. Например, клетки могут быть собраны посредством промывания подходящей средой и/или посредством сбора, основанного на вибрации, как описано ниже.
[0082] Кроме того, допускается добавление дополнительных компонентов к культуральной среде. Такие компоненты могут представлять собой антибиотики, противогрибковые средства, альбумин, аминокислоты и другие компоненты, известные в области культивирования клеток.
ПРИМЕР 1
[0083] Оценивали пригодность культивирования клеток при использовании различных носителей, которые описаны в данном документе. Свежие или замороженные клетки PD051010 p.3/2 культивировали с полной DMEM в инкубаторе с увлажнением. Клетки выращивали в полученных методом литья под давлением носителях, изготовленных из различных полимерных материалов, или колбах, как определено ниже. Материал, форму и конфигурацию, обработки поверхности и текстуру поверхность варьировали, как описано подробно ниже и/или указано на фигурах. Измеряли скорость роста и эффективность прикрепления клеток при использовании различных носителей, и результаты обобщены ниже.
[0084] Фиг. 10 представляет собой гистограмму, показывающую результаты культивирования клеток в 175 см2 колбах или при использовании двухмерных устройств для культивирования представленного раскрытия. Фиг. 11 представляет собой гистограмму, показывающую число удвоения популяции клеток, культивируемых в 175 см2 колбах или при использовании двухмерных устройств для культивирования представленного раскрытия. Результаты, показанные на Фиг. 10-11, основаны на культивировании свежих клеток PD051010 p.3/2 при использовании устройств культивирования клеток, образованных из LEXAN® методом литья под давлением с гладкой текстурой поверхности и наличием конфигурации, как показано на Фиг. 1A-1B. Как показано на фигурах, количество полученных клеток и число удвоения клеток были аналогичными при использовании устройств культивирования клеток вместо колб.
[0085] Фиг. 12 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую эффективность крепления клеток для клеток, выращенных при использовании двухмерных устройств для культивирования. Результаты, показанные на Фиг. 12, основаны на культивировании замороженных клеток PD051010 p.3/2 при использовании устройств культивирования клеток, образованных из LEXAN® методом литья под давлением, с шероховатой текстурой поверхности и наличием конфигурации, как показано на Фиг. 1A-1B. Фиг. 13 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую эффективность крепления клеток для клеток, выращенных при использовании двухмерных устройств для культивирования. Результаты, показанные на Фиг. 13, основаны на культивировании замороженных клеток PD051010 p.3/2 при использовании устройств культивирования клеток, образованных из GRILAMID® методом литья под давлением с шероховатой текстурой поверхности и наличием конфигурации, как показано на Фиг. 1A-1B.
[0086] Фиг. 14 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую эффективность крепления клеток для клеток, выращенных при использовании двухмерных устройств для культивирования с различными покрытиями. Результаты, показанные на Фиг. 14, основаны на культивировании замороженных клеток PD051010 p.3/2 при использовании устройств культивирования клеток, образованных из LEXAN® или GRILAMID® методом литья под давлением (как показано на фигуре) с плавной текстурой поверхности и наличием конфигурации, как показано на Фиг. 2A-2D. Кроме того, как показано, Фиг. 14 демонстрирует влияние обработки поверхности при использовании белков питательной среды и/или полилизина на носителях LEXAN® или GRILAMID®. Как показано, обработка полилизина и обработка белков питательной среды в общем увеличивала эффективность крепления клеток.
[0087] Фиг. 15 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую эффективность крепления клеток для клеток, выращенных при использовании двухмерных устройств для культивирования с покрытием. Результаты, показанные на Фиг. 15, основаны на культивировании замороженных клеток PD051010 p.3/2 при использовании устройств культивирования клеток, образованных из GRILAMID® методом литья под давлением с шероховатой поверхностью, которую предварительно инкубировали с белками питательной среды и наличием конфигурации, как показано на Фиг. 1A-1B.
[0088] Фиг. 16 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую эффективность крепления клеток для клеток, выращенных при использовании двухмерных устройств для культивирования с различными покрытиями с плазменной обработкой поверхности устройств или без нее. Результаты, показанные на Фиг. 16, основаны на культивировании замороженных клеток PD051010 p.3/2 при использовании устройств культивирования клеток, образованных из LEXAN® или GRILAMID® методом литья под давлением (как показано на фигуре) с плавной текстурой поверхности и наличием конфигурации, как показано на Фиг. 2A-2D. Кроме того, как показано, Фиг. 16 демонстрирует влияние обработки поверхности при использовании белков питательной среды и/или плазменной обработки носителей LEXAN® или GRILAMID®. Как показано, плазменная обработка и обработка белков питательная среда в общем повышала эффективность крепления клеток.
ПРИМЕР 2
[0089] В данном эксперименте клетки, выращенные на двухмерных устройствах для культивирования, собирали при использовании основанного на вибрации способа сбора, как описано в PCT/IB2012/000933, поданной 15 апреля 2012 года. Двухмерные устройства для культивирования изготавливали за счет суспендирования 220 устройств в минимальной эссенциальной среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко («DMEM») и посева в них прилипающих стромальных клеток, полученных из человеческой плаценты в концентрации, равной 3000 клеток на см. Устройства инкубировали в течение ночи с мягким перемешиванием для предоставления возможности прикрепления клеток к устройствам. После инкубирования в течение ночи 90-100 засеянных устройств переносили в 250 мл вращающуюся колбу, содержащую 150 мл полной DMEM и инкубировали три дня при 37°C и 5% CО2.
[0090] После трехдневного роста клетки собирали из устройств за счет вибрации следующим образом. Вращающиеся колбы и трубки извлекали из инкубатора, и десять устройств для культивирования извлекали для окрашивания клеток. Эффективность сбора определяли посредством окрашивания клеток и подсчета клеток. Культуральную среду выбрасывали и оставшиеся устройства промывали дважды PBS и помещали в контейнер, наполненный 800 мл предварительно нагретого раствора TrypLE. Затем устройства немедленно подвергали вибрации в течение 5 секунд при 5 Гц, 5 минут при 1 Гц и 30 секунд при 5 Гц (все с амплитудой, равной 25 мм). После вибрации дополнительные десять устройств извлекали для окрашивания клеток. К оставшимся устройствам добавляли 200 мл FBS, и среду переносили в 2500 мл бутылки для центрифугирования. Клетки центрифугировали при 1200 об./мин в течение 10 минут при 4°C, сгусток клеток повторно суспендировали и проводили подсчет клеток.
[0091] Было показано, что сбор посредством вибрации является эффективным средством извлечения клеток из данных устройств, при этом извлекали 7,8×106 клеток. Посредством вытеснения красителя трипанового синего было показано, что клетки имеют жизнеспособность 95%.
ПРИМЕР 3
[0092] В еще одном эксперименте мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки плаценты (PD020112), жировые (PLA25) и костного мозга (BM122) высевали в 175 см2 колбы, 0,5×106 клеток/колбу, в полную питательную среду DMEM (DMEM As22320 номер по каталогу 041-96417A GIBCO, 10% FBS номер по каталогу S0115 BIOCHROM, 1% L-Глютамина номер по каталогу G7513 SIGMA). Клетки инкубировали в инкубаторе с увлажнением при 37°C в течение 4 дней. Каждый тип клеток собирали при использовании TrypLE (GIBCO номер по каталогу 12563-029). Затем каждый тип клеток высевали как в колбы 175 см2, так и на 2D носители, в полную DMEM, в двух повторениях. Далее, 0,5×106 клеток высевали в колбы, и 1×106 клетки высевали на 90 2D носителей, в 20 мл флаконах. Колбы инкубировали в инкубаторе при 37°C. Флаконы с 2D носителями вращали в течение 24 часов для прикрепления, а затем переносили в 250 мл вращающуюся колбу с корзиной. Вращающиеся колбы помещали на устройство для перемешивания в инкубаторе при 37°C еще на 3 дня, при скорости встряхивания 40 об./мин. После суммарной продолжительности роста, равной 4 дня, клетки собирали из колб и из 2D носителей с помощью TrypLE и подсчитывали с помощью устройства для подсчета клеток Casy.
[0093] Фиг. 17 показывает гистограмму сравнения PDD (удвоение популяции в сутки) между 175 см2 колбами и 2D носителями, рассчитанные PDD показывают сравнимые скорости роста клеток Плаценты, костного мозга и жировых между 2D носителями и колбами.
Группа изобретений относится к области биохимии, включает устройство и систему для культивирования клеток, а также способ культивирования клеток с использованием вышеуказанного устройства и системы (варианты). Устройство включает сферический трехмерный корпус с множеством двухмерных поверхностей, продолжающихся внутрь от периферии трехмерного корпуса в направлении внутренней части трехмерного корпуса. Система содержит контейнер и группу сферических трехмерных корпусов, помещенных в контейнер. При этом трехмерный корпус имеет максимальный пространственный размер в диапазоне от 1 мм до 50 мм или отношение площади поверхности к объему между 3 см2/см3 и 1000 см2/см3. Способ включает выбор группы эукариотических клеток и введение эукариотических клеток в контакт с трехмерным корпусом. Изобретения обеспечивают двухмерный рост эукариотических клеток. 4 н. и 32 з.п. ф-лы, 24 ил., 3 пр. 
1. Устройство для культивирования клеток, содержащее:
по существу сферический трехмерный корпус, содержащий множество двухмерных поверхностей, продолжающихся внутрь от периферии трехмерного корпуса в направлении внутренней части трехмерного корпуса, при этом множество двухмерных поверхностей выполнено с возможностью поддержки однослойного роста эукариотических клеток по меньшей мере на большей части или всей площади поверхности множества двухмерных поверхностей, и при этом трехмерный корпус имеет:
(a) максимальный пространственный размер в диапазоне от 1 мм до 50 мм; или
(b) отношение площади поверхности к объему между 3 см2/см3 и 1000 см2/см3.
2. Устройство по п. 1, в котором множество двухмерных поверхностей:
(a) содержит множество ребер, продолжающихся от внутренней части трехмерного корпуса в направлении периферии трехмерного корпуса;
(b) содержит множество ребер, продолжающихся по существу параллельно друг другу от внутренней части трехмерного корпуса в направлении периферии трехмерного корпуса;
(c) (i) имеют изогнутую форму и/или содержат по меньшей мере одно спиралеобразное ребро, продолжающееся от внутренней части трехмерного корпуса в направлении периферии трехмерного корпуса; или
(ii) являются по существу плоскими на протяжении по меньшей мере части их площади поверхности; и/или
(d) содержат множество ребер, продолжающихся от центрального сердечника в направлении периферии трехмерного корпуса.
3. Устройство по п. 1, при этом материал, образующий множество двухмерных поверхностей, содержит материал, выбранный по меньшей мере из одного из металлов, стекла, борсиликата, углеродных волокон, керамики, коллагена, желатина, гидрогелей и полимеров.
4. Устройство по п. 1, при этом материал, образующий множество двухмерных поверхностей, содержит по меньшей мере один полимер, необязательно при этом полимер:
(a) выбран из полиамида, поликарбоната, полисульфоната, полиэфира, полиацеталя и поливинилхлорида;
(b) представляет собой полиамид или
(c) поликарбонат.
5. Устройство по п. 1, при этом множество двухмерных поверхностей дополнительно содержит по меньшей мере одно покрытие, выбранное для облегчения прикрепления и роста эукариотических клеток, необязательно при этом по меньшей мере одно покрытие выбирают из белка и полилизина.
6. Устройство по п. 1, при этом множество двухмерных поверхностей подвергают плазменной обработке поверхности.
7. Устройство по п. 1, при этом множество двухмерных поверхностей содержат модуль упругости и искривление, выбранное для облегчения роста эукариотических клеток.
8. Устройство по п. 1, при этом эукариотические клетки содержат по меньшей мере одно из: стволовых клеток, зависимых от культуральной подложки клеток, мезенхимальных клеток и стромальных клеток.
9. Устройство по п. 1, при этом отношение площади поверхности множества двухмерных поверхностей к объему трехмерного корпуса составляет между 3 см2/см3 и 1000 см2/см3, необязательно при этом отношение площади поверхности множества двухмерных поверхностей к объему трехмерного корпуса составляет между 10 см2/см3 и 15 см2/см3.
10. Устройство по п. 1, при этом трехмерный корпус имеет максимальный пространственный размер между 2 мм и 10 мм, необязательно максимальным пространственным размером является диаметр.
11. Система культивирования клеток, содержащая:
контейнер; и
группу по существу сферических трехмерных корпусов, помещенных в контейнер, при этом каждый трехмерный корпус содержит:
множество двухмерных поверхностей, продолжающихся внутрь от периферии трехмерного корпуса в направлении внутренней части каждого трехмерного корпуса, при этом множество двухмерных поверхностей выполнено с возможностью поддержки однослойного роста эукариотических клеток по меньшей мере на большей части или всей площади поверхности множества двухмерных поверхностей, и при этом каждый трехмерный корпус имеет:
(a) максимальный пространственный размер в диапазоне от 1 мм до 50 мм; или
(b) отношение площади поверхности к объему между 3 см2/см3 и 1000 см2/см3.
12. Система по п. 11, в которой трехмерный корпус имеет максимальный пространственный размер между 1 мм и 20 мм.
13. Система по п. 11, в которой множество двухмерных поверхностей:
(a) содержит множество ребер, продолжающихся от внутренней части трехмерного корпуса в направлении периферии трехмерного корпуса;
(b) содержит множество ребер, продолжающихся по существу параллельно друг другу от внутренней части трехмерного корпуса в направлении периферии трехмерного корпуса;
(c) (i) имеет изогнутую форму и/или содержит по меньшей мере одно спиралеобразное ребро, продолжающееся от внутренней части трехмерного корпуса в направлении периферии трехмерного корпуса; или
(ii) является по существу плоскими на протяжении по меньшей мере части их площади поверхности; и/или
(d) содержит множество ребер, продолжающихся от центрального сердечника в направлении периферии трехмерного корпуса.
14. Система по п. 11, при этом материал, образующий множество двухмерных поверхностей, содержит материал, выбранный по меньшей мере из одного из металлов, стекла, борсиликата, углеродных волокон, керамики, коллагена, желатина, гидрогелей и полимеров.
15. Система по п. 11, при этом материал, образующий множество двухмерных поверхностей, содержит по меньшей мере один полимер, не обязательно при этом полимер:
(a) выбран из полиамида, поликарбоната, полисульфоната, полиэфира, полиацеталя и поливинилхлорида;
(b) представляет собой полиамид или
(c) поликарбонат.
16. Система по п. 11, при этом множество двухмерных поверхностей дополнительно содержит по меньшей мере одно покрытие, выбранное для облегчения прикрепления и роста эукариотических клеток, необязательно при этом по меньшей мере одно покрытие выбирают из белка и полилизина.
17. Система по п. 11, при этом множество двухмерных поверхностей подвергают плазменной обработке поверхности.
18. Система по п. 11, при этом множество двухмерных поверхностей содержит модуль упругости и искривление, выбранное для облегчения роста эукариотических клеток.
19. Система по п. 11, при этом эукариотические клетки содержат по меньшей мере одно из: стволовых клеток, зависимых от культуральной подложки клеток, мезенхимальных клеток и стромальных клеток.
20. Система по п. 11, при этом отношение площади поверхности множества двухмерных поверхностей к объему трехмерного корпуса составляет между 3 см2/см3 и 1000 см2/см3, необязательно при этом отношение площади поверхности множества двухмерных поверхностей к объему трехмерного корпуса составляет между 10 см2/см3 и 15 см2/см3.
21. Система по п. 13, при этом материал, образующий множество двухмерных поверхностей, содержит материал, выбранный по меньшей мере из одного из металлов, стекла, борсиликата, углеродных волокон, керамики, коллагена, желатина, гидрогелей и полимеров.
22. Система по п. 13, при этом материал, образующий множество двухмерных поверхностей, содержит по меньшей мере один полимер, необязательно при этом полимер:
(а) выбран из полиамида, поликарбоната, полисульфоната, полиэфира, полиацеталя и поливинилхлорида;
(b) представляет собой полиамид или
(c) поликарбонат.
23. Система по п. 13, при этом множество двухмерных поверхностей дополнительно содержит по меньшей мере одно покрытие, выбранное для облегчения прикрепления и роста эукариотических клеток, необязательно при этом по меньшей мере одно покрытие выбирают из белка и полилизина.
24. Система по п. 13, при этом множество двухмерных поверхностей подвергают плазменной обработке поверхности.
25. Система по п. 13, при этом множество двухмерных поверхностей содержит модуль упругости и искривление, выбранное для облегчения роста эукариотических клеток.
26. Система по п. 13, при этом эукариотические клетки содержат по меньшей мере одно из: стволовых клеток, зависимых от культуральной подложки клеток, мезенхимальных клеток и стромальных клеток.
27. Система по п. 13, при этом отношение площади поверхности множества двухмерных поверхностей к объему трехмерного корпуса составляет между 3 см2/см3 и 1000 см2/см3, необязательно при этом отношение площади поверхности множества двухмерных поверхностей к объему трехмерного корпуса составляет между 10 см2/см3 и 15 см2/см3.
28. Система по п. 13, при этом трехмерный корпус имеет максимальный пространственный размер между приблизительно 2 мм и 10 мм, необязательно максимальным пространственным размером является диаметр.
29. Система по п. 11, при этом трехмерный корпус имеет максимальный пространственный размер между приблизительно 2 мм и 10 мм, необязательно максимальным пространственным размером является диаметр.
30. Система по п. 13, в которой трехмерный корпус имеет максимальный пространственный размер между 1 мм и 20 мм.
31. Способ культивирования клеток, включающий:
выбор группы эукариотических клеток; и
введение эукариотических клеток в контакт с по меньшей мере одним трехмерным корпусом по п. 1 или 11, в присутствии среды.
32. Способ по п. 31, в котором введение эукариотических клеток в контакт по меньшей мере с одним трехмерным корпусом включает:
(a) размещение клеток и по меньшей мере одного трехмерного корпуса в контейнере;
(b) дополнительно включает подачу культуральной среды в клетки; и/или
(c) дополнительно включает вызов передвижения по меньшей мере одного трехмерного корпуса, необязательно при этом вызов передвижения включает:
(i) вращение или встряхивание контейнера, в котором содержится по меньшей мере один трехмерный корпус; или
(ii) обеспечение протекания среды в контейнер, в котором содержится указанный по меньшей мере один трехмерный корпус.
33. Способ по п. 31, в котором указанный по меньшей мере один трехмерный корпус погружен в культуральную среду внутри подходящего контейнера, который выполнен с возможностью препятствования клеточной адгезии.
34. Способ культивирования клеток, включающий:
выбор группы эукариотических клеток; и
введение эукариотических клеток в контакт с по меньшей мере одним трехмерным корпусом по п. 2 или 13, в присутствии среды.
35. Способ по п. 34, в котором введение эукариотических клеток в контакт по меньшей мере с одним трехмерным корпусом включает:
(a) размещение клеток и по меньшей мере одного трехмерного корпуса в контейнере;
(b) дополнительно включает подачу культуральной среды в клетки; и/или
(c) дополнительно включает вызов передвижения по меньшей мере одного трехмерного корпуса, необязательно при этом вызов передвижения включает:
(i) вращение или встряхивание контейнера, в котором содержится по меньшей мере один трехмерный корпус; или
(ii) обеспечение протекания среды в контейнер, в котором содержится указанный по меньшей мере один трехмерный корпус.
36. Способ по п. 34, в котором указанный по меньшей мере один трехмерный корпус погружен в культуральную среду внутри подходящего контейнера, который выполнен с возможностью препятствования клеточной адгезии.
| WO 2012005580 A1, 12.01.2012 | |||
| US 20050221485 A1, 06.10.2005 | |||
| US 5010013, 23.04.1991 | |||
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРЕХМЕРНЫХ МАТРИЦ ДЛЯ ТКАНЕПОДОБНЫХ СТРУКТУР ИЗ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ | 2008 |
|
RU2396342C1 |
