СПОСОБ ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ АПОПТОЗА ЭРИТРОЦИТОВ IN VITRO Российский патент 2017 года по МПК G01N33/49 

Предлагаемое изобретение относится к биологии и медицине и может использоваться в опытах in vitro для оценки степени апоптоза эритроцитов.

Важнейшим признаком апоптоза эритроцитов является образование микрочастиц, несущих на своей поверхности большое количество фосфатидилсерина (Lang K.S et al. Mechanisms of suicidal erythrocyte death. Cell Physiol. Biochem. 2005. Vol. 15. P. 195-202). По появлению микрочастиц в инкубационной среде судят об апоптозе эритроцитов.

В качестве прототипа выбран способ оценки степени апоптоза эритроцитов in vitro по образованию количества микрочастиц, включающий отмывание эритроцитов, их инкубирование и центрифугирование для получения супернатанта, ультрацентрифугирование супернатанта и определение в осадке количества микрочастиц (Vader P. et al. Taxol - induced phosphatidylserine exposure and microvesicle formation in red blood cells is mediated by its vehicle cremophor. Nanomedicine. 2013. Vol. 8. P. 1127-1135).

Однако способ требует длительного ультрацентрифугирования супернатанта при 100000 g в течение 60 мин и дорогого специального оборудования (анализатор микрочастиц).

Задача предлагаемого изобретения - совершенствование способа.

Технический результат - упрощение и ускорение способа оценки степени апоптоза эритроцитов in vitro.

Принцип метода основан на том, что трехвалентный катион гадолиний избирательно взаимодействует с отрицательно заряженным фосфатидилсерином микрочастиц. В результате этого происходит агрегация микрочастиц и последующее выпадение их в осадок. В осадке, содержащем микрочастицы, определяют активность маркерного фермента микрочастиц ацетилхолинэстеразы (Greenwalt T.J. Tranfusion. - 2005. - V. 46. - P. 143-152).Чем выше активность ацетилхолинэстеразы микрочастиц, тем выше степень апоптоза эритроцитов.

Способ осуществляется следующим образом. Эритроциты трижды отмывают от плазмы и белых клеток крови центрифугированием в 10-кратном объеме физиологического раствора. После инкубации эритроциты центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин. К супернатанту добавляют хлористый гадолиний до конечной концентрации 400-600 мкМ, интенсивно перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин, получают осадок, содержащий микрочастицы, и в нем определяют ацетилхолинэстеразную активность, по активности ацетилхолинэстеразы микрочастиц судят о степени апоптоза эритроцитов.

Пример 1. Отмытые эритроциты инкубировали в среде, содержащей 1 мкМ ионофора А 23187 и 1 мМ кальция, в течение 3 ч. После инкубации эритроциты центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин. К супернатанту добавляли хлористый гадолиний до конечной концентрации 400-600 мкМ, интенсивно перемешивали и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин. В осадке определяли активность ацетилхолинэстеразы микрочастиц. Активность ацетилхолинэстеразы микрочастиц составила 6.2±0.5 мкмоль/мин/мг белка.

Пример 2. Отмытые эритроциты инкубировали в среде, содержащей 400 мМ сахарозы и 1 мМ кальция, при 37°C в течение 24 ч. После инкубации эритроциты центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин. К супернатанту добавляли хлористый гадолиний до конечной концентрации 400-600 мкМ, интенсивно перемешивали и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин. В осадке определяли активность ацетилхолинэстеразы микрочастиц. Активность ацетилхолинэстеразы микрочастиц составила 36.31±1.82 мкмоль/мин/мг белка.

Пример 3. Отмытые эритроциты инкубировали в среде, содержащей 5 мкМ хлористого лантана, при 37°C в течение 24 ч. После инкубации эритроциты центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин. К супернатанту добавляли хлористый гадолиний до конечной концентрации 400-600 мкМ, интенсивно перемешивали и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин. В осадке определяли активность ацетилхолинэстеразы микрочастиц. Активность ацетилхолинэстеразы микрочастиц составила 29.7±1.14 мкмоль/мин/мг белка.

Таким образом, с помощью предлагаемого способа можно выяснить степень апоптоза эритроцитов in vitro. Так наибольшая степень апоптоза эритроцитов наблюдается в опытах с сахарозой.

Преимуществом предлагаемого способа является быстрота, простота, доступность, отсутствие необходимости в сложном дорогостоящем оборудовании. Способ позволяет проводить скрининг лекарственных препаратов на апоптоз эритроцитов.

Изобретение относится к медицине, а именно к фармацевтике для определения степени апоптоза эритроцитов in vitro. Для этого эритроциты отмывают в 10-кратном объеме физиологического раствора, а полученный супернатант инкубируют с хлористым гадолинием до конечной концентрации 400-600 мкМ. После интенсивного перемешивания смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. В полученном осадке, содержащем микрочастицы, определяют активность ацетилхолинэстеразы. По активности ацетилхолинэстеразы судят о степени апоптоза эритроцитов. Изобретение обеспечивает простой и быстрый способ определения степени апоптоза эритроцитов при скрининге лекарственный препаратов. 3 пр.

Способ оценки степени апоптоза эритроцитов in vitro, включающий отмывание эритроцитов, их инкубирование и центрифугирование для получения супернатанта, отличающийся тем, что к супернатанту добавляют хлористый гадолиний до конечной концентрации 400-600 мкМ, интенсивно перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин, получают осадок, содержащий микрочастицы, и в нем определяют активность ацетилхолинэстеразы, по активности ацетилхолинэстеразы микрочастиц судят о степени апоптоза эритроцитов.