Способ первичного скрининга химических соединений на иммуномодулирующую активность Советский патент 1992 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии.

Целью изобретения является упрощение и ускорение первичной фармакологической оценки химических соединений в качестве иммуномодуляторов.

Способ осуществляется следующим образом.

Проводят оценку эффекта тестируемых препаратов на способность стимулировать или подавлять розеткообразование лимфоцитов доноров в активном тесте с эритроцитами барана (Т - активные лимфоциты. Та) по сравнению со стандартными иммуномодуляторами. Для этого на первом этапе реакции подбирают оптимальную нетоксичную для клеток, концентрацию препарата/Исследуемые препараты

растворяют в изотоническом растворе хлористого натрия в различных рачведениях и ставят реакцию лейколизиса, для чего получают лейковзвесь из крови здорового человека, взятой в количестве 15-20 мл на 2.7% N32 ЭДТА. Клетки трижды отмывают раствором Хенкса и ресуспендируют в этом же растворе о концентрации 4-5-х 10 клеток/мл. Затем смешивают в пробирке в равных объемах взвесь лейкоцитов и разведения испытуемого вещества, инкубируют 20 мин при 37°С, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин. нэдосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 1-2 капли трипанового синего с эозином, исполь- sveMoro для оценки жизнеспособности лейкоцитов, ресуспензируют и подсчитывают количество окрашенных клеток на 100 лейкоXI

О

N о

00

-Ьь

цитов в камере Горяева. Для работы отбирают наименьшие разведения препарата, не оказывающие повреждающего действия на клетки (жизнеспособность клеток не менее 95%).

После определения рабочих концентраций препаратов тестируют их эффект на количество Т-лимфоцитов 3-х доноров, одновременно оценивая чувствительность этих клеток к стандартным иммуномодуляторам, в качестве которых используются левамизол (, ЮМ) как иммуностимулятор и гепарин (10 ЕД/мл, 50 ЕД/мл) как средство с им- мунодепрессорными свойствами. Отмытые от плазмы лейкоциты крови разводят раствором Хенкса до концентрации 2-3 х 10 /мл. Смешивают в равных объемах (по 0,1 мл) лейкоциты с тестируемыми препаратами в лунках планшет для иммунологи- ческих реакций (каждую пробу дублируют) и инкубируют в термостате при 37°С 30 мин. Контролем служат лейкоциты, аналогично инкубированные в среде.

После инкубации планшету центрифугируют на центрифуге со специальными держателями при 1000 об/мин в течение 5 мин (при отсутствии такой центрифуги реакцию

можно осуществлять в пробирках). Надоса- дочную жидкость удаляют пастеровской пипеткой, к осадку добавляют 0.1 мл раствора Хенкса и 0,1 мл суспензии эритроцитов барана (концентрация клеток 1-2 х 108/мл),

инкубируют при 37°С в течение 15 мин. центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в 2-3-х каплях 0,06%-ного раствора глютарового альдегида и делают мазки на предметных стеклах. Мазки фиксируют этанолом. окрашивают азур-эозином и подсчитывают в микроскопе с помощью иммерсии количество розетко- образующих на 100 лимфоцитов, принимая

за розетку лимфоцит, прикрепивший три и более эритроцитов. Таким образом оценивают эффект препаратов на Т-лимфоциты не менее 3-х доноров и рассчитывают для каждого препарата индекс изменения розеткообразования (НИР):

Изобретение относится к медицине и может быть использовано как первичный скрининговый этап при поиске новых иммунотропных препаратов. Цель изобретения - упрощение и ускорение поиска средств, обладающих потенциальной иммуномодули- рующей активностью, путем оценки реакции лейкоцитов кроеи на испытуемое средство. Цель изобретения достигается тем, что после предварительного определения нетоксичных для клеток концентраций препаратов оценивают их эффект на рецепторы лимфоцитов периферической крови доноров в тесте активного розеткообразо- вэния по сравнению со стандартными имму- номодуляторами. и при стимулирующей активности на розеткообразование. равной по степени эффекта левамизолу, или угнетающей, равной гепарину. средство относят к иммуномодуляторам.

Количество Та лимфоцитов (среднее от 3-х доноров) в контроле - Число Те в опыте х Ю0%

НИРКоличество Та в контроле

Затем сравнивают эффект средств, обладающих стимулирующим действием на ро- зеткообразование. с левамизолом, а средств, обладающих угнетающим действием. - с гепарином. Для этого выИндекс изменения роэеткообраэования не тестируемый препарат

Индекс изменения роэеткоо6рзэовз ия ьа стандартный иммуномодулятор

Если эффект тестируемого препарата составляет не менее 70% от эффекта стандартного иммуномодулятора (КЭ 70%), его относят к потенциальным иммуномодуляторам.

Тестировали на наличие иммунотроп- ной активности следующие препараты: ме- затон, соединения рения № 2 и Nf 5. Тестируемые препараты и препараты сравнения (гепарин и левамизол) в день постановки реакции растворили в изотоническом растворе хлористого натрия. Приготовили последовательные разведения тестируемых веществ 10 -1М. Процесс тестирования состоял из двух этапов. На первом этапе определяли рабочие концентрации препаратов, Брали по 20 мл крови на 2,7% раствора ЭД- ТА у 3-х здоровых лиц. Получали лейковзвесь путем отстаивания крови в течение 45 мин.

числяют степень различия между изменениями Та лимфоцитов, вызываемыми тестируемыми и стандартными иммуно- модуляторами, так называемый коэффициент эффекта (КЗ):

Лейкоциты отмывали трижды раствором Хенкса и ресуспенз овали в этом же растворе дб концентрации 4-5 х . Смешивали в пробирках в равных объемах (по 0.1 мл) суспензию клеток и испытуемый препарат (в контроле 0.1 мл клеток и 0,1 мл раствора Хенкса). Смесь инкубировали 20 мин при 37°С. а затем центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливали, а к осадку добавляли 1-2 капли 0,1 %-ного раствора трипанового синего, используемого для оценки жизнеспособности лейкоцитов. Ресуспенэировали и подсчитывали количество окрашенных (мертвых) клеток на 100 лейкоцитов в камере Горячева.

Суммируя результаты экспериментов с лейкоцитами 3-х доноров выбирали наи меньшие разведения препаратов, не оказывающие повреждающего действия на

клетки (жизнеспособность не менее 95%). Для препаратов рения № 2 и № 5 такой концентрацией были 10 М. мезатона - 10 6М.

Препараты сравнения применяли в оптимальных концентрациях, которые наиболее эффективно изменяют розетко- образование лимфоцитов доноров. Такой концентрацией для левамиэола является М, для гепаринэ - 10 ЕД/мл или 50 ЕД/мл.

Вторым этапом было определение эффекта препаратов на роэеткообраэование Та лимфоцитов с эритроцитами барана в активном тесте. Для этого брали по 20 мл крови у 3-х доноров. Выделенные и отмытые от плазмы лейкоциты разводили раствором Хенкса до концентрации 2-3 х 10 /мл. Смешивали в равных объемах (по 0,1 мл) лейкоциты с тестируемыми препаратами в лунках планшет для иммунологических реакций и инкубировали в термостате при 37°С в течение 30 мин. В качестве контроля использовали лейкоциты, аналогично инкубированные в среде. Все пробы ставили в трех параллелях. После инкубации планшеты центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость удаляли па.стеровской пипеткой, а к осадку добавляли 0,1 мл раствора Хенкса и 0.1 мл суспензии эритроцитов барана (концентрация эритроцитов х 108 кл/мл), инкубировали при 37°С в течение 15 мин, центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин. Осадок ресуспендируют в 2-3-х каплях 0,06%-ного раствора глютароерго альдегида и делали мазки на предметных стеклах. После высыхания мазки фиксировали эта- нолом 10 мин. окрашивали азур-зозином и подсчитывали под иммерсией количество розеткообразующих клеток на 100 лейкоцитов.

Вычисляли средний процент Т-лимфо- цитов у этих донорюв и рассчитывали для

каждого препарата ИИР . Затем сравнивали эффект средств, обладающих стимулирующим действием на розеткообразование, с левамизолом, а средств, обладающих угнетающим действием. - с гепарином. Препараты рения № 2 и № 5 обладают стимулирующим эффектом, поэтому КЭ для них рассчитывали по отношению к левамизолу, а мезатон снижает розеткообразование (препарат сравнения - гепа- рин). Лишь один из препаратов (рений № 5) имеет КЭ 84%, т.е. его эффект составляет более 70% от эффекта стандартного им- муномодулятора. Следовательно, среди

тестируемых средств только препарат рения Nk 5 обладает иммунотропной активностью.

Предлагаемый способ высоко чувствителен, прост в исполнении и позволяет быстро и эффективно произвести отбор среди препаратов различных групп средств с потенциальной иммунотропной активностью.

Формула изобретения

Способ первичного скрининга химических соединений на иммуномодулирующую активность путем оценки лейкоцитов на испытуемое соединение, отличающийся тем. что, с целью упрощения и ускорения

способа, предварительно в реакции In vitro определяют нетоксичные концентрации препарата в пробе лейкоцитов периферической крови донора с трипановым синим, далее оценивают активность соединений в

этих концентрациях в тесте активного ро- зеткообразования и при наличии стимулирующей активности препарата на розеткообрээование. составляющей не менее 70% от активности контрольной

пробы, содержащей левамизол, или угнетающей - не менее 70% от активности контрольной пробы, содержащей гепэрин, химическое соединение оценивают как им- муномодулятор.