Способ очистки почвы и водной среды от нефти и нефтепродуктов Российский патент 2017 года по МПК B09C1/10 C02F3/34 C12N1/20 C12R1/01 

Способ очистки почвы и водной среды от нефти и нефтепродуктов

Изобретение относится к области экологии и охраны окружающей среды, а именно способам очистки почвы и водной среды от нефти и нефтепродуктов.

Известны штаммы микроорганизмов, используемые для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов: Pseudomonas putida 36 (см. SU № 1076446, МПК C02F3/34, B09C1/10, C12N1/20 C02F3/34, C02F101:32, C12N1/20, C12R1:40, опубл. 28.02.1984), Acinetronacter sp. HB-1 (см. RU № 2077579, МПК C12N1/20, C02F3/34, B09C1/10, C12R1:01, C12N1/20, B09C101:00, опубл. 20.04.1997), Pseudomonas alcaligenes E7 (см. RU № 2134723, МПК C12N1/20, C02F3/34, B09C1/10, C12N1/20, C12R1:38, опубл. 20.08.1999).

Недостатком известных штаммов является то, что они утилизируют нефть при сравнительно высоких температурах.

Большую эффективность в условиях низких положительных температур показал штамм Rhodococcus erythroplis E-15 (см. RU № 2019527, МПК C02F3/34, E02B15/04, C09K17/00, опубл. 15.09.1994), но процесс биодеградация нефти протекает медленно и только при добавлении нитроаммофоски или нитроаммофоски и натриевой селитры.

Известен консорциум нефтеокисляющих микроорганизмов в составе Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus sp. ПИ Ky-1, Burkholderia caryophylli Jap-3, Serratia odorifera Jap-1 при весовом соотношении 3-12 масс.% каждого микроорганизма, при этом совместно с суспензией биопрепарата в загрязненную среду вводят ризоторфин в количестве 30-120 г/м² (см. RU №2191643, МПК B09C1/10, C12N1/20, C12N1/20, C12R1:01, опубл. 27.10.2002).

Недостатком известного решения является то, что при приготовлении рабочей суспензии микроорганизмов температура поддерживается на уровне +18…+22ºС, т.е. микроорганизмы, входящие в состав консорциума, не способны к деградации нефтепродуктов при пониженных положительных температурах (+5ºС).

В качестве прототипа служит штамм бактерий «Bacillus subtilis Колыма 7/2» (см. RU №2446900, МПК B09C1/10, опубл. 10.04.2012), обладающий способностью снижать концентрацию нефти до 0,48%, то есть уровень нефти от 135143 мг/кг снижается до 645 мг/кг в течение 3 месяцев летнего периода. Однако штамм осуществляет деградацию только нефти и только в почве и не способен утилизировать нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат), в том числе в водной среде в условиях широкого диапазона температур от +5 до +37°С.

Задача, на решение которой направлено заявленное изобретение, выражается в расширении номенклатуры эффективных способов очистки объектов окружающей среды (в частности, почвы и водной среды) от нефти и нефтепродуктов (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат) в относительно короткие сроки, в широком диапазоне температур от +5 до +37°С.

Для решения поставленной задачи способ очистки почвы и водной среды от нефти и нефтепродуктов отличается тем, что для очистки водной среды от нефти и нефтепродуктов применяется бактериальный препарат, состоящий из клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 в концентрации 1·10⁹ клеток/см³ суспензии.

Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками прототипа и аналогов свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна».

Признаки отличительной части формулы изобретения обеспечивают решение поставленных функциональных задач.

Предлагаемый штамм бактерий Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 выделен 16 февраля 2015 года из мерзлых почвенных образцов, загрязненных соляркой, отобранных возле емкостей Момского РЭС ОАО «Сахаэнерго», Северо-Восток Якутии, Момский район, село Хонуу.

Штамм идентифицирован и депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ФГУП «ГосНИИгенетика», 117545, Москва, 1-й Дорожный пр-д, 1, номер регистрации ВКПМ В-12247.

Первичный скрининг по базе данных GenBank и RDP-II показал, что исследуемый штамм принадлежит к следующим систематическим группам Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Stenotrophomonas.

При секвенировании вариабельных участков 16S rDNA получена следующая собранная нуклеотидная последовательность для исследуемого штамма:

Результаты обработки секвенсов, представляются в графическом виде.

По данным анализа RDP II 16S рРНК было построено филогенетическое дерево с гомологичными штаммами Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 (см. чертеж).

Критерием отнесения микроорганизма к тому или иному виду считается гомология не менее 97%.

По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, тестируемый штамм отнесен к видy Stenotrophomonas maltophilia (100%).

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки

Грамотрицательные палочки, в мазках расположены одиночно или беспорядочными скоплениями. Спор и капсул не образует.

Культуральные признаки

На мясопептонном агаре (МПА) (масс.%): ферментативный пептон – 1,0; натрий хлористый – 0,5; агар – 1,0; вода мясная - остальное, рН 7,0-7,2, формирует полупрозрачные желтоватые колонии с ровным краем диаметром 1-3 мм. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности агара, легко размазываются. Старые культуры могут образовывать коричневатый или сероватый пигмент.

На питательном агаре на основе гидролизата рыбной муки (масс.%): гидролизат рыбной муки - 1,2; пептон ферментативный - 1,2; натрий хлористый - 0,6; агар - 1,0; вода дистиллированная остальное; рН 7,1 - 7,5, формирует полупрозрачные желтоватые колонии с ровным краем диаметром 1-3 мм. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности агара, легко размазываются. Старые культуры могут образовывать коричневатый или сероватый пигмент.

На среде Сабуро (масс.%): гидролизат рыбной муки – 1,0; панкреатический гидролизат казеина – 1,0; дрожжевой экстракт – 0,2; натрия фосфат однозамещенный – 0,2; D-глюкоза – 4,0; агар – 1,0; вода дистиллированная – остальное; рН 6,0±3, формирует желтоватые колонии, в старых культурах может образовывать коричневатый или серый пигмент, диаметр колоний 1-3 мм. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности агара, легко размазываются.

В мясопептонном бульоне (масс.%): ферментативный пептон – 1,0, натрий хлористый – 0,5, вода мясная – остальное; рН 7,0-7,2, образует муть.

На минеральной среде Мюнца (см. Керстен Д.К. Морфологические и культуральные свойства индикаторных микроорганизмов нефтегазовой съемки. - Микробиология, 1963, №5. С.1024-1030) с нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат, бензин) следующего состава (масс.%): KNO₃ – 0,4; MgSO₄ ·7H₂O – 0,08; NaCl – 0,1; K₂HPO₄ –0,14; KH₂PO₄ –0,06; агар-2,0; нефть или нефтепродукты – 1,0; вода дистиллированная – остальное, рН – 7,2, растет в виде полупрозрачных серовато-желтых мелких колоний диаметром 1 мм.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм аэроб, растёт при температуре от +5 до +37°С, более интенсивно растет + 10+30°С. Растёт при рН 5,0 – 8,5. Оптимум рН 6,5 – 8,0. Растёт в солевом бульоне с добавлением 0,1 - 2,0% NaCl.

Используемые источники углерода: сорбит, маннит.

Проверенные неиспользуемые источники углерода: лактоза, глюкоза, цитрат натрия, малонат натрия. Штамм индол-отрицателен. Реакция Фогес - Проскауэра отрицательная. Фенилаланиндезоксаминаза отрицательная. Не ферментирует бета-галактозидазу. Не утилизирует инозит. Продукт, синтезируемый штаммом: поверхностно-активные вещества, способные деструктировать нефть. Использует в качестве источника энергии углеводороды нефти и нефтепродуктов.

Штамм не токсичен по отношению к высшим растениям (биотестирование проведено на семенах овса обыкновенного сорт «Скакун»).

Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 10-14 дней) на скошенном мясопептонном агаре или храниться в лиофилизированном состоянии в ампулах при температуре +4°С.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Выделение и культивирование штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3

Штамм бактерий Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 выделен из мерзлых почвенных образцов, загрязненных соляркой, методом накопительных культур на среде Мюнца с нефтью с последующим пересевом на МПА.

Для этого 1,0 г мерзлого грунта с вышеуказанного объекта вносили в 250 мл минеральной среды Мюнца следующего состава: (масс.%) KNO₃ – 0,4; MgSO₄ ·7H₂O – 0,08; NaCl – 0,1; K₂HPO₄ – 0,14; KH₂PO₄ – 0,06; вода дистиллированная – остальное, рН – 7,2, В качестве единственного источника углерода и энергии использовали нефть, которую вносили в среду Мюнца в количестве 1000 мг на 1,0 дм³ среды. На первом этапе инкубация проводилась в качалочных условиях при 200 об/мин и температуре +20±1°С. Рост бактерий наблюдали уже через 3 дня инкубации по образованию мутной эмульсии и дезинтеграции слоя нефти.

Чистая культура бактерий Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 была получена путем культивирования при выше перечисленных условиях и многократных пересевов (более 10) накопительной культуры на чашки Петри с МПА.

Далее посевы инкубировали в стационарных условиях при различных температурах от +5 до +37°С. Через 72 ч на поверхности МПА наблюдали появление полупрозрачных колоний желтовато-серого цвета, диаметром до 5 мм, которые по культурально-морфологическим и биохимическим признакам, а также по результатам проведенного анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и ключевых фенотипических признаков согласно таксономическим описаниям, приведенным в Определителе Берги (см. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology Book Review Int. J. of Syst. Bact.; July 1985, p. 408) идентифицированы, как штамм Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3.

Пример 2. Приготовление бактериального препарата на основе клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3.

Изолированные колонии, полученные по примеру 1, пересевали на скошенный МПА и инкубировали 48 часов при температуре +20±1°С. Выросшие на МПА культуры Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 смывали 0,9% раствором NaCl; готовили исходную микробную суспензию бактериального изолята с титром 1·10⁹ микробных клеток/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. А.М. Тарасевича.

Для получения препарата готовили жидкую минеральную среду по примеру 1 и культивировали в колбах в качалочных условиях в течение 48 часов, при температуре 20±1°С, при 200 об/мин. Полученную жидкую смесь клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 с титром 1·10⁹ клеток/см³ использовали в качестве препарата для обработки почвы и воды, загрязненной нефтью и нефтепродуктами.

Пример 3. Исследование нефтеокисляющей активности штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3

Клетки штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 смывают 0,9% раствором NaCl со скошенного мясопептонного агара. Готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята, объемом 25 см³, с концентрацией 1·10⁹ микробных клеток/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. А.М. Тарасевича.

Полученный бактериальный изолят штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 культивируют в водной среде с минеральным составом по примеру 1.

В колбочки объемом 250,0 см³ вносят по 100,0 см³ готовой минеральной среды и 1000 мг нефти. Колбы засевают клетками штамма до концентрации 1·10⁹ клеток/ см³. В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, нефтью и без бактерий для определения общих (естественных) потерь. Опыт проводят в трех повторениях. Колбы культивируют при разных температурах (от +5°C до +37°С) в течение 3-5 суток.

Биодеградацию нефти и нефтепродуктов определяют спектрометрическим методом, с использованием концентратомера «ИКН-025» (см. ФР.1.31.2007.03234 МВИ 01.02.117 Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в питьевых, природных и сточных водах ИК-спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-025»).

Данные эксперимента показывают, что в водной среде с минеральными компонентами, в условиях постоянной аэрации, предлагаемый штамм уже через 3-е суток при температуре +5°C утилизирует 4,4 – 5,5% - нефти и нефтепродуктов; при температуре +20°C – 56,4 – 59,8%; при температуре +30°C – 62,0 – 63,4%; при температуре +37°C – 67,0 – 69,6%; в зависимости от типа ксенобиотика (см. таблицу 1).

Пример 4. Очистка водопроводной воды от нефти с помощью клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3

В эксикатор объемом 5,0 дм³ вносят 3,0 дм³ водопроводной воды, отстоявшейся в течение суток при комнатной температуре. В воду добавляют 30000 мг сырой неочищенной нефти и 30,0 см³ бактериального изолята штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 (по примеру 2), содержащего 1,0·10⁹ клеток/см³ суспензии. В качестве контроля используют воду в количестве 3,0 дм³ с добавлением 30000 мг нефти и без внесения микробной суспензии бактериального изолята.

Эксперимент проводят в течение 45 суток при температуре +20±1°С.

Полученные результаты (см. таблицу 2) показали, что в воде деструкция нефти под влиянием штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 за 45 суток составила 53,0%. Деструкция в контрольной ёмкости существенно не изменилась.

Пример 5. Очистка почвы от нефтезагрязнений с помощью клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3

Опыты с применением клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов проведены на супесчаной почве в условиях модельного опыта, искусственно загрязненной нефтью и соляркой. Исходное содержание нефтепродуктов (НП) в почве до обработки почв клетками штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 составило 3000 мг/кг, что соответствовало среднему уровню загрязнения в соответствии с нормативными документами (см. Письмо Минприроды России от 27.12.1993 г. № 04-25/61-5678 «О порядке определения размеров ущерба от загрязнения земель химическими веществами»; Методические рекомендации по выявлению деградированных и загрязненных земель. Комитет РФ по земельным ресурсам от 27 марта 1995 г. № 3-15/582, 29 с.).

Эффективность применения штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 оценивали по степени деградации нефтезагрязнения в почвенных образцах, отобранных для анализа до и после внесения микробной суспензии на основе клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3.

Оценку остаточного содержания нефти в почве до и после проведения опыта проводили гравиметрическим методом согласно инструкции, общепринятым документам (см. РД 39-0177098-015-90 «Инструкция по контролю за состоянием почв на объектах предприятий Миннефтепрома»).

Для этого образцы почвы до и после обработки биопрепаратом подвергались экстракции в аппарате Сокслета четыреххлористым углеродом, после чего экстрагент удаляли перегонкой с дефлегматором, доводя остаток до постоянного веса. Определение влажности образцов проводили общепринятым методом (см. ГОСТ 28268-89 «Почвы. Методы определения влажности, максимальной гигроскопической влажности»), после чего производили перерасчет содержания нефтепродуктов на сухую почву.

Опыты проводили в условиях холодильной камеры при температуре +5±1ºС; в комнатных условиях при температуре +20±1°С и в термостатированных условиях при температуре +30±1°С и температуре +37±1°С.

Установлено, что степень биодеградации нефти и нефтепродуктов в опытных образцах через 45 суток после обработки почв бактериальной суспензией на основе клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 составила при температуре +5±1°С – 6,6-7,3%; при температуре +20±1°С – 54,8-58,0%; при температуре +30±1°С – 60,0-66,6%; при температуре +37±1°С – 60,6-63,3% в зависимости от типа ксенобиотика (см. таблицу 3).

Таким образом, показана эффективность способа очистки почвы и водной среды от нефти и нефтепродуктов (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат), бактериальным препаратом, состоящим из клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 в концентрации 1·10⁹ клеток/см³ суспензии, в относительно короткие сроки (от 3 до 45 суток), в широком диапазоне температур от +5 до +37°С.

Таблица 1

Степень утилизации нефтепродуктов штаммом Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 в водной среде с минеральными компонентами

Вариант опыта Отбор контрольных проб Содержание нефтепродуктов, мг/дм³ t°С +5 +20 +30 +37 Вода+минеральные компоненты+штамм+
нефть до опыта 1000,0 1000,0 1000,0 1000,0 после опыта 956,0 404,0 380,0 304,0 % деструкции 4,4 59,6 62,0 69,6 Вода+минеральные компоненты+штамм+
дизельное топливо до опыта 1000,0 1000,0 1000,0 1000,0 после опыта 950,0 436,0 366,0 330,0 % деструкции 5,0 56,4 63,4 67,0 Вода+минеральные компоненты+штамм+
масло моторное до опыта 1000,0 1000,0 1000,0 1000,0 после опыта 948,0 402,0 380,0 322,0 % деструкции 5,2 59,8 62,0 67,8 Вода+минеральные компоненты+штамм+
масло гидравлическое до опыта 1000,0 1000,0 1000,0 1000,0 после опыта 954,0 402,0 380,0 312,0 % деструкции 4,6 59,8 62,0 68,8 Вода+минеральные компоненты+штамм+
газовый конденсат до опыта 1000,0 1000,0 1000,0 1000,0 после опыта 945,0 404,0 376,0 320,0 % деструкции 5,5 59,6 62,4 68,0

Таблица 2

Деструкция нефти в воде штаммом Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3

Содержание нефтепродуктов, мг/дм³ Степень утилизации нефти, % Вариант опыта до опыта после опыта Вода+нефть+ штамм 30 000,0 15 900,0 53,0 Контроль: Вода+нефть 30 000,0 29 300,0 2,3

Таблица 3

Деструкция нефти и нефтепродуктов в почве под влиянием клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3

Схема опыта Содержание нефти, мг/кг Деградация нефти,
% до очистки после очистки Опыт при температуре +5±1ºС Контроль (почва + нефть) 3000,0 2940,0 2,0 Почва + нефть + суспензия клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 3000,0 2800,0 6,6 Контроль (почва + солярка) 3000,0 2900,0 3,3 Почва + солярка + суспензия клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 3000,0 2780,0 7,3 Опыт при температуре +20±1ºС Контроль (почва + нефть) 3000,0 2820,0 6,0 Почва + нефть + суспензия клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 3000,0 1356,0 54,8 Контроль (почва + солярка) 3000,0 2800,0 6,6 Почва + солярка + суспензия клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 3000,0 1260,0 58,0 Опыт при температуре +30±1ºС Контроль (почва + нефть) 3000,0 2794,0 6,8 Почва + нефть + суспензия клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 3000,0 1200,0 60,0 Контроль (почва + солярка) 3000,0 2750,0 8,3 Почва + солярка + суспензия клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 3000,0 1000 66,6 Опыт при температуре +37±1ºС Контроль (почва + нефть) 3000,0 2760,0 8,0 Почва + нефть + суспензия клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 3000,0 1180,0 60,6 Контроль (почва + солярка) 3000,0 2700,0 10,0 Почва + солярка + суспензия клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 3000,0 1100,00 63,3

Изобретение относится к биотехнологии. Способ очистки почв и водной среды от нефти и нефтепродуктов предусматривает внесение бактериального препарата, состоящего из клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3, депонированного во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-12247 в концентрации 1·10⁹ клеток/см³ суспензии в загрязненную почву или водную среду. Изобретение позволяет повысить эффективность очистки почвы и водной среды от нефти и нефтепродуктов (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат) в относительно короткие сроки и в широком диапазоне температур (от +5 до +37°С). 1 ил., 3 табл., 5 пр.

Способ очистки почвы и водной среды от нефти и нефтепродуктов, отличающийся тем, что применяется бактериальный препарат, состоящий из клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia ВКПМ В-12247 в концентрации 1⋅10⁹ клеток/см³ суспензии.