Штамм бактерий Rhodococcus jialingiae Б-М-1 ВКПМ Ас-1967 - деструктор нефти и нефтепродуктов Российский патент 2017 года по МПК C12N1/20 B09C1/10 C02F3/34 C12R1/01 

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано при очистке почвы и воды в случае аварийных разливов нефти и нефтепродуктов (газовый конденсат, бензин, мазут) на стадии проведения биологического этапа рекультивации при температуре окружающей среды от плюс 4 до 32°С.

Проблема загрязнения окружающей среды нефтью и нефтепродуктами в настоящее время становится все более актуальной, в связи с изношенностью оборудования возникают значительные разливы данных продуктов. Наиболее эффективными способами очистки нефтезагрязненных территорий в настоящее время являются биологические методы, основанные на использовании микроорганизмов-нефтедеструкторов. Однако ситуация осложняется тем, что микроорганизмы обладают избирательностью в отношении определенных по составу нефтепродуктов.

Известны штаммы Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus luteus, Micrococcus flavus (S4 1493666), которые осуществляют деструкцию нефтепродуктов в ассоциации, что увеличивает трудозатраты на изготовление и стоимость конечного препарата.

Известны штаммы Acinetronacter sp. НВ-1 (RU 2077579); Acinetronacter sp. JN-2 (RU 2064017); Pseudomonas alcaligenes E-7 (RU 2134723); Pseudomonas putida 36 (SU 1076446), пригодные для очистки нефти. Однако данные о нефтедеструкции конкретных нефтепродуктов отсутствуют.

Большая эффективность в условиях низких положительных температур установлена для штаммов Rhodococcus erythropolis Е-17 (RU 2019527) при биодеградации нефти, без результатов утилизации нефтепродуктов.

Наиболее близким аналогом является штамм Rhodococcus sp. - деструктор нефтяных углеводородов, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером Ас-2046 (патент РФ №2518349 от 11.04.2013). Недостатком данного штамма является отсутствие информации по нефтеокисляющей способности в отношении легких углеводородов (керосин, газовый конденсат), а также о его активности при низких положительных температурах окружающей среды.

Задачей изобретения является расширение номенклатуры штаммов нефтедеструкторов, обладающих утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам при широком диапазоне температур (от плюс 4 до плюс 32°С).

Полученный штамм характеризуется следующими признаками:

Культурально-морфологические признаки

При выращивании на FT-агаре формирует колонии округлые, слизистые, кремового цвета (с возрастом приобретают розовый оттенок), с ровным краем, диаметром 1-3 мм. В тиогликолевой среде и на бульоне Хоттингера наблюдается равномерное помутнение среды со слизистым осадком на 2 сутки, при этом среда приобретает розовый оттенок. При микроскопии мазков, окрашенных по Граму, в молодых культурах (12-16 часов) преобладают грамположительные прямые или слегка изогнутые палочки с закругленными краями, расположенные отдельно или короткими (по 2-3 особи) цепочками, которые с возрастом (18 и более часов) распадаются на кокки.

Физиолого-биохимические признаки

Штаммы обладают способностью к росту при температуре от плюс 4 до 32°С в аэробных условиях, оптимум при температуре 28-32°С и рН 6,0-8,0. Продолжительность культивирования на плотной питательной среде (FT-агар) - 48-72 часа, жидкой питательной среде (минимальная солевая среда Ворошиловой-Диановой) - 96…120 часов. Обладает способностью к росту при рН, равном 9,0, и в присутствии 6% NaCl.

Штамм образует уреазу, фосфатазу, γ-глютамилтрансферазу и β-глюкозидазу.

Штамм не обладает патогенностью для человека и животных согласно классификации, приведенной в Санитарных правилах СП 1.3.2322-08.

Поддержание и хранение штамма осуществляется в лиофилизированном состоянии при температуре 2…6°С в течение 12 месяцев. Для поддержания свойств штамма проводится пассаж хранившейся культуры на жидкой минимизированной среде Ворошиловой-Диановой с добавлением нефти и последующем пересеве на аналогичную плотную питательную среду, содержащую в своем составе 2% агара по методу Дригальского. В дальнейшем проводят последовательное накопление микробных клеток, отобранных с отдельных колоний, путем пересевов на плотной питательной среде FT-агар, скошенной в пробирках и матрацах. Культуру, выращенную на скошенной питательной среде в матрацах, смывают средой высушивания и подвергают лиофильной сушке. Полученную сухую культуру закладывают на последующее хранение. При необходимости приготовления микробной массы сухую культуру ресуспендируют физиологическим раствором и полученную суспензию микробных клеток используют для дальнейшего накопления биомассы в соответствии с разработанной технологией.

Изобретение поясняется следующими примерами:

Пример 1. Выделение штамма Rhodococcus jialingiae Б-М-1 ВКПМ Ас-1967

Штамм Rhodococcus jialingiae Б-М-1 ВКПМ Ас-1967 выделен из почвы Кировской области, загрязненной нефтепродуктами, следующим образом: 1,0 г исследуемого материала разводили в 9,0 см³ стерильного физиологического раствора и высевали на чашки с плотной питательной средой Ворошиловой-Диановой, содержащей 2% агара и 1% нефти. Смесь выросших на чашках с плотной питательной средой культур смывали 10,0 см³ физиологического раствора и засевали в колбы с жидкой питательной средой Ворошиловой- Диановой, содержащей 2% нефти. После инкубирования в течение 120 часов при температуре 32°С полученную культуру высевали на чашки с плотной питательной средой Ворошиловой-Диановой, содержащей 2% агара и 1% нефти. Высев проводили по методу Дригальского на 6 последовательных чашек. В результате проведенных операций была выделена культура Б-М-1, которая характеризовалась выраженной нефтедеструктивной активностью, культурально-морфологическими и биохимическими признаками, присущими роду Rhodococcus. Дальнейшие исследования были проведены совместно со специалистами ФГУП ГосНИИГенетика, в которое были отправлены для проведения токсонометрической идентификации на основании молекулярно-генетического анализа «чистые» агаризованные культуры выделенного изолята. Идентификация штамма Б-М-1 до вида с использованием анализа генов, кодирующих 16SpPHK, показала, что наиболее близкими по исследованному показателю для выделенного изолята являются виды Rhodococcus jialingiae и Rhodococcus gingshengii. Дифференциально-диагностическая оценка была проведена на основании рекомендованных методов оценки культурально-морфологических и физиологических свойств. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1. Культурально-морфологические и физиологические свойства выделенного штамма Б-М-1

Полученные результаты свидетельствуют о том, что выделенный штамм относится к виду Rhodococcus jialingiae.

Результаты проведенных экспериментальных исследований определили целесообразность депонирования штамма Rhodococcus jialingiae во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером Ас-1967.

Пример 2. Приготовление посевного материала и препарата на основе микробных клеток Rhodococcus jialingiae штамма Б-М-1 ВКПМ Ас-1967

Лиофильно выделенную культуру Rhodococcus jialingiae ресуспендируют в 0,9%-ном растворе NaCl и высевают по 0,2 мл на плотную питательную среду FT-агар, скошенную в пробирках, содержащую (г/дм³):

сернокислотный гидролизат рыбной муки 17,0 стимулятор роста гемофильных микроорганизмов 5,0 экстракт пекарских дрожжей 2,3 магний сернокислый 0,5 натрия сульфит 0,7 цистеин 0,5 глюкоза 20,0 агар 15,0 дистиллированная вода 1,0 дм³

Посевы выдерживают при температуре 30±2°С в течение 46…50 часов. Выращенную на скошенной плотной питательной среде в пробирках микробную культуру смывают 0,9%-ным раствором NaCl и готовят посевной материал с концентрацией 1⋅10⁹ микробных тел по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Приготовленную бактериальную суспензию вносят в количестве 15 см³ в колбу емкостью 500,0 см³, содержащую 150,0 см³ жидкой питательной среды Ворошиловой-Диановой, включающую (г/дм):

К₂НР0₄ 3,8 КН₂Р0₄ 1,2; MgS0₄ 2,0 (NH₄)₂S0₄ 1,0 СаСl₂⋅6Н₂0 0,01 Fe₂(S0₄)₃⋅7Н₂0 0,0013 нефть 0,5 дистиллированная вода 1,0 дм³

и культивируют в течение 96…120 часов при температуре 30±2°С. Полученную нативную культуру, содержащую не менее 1⋅10⁹ живых микробов в 1 см³, используют в качестве биологического препарата для оценки деструктивной активности в отношении нефти и нефтепродуктов при различных температурных режимах.

Пример 3. Исследование нефтеокисляющей активности штамма Rhodococcus jialingiae Б-М-1 ВКПМ Ас-1967 в отношении нефти, мазута, бензина и газового конденсата

Для определения биодеградационной активности штамма Rhodococcus jialingiae Б-М-1 ВКПМ Ас-1967 в отношении нефти, мазута, бензина и газового конденсата готовят минимальную солевую среду Ворошиловой-Диановой по прописи, приведенной в примере 2. Среду разливают в лабораторные колбы емкостью 500,0 см³ по 150,0 см³. Затем в отдельные колбы вносят нефть, газовый конденсат, бензин, мазут в количестве 0,5 г/л среды и нативную культуру штамма Rhodococcus jialingiae (по примеру 2) в количестве, обеспечивающем конечную биологическую концентрацию в смеси 1⋅10⁷ живых микробных клеток. В качестве контроля параллельно ставят аналогичные пробы без внесения микробной культуры. Затем пробы выдерживали на шуттель-аппарате при температуре 18…22°С и постоянном перемешивании 180 об/мин в течение 7 сут. Определение нефтедеструктивной активности проводили с использованием прямого метода оценки снижения концентрации нефти и нефтепродуктов реакционной смеси. Метод заключается в выделении эмульгированных и растворенных нефтяных компонентов из воды экстракцией четыреххлористым углеродом, хроматографическом отделении нефтепродуктов от сопутствующих органических соединений других классов на колонке, заполненной оксидом алюминия, и количественном их определении по интенсивности поглощения С-Н-связей в инфракрасной области спектра (2930±70) см^-1. Измерение количества нефтепродукта проводится с использованием прибора КН-2м в соответствии с ПНДФ.14.1:2:4.168-200.

Биодеградационная активность штамма Rhodococcus jialingiae Ac-1967 рассчитывается по формуле 1:

где БА - биодеградационная активность;

m_н.к. - масса нефтепродуктов в контроле, в мг, после 7 сут;

m_н.п. - масса нефтепродуктов в опыте, в мг, после 7 сут.

Результаты, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о том, что углеводородокисляющая активность штамма Rhodococcus jialingiae составляла в отношении, %:

нефти 44 газового конденсата 56,2 мазута 29,8 бензина 54,3

Таблица 2 - Результаты оценки углеводородокисляющей активности штамма Rhodococcus jialingiae Б-М-1 ВКПМ Ас-1967 в отношении нефти и нефтепродуктов

Пример 4. Определение биодеградационной активности штамма Rhodococcus jialingiae Б-М-1 ВКПМ Ас-1967 в отношении нефти и нефтепродуктов при загрязнении воды и различных температурных режимах

Для определения биодеградационной активности штамма Rhodococcus jialingiae ВКПМ Aс-1967 в отношении нефти и нефтепродуктов при загрязнении воды и различных температурных режимах минимальную солевую среду Ворошиловой-Диановой (пропись среды изложена в примере 2) разливали в стаканы емкостью 500,0 см³ по 150,0 см³. Затем в стаканы вносили нефть в количестве 1 см³/дм³ и нативную культуру штамма Rhodococcus jialingiae (по примеру 2) в количестве, обеспечивающем конечную биологическую концентрацию в смеси 1⋅10⁷ живых микробных клеток в 1 см³. Приготовленные пробы выдерживали в статических условиях с периодическим (2-3 раза в сутки) перемешиванием при температурах плюс 2…6, 18…22, 30 …32°С в течение 7 и 14 сут. Через указанные промежутки времени при выбранных температурных режимах измеряли концентрацию нефтепродуктов в пробах (в соответствии с методом, изложенным в примере 1). Полученные результаты проведенных исследований представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Результаты оценки биодеградационной активности штамма Rhodococcus jialingiae Б-М-1 ВКПМ Ас-1967 в отношении нефти и нефтепродуктов при загрязнении воды и различных температурных режимах

Пример 5. Определение биодеградационной активности штамма Rhodococcus jialingiae Б-М-1 ВКПМ Ас-1967 в отношении нефти и нефтепродуктов при загрязнении почвы и различных температурных режимах

Определение биодеградационной активности штамма Rhodococcus jialingiae Б-М-1 ВКПМ Ас-1967 в отношении нефти и нефтепродуктов при загрязнении почвы и различных температурных режимах проводили следующим образом. Исходный материал (почву) доводили до 50-60% остаточной влажности путем внесения физиологического раствора и фасовали по 50,0 г в чашки Петри. Затем вносили нефть и нефтепродукты из расчета 10 г/кг почвы и культуру штамма Rhodococcus jialingiae из расчета конечной концентрации 1⋅10⁷ живых микробов на 1 г загрязненной почвы. Приготовленные пробы выдерживали при температурах плюс 2…6; 18…22; 30…32°С в течение 7 и 14 сут. Остаточную влажность поддерживали орошением физиологическим раствором на протяжении срока наблюдения. Через указанные промежутки времени измеряли концентрацию нефтепродуктов в пробах методом спектрометрии, который заключается в экстракции нефтепродуктов из почвы, их хроматографическом отделении от сопутствующих органических соединений других классов и количественном определении нефтепродуктов по интенсивности поглощения в ИК-области спектра. Измерение количества нефтепродукта проводится с использованием прибора КН-2м в соответствии с «Методикой выполнения измерений массовой доли нефтепродуктов в минеральных, органогенных, органоминеральных почвах и донных отложениях методом спектрометрии» (ПНДФ.16.1:2.2.22-98). Полученные результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Результаты оценки биодеградационной активности штамма Rhodococcus jialingiae Б-М-1 ВКПМ Ас-1967 в отношении нефти и нефтепродуктов при загрязнении почвы и различных температурных режимах

Таким образом, заявляемый штамм утилизирует нефть и нефтепродукты (газовый конденсат, бензин, мазут) в воде и почве в широком диапазоне температур (от плюс 2…6 до 30…32°С).

Изобретение относится к микробиологии. Штамм бактерий Rhodococcus jialingiae Б-М-1 обладает способностью утилизировать газовый конденсат, бензин, нефть, мазут в течение короткого промежутка времени. Штамм бактерий Rhodococcus jialingiae депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером Ас-1967. Штамм может быть использован для деструкции нефти и нефтепродуктов в диапазоне температуры от 4 до 32°С. Изобретение позволяет повысить эффективность мероприятий по деструкции нефти и нефтепродуктов в диапазоне температуры от 4 до 32°С. 4 табл., 5 пр.

Штамм бактерий Rhodococcus jialingiae Б-М-1 ВКПМ Ас-1967 - деструктор нефти и нефтепродуктов.