СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПСОРИАЗА Российский патент 2017 года по МПК G01N33/49 C12Q1/68 

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии, иммунологии, и может быть использовано для диагностики псориаза.

Известен способ диагностики псориаза путем микроскопического исследования биологической ткани [Б.А. Беренбейн и др. Дифференциальная диагностика кожных болезней. М.: Медицина, 1989]. Способ включает взятие биоптата кожи и определение характерных для псориаза гистологических изменений (паракератоз, акантоз, истончение мальпигиевого слоя над удлиненными сосочками дермы, лимфомакрофагальная инфильтрация вокруг сосудов дермы). Недостатки известного способа: травматичность (из-за необходимости проведения микрохирургической операции для взятия биоптата); трудоемкость; длительность (проведение гистологического исследования составляет 10-12 дней); необходимость использования дорогостоящего оборудования.

Известен способ диагностики псориаза путем оценки хемилюминесценции суспензии липопротеидов низкой и очень низкой плотности, выделенных из сыворотки крови пациентов с измерением показателей светосуммы S и интенсивности быстрой вспышки I и коэффициента Н, равного отношению S к I [патент RU 2373536]. При Н больше 4,8 предполагают наличие псориаза у обследуемого пациента. Недостатком известного способа является низкая достоверность, так как: метод хемилюминесценции является крайне чувствительным, и полученные результаты зависят от качества проведения исследования, рН рабочих растворов, температуры окружающей среды и освещения; содержание липопротеидов низкой и очень низкой плотности изменяется в зависимости от характера питания и образа жизни; способ не учитывает роль иммуногенетических факторов (уровень цитокинов в сыворотке крови в зависимости от полиморфизма генов исследуемых цитокинов) в развитии псориаза.

Прототипом заявляемого способа является способ диагностики псориаза, включающий определение наличия мономорфной сыпи в виде плоских папул розово-красного цвета величиной до 1 см плотноватой консистенции, несколько возвышающихся над уровнем здоровой кожи, и последующее выявление псориатической триады - характерных диагностических феноменов (феномен стеаринового пятна, феномен псориатической пленки, феномен кровяной росы) [В.П. Адаскевич, В.М. Козин. Кожные и венерические болезни. М.: Мед. лит., 2006]. Способ широко применяется в клинической практике, однако имеет недостаточную достоверность, так как основан на субъективной оценке диагностических критериев.

Задачей изобретения является создание информативного способа диагностики псориаза на основании лабораторных критериев.

Поставленная задача достигается тем, что при наличии псориазиформных высыпаний на коже больного и выявлении у него псориатической триады феноменов, дополнительно в цельной крови исследуют аллельный полиморфизм С-597А гена IL10, а в сыворотке крови определяют уровень цитокина IL-10. При выявлении генотипа АА-597 IL10 и уровне цитокина IL-10 ниже 1,9 пг/мл у больного диагностируют псориаз.

Значение уровня цитокина IL-10 в сыворотке крови 1,9 пг/мл получено опытным путем на основании сопоставления данных концентрации IL-10 в сыворотке крови больных псориазом (n=49) и здоровых доноров крови (n=94). Установлено, что уровень цитокина IL-10 в сыворотке крови больных псориазом был достоверно ниже в сравнении с контрольной группой: 1,4 пг/мл и 1,9 пг/мл, соответственно, p_1,2=0,007.

Продукция цитокинов является генетически детерминированной и зависит от наличия ограниченного количества конкретных генов (генов-кандидатов). Отклонения в последовательности единичных нуклеотидов генов-кандидатов (однонуклеотидные полиморфизмы или single-nucleotide polymorphism, SNPs) обуславливают нарушение их функции, что приводит к изменению уровня конечного продукта. Результаты определения SNPs IL10 при ПС представлены в таблице 1.

Нами установлено, что дефицит IL-10 в сыворотке крови больных псориазом, носителей генотипа С/А+А/А, играет ключевую роль в формировании патологии.

Способ осуществляется следующим образом.

У пациента с подозрением на псориаз на основании объективного обследования определяют наличие псориазиформных высыпаний на коже и псориатической триады феноменов (феномен стеаринового пятна, феномен терминальной пленки, феномен точечного кровотечения). Псориатическую триаду феноменов определяют путем поскабливания псориатических высыпаний на коже предметным стеклом. Феномен стеаринового пятна характеризуется усилением шелушения при легком поскабливании, придающем поверхности папул сходство с растертой каплей стеарина. Феномен терминальной (псориатической) пленки, возникающей после удаления чешуек, проявляется в виде влажной, тонкой, блестящей поверхности элементов. Феномен точечного кровотечения (кровяной росы) проявляется после легкого поскабливания терминальной пленки в виде точечных, не сливающихся капелек крови.

При наличии псориатической триады у больного утром натощак производят забор крови из локтевой вены для определения уровня цитокина IL-10 и исследования полиморфизма С-597А гена IL10. Забор крови производят в количестве 10 мл в 2 одноразовые пробирки (объемом 5 мл каждая), содержащие этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) в качестве антикоагулянта.

Уровень IL-10 определяют в сыворотке крови больного, полученной путем центрифугирования, методом твердофазного иммуноферментного анализа на иммуноферментном планшетном анализаторе Stat Fax 2100 с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск).

Для исследования полиморфизма С-597А гена IL10 производят выделение ДНК из цельной венозной крови больного при помощи стандартного набора для выделения ДНК (производитель ООО «Лаборатория Медиген», г. Новосибирск). Генотипирование аллельных вариантов осуществляют методом рестриктного анализа продуктов амплификации (ПДРФ - анализ) специфических участков генома. На первом этапе проводят амплификацию фрагмента ДНК промотора гена IL10 в пробирках типа «Эппендорф» с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфическими олигонуклеотидными праймерами, фланкирующими участок промотора, содержащий функциональный полиморфизм в позиции - 597 с применением амплификатора «Tercik МС2» («ДНК-технология», Москва). Гидролиз полученного фрагмента ДНК с помощью специфической энодонуклеазы (рестриктазы) («Сибэнзим», г. Новосибирск). Идентификацию генотипа проводят при электрофоретическом разделении продуктов рестрикции в 2% агарозном геле, окрашенных раствором этидиум бромида.

Уровень цитокина IL-10 в сыворотке крови ниже 1,9 пг/мл и выявление генотипа АА-597 IL10 у больных с наличием псориазиформных высыпаний на коже и псориатической триады феноменов являются основанием для диагностики псориаза.

Клинический пример. Пациентка К., 24 года.

Поступила с жалобами на высыпания на волосистой части головы, туловище, верхних и нижних конечностях. Предварительный диагноз: псориаз.

Проведено исследование по заявленному способу. Данные объективного осмотра: кожный процесс распространенный, локализован на волосистой части головы, туловище, верхних, нижних конечностях, представлен ярко-красными папулами, сливающимися в бляшки, покрытые серебристо-белыми чешуйками с инфильтрацией в основании. При поскабливании папул предметным стеклом выявлена положительная псориатическая триада.

Уровень цитокина IL-10 в сыворотке крови больной, определенный методом твердофазного иммуноферментного анализа, составил 1,4 пг/мл (ниже 1,9 пг/мл).

При исследовании полиморфизма С-597А гена IL10 с выделением ДНК из цельной венозной крови больной выявлен генотип А/А-597 IL10.

Наличие у больной характерных высыпаний на коже, присутствие псориатической триады феноменов, уровень IL-10 в сыворотке крови менее 1,9 пг/мл и наличие генотипа А/А-597 IL10 в цельной венозной крови позволяют диагностировать псориаз.

Технический результат заявленного способа:

- объективизация диагностики псориаза за счет использования информативных иммуногенетических диагностических критериев;

- расширение арсенала способов для диагностики псориаза.

Таким образом, способ информативен, отвечает современным требованиям к методам лабораторной диагностики, позволяет достоверно диагностировать псориаз у больных и может быть рекомендован для применения в клинической практике.

Изобретение относится к медицине и касается способа диагностики псориаза. Сущность способа заключается в том, что при наличии псориазиформных высыпаний на коже больного и псориатической триады феноменов дополнительно в цельной крови исследуют аллельный полиморфизм С-597A гена IL10, и в сыворотке крови определяют уровень цитокина IL-10. При выявлении генотипа АА-597 IL10 и уровне цитокина IL-10 ниже 1,9 пг/мл у больного диагностируют псориаз. Использование способа позволяет с высокой точностью диагностировать псориаз у больных. 1 табл., 1 пр.

Способ диагностики псориаза, включающий определение клинических признаков, отличающийся тем, что при наличии псориазиформных высыпаний на коже больного и выявлении псориатической триады феноменов дополнительно в цельной крови исследуют аллельный полиморфизм С-597А гена IL10, а в сыворотке крови определяют уровень цитокина IL-10, и при выявлении генотипа А/А-597 IL10 и уровня цитокина IL-10 ниже 1,9 пг/мл у больного диагностируют псориаз.