Способ оценки у детей влияния стронция на апоптоз, ассоциированный с аллельными вариантами гена FAS Российский патент 2017 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к области медицины и биологии, в частности к исследованиям ксенобиотиков, в частности стронция, модифицирующего апоптоз у детей, проживающих в районах экологического неблагополучия, и может быть использовано для диагностики и прогнозирования токсического действия стронция на процесс апоптоза, приводящий к нарушению иммунной системы пациента, в частности приводящий к аллергическим и/или аутоиммунным состояниям человека.

Для понимания существа вопроса, следует пояснить следующее.

Постоянное многокомпонентное воздействие техногенных химических факторов в промышленно развитых регионах оказывает негативное влияние на здоровье населения, в частности детское. В последнее десятилетие возникла проблема воздействия стабильного стронция на здоровье в связи с вовлечением в питьевое водоснабжение больших объемов артезианской воды водоносных горизонтов, где содержание стабильного стронция в 2-5 раз превышает предельно-допустимое - 7 мг/л. Стронций, будучи изоформен кальцию и обладая высокой подвижностью, способен блокировать ионные каналы для последнего, воздействовать на кальций-зависимые рецепторы и конкурировать за активные участки белков, не выполняя физиологической функции, что может определить ингибирующее влияние стронция на иммунную регуляцию, в том числе, на апоптоз.

Апоптоз - генетическая запрограммированная форма клеточной гибели, определяемая на основе характерных морфологических изменений умирающих клеток. Данный процесс является одним из ключевых процессов, определяющих формирование антигенспецифической составляющей иммунной системы и в значительной степени реализацию ее эффекторных функций. Однако известны патологические состояния, при которых механизм запрограммированной клеточной гибели оказывается либо заблокированным, либо активированным, что приводит либо к неконтролируемой клеточной пролиферации, не сдерживаемой конкурирующим процессом апоптоза, либо к ускоренной клеточной гибели и к снижению их иммунокомпетентности. При этом экотоксиканты, в частности стронций, способны нарушать регуляторные функции иммунной системы, что может способствовать снижению адаптационных возможностей организма, возникновению онкологических, аутоиммунных и иммунодефицитных состояний. Этим и обусловлена потребность в получении оценки апоптоза, модифицированного стронцием. А использование в качестве инструмента при такой оценке аллельных состояний гена FAS обусловлено тем, что, во-первых, среди маркеров апоптоза наиболее изученным является клеточный рецептор CD95 (FAS), по которому судят об активации иммунных клеток и их готовности к FAS-индуцированному апоптозу; во-вторых, измененный ген является предиктором, т.е. наиболее ранним предвестником возможных нарушений функции иммунной системы, что особенно важно для детского контингента, у которых только формируются адаптации к факторам окружающей среды. Выбранный полиморфный участок гена FAS 14405С/Т (нуклеотид цитозин (С) в позиции 14405 заменен тимидином (Т)) (rs 1159120) относится к его интронной части, аллельная транзиция которого изменяет транскрипционную активность гена.

Из уровня техники известен ряд способов, при реализации которых оценивают апоптоз у биологических объектов, а именно:

- «Способ определения тяжести заболевания и эффективности лечения у больных бронхолегочными заболеваниями (Заявка на изобретение №2009101693). Согласно указанному известному решению производят отбор исследуемого материала, выделение из него клеточной субстанции, подготовку ее к исследованию, определение величины альтерации клеток путем оценки их апоптоза, при этом в качестве исследуемого материала используют индуцированную мокроту больного и здорового человека, в клеточной субстанции дополнительно определяют величину альтерации клеток путем некроза, при этом показатели апоптоза и некроза определяют при двух и более обследованиях с интервалом в 1-3 суток, полученные показатели выражают в виде апоптотического индекса (АИ) и индекса некроза (ИН), рассчитывают индекс альтерации клеток (ИАК) по формуле: ИАК=ИН/АИ, где ИН - индекс некроза; АИ - апоптотический индекс; при этом тяжесть заболевания определяют путем сравнения показателя индекса альтерации клеток больного с показателем индекса альтерации клеток здоровых лиц, и диагностируют легкое течение бронхолегочного заболевания при показателях ИАК более 1,5, среднее до 1,0 и тяжелое менее 1,0, а эффективность лечения определяют путем сравнения начальных показателей индекса альтерации клеток больного с показателем индекса альтерации после лечения, и диагностируют положительную динамику лечения при увеличении ИАК до значений для здоровых лиц 2,0.

Предлагаемый способ отличается от указанного известного тем, что оценивается не степень тяжести патологии, а идентифицируется этиологический фактор (химический - стронций), инициирующий процесс апоптоза, а также степень вызываемых исключительно этим фактором отклонений по данному критерию. Кроме того, в качестве показателя гибели в заявляемом способе используется критерий только апоптоза (некроз, как в известном способе, не учитывается), причем именно ген рецептора, отвечающего за апоптоз, что позволяет прогнозировать и анализировать предлагаемым способом ранние нарушения состояния запрограммированного процесса клеточной гибели.

- «Функциональный иммуноанализ in vitro» (Патент РФ №2416797), согласно которому производят выделение клеток, первичную инкубацию из крови, сыворотки или плазмы пациента клеток с исследуемым веществом, получение супернатанта или смеси из клеток и супернатанта первичной инкубации, вторичную инкубацию клеток-мишеней с супернатантом или смесью из клеток и супернатанта и анализ клеток-мишеней. При этом в случае выделенных клеток речь идет о первичной инкубации эффекторных клеток иммунной системы. В случае клеток-мишеней вторичной инкубации речь идет о клетках человека или клетках высших млекопитающих.

В известном способе вещество используется как лекарственное преиммобилизационное средство, измененные клетки и супернатант после экспозиции которого будут применяться для апоптоза опухолевых клеток. В предлагаемом же способе оценивается угнетение апоптоза самих клеток иммунной системы под воздействием исследуемого вещества - стронция, что не ставится задачей известного способа, но может привести к недостаточной эффективности в дальнейшем апоптоза опухолевых клеток.

Также известен Способ количественной оценки апоптоза, модифицированного органическими низкомолекулярными соединениями (Патент РФ №2471190), согласно которому производят отбор пробы крови у пациента, выделение из пробы мононуклеарных клеток и инкубацию клеток с исследуемым соединением, где выделение из пробы мононуклеарных клеток производят путем введения в пробу этилендиаминтетраацетата, разведения ее водным раствором хлорида натрия, наслоения на 3 мл фиколла-урографина с градиентом плотности 1,077 г/мл, с последующим центрифугированием в течение 30 мин при 1500 об/мин и отбором мононуклеарных клеток, затем производят двукратный отмыв выделенных клеток раствором хлорида натрия и проводят ресуспендирование указанных клеток в рабочем растворе буфера для окрашивания IX Annexin V Binding Buffer до концентрации 1×10⁶ клеток/мл, при этом рабочий раствор буфера для окрашивания IX Annexin V Binding Buffer представляет собой смесь концентрированного буфера для окрашивания 10Х Annexin V Binding Buffer с дистиллированной водой в объемном соотношении 1:9 соответственно, затем осуществляют инкубацию полученных клеток с исследуемым органическим низкомолекулярным соединением, получая опытный образец, и осуществляют инкубацию полученных клеток без добавления указанного соединения, получая контрольный образец, при этом инкубацию полученных клеток с исследуемым органическим низкомолекулярным соединением и без него проводят в течение 1 часа при температуре 37°C, после инкубации в опытный и контрольный образцы вводят реагенты аннексии V и йодид пропидия, образцы вновь инкубируют в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин, добавляют рабочий раствор буфера для окрашивания IX Annexin V Binding Buffer и осуществляют цитометрический анализ полученных образцов с определением содержания в них аннексина V, сравнивают численные величины содержания аннексина V в контрольном и опытном образцах и по соотношению большего числа содержания аннексина V к меньшему количественно оценивают апоптоз, модифицированный органическим низкомолекулярным соединением, причем при указанном соотношении, равном 1,5 и более, судят об апоптозе - критическом состоянии запрограммированной клеточной гибели в связи с влиянием указанного органического соединения.

Однако известный способ предназначен для оценки состояния апоптоза клеток под воздействием анализируемого химического вещества как факта свершившегося, то есть идентификация происходит на последней стадии процесса апоптоза, когда мероприятия по нейтрализации нарушений апоптоза будут запоздалыми, в то время как предлагаемый способ предполагает оценку состояния апотоза на уровне запуска рецептора CD95+, который является пусковым фактором в цепочке событий апоптоза, и идентификация его изменений позволяет использовать меры по коррекции развития сценария апоптоза, а выявление измененного гена FAS позволяет получить максимально раннюю информацию об апоптозе на уровне прогноза и использовать ранние превентивные мероприятия.

При этом из уровня техники не были выявлены известные способы оценки влияния стронция на апоптоз, ассоциированный с аллельным состоянием гена FAS, поэтому сделать выбор ближайшего аналога к заявляемому объекту не представляется возможным.

Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в обеспечении точности оценки влияния стронция на апоптоз через аллельные варианты гена FAS с обеспечением возможности в последующем судить о развитии иммунодефицитных и иммунопролиферативных состояний населения уже на ранних стадиях.

Указанный технический результат достигается предлагаемым способом оценки у детей влияния стронция на апоптоз, ассоциированный с аллельными вариантами гена FAS, заключающимся в том, что производят отбор пробы крови у ребенка и определяют в пробе содержание стронция, также из указанной пробы крови производят выделение мононуклеарных клеток, далее на полученных мононуклеарных клетках определяют уровень лимфоцитов, содержащих на мембране рецептор CD95+, также у указанного ребенка отбирают пробу буккального эпителия, осуществляют выделение из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты ДНК, затем на детектирующем амплификаторе с использованием полимеразной цепной реакции ПЦР проводят генотипирование полиморфизма, используя в качестве праймера участок ДНК гена FAS 14405С/Т (rs1159120) путем исследования его аллельного состояния, устанавливая при этом для гена FAS одно из следующих его состояний: гетерозиготное, или нормальное гомозиготное, или патологическое гомозиготное, и при одновременном выполнении следующих условий: наличие патологического гомозиготного или гетерозиготного генотипов гена FAS 14405С/Т, снижение в крови уровня лимфоцитов, содержащих на мембране рецептор CD95+, в 1,5 и более раз по отношению к нижней границе физиологической нормы указанных лимфоцитов с CD95+ для детей, и при превышении концентрации стронция в крови более чем в 1,5 раза по отношению к референтному уровню оценивают процесс апоптоза у ребенка под влиянием стронция как замедленный, а при отсутствии хотя бы одного из вышеуказанных условий оценивают процесс апоптоза у ребенка под влиянием стронция как нормальный.

Поставленный технический результат достигается за счет следующего.

Многочисленные экспериментальные данные указывают на участие стабильного стронция (Sr²⁺) в переключении основных режимов функционирования клетки, тем самым принимая участие в регуляции апоптоза. При воздействии стронция как лиганда происходит запуск цепочки событий апоптоза через ген FAS-рецептор (CD95+), передача сигнала через мембрану в разные компартменты клетки, внутриклеточное распознавание, с последующим сигнальным процессингом, включающим активацию и транслокацию транскрипционных факторов, что в итоге приводит к транскрипции и экспрессии требуемых генов. В настоящее время не вызывает сомнения участие стронция в изменение трансдукции апоптотического сигнала, однако, возможные механизмы участия Sr² в регуляции летальной программы иммунокомпетентных клеток остаются недостаточно изученными.

Благодаря использованию в качестве исследуемого материала пробы крови, а также стандартных методик изучения иммунологических параметров, обеспечивается простота, надежность и доступность исследований, а также получение результатов нужной информативности.

Установление содержания химического контаминанта - стронция, именно в крови обусловлено тем, что кровь является самой гомеостатичной средой (управляемость и регулируемость концентраций составляющих ее компонентов) и единственной, имеющей реферируемые константы в отношении техногенных химических веществ.

Воздействие химических факторов оказывает негативное влияние на регуляторные системы и адаптационные возможности организма, что в свою очередь ведет к снижению резистентности, сопротивляемости организма к инфекционным заболеваниям и повышению чувствительности к неинфекционной патологии. Механизмы реализации этих состояний часто ассоциированы с нарушениями запрограммированной гибели клеток (апоптоза), при которых наблюдается либо активация апоптоза, либо его торможение (замедление). Ингибирование клеточной гибели определяет опухолевые поражения различной природы, аутоиммунные и вирусные заболевания.

При изучении влияния химических факторов на возникновение дисбаланса иммунной системы, что часто выражается в нарушении регуляции апоптоза, особую значимость представляет оценка генотипа и фенотипа клеточного иммунитета, который определяется клеточной рецепцией. Использование генетического, медико-химического и специфического иммунологического тестирования позволило подтвердить наличие особенностей апоптоза при воздействии химических факторов на организм человека. При этом для идентификации рецептора регуляции апоптоза CD95+ рекомендуется использовать метод проточной цитометрии типов клеток в суспензии из периферической крови населения, проживающего в условиях экспозиции стронцием.

В качестве критерия оценки нарушения регуляции клеточной гибели в условиях химической контаминации рекомендуется использовать снижение уровня мембранного рецептора клеточной гибели CD95+ при условии гомо- и гетерозиготных аллельных вариантов гена FAS 14405С/Т.

Выделение из пробы крови мононуклеарных клеток обусловлено необходимостью определения в них уровня лимфоцитов, содержащих на своей мембране рецептор CD95+. Это обусловлено тем, что CD95+ является пусковым рецептором для инициаций цепочки молекулярных процессов, заканчивающихся апоптозом клетки.

Благодаря использованию в качестве исследуемого материала буккального эпителия (пробы биологического материала со слизистой щеки), обеспечивается простота и надежность исследований, а также получение нужной информативности, в плане выделения из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) проведения генотипирования полиморфизма используется в качестве праймера участок ДНК гена FAS С14405Т (rs 1159120) путем исследования его аллельного состояния, устанавливая при этом для гена FAS одно из следующих его состояний: гетерозиготное, или нормальное гомозиготное, или патологическое гомозиготное. У гена FAS 2 аллеля (1 пара аллелей) С и Т (С - дикий или нормальный, Т - мутантный или вариантный). Замедленный процесс апоптоза характеризует наличие аллеля Т, который в виде генотипа СТ (гетерозиготный) или ТТ (вариантный гомозиготный) и обуславливает угнетение апоптоза, что отражается на величине рецептора CD95+, который этот ген кодирует. Это необходимо для того, чтобы выявить наличие вариантного аллеля гена FAS, который характеризует замену (транзицию) одного пиримидинового основания в их цепочке на другое (С на Т), а значит потерю (модификацию) функции экспрессии самого FAS-рецептора CD95+. А выбор в качестве исследуемого гена FAS обусловлен тем, что он кодирует CD95+ и его экспрессию и в случае полиморфизма гена (гетерозиготное или патологическое гомозиготное его состояние) наблюдается снижение (замедление) функции запуска событий апоптоза и «старение» клетки.

Ген рецептора запуска апоптоза FAS кодирует белок смерти - клеточный рецептор CD95+. Цепочка молекулярных событий под воздействием чрезмерных по интенсивности факторов, таких как стронций, в основе действия которых лежит поломка апоптотического сигнала путем шединга сигнальных рецепторов, что приводит к реализации негативной генетической программы или ее усугублению.

Стронций оказывает воздействие на апоптоз, его угнетая. В случае генетической поломки рецептора CD95+ (гена FAS), входящего в состав TNF, действие фактора усиливается.

Таким образом, при оценке на детей влияния стронция на апоптоз в предлагаемом способе рекомендуется использовать три критерия и их количественное соотношение: наличие патологического гомозиготного или гетерозиготного генотипов гена FAS, снижение в крови уровня лимфоцитов, содержащих на мембране рецептор CD95+, по отношению к нижней границе физиологической нормы, и превышение концентрации стронция в крови по отношению к референтному уровню. Именно благодаря расширению информационных показателей, связанных с апоптозом, и одновременно с количеством химического токсиканта - стронция, в крови, и будет обеспечена точность оценки влияния стронция на апоптоз. Причем были установлены и количественные критерии этих показателей для оценки: оценивают процесс апоптоза у ребенка под влиянием стронция как замедленный, при одновременном выполнении трех следующих условий: наличие патологического гомозиготного или гетерозиготного генотипов гена FAS-14405C/T, снижение в крови уровня лимфоцитов, содержащих на мембране рецептор CD95+, в 1,5 и более раз по отношению к нижней границе физиологической нормы CD95+ для детей, и при превышении концентрации стронция в крови более, чем в 1,5 раза, по отношению к референтному уровню. А при отсутствии хотя бы одного из вышеуказанных условий оценивают процесс апоптоза у ребенка в присутствии стронция как нормальный, т.е. не приводящий к старению клетки, накоплению нефункционального клеточного материала и развития иммунопролиферативных, онкологических и других патологических состояний.

Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод, что поставленный технический результат обеспечивается за счет совокупности операций предлагаемого способа, их последовательности и режимов его реализации.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

1. Выбирают территорию экологического риска, характеризующуюся наличием химических токсикантов, обусловленных экологической средой обитания. Исследования были проведены на территории г. Кунгур, характеризующейся наличием биогеохимической провинции с высоким содержанием стронция в подземных водах, использующихся населением, в частности детским, в качестве питьевой воды.

2. На указанной территории производят отбор группы детей одной этнической популяции. Затем производят отбор пробы крови у обследуемого ребенка в специальные пробирки с антикоагулянтом ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) (0,05М раствор ЭДТА в соотношении 500 мкл крови на 50 мкл антикоагулянта) - для определения содержания стронция, для выделения клеток крови и изучения маркеров клеточной дифференцировки. При этом определение стронция в крови проводят методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой в соответствии с требованиями СТО М. 12-2013 и устанавливают, имеется ли превышение концентрации этого контаминанта в пробе крови над его референтным уровнем (в примере конкретного осуществления на территории г. Кунгур Пермского края референтным значением по стронцию был показатель равный 0,077 мг/дм (P. Heitland, 2006 г.)).

3. Также из указанной пробы крови производят выделение мононуклеарных клеток. Для этого:

- производят забор периферической венозной крови утром, натощак, в пробирку, содержащую этилендиаминтетраацетат (ЭДТА);

- кровь с ЭДТА разводят раствором хлорида натрия (9 г/л, pH=7,2) в два раза, наслаивают на 3 мл градиента плотности фиколла-урографина (концентрация фиколла составляла 9%, плотность градиента - 1,077 г/мл) и центрифугируют 30 мин при 1500 об/мин;

- образовавшееся в интерфазе «кольцо» мононуклеарных клеток отбирают пипеткой, полученную клеточную взвесь дважды отмывают раствором хлорида натрия (9 г/л, pH 7,2);

- полученную взвесь мононуклеаров ресуспендируют в рабочем растворе фосфатно-солевого буфера (PBS) до концентрации 1×10⁶ клеток/мл. В состав фосфатно-солевого буфера PBS входит смесь солей: хлорида натрия, гидроортофосфата натрия, дигидроортофосфата натрия и азида натрия, с pH=7,2;

- далее на полученных мононуклеарных клетках определяют уровень лимфоцитов, содержащих рецептор CD95+. Фенотипирование CD95+ лимфоцитов проводится методом проточной цитометрии на цитометре FACSCalibur фирмы «Becton Dickinson» («BD», USA) с использованием программы CellQuest-PrO («BD», USA). Рецептор CD95+определяют с помощью меченых моноклональных антител (МКАТ), конъюгированных с FITC («eBioscience», США).

4. Также у указанного ребенка отбирают пробу буккального эпителия (в виде мазка со слизистой оболочки щеки), причем забор осуществляют сухими стерильными зондами с ватными тампонами вращательными движениями без травматизации после предварительного полоскания полости рта водой. После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную пробирку типа «Эппендорф» с 500 мкл транспортной среды (стерильный 0,9%-ный раствор NaCl). Конец зонда отламывают или отрезают с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть крышку пробирки. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают.

Далее производят выделение ДНК из пробы. Для этого пробы в количестве 100 мкл лизируют 300 мкл лизирующего раствора, представляющего собой 0,5%-ный раствор саркозила и протеиназы К (20 мг/мл) в ацетатном буфере (pH 7,5). Затем добавляют сорбент (каолин) и последовательными процедурами промывки отмывают фосфатно-солевым буфером (pH 7,2) пробы от белков и смесью изопропиловый спирт: ацетон от липидов. Нуклеиновые кислоты остаются при этом на сорбенте. Далее адсорбированные на сорбенте ДНК из пробы экстрагируют ТЕ-буфером, представляющим собой смесь 10 мМ трис-HCl и 1 мМ ЭДТА (pH 8,0). Экстракт подвергают центрифугированию. После центрифугирования пробирки надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК.

Полученный материал готов к постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полимеразную цепную реакцию проводят на детектирующем амплификаторе с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» с использованием готовых наборов праймеров и зондов производства Applied Biosystems, в котором в качестве праймера использовался участок ДНК гена FAS.

Проводят реакцию амплификации, это достигается тем, что для исследования аллельного состояния каждого гена у отдельного человека готовят свою реакционную смесь. В пробирку вносят 0,1 мкл готовой смеси праймеров (принятый в генетике термин, обозначающий конечные нуклеотиды с меткой, ограничивающие (отрезающие) амплифицируемую цепочку нуклеотидов гена) и зондов для выбранного гена FAS (использован Набор реагентов для определения полиморфизма С14405Т гена FAS (rs 1159120) ЗАО «Синтол», Россия). В эту же пробирку добавляют остальные компоненты, необходимые для осуществления ПЦР: нуклеотиды (дезоксинуклеозидтрифосфаты: по 10 мМ дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), буфера (100 мМ трис-HCl-буфера, 500 мМ KCl, 40 мМ MgCl₂) и Tag F-полимеразы. Вносят пробу в количестве 10 мкл. Таким образом, общий объем реакционной смеси составляет 25 мкл.

Пробирка плотно закрывается пробкой и устанавливается в амплификатор.

При проведении ПЦР амплификацию и детекцию проводят на детектирующем амплификаторе CFX96 фирмы Bio-Rad.

Используется универсальная программа амплификации, подобранная производителем реактивов. Она включает в себя несколько этапов: 1 этап - активация TaqF-полимеразы (режим «горячего старта») продолжается 15 мин при 95°C; 2 этап - установочные циклы амплификации без измерения флуоресценции (5 циклов); 3 этап - рабочие циклы амплификации с измерением флюоресценции (40 циклов).

Каждый цикл амплификации включает в себя денатурацию ДНК (5 с при 95°C), отжиг праймеров (20 с при 60°C) и саму реакцию полимеризации ДНК (15 с при 72°С).

Регистрация сигнала флюоресценции, возникающего при накоплении продуктов амплификации участков ДНК, проводится в режиме «реального времени» после стадии отжига праймеров для выбранных генов по каналу VIC - для детекции одного из аллельных вариантов генов, и по каналу FAM - для альтернативного варианта.

Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флюоресценции с установленной на заданном уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла (N) в соответствующей графе в таблице результатов, отображаемой в программном обеспечении для амплификатора CFX96.

По соотношению пороговых циклов, полученных по двум каналам детекции, определяют состояние гена FAS в исследуемом участке ДНК С14405Т (rs1159120) (метод аллельной дискриминации). Возможных вариантов состояния гена было два: гомозиготное - в случае, когда одно из значений порогового цикла не определяется (ниже пороговой линии) и гетерозиготное - в случае, когда получено два значения пороговых циклов и по этим каналам получены параболические кривые флюоресценции. В зависимости от того, накопление какого продукта амплификации происходит в реакции, устанавливается гетерозиготное, или нормальное гомозиготное, или патологическое гомозиготное состояние гена FAS.

5. И при одновременном выполнении следующих условий: наличие патологического гомозиготного или гетерозиготного генотипов гена FAS, снижение в крови уровня лимфоцитов, содержащих рецептор CD95+, в 1,5 и более раз по отношению к нижней границе физиологической нормы CD95+ у детей, и при превышении концентрации стронция в крови более чем в 1,5 раза по отношению к референтному уровню оценивают процесс апоптоза у пациента под влиянием стронция как замедленный, а при отсутствии хотя бы одного из вышеуказанных условий оценивают процесс апоптоза у пациента под влиянием стронция как нормальный.

В последующем по этому показателю замедления апоптоза судят о негативных явлениях иммунорегуляции, приводящих к старению клетки, накоплению нефункционального клеточного материала и развитию иммунопролиферативных, онкологических и других патологических состояний.

При проведении испытаний по реализации предлагаемого способа выполнено исследование детского населения, проживающего в различных по содержанию стронция в питьевой воде условиях среды обитания. Группу наблюдения составили 63 ребенка, потребляющих воду с содержанием стабильного стронция в ней, превышающим предельно-допустимую концентрацию до 1.3 раза. Группа контроля - 53 ребенка, потребляющих воду с допустимым содержанием стронция. Группа наблюдения и контрольная группа были сопоставимы по полу, возрасту, соматической заболеваемости.

Кроме того, для подтверждения точности и достоверности оценки влияния стронция на апоптоз предлагаемым способом, схема реализации которого приведена выше, у указанных детей был установлен уровень аннексина - маркера апоптоза. Этот маркер позволяет достоверно установить завершение клеткой процедуры апоптоза, проявляющийся в накоплении в мембране белка фосфатидилсерина, что фиксируется красителем аннексином.

Установление уровня аннексина проводили следующим образом. Мононуклеарные клетки из пробы крови ребенка собирают с интерфазной поверхности и ресуспендируют в рабочем растворе фосфатно-солевого буфера (PBS) до концентрации 1×10⁶ клеток/мл. Содержание лимфоцитов в состоянии апоптоза определяют с помощью окрашивания клеток аннексином V-FITC (Annexin V-FITC) и 7-аминоактиномицином D (7-AAD), согласно протоколу фирмы-производителя (ВС, США). Тестирование осуществляется на проточном цитометре FACSCalibur (BD, США).

Полученные данные приведены в таблице 1.

Данные, приведенные в таблице 1, показывают, что при сочетании вариантного (гетерозиготное или патологическое гомозиготное состояние аллеля) аллеля гена FAS 14405С/Т и концентрации виновного фактора (стронция) выше референтной концентрации (0,077 мг/л) более чем в 1,5 раза наблюдается снижение концентрации лимфоцитов, содержащих на мембране рецептор CD95+, в 1,5 раза и более по отношению к значениям CD95+, соответствующим физиологической норме у детей. Тогда как при допустимом (на уровне референтной концентрации) содержании стронция в крови даже в условиях наследования вариантного генотипа гена FAS, содержание рецептора CD95+ снижено менее чем в 1,5 раза по сравнению с физиологической нормой.

Эти выводы подтверждаются показателем маркера апоптоза - аннексином. При совокупности трех указанных критериев (наличие патологического гомозиготного или гетерозиготного генотипов гена FAS, снижение в крови уровня лимфоцитов, содержащих на мембране рецептор CD95+, в 1,5 и более раз по отношению к нижней границе физиологической нормы рецептора CD95+ у детей и превышение концентрации стронция в крови более чем в 1,5 раза по отношению к референтному уровню) уровень аннексина в организме пациента (пациенты 1-5) выходит за пределы нормы, а значит, это указывает на снижение (замедление) процесса апоптоза или запрограммированной клеточной гибели, и таким образом подтверждает точность и достоверность предлагаемого способа. При других вариантах уровень аннексина в организме соответствует норме.

Таким образом, для выявления реализации генетической поломки нарушений физиологического процесса клеточной гибели, ассоциированного с экспозицией стронция в крови, рекомендуется использование методического подхода, основанного на определении содержания стронция в крови, генотипа гена FAS 14405С/Т, кодирующего белок смерти, и содержание самого рецептора CD95+. В случае если наличие вариантного аллеля гена FAS ассоциировано со снижением концентрации белка рецептора CD95+ в 1,5 раза и более по отношению к нижней границе физиологической нормы CD95+ на фоне снижения апоптоза (аннексиновый тест), а также превышением концентрации стронция выше более чем в 1,5 раза по отношению к референтному уровню, фиксируется реализация стронцием негативной генетической программы у ребенка.

Для иллюстрации реализации предлагаемого способа приведены четыре примера по конкретным пациентам одного возраста и этнической принадлежности из группы пациентов с повышенным содержанием стронция в крови и наличием вариантного аллеля гена FAS 14405С/Т; с содержанием стронция в пределах референтной концентрации и наличием вариантного аллеля гена FAS 14405С/Т; с повышенным содержанием стронция в крови и отсутствием вариантного аллеля гена FAS 14405С/Т; с содержанием стронция в пределах референтной концентрации и отсутствием вариантного аллеля гена FAS 14405С/Т.

Пример 1. Пациент, 12 лет, русский. Определяется уровень стронция в крови более чем в 1,5 раза выше референтных уровней - 0,153 мг/дм³. Определяется наличие мутантного аллеля гена FAS по гетерозиготному генотипу. Значение клеточного рецептора CD95⁺: 9% - в 1,67 раза ниже нижней границы нормы. Содержание аннексии прокрашенных клеток, т.е. клеток, ушедших в апоптоз - 1,35% - ниже диапазона нормы (1,6-2,6%). Таким образом, при анализе клеточного фенотипа CD95⁺ установлено его снижение более чем в 1,5 раза по отношению к нижней границе нормы (15-25%) на фоне повышенного по отношению к референтному уровню, более чем в 1,5 раза содержания стронция в крови, а также наличия гетерозиготного полиморфизма гена FAS, кодирующего рецептор CD95+, и снижения числа клеток, ушедших в апоптоз за пределы нижней границы нормы, что указывает на реализацию негативной генетической программы угнетения апоптоза у данного пациента, инициированной действием стронция.

Пример 2. Пациент, 11 лет, русский. Определяется уровень стронция в крови не превышающий в 1,5 раза референтный уровень - 0,111 мг/дм³. Значение клеточного рецептора смерти CD95⁺: 11% - в 1,36 раза ниже нижней границы нормы. Содержание аннексии прокрашенных клеток, т.е. клеток, ушедших в апоптоз 1,75%, - в диапазоне нормы (1,6-2,6%). Таким образом, при анализе клеточного фенотипа CD95⁺ установлено его снижение менее чем в 1,5 раза по отношению к нижней границе нормы (15-25%), на фоне менее чем в 1,5 раза повышенного по отношению к референтному уровню содержания стронция в крови, а также наличие гетерозиготного полиморфизма гена FAS без снижения количества клеток, ушедших в апоптоз, что указывает на отсутствие у данного пациента реализации негативной генетической программы угнетения апоптоза при уровне воздействующего фактора - стронция ниже значения, превышающего в 1,5 раза референтный уровень.

Пример 3. Пациент, 12 лет, русский. Определяется уровень стронция в крови более чем в 1,5 раза выше референтных уровней - 0,163 мг/дм³. Отсутствует мутантный аллель гена FAS. Значение клеточного рецептора CD95⁺: 14% - в 1,07 раза ниже нижней границы нормы. Содержание аннексии прокрашенных клеток, т.е. клеток, ушедших в апоптоз, 1,71% - в диапазоне нормы (1,6-2,6%). Таким образом, при анализе клеточного фенотипа CD95⁺ установлено его снижение менее чем в 1,5 раза по отношению к нижней границе нормы (15-25%) на фоне повышенного по отношению к референтному уровню, более чем в 1,5 раза содержания стронция в крови, при отсутствии полиморфизма гена FAS, кодирующего рецептор CD95, и нормальном уровне клеток, ушедших в апоптоз, что указывает на воздействие повышенной концентрации стронция на рецептор смерти, но в отсутствие негативной генетической программы это превышение не изменяет физиологический процесс апоптоза.

Пример 4. Пациент, 11 лет, русский. Определяется уровень стронция в крови менее чем в 1,5 раза выше референтных уровней - 0,043 мг/дм³. Отсутствует мутантный аллель гена FAS. Значение клеточного рецептора смерти CD95⁺: 19% - в пределах диапазона нормы. Содержание аннексии прокрашенных клеток, т.е. клеток, ушедших в апоптоз 1,79%, - в диапазоне нормы (1,6-2,6%). Таким образом, при анализе клеточного фенотипа CD95⁺ установлено его допустимое содержание на фоне допустимого по отношению к референтному уровню содержания стронция в крови, при отсутствии полиморфизма гена FAS, кодирующего рецептор CD95+, и нормальном уровне клеток, ушедших в апоптоз, что указывает на физиологическое течение событий апоптоза на фоне мажорной генетической программы и допустимого уровня экспозиции стронцием.

Таким образом, приведенные данные показывают, что при реализации предлагаемого способа с использованием предлагаемых критериев по содержанию стронция в крови, уровню рецептора CD95+ и вариантов аллеля гена FAS (участок гена 14405С/Т, rs1159120) обеспечивается его назначение.

Изобретение относится к области медицины и биологии и может быть использовано для диагностики и прогнозирования токсического действия стронция на процесс апоптоза. Технический результат заключается в обеспечении точности оценки влияния стронция на апоптоз. Сущность: производят отбор пробы крови у ребенка и определяют в пробе содержание стронция, также из указанной пробы крови производят выделение мононуклеарных клеток, на которых определяют уровень лимфоцитов, содержащих на мембране рецептор CD95+. Также отбирают пробу буккального эпителия, выделяют ДНК и проводят генотипирование полиморфизма, используя в качестве праймера участок ДНК гена FAS 14405С/Т путем исследования его аллельного состояния и при одновременном наличии патологического гомозиготного или гетерозиготного генотипов гена FAS 14405С/Т, снижения в крови уровня лимфоцитов, содержащих на мембране рецептор CD95+, в 1,5 и более раз по отношению к нижней границе физиологической нормы указанных лимфоцитов с CD95+ для детей и при превышении концентрации стронция в крови более чем в 1,5 раза по отношению к референтному уровню оценивают процесс апоптоза у ребенка под влиянием стронция как замедленный, а при отсутствии хотя бы одного из вышеуказанных условий - нормальный. 1 табл., 4 пр.

Способ оценки у детей влияния стронция на апоптоз, ассоциированный с аллельными вариантами гена FAS, характеризующийся тем, что производят отбор пробы крови у ребенка и определяют в пробе содержание стронция, также из указанной пробы крови производят выделение мононуклеарных клеток, далее на полученных мононуклеарных клетках определяют уровень лимфоцитов, содержащих на мембране рецептор CD95+, также у указанного ребенка отбирают пробу буккального эпителия, осуществляют выделение из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты ДНК, затем на детектирующем амплификаторе с использованием полимеразной цепной реакции ПЦР проводят генотипирование полиморфизма, используя в качестве праймера участок ДНК гена FAS 14405С/Т (rs1159120) путем исследования его аллельного состояния, устанавливая при этом для гена FAS одно из следующих его состояний: гетерозиготное, или нормальное гомозиготное, или патологическое гомозиготное, и при одновременном выполнении следующих условий: наличие патологического гомозиготного или гетерозиготного генотипов гена FAS 14405С/Т, снижение в крови уровня лимфоцитов, содержащих на мембране рецептор CD95+, в 1,5 и более раз по отношению к нижней границе физиологической нормы указанных лимфоцитов с CD95+ для детей, и при превышении концентрации стронция в крови более чем в 1,5 раза по отношению к референтному уровню оценивают процесс апоптоза у ребенка под влиянием стронция как замедленный, а при отсутствии хотя бы одного из вышеуказанных условий оценивают процесс апоптоза у ребенка под влиянием стронция как нормальный.