Способ установления предрасположенности к формированию "синдрома полярного напряжения" у школьников 7-13 лет, проживающих в условиях Заполярья Российский патент 2023 года по МПК G01N33/577 G01N33/74 G01N33/58 C12Q1/6806 C12Q1/6827 C12Q1/686 C12Q1/6876 C12Q1/6883 

Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской генетике, педиатрии, и связано с разработкой способа прогнозирования опасности формированию «синдрома полярного напряжения» у школьников 7-13 лет, проживающих в условиях Заполярья, т.е. в частности, на территории Севера Сибири.

Изобретение может быть использовано для постановки предварительного диагноза как в специализированных клиниках при обследовании детей, так и в традиционных учреждениях здравоохранения.

Здоровье человека, в том числе, детей-школьников, в условиях Заполярья подвержено влиянию сложного комплекса факторов как социального, так и геофизического характера. Изучение нарушений ритмичности различных функций организма открывает перспективу использования генетической информации в качестве критерия оценки состояния адаптационного напряжения у школьников.

В настоящее время на территории Заполярья проживает большой контингент лиц, в том числе детей, которые длительное время находятся в экстремальных климато-географических условиях Арктической зоны Российской Федерации. В связи с вышеизложенным, разработка эффективных средств контроля за состоянием и здоровьем детей, связанным с проживанием в таких непростых условиях, представляется актуальным направлением научных исследований, так как является необходимым условием эффективного сохранения здоровья. В основу изобретения положена задача создания эффективного способа прогнозирования риска формирования «северного стресса», т.е. «синдрома полярного напряжения», у школьников 7-13 лет, проживающих в Арктической зоне Российской Федерации (в Заполярье).

Факторами, влияющими на возникновение «северного стресса», являются:

- погодные условия (резкое изменение температуры);

- кислородное голодание, вызывающее затруднение дыхания и отдышку;

- наличие сильных ветров, что вызывает возбуждение центральной нервной системы, головные боли, тревожность, а иногда и ощущение тоски;

- резкая смена освещенности (полярный день и полярная ночь), что вызывает сонливость, постоянный упадок сил, усталость, значительные трудности в овладении учебной программой, снижается иммунитет и обостряются заболевания.

- частые магнитные бури, что вызывает головные боли, эмоциональную нестабильность, нервозность, повышенную чувствительность, обострение хронических заболеваний, упадок сил.

- геохимические условия местности (нехватка фтора, кальция, магния и йода), что приводит к нарушению обменных процессах организма, деятельности нервной и мышечной систем.

Проблемы, возникающие из совокупности вышеперечисленных факторов, могут привести к «синдрому полярного напряжения». «Синдром полярного напряжения» - это специфическая форма хронического психоэмоционального напряжения, которая сопровождается нарушением сна, отдышкой, повышенной утомляемостью и астенизацией (Казначеев В.П. Механизмы адаптации человека в условиях высоких широт, журнал Медицина, 1980. 200 s. [в России]).

Данный термин впервые был предложен В.П. Казначеевым в 1974 году. За ним стоит не просто набор внешних симптомов, а некий внутренний механизм формирования особого состояния организма человека. «Синдром полярного напряжения» отражает механизм развития реакций сопротивления адаптации, впоследствии ведущих к развитию болезней (https://congress.oh-events.ru/doc/arch/2019_RTStress-ShuraevaEV.pdf).

Обобщенные данные ученых, открывших «синдром полярного напряжения», позволяют определить его основные составляющие звенья (Хаснулин В.И. «Современные представления о механизмах формирования северного стресса у человека в высоких широтах» https://cyberleninka.ru/article/n/sovremennye-predstavleniya-o-mehanizmah-formirovaniya-severnogo-stressa-u-cheloveka-v-vysokih-shirotah): - липидная гиперпероксидация (окислительный стресс); - недостаточность детоксикационных процессов и выделительных процессов: - расстройства северного типа метаболизма; - северная тканевая гипоксия; - иммунная недостаточность; - полиэндокринные расстройства; - регенераторно-пластическая недостаточность; - нарушения электромагнитного гомеостаза; - функциональная диссимметрия межполушарных взаимоотношений; - десинхроноз; - психоэмоциональное напряжение; - метеопатия.

Из уровня техники не были выявлены известные решения, позволяющие прогнозировать риск возникновения именно «северного стресса». Однако в ряде публикаций отражены клинико-лабораторные способы оценки предрасположенности к развитию стресса как такового с использованием Лабораторных прогностических критериев.

Клинико-лабораторные способы оценки предрасположенности к развитию стрессов следующие:

- патент РФ №2508545 «Способ определения индивидуальной чувствительности человека к оксидативному стрессу». Согласно этому способу в суспензии нейтрофилов периферической крови конкретного индивидуума регистрируют интенсивность исходной хемилюминесценции (ИХ) и хемилюминесценции (НХ) после их нагревания в пробирках на водяной бане в течение 30-60 секунд при температуре 42°С путем подсчета числа импульсов в минуту. При значении ИХ/НХ менее 3 исследуемого относят к стрессочувствительным.

- «Способ оценки уровней психоэмоционального стресса» (К.В. Судаков «Социальные и биологические аспекты психоэмоционального стресса: пути защиты от его нежелательных последствий», Вестник международной академии наук, 2006, №1, стр. 8-14). Он включает приборную регистрацию наиболее информативных физиологических показателей (частоту сердечных сокращений, частоту дыхания, величины систолического и диастолического кровяного давления, показатели электромиограммы, кожно-гальванической реакции и др.).

- патент РФ №2761743 «Способ оценки хроноархитектоники напряжения сосудистой стенки» посредством амбулаторного мониторинга систолического и диастолического артериального давления у группы лиц или индивидуально у отдельного пациента. Указанное техническое решение может применяться для жителей Крайнего Севера для оценки с целью оценки риска возникновения сосудистых катастроф в зимний или летний сезон в исследуемое время суток и дальнейшей их профилактики.

Недостатками известных способов является то, что данные способы не учитывают такой объективный критерий, как генетическую предрасположенность к развитию северного стресса и не включают идентификацию генов-кандидатов, полиморфизм которых лежит в основе формирования такого полярного напряжения.

Из патента РФ №2534821 известен способ диагностики окислительного стресса измерением экспрессии кислородчувствительных генов (варианты). Способ предусматривает измерение экспрессии следующих кислородчувствительных генов: Pdk4, Nid2, Golph2, Actr1a, Api5, Mrp13, Scn7a, Асох3, Lamr1, Sv2b, Stmn2, Trpc3, Crebzf, Herd, Ssc1, Snrpb, Zfhx1b, sc125b, Rn. 48050, Rn. 42485, MPP3, AI 101224, Abca1, Appbp1, Rn. 96234, Nptxr, Rn. 16755, Vamp2, Ghr, Calm1, Cyp51, и ID1, и no определенному различию в уровне экспрессии данных генов у животных, подвергнутых и не подвергнутых воздействию окислительного стресса, делают вывод о наличии окислительного стресса у млекопитающего. Способ позволяет диагностировать состояние окислительного стресса у организма как во время, так и после воздействия окислительного стресса.

Однако указанный известный способ, во-первых, устанавливает уже состоявшееся состояние стресса, т.е. не на ранних стадиях его формирования; а во-вторых, устанавливает только одно из составляющих стресса - окислительный стресс, в то время как на формирование «синдрома полярного напряжения» в целом воздействует целый ряд факторов, о чем сказано выше; в-третьих - в публикации отсутствует указание на то, что этот способ применим для школьников, проживающих в условиях Заполярья.

При этом из уровня техники не были выявлены известные способы установления предрасположенности к формированию «синдрома полярного напряжения» у школьников 7-13 лет, проживающих в условиях Заполярья, поэтому сделать выбор ближайшего аналога к заявляемому объекту не представляется возможным.

Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в обеспечении достоверности выявления предрасположенности к формированию «синдрома полярного напряжения» у школьников 7-13 лет, проживающих в условиях Заполярья, с обеспечением возможности в последующем судить о развитии таких состояний у детей уже на ранних стадиях его формирования.

Указанный технический результат достигается предлагаемым способом установления предрасположенности к формированию «синдрома полярного напряжения» у школьников 7-13 лет, проживающих в условиях Заполярья, заключающийся в том, что отбирают у школьника пробу крови и пробу буккального эпителия, осуществляют определение в пробе крови относительного содержания лимфоцитов CD3+CD95+ и уровень дофамина, осуществляют выделение из пробы буккального эпителия дезоксирибонуклеиновой кислоты ДНК, затем на детектирующем амплификаторе с использованием полимеразной цепной реакции ПЦР проводят генотипирование полиморфизма генов TNF и ANKK1/DRD2, используя в качестве праймера участок ДНК путем исследования генотипов гена TNF G308A (rs1800629), устанавливая при этом для указанного гена генотип GG, и гена ANKK1/DRD2 С2137Т (rs1800497), устанавливая при этом для указанного гена генотип ТТ, и при одновременном выполнении следующих условий: наличием комбинации GG генотипа гена TNF G308A (rs1800629), а также генотипа ТТ гена ANKK1/DRD2 С2137Т (rs1800497), повышения содержания относительных лимфоцитов CD3+CD95+ в крови по сравнению с верхней границей физиологической нормы, равной 15-25%, в 1,2 и более раз, и повышения уровня дофамина по сравнению с верхней границей физиологической нормы, равной 5,6-44 пг/см³, в 1,7 и более раз, делают вывод о наличии предрасположенности к формированию «синдрома полярного напряжения» у школьников, проживающих в условиях Заполярья.

Предлагаемый технический результат достигается благодаря следующему.

В качестве критериев реализации предрасположенности к установления формирования «синдрома полярного напряжения» у школьников 7-13 лет, проживающих в условиях Заполярья, рекомендуется использовать генотипы генов-кандидатов: генотип GG гена фактор некроза опухоли TNF G308A (rs1800629) и генотип ТТ гена дофаминового рецептора ANKK1/DRD2 С2137Т (rs1800497).

Ген TNF - фактор некроза опухоли, представляет собой адипокин и цитокин. TNF является членом суперсемейства TNF, которое состоит из различных трансмембранных белков с гомологичным доменом TNF. Как адипокин, TNF способствует резистентности к инсулину и связан с диабетом 2 типа, вызванным ожирением. Как цитокин, TNF используется иммунной системой для передачи сигналов клеткам. Если макрофаги (определенные лейкоциты) обнаруживают инфекцию, они высвобождают TNF, чтобы предупредить другие клетки иммунной системы как часть воспалительной реакции.

Передача сигналов TNF происходит через два рецептора: TNFR1 и TNFR2. TNFR1 конститутивно экспрессируется на большинстве типов клеток, тогда как TNFR2 ограничивается в основном эндотелиальными, эпителиальными и подмножествами иммунных клеток. Передача сигналов TNFR1 имеет тенденцию быть провоспалительной и апоптотической, тогда как передача сигналов TNFR2 является противовоспалительной и способствует пролиферации клеток. Подавление передачи сигналов TNFR1 имеет важное значение для лечения аутоиммунных заболеваний, тогда как передача сигналов TNFR2 способствует заживлению ран.

Аллельное состояние гена TNF предусматривает следующие его состояния: гомозиготное - GG или АА, или гетерозиготное - GA.

В процессе исследования было установлено, что на фоне наличия типичного гомозиготного полиморфизма GG гена TNF G308A (rs1800629) присутствуют высокие значения содержания рецептора клеточной смерти - лимфоциты CD3+CD95+, кодирующие синтез фактора некроза опухоли, частью рецептора которого является рецепция CD95+. Физиологический смысл данного иммунорегуляторного сценария в условиях Крайнего Севера связан с ускорением обменных и иммунных процессов быстрой гибели и смены клеточных фенотипов, отражающих необходимость компенсации энергетических потерь и поддержания повышенного уровня цитокиновых противовоспалительных профилей, что сопровождается постоянным воспалением, иммунорегуляторным стрессом и депрессией.

Также в качестве диагностического критерия в заявляемом способе предлагается использовать наличие гена ANKK1/DRD2. На регуляцию экспрессии гена ANKK1 оказывает влияние ген DRD2, локализующийся с ним рядом. Один из полиморфных локусов гена ANKK1 располагается в позиции 2137 в 8-м экзоне, в нем может происходить замена цитозина (С) на тимин (Т). Данный участок называется генетическим маркером С2137Т, или Taq1A (rs1800497 - номер по dbSNP).

Ген DRD2 кодирует рецептор дофамина - белок, располагающийся на поверхности нейронов, сопряженный с G-белками и запускающий каскад реакций внутри клетки под воздействием дофамина - «гормона удовольствия». Нарушение работы дофаминергической системы ассоциировано с неврологическими и психическими заболеваниями.

В настоящее время отмечена связь полиморфизма rs1800497 с девиантным поведением, предрасположенностью к алкоголизму, наркомании, табакокурению, развитию психозов, шизофрении и маниакально-депрессивным расстройствам, болезнью Паркинсона, двигательным расстройствам, мигрени и т.д. Это связано с тем, что при наличии полиформизма rs1800497 (аллель Т) происходит уменьшение плотности D2- дофаминовых рецепторов во всех областях полосатого тела головного мозга. Также выявлена зависимость полиморфизма rs1800497 с вариантами гена FTO ("Fat mass and obesity-associated protein"), при этом может быть повышен риск ожирения и развития диабета

Дофамин является медиатором симпато-адреналовой системы. Он выделяется в ответ на стресс, в том числе на холод, для адаптации и мобилизации энергетических резервов организма. Обнаружили, что у жителей Ямало-Ненецкого автономного округа повышенная активность щитовидной железы и выше уровень дофамина.

Установленный преимущественный в подростковой популяции Заполярья вариантный гомозиготный генотип ТТ гена ANKK1/DRD2 С2137Т (rs1800497), сопряженный с низкой экспрессией рецептора дофамина, снижением плотности D2 рецепторов, что приводит к избыточному содержанию лиганда в сыворотке из-за разряженной рецепции и компенсаторно увеличивает эффекты, связанные со стимулированным потреблением пищи и дополнительной энергетической компенсацией, что однако одновременно является фактором постоянного поддержания высокой стрессовой готовности и формирования депрессии («синдрома полярного напряжения»).

Благодаря использованию в качестве исследуемого материала буккального эпителия (пробы биологического материала со слизистой щеки), обеспечивается простота и надежность исследований, а также получение нужной информативности в плане выделения из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) проведения генотипирования полиморфизма указанных генов TNF и гена ANKK1/DRD2. При этом предлагается использовать в качестве праймера участок ДНК гена TNF G308A (rs1800629) и гена ANKK1/DRD2 С2137Т (rs1800497), устанавливая при этом для первого гена генотип GG, а для второго гена - генотип ТТ.

Причем из уровня техники неизвестны методы выявления предрасположенности к развитию «синдрома полярного напряжения» у школьников 7-13 лет, проживающих в условиях Заполярья, с использованием одновременно именно полиморфизмов этих генов.

При оценке высокой степени предрасположенности к развитию «синдрома полярного напряжения» у школьников 7-13 лет, проживающих в условиях Заполярья, были также определены в пробе крови такие лабораторные показатели, как содержание лимфоцитов CD3+CD95+ (связь с геном TNF G308A (rs1800629), и уровень дофамина в пробе крови школьника (связь с геном ANKK1/DRD2 С2137Т (rs1800497).

Именно благодаря расширению информационных показателей, связанных с полиморфными вариантами указанных генов, будет обеспечена точность потенциального появления возникновения «синдрома полярного напряжения» у ребенка.

Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод, что поставленный технический результат обеспечивается за счет совокупности операций предлагаемого способа, их последовательности и режимов его реализации.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

1. Проводят отбор группы школьников 7-13 лет одной этнической популяции. Затем проводят отбор пробы крови у обследуемого ребенка - для определения содержание относительных лимфоцитов CD3+CD95+ в крови и уровня дофамина. Указанные показатели определяют:

- лимфоциты CD3+CD95+- методом проточной цитометрии на проточном цитометре «FACSCalibur» (Becton Dickinson, США), используя панели меченых моноклональных антител согласно Методике, изложенной в Е.R. Polosukhina, S.V. Kusnetsov, Т.N. Zabotina, A.D. Shirin, G.I. Kaletin, D. Yu. Blokhin, A.G. Turkina, N.V. Tsvetaeva, N.P. Logatcheva, M.R. Tenuta, Yu. V. Shishkin, Z.G. Kadagidze, N.V. Khoroshko, M.A. Volkova & A. Yu. Baryshnikov. CD95 (Fas/APO-1) Antigen Expression on the Cells of Myelodysplastic Syndromes, Acute Myelogenous Leukemia, and Chronic Myelogenous Leukemia Patients // Acute Leukemias VII Experimental Approaches and Novel Therapies Hiddemann et al. (eds) Springer-Verlag Berlin Heidelberg. - 1998. - p.96 https://link-springer-com.translate.goog/chapter/10.1007/978-3-642-71960-814?error=cookies_not_supported&error:=cookies_not_supported&code=05011daf-110d-49d4-aa6f-5a587c69d41f&code=35f8c998-24a7-449e-8698-3b8ffle7568dc&_x_tr_sl=auto&_x_tr_tl=ru&_x_tr_hl=ru

- уровень дофамина методом иммуноферментного анализа согласно инструкции к коммерческому набору Dopamine ELISA Fast Track (Labor Diagnostika Nord GmbH, Германия).

Устанавливают, имеется ли превышение концентрации лимфоцитов CD3+CD95+ в крови и уровня дофамина в пробе крови над их физиологической нормой (физиологическая норма лимфоцитов CD3+CD95+ равна 15-25%; физиологическая норма дофамина равна 5,6 - 44 пг/см³).

2. Также у указанного ребенка отбирают пробу буккального эпителия (в виде мазка со слизистой оболочки щеки). После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную пробирку типа «Эппендорф» с 500 мкл транспортной среды (стерильный 0,9%-ный раствор NaCl). Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают.

Далее производят выделение ДНК из пробы. Для этого пробы в количестве 100 мкл лизируют 300 мкл лизирующего раствора, представляющего собой 0,5%-ный раствор саркозила и протеиназы К (20 мг/мл) в ацетатном буфере (рН 7,5). Затем добавляют сорбент (каолин) и последовательными процедурами промывки отмывают фосфатно-солевым буфером (рН 7,2) пробы от белков и смесью изопропиловый спирт: ацетон от липидов. Нуклеиновые кислоты остаются при этом на сорбенте. Далее адсорбированные на сорбенте ДНК из пробы экстрагируют ТЕ-буфером, представляющим собой смесь 10 мМ трис-HCl и 1 мМ ЭДТА (рН 8,0). Экстракт подвергают центрифугированию. После центрифугирования пробирки надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК.

Полученный материал готов к постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР проводят на детектирующем амплификаторе с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» с использованием готовых наборов праймеров и зондов производства ЗАО «Синтол», Россия, в котором в качестве праймеров использовались участки ДНК гена TNF G308A (rs1800629) и гена ANKK1/DRD2 С2137Т (rs1800497).

Проводят реакцию амплификации, это достигается тем, что для исследования аллельного состояния каждого гена у отдельного ребенка готовят свою реакционную смесь. В каждую пробирку вносят 0,1 мкл готовой смеси праймеров (принятый в генетике термин, обозначающий конечные нуклеотиды с меткой, ограничивающие (отрезающие) амплифицируемую цепочку нуклеотидов гена) и зондов для выбранных гена TNF G308A (rs1800629) и гена ANKK1/DRD2 С2137Т (rs1800497) (использованы Наборы реагентов для определения полиморфизма TNF G308A (rs1800629 и гена ANKK1/DRD2 С2137Т (rs1800497) ЗАО «Синтол», Россия). В каждую пробирку добавляют остальные компоненты необходимые для осуществления ПЦР: нуклеотиды (дезоксинуклеозидтрифосфаты: по 10 мМ дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), буфера (100 мМ трис-HCl-буфера, 500 мМ KCl, 40 мМ MgCl₂) и Tag F-полимеразы. Вносят пробу в количестве 10 мкл. Таким образом, общий объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Каждая пробирка плотно закрывается пробкой и устанавливается в амплификатор.

При проведении ПЦР амплификацию и детекцию проводят на детектирующем амплификаторе CFX96 фирмы Bio-Rad.

Используется универсальная программа амплификации, подобранная производителем реактивов. Она включает в себя несколько этапов: 1 этап - активация TaqF-полимеразы (режим «горячего старта») продолжается 15 мин при 95°С; 2 этап - установочные циклы амплификации без измерения флуоресценции (5 циклов); 3 этап - рабочие циклы амплификации с измерением флюоресценции (40 циклов).

Каждый цикл амплификации включает в себя денатурацию ДНК (5 с при 95°С), отжиг праймеров (20 с при 60°С) и саму реакцию полимеризации ДНК (15 с при 72°С).

Регистрация сигнала флюоресценции, возникающего при накоплении продуктов амплификации участков ДНК проводится в режиме «реального времени» после стадии отжига праймеров для выбранных генов по каналу VIC - для детекции одного из аллельных вариантов генов, и по каналу FAM - для альтернативного варианта.

Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флюоресценции с установленной на заданном уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла (N) в соответствующей графе в таблице результатов, отображаемой в программном обеспечении для амплификатора CFX96.

По соотношению пороговых циклов, полученных по двум каналам детекции, определяют состояние гена TNF в исследуемом участке ДНК G308A (rs1800629), а также гена ANKK1/DRD2 в исследуемом участке ДНК С2137Т (rs1800497) (метод аллельной дискриминации). Возможных вариантов состояния гена было два: гомозиготное - в случае, когда одно из значений порогового цикла не определяется (ниже пороговой линии) и гетерозиготное - в случае, когда получено два значения пороговых циклов и по этим каналам получены параболические кривые флюоресценции. В зависимости от того, накопление какого продукта амплификации происходит в реакции, устанавливается типичное гомозиготное (GG), или вариантное гомозиготное (АА) состояние, или гетерозиготное (GA) состояние гена TNF G308A (rs1800629), а также устанавливается типичное гомозиготное (СС), или вариантное гомозиготное (ТТ) состояние, или гетерозиготное (СТ) состояние гена ANKK1/DRD2 С2137Т (rs1800497).

3. И при выполнении следующих условий: при одновременном наличии комбинации GG генотипа гена TNF G308A (rs1800629), а также генотипа ТТ гена ANKK1/DRD2 С2137Т (rs1800497), при повышении содержания относительных лимфоцитов CD3+CD95+ в крови по сравнению с верхней границей физиологической нормы, равной 15-25%, в 1,2 и более раза, и при повышении уровня дофамина по сравнению с верхней границей физиологической нормы, равной 5,6-44 пг/см³, в 1,7 и более раз, делают вывод о высокой предрасположенности к формированию «синдрома полярного напряжения» у школьников, проживающих в условиях Заполярья.

При проведении испытаний по реализации предлагаемого способа были сформированы две группы детей, первая - группа наблюдения - постоянно проживающих на территории Заполярья (город Норильск): школьники возраста 7-13 лет, у которых по результатам проведенного нейропсихологического тестирования (тест STROOP) установлено достоверное снижение показателей образной памяти, числовой памяти, уровня внимания, наличие раздражительности, плаксивости, нарушения сна, частых головных болей, эмоциональной нестабильности. Группа сравнения также из детей - школьников возраста 7-13 лет, проживающих вне условий формирования «синдрома полярного напряжения» (г. Братск), у которых по результатам проведенного нейропсихологического тестирования (тест STROOP) не установлено снижение показателей образной памяти, числовой памяти, а также уровня внимания, в анамнезе отсутствовали жалобы на наличие раздражительности, плаксивости, нарушения сна, частых головных болей, эмоциональной нестабильности.

В группу наблюдения вошли 154 ребенка. В группу сравнения вошли 103 ребенка. Группы исследования были сопоставимы по возрасту, полу, этническому составу, сопутствующей патологии, социально-экономическому уровню семьи, качеству и составу питания.

У всех обследуемых детей была взята проба венозной крови, исследование которых проводилось по вышеуказанной схеме. Также была взята проба буккального эпителия для установления по реакции ПЦР полиморфизма исследуемых генов.

Данные, полученные в результате исследований для детей из группы наблюдения и группы сравнения, приведены в таблице 1.

Данные, приведенные в таблице 1, показывают следующее. У школьников - пациентов 1-4 (дети из группы наблюдения) таблицы 1, было установлено наличие жалоб в виде плаксивости, раздражительности, тревожности и перепадов настроения особенностей социальных и поведенческих реакций, указывающих на формирование у них «синдрома полярного напряжения», негативное отклонение показателей нейропсихологического тестирования (тест STROOP) от аналогичных значений контингента группы сравнения, проживающего вне условий северного стресса - снижение показателей образной памяти, числовой памяти, а также уровня внимания. И у этих пациентов 1-4 присутствовала комбинации GG генотипа гена TNF G308A (rs1800629), а также генотипа ТТ гена ANKK1/DRD2 С2137Т (rs1800497), высокое содержание относительных лимфоцитов CD3+CD95+ в крови по сравнению с верхней границей физиологической нормы в 1,2 - 1,56 раза, высокий уровень дофамина по сравнению с верхней границей физиологической нормы в 1,7 - 1,84 раза. Т.е. этим подтверждается достоверная связь предложенных в заявляемом способе прогностических критериев с риском наступления ««синдрома полярного напряжения»» у обследованных школьников.

У школьников 5-14 таблицы 1 отсутствовало наличие у них проявлений «синдрома полярного напряжения». И исследования показали, что для них нехарактерно наличие указанных прогностических критериев, т.е. у них отсутствовала одновременная комбинации GG генотипа гена TNF G308A (rs1800629), а также генотипа ТТ гена ANKK1/DRD2 С2137Т (rs1800497), а также отсутствовало повышенное содержание лимфоцитов (выше границ физиологической нормы более чем в 1,2 раза) и уровня дофамина (выше границ физиологической нормы более чем в 1,7 раза).

Таким образом, установлены высокие значения содержания рецептора клеточной смерти CD95+ на фоне наличия типичного гомозиготного полиморфизма GG гена TNF G308A (rs1800629), кодирующего синтез фактора некроза опухоли, частью рецептора которого является рецепция CD95+, физиологический смысл данного иммунорегуляторного сценария в условиях Крайнего Севера связан с ускорением обменных и иммунных процессов быстрой гибели и смены клеточных фенотипов, отражающих необходимость компенсации энергетических потерь и поддержания повышенного уровня цитокиновых провоспалительных профилей, что сопровождается постоянным воспалением, иммунорегуляторным стрессом и депрессией («синдрома полярного напряжения»).

Одновременно наблюдается повышенная экспрессия нейротрансмиттера дофамина в сыворотке крови, который принадлежит к семейству катехоламинов, осуществляющих регуляцию кровяного давления, процесса терморегуляции, поведенческих и эмоциональных процессов, необходимость в которых в условиях Крайнего Севера возрастает.

Установлен преимущественный в подростковой популяции Заполярья (7-13 лет) вариантный гомозиготный генотип ТТ гена ANKK1/DRD2 С2137Т (rs1800497), сопряженный с низкой экспрессией рецептора дофамина, снижением плотности D2 рецепторов, что приводит к избыточному содержанию лиганда в сыворотке из-за разряженной рецепции и компенсаторно увеличивает эффекты, связанные со стимулированным потреблением пищи и дополнительной энергетической компенсацией, что одновременно является фактором поддержания постоянной высокой стрессовой готовности и формирования депрессии («синдрома полярного напряжения»).

Для иллюстрации реализации предлагаемого способа приведены два примера по конкретным пациентам одного возраста и этнической принадлежности.

Пример 1. Пациент, 10 лет, русский. Родился и постоянно проживает на территории Заполярья (г. Норильск) 69⁰ Северной широты. В анамнезе отсутствовали признаки, указывающие на проявления «синдрома полярного напряжения». Однако в пробе буккального эпителия пациента установлено наличие типичного гомозиготного полиморфизма GG гена TNF G308A (rs1800629), а также вариантного гомозиготного генотипа ТТ гена ANKK1/DRD2 С2137Т (rs1800497). В пробе крови было установлено, что содержание рецептора клеточной смерти CD3+CD95+ - иммунного маркера формирующегося стресса - 35%, т.е. выше диапазона нормы (15-25%) более чем в 1,2 раза. Повышена экспрессия нейротрансмиттера дофамина в сыворотке крови - маркера поведенческих и эмоциональных процессов и формирования депрессии - 80 пг/мл, т.е. выше диапазона нормы (5,6-44 пг/мл) более чем в 1,7 раза. Это позволило прогнозировать риск развития в будущем у данного ребенка «синдрома полярного напряжения». Наблюдение за указанным ребенком в течение 12 месяцев показало, что в течение этого времени постепенно сформировались стрессовые реакции на фоне иммунного воспаления и ускоренной клеточной гибели и избыточной симпатико-катехоламиновой активности нервной системы, проявляющиеся жалобами в виде плаксивости, раздражительности, тревожности и перепадов настроения, изменений результатов нейропсихологического тестирования (тест STROOP) в виде снижения показателей образной памяти, числовой памяти, уровня внимания, а также гиперсимпатикотонией по результатам вариационной пульсометрии, что в итоге привело к депрессии у ребенка в виде «синдрома полярного напряжения».

Анализируя характеризующие данного школьника вышеприведенные генетические критерии и лабораторные показатели, можно сделать вывод, что у пациента имеются изменения в иммунном профиле в виде гиперреактивности воспалительного процесса по критерию активационного маркера CD3+CD95+, которое характеризует наличие избыточной клеточной гибели, гиперцитокинемии и астении, что лежит в основе иммунного механизма депрессионных нарушений, а также имеется гиперпродукция сывороточного дофамина, что на фоне SNP-дефекта дофаминового рецептора D2 привело к накоплению катехоламина (дофамина), нарушению поведенческих и эмоциональных процессов, гиперсимпатикотонии с формированием депрессии. Это доказывает то, что, согласно предлагаемому способу, у данного пациента верно был спрогнозирован риск формирования «синдрома полярного напряжения».

Пример 2. Пациент, 12 лет, русский, школьник, здоров. Постоянно проживает на территории, не относящейся к Заполярью (г. Братск) 56⁰ Северной широты. Установлено наличие вариантного гомозиготного полиморфизма АА гена TNF G308Ars1800629, а также типичного гомозиготного генотипа СС гена ANKK1/DRD2 С2137Т rs 18004976. Содержание рецептора клеточной смерти CD3+CD95+- иммунного маркера формирующегося стресса - 19%, т.е. в диапазоне нормы (15-25%). Экспрессия нейротрансмиттера дофамина в сыворотке крови - маркера поведенческих и эмоциональных процессов и формирования депрессии - 19 пг/мл, т.е. в диапазоне нормы (5,6-44 пг/мл). Таким образом, установлены нормальные значения рецептора, запускающего клеточную гибель, на фоне вариантного генотипа АА гена TNF G308A (rs1800629), а также соответствующая норме продукция сывороточного дофамина в условиях полиморфно неизмененного гена рецептора дофамина ANKK1/DRD2 С2137Т (rs1800497) - генотипа СС, что в совокупности не создает условия формирования стрессовых реакций иммунного генеза и избыточной симпатико-катехоламиновой активности нервной системы, отсутствуют жалобы в виде плаксивости, раздражительности, тревожности и перепадов настроения, а по результатам вариационной пульсометрии наблюдается эйтония, что в итоге не приводит к развитию депрессии в виде «синдрома полярного напряжения».

Наблюдение за указанным школьником в течение 12 месяцев показало, что у него не возник «северный стресс», результаты нейропсихологического тестирования (тест STROOP) показали отсутствие нарушений образной памяти, числовой памяти, уровня внимания. То есть, наличие генетической программы одного из патогенетически значимых полиморфизмов гена TNF G308Ars1800629 в виде вариантного генотипа АА, а также наличие типичного генотипа гена рецептора дофамина ANKK1/DRD2 С2137Т rs 18004976 - СС, не приводит к развитию стресса и «синдрома полярного напряжения» у данного пациента.

Таким образом, приведенные данные показывают, что при реализации предлагаемого способа с использованием предлагаемых критериев обеспечивается его назначение.

Заявляемый способ позволяет с достаточной достоверностью установить предвестники формирования депрессии в виде «синдрома полярного напряжения» у школьников-подростков 7-13 лет, проживающих в условиях Заполярья, по заявляемым генетическим критериям - комбинации двух генотипов кандидатных генов - генотип GG гена TNF G308Ar (s1800629) и генотип ТТ гена ANKK1/DRD2 С2137Т (rs1800497), а также повышения содержания относительных лимфоцитов CD3+CD95+ в крови по сравнению с верхней границей физиологической нормы, равной 15-25%, в 1,2 и более раз, и повышения уровня дофамина по сравнению с верхней границей физиологической нормы, равной 5,6-44 пг/см³, в 1,7 и более раз, и планировать профилактические мероприятия.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской генетике и педиатрии, и может быть использовано для установления предрасположенности к формированию «синдрома полярного напряжения» у школьников 7-13 лет, проживающих в условиях Заполярья. Отбирают у школьника пробу крови и пробу буккального эпителия. В крови определяют относительное содержание лимфоцитов CD3+CD95+ и уровень дофамина. Из буккального эпителия выделяют ДНК. Проводят генотипирование полиморфизма генов TNF и ANKK1/DRD2. При одновременном выполнении следующих условий: наличии комбинации GG генотипа гена TNF G308A (rs1800629), а также генотипа ТТ гена ANKK1/DRD2 С2137Т (rs1800497), повышения содержания относительных лимфоцитов CD3+CD95+ в крови по сравнению с верхней границей физиологической нормы, равной 15-25%, в 1,2 и более раз, и повышения уровня дофамина по сравнению с верхней границей физиологической нормы, равной 5,6-44 пг/см³, в 1,7 и более раз, делают вывод о наличии предрасположенности к формированию «синдрома полярного напряжения» у школьников, проживающих в условиях Заполярья. Способ обеспечивает достоверное выявление предрасположенности к формированию «синдрома полярного напряжения» у школьников 7-13 лет, проживающих в условиях Заполярья за счет совокупности операций предлагаемого способа и режимов его реализации. 1 табл., 2 пр.

Способ установления предрасположенности к формированию «синдрома полярного напряжения» у школьников 7-13 лет, проживающих в условиях Заполярья, характеризующийся тем, что отбирают у школьника пробу крови и пробу буккального эпителия, осуществляют определение в пробе крови относительного содержания лимфоцитов CD3+CD95+ и уровень дофамина, осуществляют выделение из пробы буккального эпителия дезоксирибонуклеиновой кислоты ДНК, затем на детектирующем амплификаторе с использованием полимеразной цепной реакции ПЦР проводят генотипирование полиморфизма генов TNF и ANKK1/DRD2, используя в качестве праймера участок ДНК путем исследования генотипов гена TNF G308A (rs1800629), устанавливая при этом для указанного гена генотип GG, и гена ANKK1/DRD2 С2137Т (rs1800497), устанавливая при этом для указанного гена генотип ТТ, и при одновременном выполнении следующих условий: наличием комбинации GG генотипа гена TNF G308A (rs1800629), а также генотипа ТТ гена ANKK1/DRD2 С2137Т (rs1800497), повышения содержания относительных лимфоцитов CD3+CD95+ в крови по сравнению с верхней границей физиологической нормы, равной 15-25%, в 1,2 и более раз, и повышения уровня дофамина по сравнению с верхней границей физиологической нормы, равной 5,6-44 пг/см³, в 1,7 и более раз, делают вывод о наличии предрасположенности к формированию «синдрома полярного напряжения» у школьников, проживающих в условиях Заполярья.