АГЛОМЕРИРОВАНИЕ МАГНИТНЫХ ПОКРЫТЫХ АЛКОКСИСИЛАНОМ НАНОЧАСТИЦ Российский патент 2017 года по МПК A61K33/26 A61K31/695 A61K41/00 A61K9/14 H01F1/00 A61J3/00 A61P35/00 

Несмотря на недавние достижения в опухолевой терапии солидных опухолей, таких как антитела, остается необходимость в более действенных и эффективных по стоимости вариантах лечения.

Термотерапия или, более конкретно, гипертермия является привлекательным подходом для лечения рака, так как, по сравнению с химиотерапией или лучевой терапией, ожидаются меньшие побочные эффекты для широкого диапазона опухолевых заболеваний вследствие ее физического способа воздействия. Однако в текущее время доступные способы являются все еще субоптимальными (Moroz и др. 2002) и гарантируют улучшение.

Одним предпочтительным способом термотерапии является способ, в котором магнитные наночастицы напрямую вводятся в опухоль. Наночастицы впоследствии нагреваются в переменном магнитном поле. В зависимости от продолжительности лечения и достигнутых внутриопухолевых температур, опухолевые клетки либо непосредственно разрушаются (термическое удаление), либо делаются чувствительными для сопутствующих химио- или радиотерапии (гипертермия). С помощью этой новой процедуры является возможным бороться с опухолью изнутри, тем самым сохраняя окружающую здоровую ткань. Этот способ лечения продемонстрировал перспективные терапевтические эффекты в лечении глиобластомы (Maier-Hauff и др. 2011).

Несмотря на положительные результаты от первых клинических испытаний все еще имеется пространство для улучшения эффективности и/или уменьшения потенциальных побочных эффектов или ограничений терапии. Одна нерешенная проблема состоит в том, что в течение инстилляции наночастиц возникают отложения магнитных наночастиц вне целевой области в окружающей ткани. Такие внешние депо либо вызывают нежелательные побочные эффекты, так как они ведут к увеличенным температурам вне целевой области при нагревании в переменном магнитном поле, или они ограничивают прикладываемую напряженность магнитного поля, используемую, чтобы нагревать депо наночастиц, если такое нагревание окружающей ткани избегается. Эта проблема может возникать вследствие высокого давления внутри инъецированной опухолевой ткани, что ведет к истечению осажденных наночастиц в течение или непосредственно после инъекции. Дополнительно, в то время как требуются наноразмерные частицы, чтобы иметь высокие удельные коэффициенты поглощения (SAR), такие наночастицы могут легко перемещаться внутри промежуточного пространства и, тем самым, могут теряться из целевой ткани. Дополнительно, величина тепла, которое может 'осаждаться' внутри опухоли - посредством сначала осаждения наночастиц, которые впоследствии возбуждаются посредством переменного магнитного поля, - является ограниченной вследствие субоптимального удельного коэффициента поглощения (SAR) наночастиц/магнитной текучей среды, которые используются до сих пор во врачебной практике.

Дополнительно, такие наночастицы должны изготовляться управляемым способом в большом масштабе и при разумной стоимости, и должна присутствовать возможность составлять их в устойчивом составе, чтобы они стали пригодным для продажи продуктом.

Предшествующий уровень техники описывает некоторое количество способов и использований таких наночастиц, как описано в Gupta и Gupta (2005).

Lesniak и др. (1997) описывают способ приготовления свободных от агломератов наночастиц. Способ включает в себя (i) приготовление водной суспензии наночастиц оксида железа, которые частично формируют агломераты, (ii) добавление триалкоксисиланов и водорастворимого полярного органического растворителя, например, этиленгликоля, (iii) обработку полученной суспензии с помощью ультразвука, чтобы уменьшить агломерацию, (iv) удаление воды посредством дистилляции под действием ультразвука; и (v) удаление оставшихся агломератов. Способ дает в результате свободные от агломератов наночастицы со стойким к гидролизу покрытием на основе алкоксисиланов. Однако эти наночастицы, если применяются локально к солидным опухолям, только частично остаются на месте инъекции вероятно вследствие того их свойства, что они являются свободными от агломератов. Эти наночастицы широко распространяются в теле, тем самым ограничивая как оставшееся количество наночастиц внутри целевой области, также увеличивая риск побочных эффектов вследствие накопления наночастиц в окружающих тканях или где-то в другом месте в теле. Дополнительно, очень трудно избавиться от использованного этиленгликоля вследствие его взаимодействия с аминогруппами алкоксисиланового покрытия и его высокой точки кипения (197°C). Соответственно, присутствие этиленгликоля в конечном продукте ограничивает применимость наночастиц в соответствии с аспектами безопасности и регулирования.

Ruefenacht и др. (2006) раскрывают инъецируемый основывающийся на полимерах состав генерирующих тепло наночастиц в жидком носителе, который является способным формировать имплантаты в месте нахождения при контакте с текучей средой тела или тканью. Несмотря на то, что кажется, что этот состав решает проблему истечения наночастиц из опухоли, система предпочтительно использует растворители, такие как N-метил-2-пирролидон (NMP) или диметилсульфоксид (DMSO). Оба растворителя, в общем, рассматриваются как имеющие низкую токсичность, и часто используются для пероральных и трансдермальных составов медикаментов. Однако немного известно в отношении инъекции растворителей в ткани или опухоли, особенно в мозг в случае опухолей мозга. Поэтому, следует избегать таких растворителей. Дополнительно, такие составы формируют при инъекции определенный имплантат, тогда как в контексте настоящего изобретения предполагается достигать некоторого распределения инъецированных наночастиц внутри опухоли/ткани, которое, однако, ограничено опухолью/тканью. Другой недостаток этой системы состоит в ожидаемом увеличении объема внутри опухоли, если эти инъецируемые основывающиеся на полимерах составы инъецируются в опухоли, что может вызывать проблемы в некоторых условиях опухолей, особенно в опухолях мозга, где пространство внутри черепа является ограниченным. Вместе, такие основывающиеся на полимерах составы не подходят для лечения неоперабельных опухолей.

Задачей настоящего изобретения является, поэтому, обеспечить улучшенные биологически совместимые магнитные наночастицы. В частности, задачей настоящего изобретения является обеспечить улучшенную биологически совместимую магнитную наночастицу для лечения опухолей.

Как показано в примерах, авторы неожиданно обнаружили, что управляемая аминосиланизация наночастиц оксида железа в отсутствии органических растворителей ведет к магнитным наночастицам с неполной конденсацией поверхностных аминосиланов, что дает в результате устойчивый, магнитных наночастиц (магнитных текучих сред) на водной основе, который может быть высоко концентрированным. При инъекции в ткань или опухоль эти магнитные текучие среды формируют подходящие депо с высоким процентом удержания внутри целевой ткани. Соответственно, авторы предлагают улучшенный способ для изготовления, улучшенные наночастицы, и подходящие суспензии и композиции (магнитные текучие среды) с улучшенной биосовместимостью, улучшенным формированием депо внутри целевой области и меньшими побочными эффектами вследствие отсутствия органических растворителей и/или уменьшенного истечения осажденных наночастиц из области лечения.

Следовательно, настоящее изобретение обеспечивает биологически совместимые магнитные наночастицы с высоким удельным коэффициентом поглощения (SAR), которые могут инъецироваться в повседневной работе в опухолевую ткань, которые остаются в или рядом с местом инъекции внутри предполагаемой области лечения, например, опухоли, и, по существу, не распространяются в окружающую ткань. Дополнительно, настоящее изобретение обеспечивает устойчивый и эффективный по стоимости процесс изготовления для таких биологически совместимых магнитных наночастиц.

Определения

"Удельный коэффициент поглощения" (SAR) является мерой для скорости, с которой энергия поглощается наночастицами при воздействии переменного магнитного поля. Он зависит от напряженности магнитного поля и частоты изменения поляризованности магнитного поля. SAR предпочтительно определяется согласно способу, разработанному Jordan и др. (1993), при частоте, равной 100 кГц, и напряженности поля, равной вплоть до 18 кА/м, предпочтительно при 3,5 кА/м, и относится к массе используемого металла, например, железа (единица Вт/г металла).

"Дзета-потенциал" указывает на измеренный электрический потенциал коллоидной наночастицы в водной среде, измеренный с помощью инструмента, такого как Malvern ZetaSizer 3000 HSA при pH 5,2 и проводимости, равной 2,0 мСм/см, (каждое определяется при 25°C). Дзета-потенциал описывает потенциал на границе между основной массой раствора и областью гидродинамического сдвига или диффузного слоя.

В контексте настоящего изобретения, признак "приблизительно" означает отклонение от заданного количества или значения, равное ±10%, предпочтительно равное ±5% и особенно равное ±1%.

Признак "магнитный" включает в себя магнитный, парамагнитный, ферромагнитный, анти-ферромагнитный, ферримагнитный, анти-ферримагнитный и суперпарамагнитный. Предпочтительно, наночастицы согласно этому изобретению являются парамагнитными, более предпочтительно ферромагнитными, ферримагнитными, анти-ферримагнитными или суперпарамагнитными.

В особенно предпочтительном варианте осуществления, наночастицы являются суперпарамагнитными.

Признак "наночастицы" должен обозначать наночастицы в нанометровом диапазоне, что означает наночастицы от 1 до 100 нм по отношению к своему металлическому ядру, как может определяться посредством электронной микроскопии. Предпочтительно, наночастицы имеют размер от 5 до 25 нм, более предпочтительно от 7 до 20 нм и особенно от 9 до 15 нм.

"Металлическая наночастица" указывает на магнитную наночастицу, которая содержат металл или ионы металлов.

"Органический растворитель" означает жидкое органическое соединение, т.е. углевод, со способностью растворять твердые вещества, газы, или жидкости. Примеры органических растворителей согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничены этим, этиленгликоль, ацетон, толуол и эквиваленты.

Признак "алкоксисилановое покрытие" указывает на покрытие, результирующее из поликонденсации алкоксисиланов, обработку, которая также упоминается как "аминосилановое покрытие". Признак "поликонденсация", как здесь используется, в общем, означает любую реакцию конденсации мономера с двумя функциональными группами, которая ведет к формированию полимера.

В первом аспекте, настоящее изобретение относится к способу для получения суспензии агломератов магнитных покрытых алкоксисиланом металлических наночастиц, при этом водная суспензия магнитных металлических наночастиц инкубируется с алкоксисиланом, отличающемуся тем, что упомянутая инкубация выполняется, по существу, в отсутствии органического растворителя.

В контексте настоящего изобретения, признак "инкубирование" или "инкубация" означает любую экспериментальную установку, экспериментальное условие (условия) или реакционную смесь (смеси), которые обеспечивают возможность для поликонденсации алкоксисиланов и, тем самым, для аминосиланового покрытия наночастиц.

Как показано в примерах, в контексте этого изобретения было обнаружено, что, для лечения опухолей и других заболеваний, агломераты магнитных покрытых алкоксисиланом металлических наночастиц могут лучше формировать отложения внутри целевой области и меньше наночастиц теряются в циркуляцию или формируют отложения вне целевой области, чем магнитные покрытые алкоксисиланом металлические наночастицы, которые не формируют агломераты. 'Агломерирование' в этом контексте означает, что несколько индивидуальных наночастиц формируют агломераты или кластеры наночастиц. "Агломераты" указывают на агломерированные наночастицы или кластеры наночастиц.

Существенным этапом настоящего изобретения является инкубация/реакция с алкоксисиланами, по существу, в отсутствии органического растворителя. "По существу, в отсутствии" в контексте органических растворителей означает, что могут присутствовать малые следы органических растворителей, предпочтительно величина органических растворителей меньше чем 10% по объему, более предпочтительно меньше чем 5% по объему, более предпочтительно меньше чем 1% по объему, особенно предпочтительно меньше чем 0,5% по объему. Например, в ходе реакции могут получаться незначительные величины метанола и, поэтому, до некоторой степени могут оставаться в продукте. В предпочтительном варианте осуществления, покрытие выполняется в отсутствии органического растворителя, особенно покрытие выполняется в отсутствии добавленного органического растворителя. Предпочтительным растворителем для реакции покрытия является вода. Не ограничиваясь какой-либо научной теорией, авторы предполагают, что эти условия реакции ведут к определенной, однако неполной реакции конденсации алкоксисиланов, что ведет к свойствам агломерации наночастиц.

Способ по настоящему изобретению предпочтительно выполняется в отсутствии этиленгликоля. Этиленгликоль препятствует реакции покрытия по настоящему изобретению. Дополнительно, является, по меньшей мере, очень трудным, если не невозможным, удалить его полностью из препаратов наночастиц, так как обычно относительно большие величины этиленгликоля остаются присоединенными к покрытию наночастиц, и вследствие его высокой точки кипения 197ºC. Это относится также к препаратам, приготовленным согласно Lesniak и др. (1997, выше). Согласно Европейской фармакопее только 600 ppm этиленгликоля разрешены в конечном медицинском продукте, что делает приготовления наночастиц с более высокими величинами этиленгликоля неприемлемыми для коммерческого клинического использования.

В одном варианте осуществления металлические наночастицы содержат железо, комплексные соединения железа, карбонильные соединения железа или соли железа, причем соли железа являются предпочтительными. Железосодержащие наночастицы являются предпочтительными вследствие их низкой токсичности по сравнению с другими магнитными металлами, такими как кобальт или никель. В предпочтительном варианте осуществления соединение комплексные соединения железа, карбонильные соединения железа, или соли железа являются, по существу, свободными от других металлов и других загрязняющих веществ, чтобы избегать токсичности. Является хорошо известным в данной области техники, что химикаты могут содержать следы загрязняющих веществ. Поэтому, "по существу, свободный" в этом контексте означает предпочтительно, что менее, чем 1% по весу, предпочтительно, менее чем 0,1% по весу других загрязняющих веществ содержится внутри комплексных соединений железа, карбонильных соединений железа или солей железа. Особенно предпочтительными являются соли железа, по существу, свободные от других загрязняющих веществ.

В особенно предпочтительном варианте осуществления, соль железа является оксидом железа, предпочтительно магнетитом и/или маггемитом. Такие наночастицы железа, сделанные из оксида железа, могут изготовляться посредством осаждения раствора, содержащего смесь хлорида железа (III) и хлорида железа (II) с гидроксидом натрия. "Наночастицы железа" согласно настоящему изобретению являются наночастицами, содержащими атомы Fe или ионы Fe.

Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления, водная суспензия наночастиц оксида железа обеспечивается посредством осаждения раствора, содержащего смесь хлорида железа (III) и хлорида железа(II) с гидроксидом натрия.

Здесь, отношение между хлоридом железа(III) и хлоридом железа(II) является предпочтительно равным приблизительно 2:1.

В контексте настоящего изобретения, признаки "наночастицы железа" и "наночастицы оксида железа" используются как эквиваленты.

Подходящие реакции осаждения и условия были описаны в Massart (1981) и рассмотрены в Mohapatra и Anand (2010). Предпочтительными условиями для реакции осаждения являются (i) отношение хлорида Fe(III) и хлорида Fe(II), равное приблизительно 2:1; (ii) заливка раствора хлорида Fe(III) и хлорида Fe(II) в раствор гидроксида натрия с концентрацией приблизительно 2,13 М; (iii) температура осаждения, равная приблизительно 25°С; и (iv) время для реакции осаждения, равное приблизительно 52 мин. Необязательно, раствор гидроксида натрия заливается в раствор хлорида железа (а не наоборот) в течение периода, равного приблизительно 39 мин при приблизительно 15°С. Способ для получения покрытых наночастиц оксида железа посредством осаждения солей железа в растворе проиллюстрирован, например, в Примере 1.1.

Альтернативно, водная суспензия наночастиц оксида железа может обеспечиваться посредством термического разложения соли железа или комплексных соединений железа. Признак "комплексное соединение железа", как здесь используется, в общем, означает любое комплексное соединение, содержащее железо, предпочтительно любое соединение, содержащее железо, связанное в комплексе. Подходящие способы были описаны в Waldoefner и Stief (2011).Кратко, железосодержащее соединение и органический растворитель выдерживаются в течение 10 мин при температуре между 50°С и 50°С ниже температуры реакции. Далее, раствор нагревается до температуры от 200 до 400°С, чтобы вырабатывать наночастицы. Наночастицы окисляются с помощью кислорода, перекиси или третичного аминоксида, и обрабатываются с помощью азотной кислоты и азотистого железа, давая результатом наночастицы маггемита. Другой подходящий способ для приготовления наночастиц оксида железа посредством термического разложения был описан в Guardia и др. (Guardia и др. 2010 a; Guardia и др. 2010 b; Guardia и др. 2012). Кратко, ацетилацетонат железа(III) смешивается с декановой кислотой в дибензиловом эфире. Раствор постоянно нагревается вплоть до 200°С. После 2 ч при 200°С раствор нагревается до отлива и выдерживается при этой температуре в течение 1 ч и, наконец, охлаждается до комнатной температуры, промывается и собирается посредством центрифугирования. Оба способа являются предпочтительными вследствие высокого SAR результирующих наночастиц. Способ для получения наночастиц оксида железа посредством термического разложения согласно настоящему изобретению, например, описывается в Примере 1.2.

Соответственно, в альтернативно предпочтительном варианте осуществления, водная суспензия наночастиц оксида железа обеспечивается посредством термического разложения соли железа или комплексных соединений железа.

Соли железа и комплексы железа, которые могут применяться в способе настоящего изобретения, являются хорошо известными специалисту в данной области техники и включают в себя, но не ограничены этим, хлорид железа(III), хлорид железа(II), ацетилацетонат железа(III), карбонилы железа и эквиваленты.

В предпочтительном варианте осуществления, металлические наночастицы обрабатываются с помощью Н₂О₂ перед инкубацией/реакцией с алкоксисиланом. Этот необязательный этап является предпочтительным, так как железо полностью окисляется до Fe₂O₃ (маггемита) при определенных условиях и, как следствие, последующие этапы реакции могут проводиться в отсутствии защитного газа (например, аргона). В противном случае в отсутствии Н₂О₂, является предпочтительным работать при защитном газе, таком как аргон, чтобы управлять условиями реакции.

Алкоксисилан является предпочтительно триалкоксисиланом. Он предпочтительно выбирается из группы, включающей 3-(2-аминоэтиламино)-пропил-триметоксисилан (DIAMO), 3-аминопропилтриэтоксисилан (APTES), триметоксисилопропил-диэтилентриамин (TRIAMO) и N-(6-аминогексил)-3-аминопропил-триметоксисилан. В особенно предпочтительном варианте осуществления, алкоксисилан является 3-(2-аминоэтиламино)-пропил-триметоксисиланом.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления, реакция покрытия выполняется посредством добавления от 0,3 до 0,6×10^-3 моль, предпочтительно от 0,4 до 0,5×10^-3 моль и особенно от 0,43 до 0,45×10^-3 моль триалкоксисилана на 0,9 моль металла.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения, инкубация/реакция с алкоксисиланом выполняется при pH между 2 и 6 (что означает, что также pH 2 или 6 включено в этот диапазон), предпочтительно между 2,5 и 5,5, особенно 4,5±1. В течение инкубации/реакции, pH может регулироваться до упомянутых значений, если требуется. Может использоваться уксусная кислота, чтобы регулировать pH соответственно.

Предпочтительно, металлические магнитные наночастицы дезинтегрируются перед инкубацией/реакцией с алкоксисиланом. Наночастицы дезинтегрируются предпочтительно посредством ультразвуковой обработки, чтобы генерировать суспензию шарообразных или кубических электроноплотных наночастиц, которые могут затем подвергаться реакции покрытия. В одном варианте осуществления ультразвуковая обработка осуществляется в ультразвуковой ванне при 45 кГц от 30 мин до 2 ч, особенно в течение приблизительно 1 ч. Этот способ дезинтеграции предпочтительно выполняется при кислотных условиях, предпочтительно между pH 2,5 и 3,0. Дезинтеграция наночастиц согласно настоящему изобретению, например, описывается в Примере 1.1.

Другой подходящий способ для дезинтеграции наночастиц является лазерной деагломерацией/способом лазерной фрагментации (Schnoor и др. 2010).

Способ по настоящему изобретению может дополнительно содержать этап дезинтеграции агломератов после начала инкубации/реакции с алкоксисиланом, который может выполняться, как описано выше. В одном варианте осуществления дезинтеграция наночастиц начинается с или после этапа покрытия. Однако в дополнительном предпочтительном варианте осуществления этап дезинтеграции начинается до этапа покрытия и дополнительно выполняется одновременно с и/или после этапа покрытия. Особенно, дезинтеграция начинается до этапа покрытия и продолжается в течение и после этапа покрытия. Предпочтительно, дезинтеграция выполняется в целом в течение приблизительно 24 ч или более.

При покрытии и дезинтеграции, может генерироваться суспензия, которая может устойчиво храниться при комнатной температуре, что делает этот вариант осуществления предпочтительным. Не ограничиваясь какой-либо научной теорией, предполагается, что большинство индивидуальных наночастиц полностью покрыты алкоксисиланом, которые легко присоединяются к соседним наночастицам, и формируют агломераты согласно этому изобретению, как можно видеть на фиг.1. Еще, суспензия является достаточно текучей, чтобы легко проходить через шприцы и иметь возможность инъецироваться в опухолевую ткань.

В предпочтительном варианте осуществления, выполняется дополнительный этап для удаления неполностью покрытых и/или очень больших агломератов (например, агломератов из более, чем 2000 наночастиц) из суспензии. Подходящие способы для этого этапа являются центрифугированием (например, в течение 10 мин при 2000 об/мин) и фильтрацией (например, через гофрированный фильтр с размером пор 12-25 мкм). В особенно предпочтительном варианте осуществления, выполняются как центрифугирование, так и фильтрация. Было замечено, что преобладающе и полностью покрытые алкоксисиланом наночастицы не осаждаются из суспензии, например, если центрифугируются в течение 10 мин при 2000 об/мин. Соответственно надосадочная жидкость центрифугирования и/или проходящий поток фильтрации является/являются суспензией согласно изобретению, которая/которые не демонстрирует/демонстрируют отложение осадка в течение одного дня, предпочтительно одной недели, особенно одного месяца, и, поэтому, может храниться в течение длительного времени.

С другой стороны, неполностью покрытые наночастицы могут удаляться в большой степени из суспензии, например, посредством такого центрифугирования. Такое удаление неполностью покрытых наночастиц является предпочтительными, так как неполностью покрытые наночастицы имеют уменьшенный SAR, который, поэтому, уменьшает объемный SAR суспензии.

Этап (этапы) дезинтеграции и необязательно этап удаления предпочтительно выполняется/выполняются до тех пор, пока агломераты металлических наночастиц имеют средний размер (z-среднее), равный от 30 до 450 нм, предпочтительно от 50 до 350 нм и особенно от 70 до 300 нм, как определяется посредством рассеяния света. В этом контексте средний размер определяется в воде согласно примеру 3. С помощью этого измерения рассеяния света, определяется размер агломератов наночастиц - в отличие от размера шарообразных или кубических электроноплотных одиночных наночастиц, которые формируют такие агломераты. "Z-среднее" по отношению к размеру агломератов означает считывание определения размера рассеяния света, как выполняется в примере 3. Z-средние значения выше обеспеченных диапазонов ведут к осаждению наночастиц и являются, поэтому, в общем, не подходящими для предполагаемых применений этих наночастиц. Даже если дисперсия может восстанавливаться перед инстилляцией в опухоль, более большие агломераты могут вести к серьезным проблемам, так как дисперсия может частично разделяться на буфер и агломераты при прохождении через иглу, что ведет к неравномерному распределению наночастиц внутри ткани.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, суспензия агломератов концентрируется до концентрации, по меньшей мере, приблизительно 2M, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 3M, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 4M, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 5M, и особенно, по меньшей мере, приблизительно 6M, как определяется содержанием металла в ней. Требуемая концентрация металла внутри суспензии согласно этому изобретению может регулироваться посредством выпаривания воды в ротационном выпарном аппарате. Образцы суспензии могут анализироваться в отношении содержания твердых веществ и концентрации металла с использованием способа, раскрытого ниже (см. например, Пример 2).

Неожиданно, было обнаружено, что наночастицы в композиции согласно этому изобретению могут концентрироваться до высоких концентраций, равных 2M содержания металла и выше, без потери удобства их использования в качестве медицинского изделия или медикамента. Эти высококонцентрированные суспензии могут все еще инфузироваться или инъецироваться в повседневной работе и, важно, могут храниться в течение месяцев. После автоклавной обработки суспензии, может наблюдаться некоторое гелеобразование, которое, однако, может быть обратимо посредством интенсивного встряхивания (например, в течение приблизительно 12 часов). По сравнению с суспензией с более низкой концентрацией металла, эти суспензии имеют более высокий удельный коэффициент поглощения (SAR) на основе объема и высокую вязкость. Неожиданно, было показано для наночастиц по настоящему изобретению, что формирование депо таких наночастиц внутри предполагаемой ткани, например, опухоли, зависит от концентрации наночастиц, т.е. увеличенные концентрации наночастиц ведут к улучшенному формированию депо. Этот результат был неожиданным, так как можно разумно предполагать, что концентрация инъецированных наночастиц быстро уравнивается для разных концентраций внутри ткани, так что идентичные наночастицы в разных концентрациях не ведут себя различным образом.

Другим аспектом настоящего изобретения является суспензия агломератов магнитных покрытых алкоксисиланом металлических наночастиц, получаемых посредством способа, описанного выше. Как показано в примерах ниже эта суспензия может инъецироваться в повседневной работе в опухоли, остается внутри опухолевой ткани и, поэтому, может использоваться для гипертермии и термоабляции. Неожиданно было обнаружено, что алкоксисилановое покрытие согласно этому изобретению ведет к свойствам наночастиц, обеспечивающим агломерирование таким образом, что при инъекции в ткань агломераты в основном остаются в тесной близости с местом инъекции, но все еще ими легко управлять. Это делает эти агломераты особенно подходящими для инъекции в опухолевые ткани, например, для гипертермии и/или термоабляции.

Дополнительным аспектом изобретения является композиция, содержащая агломераты магнитных покрытых алкоксисиланом металлических наночастиц, при этом агломераты имеют средний размер, равный от 30 до 450 нм, предпочтительно от 50 до 350 нм и особенно от 70 до 300 нм, как определяется посредством рассеяния света. Измерение размера агломерированных наночастиц согласно настоящему изобретению описывается, например, в Примере 3.

Предпочтительно, эта композиция, содержащая агломераты, является, по существу, свободной от органических растворителей. "По существу, свободный от органических растворителей" в этом контексте означает, что могут присутствовать малые следы органических растворителей, например, величина органических растворителей является меньшей, чем 5% по объему, предпочтительно 1% по объему, более предпочтительно меньшей, чем 0,5% по объему, особенно меньшей, чем 0,1% по объему. В особенно предпочтительном варианте осуществления, никакой органический растворитель не может обнаруживаться в препарате наночастиц посредством обычных способов.

Металлические наночастицы таких композиций являются предпочтительно наночастицами, имеющими металлическое ядро с размером, равным от 5 до 25 нм, предпочтительно с размером, равным от 7 до 20 нм, и особенно с размером, равным от 9 до 15 нм, как определяется посредством электронной микроскопии. Агломераты суспензии предпочтительно состоят из от дюжин до сотен таких индивидуальных наночастиц, тогда как какие-либо или только очень малое количество являются малыми агломератами, меньше, чем десять наночастиц, как определяется при просвечивающей электронной микроскопии (TEM) - предпочтительно меньше, чем 3 агломерата из 10 или менее наночастиц на показательном снимке TEM, отображающем 700 на 700 нм и, по меньшей мере, 1000 наночастиц. Просвечивающая электронная микроскопия согласно настоящему изобретению описывается, например, в Примере 6.

В свою очередь, на показательном снимке TEM, отображающем 700 на 700 нм и, по меньшей мере, 1000 наночастиц, могут обнаруживаться меньше, чем 10 индивидуальных наночастиц, предпочтительно меньше, чем 5 индивидуальных наночастиц, особенно одна или никакая индивидуальная наночастица. Наночастица в этом контексте является одной в основном шарообразной или кубической электроноплотной наночастицей, видимой на микроснимках просвечивающей электронной микроскопии. Одиночная наночастица является наночастицей, которая не присоединена к, по меньшей мере, одной другой наночастице.

Предпочтительно, форма одиночных наночастиц является шарообразной или кубической. Размер и форма наночастиц могут регулироваться посредством регулировки pH, ионной силы, температуры, природы солей (перхлораты, хлориды, сульфаты, и нитраты), или отношения концентрации Fe(II)/Fe(III) (рассмотрено в Mohapatra и Anand 2010).

Предпочтительно, металлические наночастицы содержат железо, комплексные соединения железа, карбонильные соединения железа или соли железа, предпочтительно соли железа. Соль железа является предпочтительно оксидом железа, особенно магнетитом. Предпочтительные наночастицы могут получаться посредством способов, как описано выше, предпочтительно посредством обеспечения суспензии наночастиц оксида железа посредством осаждения раствора, содержащего смесь хлорида железа (III) и хлорида железа (II) с гидроксидом натрия.

В предпочтительном варианте осуществления, композиция, содержащая агломераты магнитных покрытых алкоксисиланом металлических наночастиц изобретения, имеет дзета-потенциал, равный от 25 до 80 мВ, предпочтительно, равный от 35 до 70 мВ, особенно от 45 до 60 мВ. Дзета-потенциал композиции определяется, как описано в Примере 4 при pH 5,2 и при проводимости, равной 2,0 мСм/см (каждое определяется при 25°C). Дзета-потенциал зависит от успешного покрытия наночастиц, так как он зависит от аминогрупп алкоксисиланов. Более низкие дзета-потенциалы показывают недостаточное покрытие наночастиц. Корректный дзета-потенциал внутри обеспеченных диапазонов вносит вклад в свойства наночастиц при инъекции в ткань, т.е. что инъецированные наночастицы остаются в или рядом с местом инъекции внутри, например, опухоли, и не распространяются в окружающую ткань, что ограничивало бы прикладываемое магнитное поле и, тем самым, успех лечения. Дополнительно, дзета-потенциал в обеспеченных диапазонах обеспечивает оптимальную коллоидную устойчивость и, поэтому, продлевает срок хранения композиции наночастиц.

Дополнительный предпочтительный вариант осуществления этого изобретения является композицией, содержащей агломераты магнитных покрытых алкоксисиланом металлических наночастиц, при этом агломераты суспендируются в физиологически приемлемом буфере на водной основе. Физиологически приемлемые буферы являются известными в данной области техники и включают в себя, например, ацетат, цитрат, карбонат или фосфат при pH (при 25°C) между 5 и 8, предпочтительно между 5 и 6, и особенно между 5,1 и 5,8, и проводимости (при 25ºC), равной от 1,5 до 2,5 мСм/см, предпочтительно от 1,7 до 2,3 мСм/см. Осмотическая концентрация подходящей суспензии равняется от 0,01 до 0,05 осмоль/кг, предпочтительно от 0,02 до 0,04 осмоль/кг. Такие суспензии являются предпочтительно готовыми для использования в качестве инфузий для систематического лечения или инъекций для промежуточного или внутриопухолевого применения.

Композиция по настоящему изобретению предпочтительно имеет концентрацию наночастиц, равную, по меньшей мере, приблизительно 2M, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 3M, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 4M, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 5M и особенно, по меньшей мере, приблизительно 6M, как определяется содержанием металла в ней. Предпочтительно, концентрация наночастиц ниже приблизительно 8M, так как слишком высокие концентрации, для некоторых применений, могут вести к трудностям во время инъекции вследствие высокой вязкости дисперсии. По отношению к железу 2M равняется 112 мг/мл. Концентрация металла может определяться посредством фотометрии некоторых металлических комплексов, например, железо может определяться после преобразования в комплекс фенантролина железа (II), как описано в Примере 2.

Неожиданно, было обнаружено, что наночастицы в композиции согласно изобретению могут концентрироваться до высоких концентраций 2M содержания металла и выше, без потери их удобства в использовании в качестве медицинского изделия или медикамента. Эти высоко концентрированные суспензии могут все еще инфузироваться или инъецироваться в повседневной работе и, важно, могут храниться в течение месяцев. После автоклавной обработки суспензии может наблюдаться некоторое гелеобразование, которое, однако, может быть обратимым посредством интенсивного встряхивания (например, 12 часов). По сравнению с суспензией с более низкой концентрацией металла, эти суспензии имеют более высокий SAR на основе объема и высокую вязкость. Неожиданно, было показано для наночастиц по изобретению, что формирование депо таких наночастиц внутри предполагаемой ткани, например, опухоли, зависит от концентрации наночастиц, т.е. увеличение концентрации наночастиц ведет к улучшенному формированию депо. Этот результат был неожиданным, так как можно разумно предполагать, что концентрация инъецированных наночастиц быстро уравнивается для разных концентраций внутри ткани, так что идентичные наночастицы в разных концентрациях не ведут себя различным образом.

Как можно видеть в Примере 9, больше наночастиц могут осаждаться внутри опухоли для высококонцентрированных композиций (например, 95% инъецированного железа для 6 M суспензии по отношению к 90% для 2M суспензии в день 0). Это обнаружение является совместимым с результатами, что меньше железа было найдено в легком, печени и селезенке для 6M суспензии по сравнению с 2M суспензией (например, 3% по отношению к 14% в день 0). Соответственно, делается заключение, что чем выше концентрация, тем меньше наночастиц входят в циркуляцию и перемещаются в другие органы.

Дополнительно, было обнаружено, что более высоко концентрированные наночастицы по изобретению полностью остаются внутри опухоли в пределах периода времени из 7 дней (для 6M суспензии: 95% в день 0 по отношению к 96% в день 7), тогда как некоторые потери содержания железа могут наблюдаться в течение того же периода времени для более низко концентрированной суспензии (2M суспензия: 90% в день 0 по отношению к 86% в день 7). Это обнаружение является особенно неожиданным, так как можно было бы ожидать, что наночастицы быстро растворяются при инъекции в опухолевую ткань и не демонстрируют разное поведение в течение более длительных временных периодов.

Композиция по изобретению предпочтительно имеет вязкость при скорости сдвига 100/с, равную или больше, чем 0,005 Па·с, предпочтительно равную или больше, чем 0,01 Па·с, более предпочтительно равную или больше, чем 0,1 Па·с, и особенно равную или больше, чем 1 Па·с, как определяется посредством вращательной реометрии. Вращательная реометрия согласно настоящему изобретению, например, иллюстрируется в Примере 8. Для суспензий согласно изобретению вязкость увеличивается с увеличением концентрации наночастиц или железа.

В предпочтительном варианте осуществления, удельный коэффициент поглощения (SAR) наночастиц в композиции изобретения больше или равен 2 Вт/г соответствующего металла (например, железа), предпочтительно больше или равен 3 Вт/г соответствующего металла и особенно от 4 до 50 Вт/г соответствующего металла, как определяется при напряженности магнитного поля, равной 3,5 кА/м, и частоте, равной 100 кГц согласно способу, как описано в Jordan и др. (1993). В общем, высокие значения SAR являются предпочтительными, так как следовательно более высокие температуры могут достигаться в течение воздействия переменного магнитного поля. Если значение SAR наночастиц является слишком низкими, т.е. более низким, чем обеспеченные числа, является вероятным, что при воздействии переменного магнитного поля достигаемые температуры всюду в опухоли являются слишком низкими для достижения терапевтического эффекта.

Дополнительный предпочтительный вариант осуществления изобретения является композицией согласно этому изобретению, при этом при инъекции композиции в изогенную опухолевую модель в или после дня 7 после инъекции, по меньшей мере, 90%, предпочтительно, по меньшей мере, 93%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, и особенно, по меньшей мере, 98% примененного металла остается внутри инъецированной опухоли. Изогенная опухолевая модель согласно этому изобретению является опухолевой моделью, где опухолевые клетки, которые используются, чтобы вызывать опухоль, генетически соответствуют животному-хозяину. Например, клеточная линия карциномы молочных желез C3H RS1 используется, чтобы генерировать опухоли в мышах штамма C3H-HeN. Оставшийся металл в опухоли может определяться посредством измерения коэффициента использования металла с использованием спектрометрии, например, посредством спектрометра Tecan Infinite M 200.

Дополнительный вариант осуществления изобретения является композицией, которая получается посредством любого из способов изобретения.

Дополнительный аспект изобретения является медицинским изделием, содержащим суспензию или композицию согласно этому изобретению. Так как магнитные наночастицы оказывают их терапевтический эффект при воздействии переменного магнитного поля посредством генерирования тепла как физического способа действия и напрямую не взаимодействуют с метаболизмом пациента, эти наночастицы классифицируются в множестве юрисдикций как медицинские изделия. Тем не менее, они могут использоваться как мощные инструменты для лечения или профилактики опухолевых заболеваний и других заболеваний посредством гипертермии и/или термоабляции, где клетки неисправно функционируют в некоторой области тела.

Примерами для таких других заболеваний, которые могут лечиться согласно этому изобретению, являются ревматизм, артрит, артроз и бактериальные инфекции. Опухолевые заболевания, которые могут лечиться с помощью наночастиц согласно изобретению, являются предпочтительно солидными опухолями, особенно локальными или локально прогрессирующими опухолями, или систематическими опухолевыми заболеваниями, которые вызывают локальные проблемы, такие как неоперабельный метастаз. Примерами являются опухоли мозга, например, глиобластома и астроцитома, метастаз в головной мозг, рак простаты, рак поджелудочной железы, гепато-целлюлярная карцинома, рак головы и шеи, рак мочевого пузыря, рак желудка, почечно-клеточная карцинома, карцинома яичника, карцинома шейки матки, саркома, базальноклеточная карцинома и меланома.

Дополнительный аспект изобретения является медикаментом, содержащим суспензию или композицию согласно этому изобретению. Суспензия или композиция изобретения могут составляться с активным фармацевтическим препаратом, таким как противораковые агенты, например, химиотерапевтические агенты (которые могут группироваться в алкилирующие агенты, противоопухолевые антибиотики, антиметаболиты, производные природных источников), гормоны/факторы роста или аналоги гормонов/факторов роста или ингибиторы, ингибиторы сигнальной трансдукции и имунные лекарства. Подходящие фармацевтические препараты перечислены, например, в Waldoefner и Stief (2011, абзацы с [0096] по [0102]). Соответственно, является одним аспектом изобретения, что наночастицы согласно этому изобретению комбинированы с такими активными фармацевтическими препаратами.

В дополнительном аспекте, настоящее изобретение относится к суспензии или композиции согласно настоящему изобретению для использования в способе лечения или предотвращения пролиферативного заболевания, рака, опухолей, ревматизма, артрита, артроза и бактериальных инфекций, как дополнительно описано выше и ниже, в пациенте, как определено выше и ниже.

Дополнительный аспект изобретения является способом лечения или предотвращения пролиферативного заболевания, рака, опухолей, ревматизма, артрита, артроза и бактериальных инфекций, содержащим этап введения суспензии или композиции изобретения в пациента человека или животного, как дополнительно описано выше и ниже.

Предпочтительно, суспензия или композиция для использования согласно этому изобретению или способу лечения или предотвращения заболеваний согласно этому изобретению дополнительно включают в себя подвергание пациента переменному магнитному полю. Обычно, переменное магнитное поле прикладывается через часы или дни после инъецирования суспензии или композиции в целевую область, например, опухоль, пациента (Johannsen и др. 2007; Thiesen и Jordan 2008; Maier-Hauff и др. 2011).

По аналогии с Jordan и др. (2008) суспензия или композиции этого изобретения могут дополнительно использоваться в способе для увеличения активности противоракового агента, содержащем этапы введения в пациента при необходимости для него фармацевтической композиции, содержащей агломераты наночастиц, как здесь описано, и в отдельном этапе введение, по меньшей мере, одного противоракового агента вместе с, по меньшей мере, одним фармацевтически приемлемым наполнителем, переносчиком и/или растворителем. Упомянутые два введения могут быть одновременными или одно после другого (сначала наночастицы, затем противораковый агент или наоборот), однако таким образом, чтобы обеспечивалось присутствие наночастиц и противоракового агента внутри тела пациента в одно и то же время для обеспечения возможности действовать вместе и усиливать терапевтический эффект друг друга. Тогда как, согласно этому изобретению, агломераты наночастиц остаются внутри ткани в течение месяцев или лет внутри целевой области и могут генерировать тепло при экспозиции переменному магнитному полю, введенный противораковый агент обычно действует в течение часов или дней, "действовать вместе" в этом контексте, поэтому, означает, что все еще достаточные фармакологически активные уровни противоракового агента присутствуют в ткани. Соответственно, одним дополнительным аспектом изобретения являются наночастицы настоящего изобретения для использования в способе для профилактики и/или лечения опухолевых заболеваний, при этом наночастицы вводятся вместе с противораковыми агентами таким образом, что наночастицы и противораковый агент присутствуют в одно и то же время внутри тела пациента.

В предпочтительном варианте осуществления агломераты наночастиц согласно этому изобретению образуют комплексы с или ковалентно соединяются с активным фармацевтическим агентом или с целевым агентом, таким как антитела, фрагменты антител или лиганды, как известно в данной области техники. Например, соединение активных фармацевтических препаратов и/или лигандов с наночастицами описано в Jordan и др. (2008), Gao и др. (2011), Waldoefner и Stief (2011) и Ivkov и др. (2005).

Другие подходящие формы фармацевтических или медицинских изделий из агломератов наночастиц согласно этому изобретению, нежели суспензии, являются порошками, например, для вдыхания, или лиофилизатами, которые могут восстанавливаться до инфузии или инъекции, или имплантатами, содержащими агломераты наночастиц согласно этому изобретению, например, твердые или геле-подобные медицинские изделия, тампоны или пленки, как, например, дополнительно описано в Jordan (2009).

В общем, медикаменты или медицинские изделия согласно этому изобретению могут легко комбинироваться со стандартными терапиями, используемыми для соответствующего лечения или профилактики заболевания, такими как химиотерапия или радиоактивное облучение. Они могут использоваться либо, чтобы увеличивать эффективность индивидуального лечения и/или уменьшать побочные эффекты стандартной терапии посредством понижения их дозы, если комбинируются с медикаментами или медицинскими изделиями этого изобретения.

В свете предшествующего общего обсуждения, конкретные числа и примеры, представленные ниже, являются только иллюстративными и не предназначены, чтобы ограничивать объем изобретения. Другие общие и конкретные конфигурации должны быть очевидными для специалистов в данной области техники.

Фигуры

Фиг.1: Микроснимок просвечивающей электронной микроскопии 2M суспензии магнитных наночастиц оксида железа, изготовленных согласно Примеру 1.

Фиг.2: Вязкость трех разных препаратов наночастиц оксида железа согласно Примеру 1 определена посредством вращательной реометрии согласно Примеру 8. Сдвиговая вязкость в Па·с изображена в зависимости от скорости сдвига в 1/с для AS1(6M Fe) [закрашенные ромбы], AS2(3M Fe) [открытые круги], и AS1(2M Fe) [закрашенные квадраты].

Фиг.3: SAR трех разных препаратов наночастиц согласно Примеру 1 определен согласно Примеру 5. SAR в Вт/г Fe изображается в зависимости от напряженности переменного магнитного поля в кА/м для AS1(6M Fe) [закрашенные ромбы], AS2(3M Fe) [открытые круги], и AS1(2M Fe) [закрашенные квадраты].

Примеры

1. Изготовление покрытых магнитных наночастиц оксида железа

1.1. Посредством осаждения оксида железа из растворов соли железа (AS1 и AS2)

Осаждение и промывка: NaOH отвешивается в колбу, растворяется в очищенной воде до концентрации 2,13 M и впоследствии охлаждается до 25°C. Хлорид Fe(III) и хлорид Fe(II) (отношение 2:1) наполняются в стеклянную бутылку и растворяются в очищенной воде, чтобы получать раствор 0,48 M хлорида Fe(III)/0,24 M хлорида Fe(II). Раствор хлорида железа заливается в раствор NaOH и смешивается в течение периода, равного приблизительно 53 мин, при температуре постоянно удерживаемой на 25°C. Сформированные наночастицы оставляются, чтобы осаждаться, и надосадочная жидкость удаляется. Наночастицы промываются с помощью дегазированной воды до тех пор, когда надосадочная жидкость достигнет проводимости <5 мСм/см.

Необязательно, раствор NaOH заливается в раствор хлорида железа (а не наоборот) в течение периода, равного приблизительно 39 мин, при 15°C. Эта модификация обработки выполняется для AS2 наночастиц.

Покрытие и дезинтеграция

Суспензия наночастиц, упомянутая выше, регулируется с помощью растворенного HCl до тех пор, когда pH будет между 2,5 и 3,0. После этого колба размещается в ультразвуковой ванне и обрабатывается с помощью ультразвука при 45 кГц в течение 1 ч при перемешивании. Теперь в течении времени 90 мин 3-(2-аминоэтиламино)-пропил)триметоксисилан (Fluka, 48 мл на 1,2 л суспензии наночастиц) добавляется каплями, в то время как pH удерживается ниже порога 5,5 посредством добавления капель кислотной кислоты, но pH не должно становиться ниже, чем 5,0. После этого этапа, pH регулируется до 4,65 с помощью растворенного HCl и суспензия дополнительно обрабатывается с помощью ультразвука в течение 23 часов. Частицы, изготовленные согласно этому протоколу (без необязательных этапов), упоминаются как AS1 наночастицы.

Необязательно, наночастицы обрабатываются с помощью H₂O₂ в течение двух дней перед покрытием, чтобы достигать более тонкой дисперсии наночастиц и более хорошей коллоидной устойчивости. Дополнительно H₂O₂ может использоваться, чтобы полностью окислять Fe под управляемыми условиями до Fe₂O₃. Как результат, последующие реакции могут выполняться в отсутствии защитного газа (например, аргона). Этот необязательный этап выполняется для AS2 наночастиц, описанных выше.

Диализ: Суспензия очищается с помощью картриджа диализа крови (Fresenius F8 HPS) против дегазированной ультрачистой воды до тех пор, когда достигается проводимость, равная 400 мСм/см.

Центрифугирование и концентрация: Половина результирующей суспензии заполняется в сосуд центрифугирования и центрифугируется в течение 10 мин при 2000 об/мин. Далее надосадочная жидкость фильтруется через гофрированный фильтр (12-25 нм) в стеклянную бутылку, которая ранее была проветрена в течение 5 мин аргоном. Эта процедура повторяется идентично со второй частью суспензии. После этого, суспензия наночастиц концентрируется с помощью ротационного выпарного аппарата до требуемой концентрации Fe (например, 112 мг/мл Fe равняется 2M Fe, 168 мг/мл Fe равняется 3M Fe, или 335 мг/мл Fe равняется 6M Fe). Образцы наночастиц могут анализироваться в отношении содержания твердых веществ и концентрации Fe.

1.2. Посредством термической декомпозиции комплекса железа (AS4 и AS5)

AS4 частицы получаются аналогично способам, описанным в Waldoefner и Stief (2011). Кратко, ацетат натрия хлорида железа (III), диаминогексан и этиленгликоль комбинируются в трехгорлой колбе и перемешиваются до тех пор, когда получится однородный раствор. Затем смесь сильно нагревается почти до кипения, и стекает обратно в течение пяти часов. После промывания и сбора частиц посредством центрифугирования высушенные частицы смешиваются с триметиленоксидом в этиленгликоле и нагреваются до 130°C и выдерживаются в течение 2 ч. Затем смесь нагревается с отливом в течение 1 ч. Для последующего этапа окисления промытые частицы ресуспендируются в азотной кислоте и обрабатываются с помощью нитрида железа. Затем, после промывания и после этого сбора частиц посредством центрифугирования, частицы покрываются тетраалкоксисиланом, чтобы формировать толстую SiO₂-оболочку. Результирующие частицы собираются посредством центрифугирования и ресуспендируются в воде. Конечное покрытие, дезинтеграция и очищение (диализ, центрифугирование и концентрация) могут делаться таким же образом, как раскрыто выше для AS1-частиц.

AS5 частицы получаются аналогично способам, описанным в Guardia и др. (Guardia и др. 2010 a; Guardia и др. 2010 b; Guardia и др. 2012).

Раствор ацетилацетоната железа (III) и декановой кислоты в дибензиловом эфире быстро нагреваются вплоть до 200°C при перемешивании. Затем смесь перемешивается в течение 2 ч при этой температуре и нагревается в течение 15 мин до 298°C. Эта температура выдерживается в течение другого часа. В заключение суспензии позволяется охладиться до комнатной температуры.

Затем, к смеси добавляется ацетон и осадок высушивается воздухом. Частицы ресуспендируются в воде. Конечное покрытие, дезинтеграция и очищение могут делаться таким же образом, как раскрыто выше для AS1-частиц.

2. Определение концентрации железа/содержания твердого вещества

Определение концентрации железа внутри суспензии основывается на фотометрическом измерении затухания комплекса фенантролина железа (II). Комплекс генерируется посредством экстракции наночастиц с хлористоводородной кислотой до тех пор, когда экстракция завершается, как определяется посредством визуального осмотра. Все содержащееся железо сводится к железу (II) с использованием гидроксиламин-гидрохлорида и преобразовывается в комплекс фенантролина в уксусной кислоте/ацетатном буфере. Затухание комплекса определяется при 513 нм с использованием Shimadzu UV-1700 Pharmaspec по отношению к стандарту сульфата этилендиаммония железа (II) (Merck, Darmstadt).

Содержание твердых веществ суспензии определяется посредством взвешивания, например, 1 мл суспензии до и после выпаривания растворителя (например, воды).

3. Измерение размера частиц

Чтобы измерить средний размер наночастиц используется процедура рассеяния света, чтобы определять гидродинамический размер препарата наночастиц (например, Malvern ZetaSizer 3000 HSA или Malvern Zetasizer Nano ZS). Первичным параметром является значение z-среднего, которое взвешивается посредством интенсивности рассеяния. Поэтому, в случае полидисперсного распределения, более большие наночастицы взвешиваются более сильно, чем более маленькие наночастицы. Дополнительно, этот способ определяет средний размер агломератов наночастиц, а не размер одиночных или первичных наночастиц.

Принцип: Если наночастицы или молекулы освещаются с помощью лазера, интенсивность рассеянного света флуктуирует на частоте, которая зависит от размера наночастицы/агломератов, так как более маленькие наночастицы "ударяются" дополнительно молекулами растворителя и двигаются более быстро. Анализ этих флуктуаций интенсивности дает вектор скорости броуновского движения и, следовательно, размер наночастиц с использованием отношения Стокса-Эйнштейна.

Процедура: Малая часть тестового вещества растворяется в зависимости от его концентрации (1:1000 вплоть до 1:3000). Образец растворенной суспензии помещается в устройство измерения и обрабатывается согласно рекомендациям Malvern ZetaSizer 3000 HSA.

4. Измерение дзета-потенциала

Чтобы измерить дзета-потенциал наночастиц, образец встряхивается в течение 30 секунд. 75 мл 1:1000 разбавления раствора с концентрацией приблизительно 0,11 мг/мл для Fe (или другого металла) в ультрачистой воде приготавливается и обрабатывается в течение 15 мин с помощью ультразвука. 20 мл раствора инъецируются в измеряющую ячейку Malvern ZetaSizer 3000 HSA (или Malvern Zetasizer Nano ZS) и измеряются согласно рекомендациям изготовителя. pH раствора определяется с помощью отдельного прибора измерения pH.

5. Измерение SAR

SAR образцов из Примера 1 определяется согласно способу, разработанному Jordan и др. (1993), при частоте, равной 100 кГц, и напряженности поля, равной вплоть до 3,5 кА/м. Результаты для 3,5 кА/м и более высоких напряженностей поля показаны в Таблице 1.

Таблица 1 Удельный коэффициент поглощения Напряженность поля в Вт/г при 100 кГц SAR AS1 112 мг/мл Fe 3,5 3,5 AS1 112 мг/мл Fe 7,5 9,45 AS2 168 мг/мл Fe 3,5 4,0 AS2 168 мг/мл Fe 6,0 8,56 AS1 335 мг/мл Fe 6,0 7,22 AS4 112 мг/мл Fe 3,0 4,02 AS4 112 мг/мл Fe 4,0 15,69 AS5 112 мг/мл Fe 6,0 11,99

Средние SAR от нескольких линий изготовления AS1 и AS2 наночастиц при разных напряженностях переменного магнитного поля показаны на фиг.3.

6. Просвечивающая электронная микроскопия

Электронная микроскопия наночастиц может осуществляться посредством анализа TEM по аналогии со способом, описанным в Jordan и др. (1996, страница 712, 3.2.2).

2 M суспензия магнитных наночастиц оксида железа, изготовленных согласно Примеру 1, была проанализирована посредством TEM. Результирующий микроснимок показан как фиг.1. На микроснимке, можно видеть большие агломераты наночастиц (одиночная наночастица указана посредством стрелки). Никакие индивидуальные наночастицы не могут наблюдаться внутри изображенной области - все наночастицы присоединены к другим.

7. Спецификации суспензии

Одна линия производства согласно примеру 1 ведет к физическим/химическим спецификациям, как изображено в Таблице 2.

Таблица 2 Спецификации показательной дозы AS1 AS4 AS5 Размер частиц
(z-среднее) 89 нм 179,6 180,8 нм Дзета-потенциал 53,5 мВ 47,8 мВ 42,5 мВ Проводимость (25°C) 2,16 мСм/см 0,90 мСм/см -- pH (25°C) 5,28 4,38 -- Осмотическая концентрация 0,03 осмоль/кг 0,08 осмоль/кг -- SAR (при 100 кГц, при заданной напряженности поля) 10 Вт/г Fe
(7,5 кА/м) 14 Вт/г Fe
(4 кА/м) 12 Вт/г Fe
(6 кА/м)

Полное содержание металла (Fe) 15% по весу 18% по весу -- Концентрация (Fe) 1,99 моль/л 1,70 моль/л 1,88 моль/л

8. Вращательная реометрия/измерение вязкости

Вязкость образцов наночастиц определялась посредством служб характеризации материала Malvern с использованием вращательной реометрии при 20°C, при этом сдвиговая вязкость (в Па·с) определялась в зависимости от скорости сдвига (от 7 до 1500 1/с). Результаты для препаратов наночастиц согласно Примеру 1 показаны на фиг.2.

9. Формирование депо магнитных текучих сред в естественных условиях

1×10⁶ опухолевых клеток клеточной линии карциномы молочных желез C3H RS1 были инъецированы в правую заднюю конечность мышей штамма C3H-HeN (Harlan Laboratories, Borchen). Когда вызванные опухоли имели объем, равный от 0,57 до 0,85 см³, животные рандомизировались (15 животных на группу) и опухоли правой задней конечности были инъецированы с помощью магнитной текучей среды из Примера 1, имеющей концентрацию Fe либо 112 или 335 мг/мл. Точное содержание объема инъекции определялось посредством взвешивания шприца инъекции до и после инъекции и вычисления различия (при среднем 31 мл ± 5,8 мл).

Полное содержание Fe ткани/опухоли мышей определялось после 0 или 7 дней посредством измерения UV-vis при 565 нм с использованием теста Spektroquant 14761 (Merck, Darmstadt) и Cary 50 (Agilent Technologies, Santa Clara, Ca, USA) и спектрометра Tecan Infinite M 200 (Tecan Group Ltd, Mannedorf, Switzerland). Первоначально примененное содержание Fe определялось посредством вычитания из полного содержания Fe ткани/опухоли начального содержания ткани (определенного посредством измерения содержания Fe неинокулированной левой ноги) и потери магнитной текучей среды в течение инокуляции, которая абсорбировалась использованным тампоном на стержне. Коэффициент использования Fe (среднее 15 опухолей на группу) вычислялся как полное содержание Fe, разделенное на первоначально примененное содержание Fe.

Таблица 3 Коэффициент использования Fe, как определен посредством Cary 50 Cary Коэффициент использования Fe Опухоль [%] Коэффициент использования Fe легкое/печень/
селезенка [%] Коэффициент использования Fe опухоль/легкое/
печень/селезенка [%] 112 мг/мл Fe день 0 90 14 104 день 7 86 10 96 335 мг/мл
Fe день 0 95 3 98 день 7 96 3 99

Таблица 4 Коэффициент использования Fe, как определен посредством Tecan Infinite M 200 Tecan Коэффициент использования Fe Опухоль [%] Коэффициент использования Fe легкое/печень/
селезенка [%] Коэффициент использования Fe опухоль/легкое/
печень/селезенка [%] 112 мг/мл Fe день 0 95 16 111 день 7 93 13 106 335 мг/мл Fe день 0 98 4 102 день 7 98 4 102

Рассматривая начальное содержание Fe (как определено в левой ноге) и потери вследствие более маленького объема инокуляции магнитных текучих сред, коэффициенты использования полного Fe в среднем для всех четырех групп были 99% для Cary 50 и 104% для Tecan Infinite M 200. В общем, значения коэффициента использования были более высокими при использовании Tecan Infinite M 200 (Таблица 4) по сравнению с Cary 50 (Таблица 3).

Сравнивая коэффициенты использования Fe между составом 112 мг/мл Fe и составом 335 мг/мл Fe, оба определения, выявили тенденцию, что в день 0 больше наночастиц Fe были сохранены внутри опухоли для состава 335 мг/мл (95% по отношению к 90%, как определено посредством Cary, и 98% по отношению к 95%, как определено посредством Tecan). С другой стороны, количества наночастиц Fe, найденные в других тканях (легкое, печень и селезенка) в день 0 были намного более высокими для состава 112 мг/мл Fe (14%/16% для 112 мг/мл по отношению к 3%/3% для 335 мг/мл). Поэтому, можно заключить, что больше наночастиц Fe вымывается из опухоли в течение и потенциально непосредственно после применения в день 0 для более низко концентрированного состава по сравнению с более высоко концентрированным составом.

Чтобы определить отношение Fe, которое осталось после 7 дней внутри опухоли, по сравнению с Fe, которое эффективно было применено к опухоли в день 0, коэффициенты использования Fe в день 0 разделялись на коэффициенты использования Fe в день 7 и усреднялись между определениями посредством Cary 50 и Tecan Infinite M 200 (результаты, показаны в Таблице 5). Аналогично, судьба Fe, которое аккумулировалось в день 0 в легком, печени и селезенке, анализировалась посредством сравнения упомянутой величины с Fe, все еще присутствующим внутри этих органов в день 7.

Таблица 5 Оставшееся Fe внутри опухоли/органов после 7 дней (отношение между днем 0 и днем 7, усредненное между Cary и Tecan) Оставшееся Fe опухоль [%] Оставшееся Fe легкое/печень/селезенка 112 мг/мл Fe 97% 75% 335 мг/мл Fe 101% 100%

Тогда как для состава 112 мг/мл Fe имелась дополнительная потеря приблизительно 3% Fe от дня 0 до дня 7, содержание Fe для состава 335 мг/мл Fe оставалось постоянным в течение этого временного периода. Интересно, что приблизительно 1/4 Fe, которое нашло свой путь в легкое, печень и селезенку, для состава 112 мг/мл Fe, исчезала в течение недели, тогда как все из Fe из состава 335 мг/мл, обнаруженное в этих органах в день 0, оставалось там до дня 7 (хотя необходимо учесть, что полные величины Fe, обнаруженные в этих органах для состава 335 мг/мл Fe, были в целом только приблизительно 1/4 от величины Fe, обнаруженного в этих органах для состава 112 мг/мл Fe, см. Таблицу 3 и Таблицу 4, столбец "коэффициент использования Fe легкое/печень/селезенка").

Соответственно, более высококонцентрированный состав наночастиц дополнительно демонстрирует улучшенный процент удержания наночастиц внутри опухоли в течение периода 7 дней, что имеет большую важность, если пациенты подвергаются множеству лечений с помощью магнитного поля в течение недель или месяцев.

ЛИТЕРАТУРА

Gao, J., et al. (2011). WO 2011/082796.

Guardia, P., et al. (2012). ACS Nano 6(4): 3080-91.

Guardia, P., et al. (2010 a). Chem Commun (Camb) 46(33): 6108-10.

Guardia, P., et al. (2010 b). Langmuir 26(8): 5843-7.

Gupta, A. K. and M. Gupta (2005). Biomaterials. 26(18): 3995-4021.

Ivkov, R., et al. (2005). Therapy via Targeted Delivery of Nanoscale Particles. US 2005/0090732.

Johannsen, M., et al. (2007). Eur Urol. 52(6): 1653-61. Epub 2006 Nov 17.

Jordan, A. (2009). Implantable Products comprising Nanoparticles. WO 2009/100716.

Jordan, A., et al. (2008). Nanoparticle/Active Ingredient Conjugates. US 2008/0268061.

Jordan, A., et al. (2008). Method of Carrying Therapeutic Substances into Cells. US 2008/0187595.

Jordan, A., et al. (1993). Int J Hyperthermia. 9(1): 51-68.

Jordan, A., et al. (1996). Int J Hyperthermia. 12(6): 705-22.

Lesniak, C., et al. (1997). US 6,183,658.

Maier-Hauff, K., et al. (2011). J Neurooncol 103(2): 317-24.

Massart, R. (1981). IEEE Trans. Magn. 17(2): 1247-48.

Mohapatra, M. and S. Anand (2010). Int J of Engineering, Science and Technology. 2(8): 127-46.

Moroz, P., et al. (2002). Int J Hyperthermia. 18(4): 267-84.

Ruefenacht, D., et al. (2006). WO 2006/125452.

Schnoor, A., et al. (2010). Chemie Ingenieur Technik 82(3): 317-26.

Thiesen, B. and A. Jordan (2008). Int J Hyperthermia. 24(6): 467-74.

Waldoefner, N. and K. Stief (2011). Magnetic Transducers. US 2011/0052609.

Группа изобретений относится к области фармацевтики. Описан способ для получения суспензии агломератов магнитных покрытых алкоксисиланом металлических наночастиц. Указанные металлические наночастицы содержат железо, комплексные соединения железа, карбонильные соединения железа или соли железа. Указанную водную суспензию магнитных металлических наночастиц инкубируют с алкоксисиланом, при этом инкубацию выполняют в отсутствии добавленного органического растворителя. Указанный алкоксисилан является триалкоксисиланом, при этом от 0,3 до 0,6×10^-3 моль триалкоксисилана добавляют на 0,9 моль металла. Указанную инкубацию выполняют при рН между 2 и 6. Также описаны композиция и суспензия, указанных агломератов, предназначенная для лечения пролиферативного заболевания, рака или опухоли у пациента; медицинское изделие, представляющее собой указанные агломераты, применение и способ лечения. Изобретения обеспечивают биологически совместимые магнитные частицы с высоким удельным коэффициентом поглощения, которые могут инъецироваться в опухолевую ткань и оставаться в или рядом с местом инъекции. 6 н. и 20 з.п. ф-лы, 3 ил., 5 табл., 9 пр.

1. Способ для получения суспензии агломератов магнитных покрытых алкоксисиланом металлических наночастиц, причем металлические наночастицы содержат железо, комплексные соединения железа, карбонильные соединения железа или соли железа, при этом водную суспензию магнитных металлических наночастиц инкубируют с алкоксисиланом, в котором упомянутую инкубацию выполняют в отсутствии добавленного органического растворителя, при этом алкоксисилан является триалкоксисиланом и, при этом от 0,3 до 0,6×10^-3 моль триалкоксисилана добавляют на 0,9 моль металла, причем инкубацию выполняют при рН между 2 и 6.

2. Способ по п. 1, в котором соль железа является оксидом железа, предпочтительно магнетитом и/или маггемитом.

3. Способ по п. 2, в котором водную суспензию наночастиц оксида железа

a) обеспечивают посредством осаждения раствора, содержащего смесь хлорида железа(III) и хлорида железа(II) с гидроксидом натрия, или

b) посредством термического разложения соли железа или комплексного соединения железа.

4. Способ по п. 1, в котором магнитные металлические наночастицы обрабатывают с помощью Н₂О₂ перед инкубацией.

5. Способ по п. 1, в котором триалкоксисилан выбирают из группы, состоящей из 3-(2-аминоэтиламино)-пропил-триметоксисилана, 3-аминопропилтриэтоксисилана, триметоксисилопропил-диэтилентриамина и N-(6-аминогексил)-3-аминопропилтриметоксисилана, особенно 3-(2-аминоэтиламино)-пропил-триметоксисилана.

6. Способ по п. 1, в котором от 0,4 до 0,5 ×10^-3 моль, предпочтительно от 0,43 до 0,45×10^-3 моль триалкоксисилана добавляют на 0,9 моль металла.

7. Способ по п. 1, в котором металлические магнитные наночастицы дезинтегрируют перед инкубацией с алкоксисиланом.

8. Способ по п. 1, дополнительно содержащий этап дезинтеграции магнитных наночастиц после начала инкубации с помощью алкоксисилана.

9. Способ по п. 1, дополнительно содержащий этап удаления не полностью покрытых наночастиц.

10. Способ по пп. 7-9, в котором агломераты дезинтегрируют до тех пор, когда достигается средний размер, равный от 30 до 450 нм, предпочтительно от 50 до 350 нм и особенно от 70 до 300 нм, как определяется посредством рассеяния света.

11. Способ по п. 1, в котором суспензию агломератов концентрируют до концентрации, по меньшей мере, около 2 М, предпочтительно, по меньшей мере, около 3 М, более предпочтительно, по меньшей мере, около 4 М, даже более предпочтительно, по меньшей мере, около 5 М, и особенно, по меньшей мере, около 6 М, как определяется содержанием металла в ней.

12. Суспензия агломератов магнитного покрытого алкоксисиланом металла, предназначенная для лечения пролиферативного заболевания, рака или опухоли у пациента, содержащая наночастицы, получаемые посредством способа согласно любому из пп. 1-11.

13. Композиция, содержащая агломераты магнитных покрытых алкоксисиланом металлических наночастиц, предназначенная для лечения пролиферативного заболевания, рака или опухоли у пациента, при этом агломераты имеют средний размер, равный от 30 до 450 нм, предпочтительно от 50 до 350 нм и особенно от 70 до 300 нм, как определяется посредством рассеяния света, и при этом дзета-потенциал металлических наночастиц равняется от 25 до 80 мВ при рН 5,2, и проводимости, равной 2,0 мСм/см, причем металлические наночастицы содержат железо, комплексные соединения железа, карбонильные соединения железа или соли железа, при этом алкоксисилан является триалкоксисиланом.

14. Композиция по п. 13, которая содержит органические растворители в количестве менее 5% по объему.

15. Композиция по п. 13, в которой металлические наночастицы имеют металлическое ядро с размером, равным от 5 до 2 5 нм, предпочтительно от 7 до 20 нм и особенно от 9 до 15 нм, как определяется посредством электронной микроскопии.

16. Композиция по п. 13, в которой металлические наночастицы дополнительно характеризуются, как определено в любом из пп. 2 или 3.

17. Композиция по п. 13, в которой дзета-потенциал металлических наночастиц равняется от 35 до 70 мВ, особенно от 45 до 60 мВ, при рН 5,2 и проводимости, равной 2,0 мСм/см.

18. Композиция по п. 13, в которой агломераты суспендированы в физиологически приемлемом буфере на водной основе.

19. Композиция по п. 18, в которой наночастицы имеют концентрацию, по меньшей мере, около 2 М, предпочтительно, по меньшей мере, около 3 М, более предпочтительно, по меньшей мере, около 4 М, более предпочтительно, по меньшей мере, около 5 М и особенно, по меньшей мере, около 6 М, как определяется содержанием металла.

20. Композиция по любому из пп. 18 или 19, в которой вязкость суспензии при скорости сдвига 100/с равна или больше чем 0, 005 Па⋅с, предпочтительно равна или больше чем 0,01 Па⋅с, более предпочтительно равна или больше чем 0,1 Па⋅с, и особенно равна или больше чем 1 Па⋅с, как определяется посредством вращательной реометрии.

21. Композиция по п. 18, в которой удельный коэффициент поглощения (SAR) наночастиц в суспензии больше или равен 2 Вт/г Me, предпочтительно больше или равен 3 Вт/г Me и особенно от 4 до 12 Вт/г Me, как определяется при напряженности магнитного поля, равной 3,5 кА/м, и частоте, равной 100 кГц.

22. Композиция по п. 18, в которой при инъекции суспензии в изогенную опухолевую модель в или после дня 7 после инъекции, по меньшей мере, 90%, предпочтительно, по меньшей мере, 93%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, и особенно, по меньшей мере, 98% примененного металла остается внутри инъецированной опухоли.

23. Композиция по п. 18, полученная способом по любому из пп. 1-10.

24. Медицинское изделие, представляющее собой агломераты покрытых алкоксисиланом металлических наночастиц, составляющие суспензию по п. 12 или композицию по любому из пп. 13-23.

25. Применение суспензии по п. 12 или композиции по любому из пп. 13-23 для изготовления медикамента для лечения пролиферативного заболевания, рака или опухолей в пациенте, причем пациента подвергают переменному магнитному полю.

26. Способ лечения пролиферативного заболевания, рака или опухолей, содержащий этап введения суспензии по п. 12 или композиции по любому из пп. 13-23 в пациента человека или животного, причем пациента подвергают переменному магнитному полю.