Способ получения пуриновых нуклеозидов ряда β-D-арабинофуранозы Российский патент 2017 года по МПК C12P19/40 C07H19/19 A61K31/7052 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству модифицированных пуриновых нуклеозидов ряда β-D-арабинофуранозы, используемых в медицинской практике для терапии опухолевых заболеваний (флударабин, неларабин и т.п.) и вирусных инфекций (видарабин).

Изобретение решает задачу разработки эффективного способа синтеза модифицированных пуриновых нуклеозидов ряда β-D-арабинофуранозы за счет использования химико-ферментативного подхода (рис. 1, 2), объединяющего два процесса: фосфоролиза и арсенолиза нуклеозидов в активном центре ферментов нуклеозидфосфорилаз.

Наиболее эффективным в настоящее время признан биотехнологический способ получения модифицированных нуклеозидов с использованием ферментов нуклеозидфосфорилаз (НФ) - реакция ферментативного трансгликозилирования - в процессе которой происходит перенос сахарного остатка от природного пуринового или пиримидинового нуклеозида на модифицированное гетероциклическое основание (Михайлопуло И.А., Мирошников А.И. Современные тенденции в биотехнологии нуклеозидов. // Acta Naturae. 2010; 2(2), с. 38-61.). Принципиальная схема процесса представлена на рисунке 1.

Реакция ферментативного трансгликозилирования обычно носит обратимый характер, что ограничивает ее применение в промышленных биотехнологических процессах. Для смещения равновесия применяют ряд подходов. К ним относятся:

1) применение избытка одного из компонентов реакции (Purine nucleoside phosphorylases: properties, functions and clinical aspects. Bzowska A., Kulikowska E., Shugar D. Pharmacology & Therapeutics. - 2000. - V. 88. P. - 349-425),

2) использование в качестве доноров пентозы бариевых солей пентозо-1-фосфатов (Использование бариевых солей пентозо-1-фосфорных кислот в ферментативном синтезе риботимидина и бромвинилдезоксиуридина. Бокуть С.Б., Барай В.Н., Зинченко А.И. Прикл. Биохим. Микробиол. 1995. Т. 31. Вып. 3. С. 308-310). При этом образующийся в ходе реакции фосфат бария выпадает в осадок и выводится из реакции.

3) Известен способ проведения реакции фосфоролиза природных нуклеозидов с использованием вместо неорганических фосфатов солей ортомышьяковой кислоты (H₃AsO₄, арсенолиз) для смещение равновесия ферментативной реакции в сторону образования гетероциклического основания. Образующийся в процессе реакции α-D-рибозо-1-арсенат нестабилен в растворе и выводится из ферментативной реакции (Purine nucleoside phosphorylase. Catalytic mechanism and transition-state analysis of the arsenolysis reaction. Kline, P.C., & Schramm, V.L. Biochemistry 1993. V. 32. P. 13212-13219).

К недостаткам этих методов, можно отнести следующее:

1) использование больших избытков одного из компонентов реакции - нуклеозида или основания - довольно затратный процесс, требующий по окончании хроматографического разделения компонентов реакционных смесей и возвращения их в реакцию по рециклу.

2) использование солей бария невозможно в случае, если целевой продукт плохо растворим и кристаллизуется в процессе реакции одновременно с фосфатом бария.

3) К недостаткам арсенолиза можно отнести следующее: соли ортомышьяковой кислоты применяются только при гидролизе нуклеозидов (рибозидов и 2'-дезоксирибозидов) до гетероциклических оснований.

Известен способ синтеза нуклеозидов по реакции трансгликозилирования с использованием солей ортомышьяковой кислоты в синтезе 1-β-D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида (рибавирина) (Константинова И.Д., Фатеев И.В., Мирошников А.И. «Способ получения 1-beta-D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида». Патент РФ №2480218 от 27.04.2013 г. Приоритет от 06.12.2011 г.), отличающийся тем, что в результате проведения реакции синтезируется рибозид 1,2,4-триазол-3-карбоксамида, и арсенат натрия добавляется в реакционную смесь по окончании синтеза рибавирина для удаления остатков не прореагировавшего гуанозина. Однако, этот способ проведения синтеза целевого нуклеозида 1-β-D-рибофуранозы является уникальным и его практически не возможно распространить на синтез других рибозидов в активном центре фермента (И.Д. Константинова, И.В. Фатеев, Г.А. Галегов, П.Г. Дерябин, А.Г. Ботиков, И.С. Музыка, Д.К. Львов, А.И. Мирошников. Арсенолиз в биотехнологическом способе получения рибавирина. Ингибирование репродукции вируса гриппа A in vitro и in vivo с помощью комбинации рибавирина и озельтамивира. // Биоорганическая химия. 2013. Т. 39., №5. С. 594-603).

Использование солей ортомышьяковой кислоты в синтезе нуклеозидов ряда β-D-арабинофуранозы в литературе не известно.

Изобретение решает задачу упрощения технологии получения модифицированных пуриновых нуклеозидов ряда β-D-арабинофуранозы из природных или химически модифицированных нуклеозидов β-D-рибофуранозы. Использование в реакциях трансгликозилирования именно рибозидов при разработке технологий получения модифицированных нуклеозидов мотивируется более высокой растворимостью по сравнению с соответствующими гетероциклическими основаниями.

Поставленная задача решается за счет того, что способ получения модифицированных пуриновых нуклеозидов ряда β-D-арабинофуранозы включает взаимодействие пуринового рибозида с 1-β-D-арабинофуранозилурацилом или 1-α-фосфатом D-арабинозы в калий-фосфатном буфере с использованием ферментов нуклеозидфосфорилаз в присутствии каталитических количеств солей ортомышьяковой кислоты (арсената натрия или калия в количестве от 0.1% по молям).

Способ осуществляют следующим образом.

В реакцию трансгликозилирования вводят:

1) источник пуринового основания: природный или химически модифицированный рибонуклеозид (соединение II, рисунок 2),

2) источник β-D-арабинозы: 1-β-D-арабинофуранозилурацил (соединение I, рисунок 2) или 1-α-фосфат-D-арабинозы (соединение III, рисунок 2),

3) ферменты нуклеозидфосфорилазы,

4) арсенат натрия (NaH₂AsO₄) в каталитическом количестве от 0.1% до 10% (молей на моль пуринового рибонуклеозида).

Принципиальная схема процесса представлена на рисунке 2.

Реакцию проводят в К-фосфатном буферном растворе.

В активном центре фермента арсенат 1-α-D-рибофуранозы образуется очень легко, тогда как арсенат 1-α-D-арабинофуранозы практически не синтезируется. Арсенат 1-α-D-рибофуранозы крайне нестабилен и гидролизуется до рибозы, которая и выводится из ферментативной реакции.

Использование каталитических количеств арсената натрия в реакциях трансгликозилирования способствует значительному ускорению ферментативного процесса, сокращению времени реакции, упрощению состава реакционных смесей и облегчению процесса разделения компонентов реакции. На рисунках 11-16 приведены данные ВЭЖХ реакционных смесей ферментативного получения нуклеозидов ряда β-D-арабинофуранозы без арсената натрия (рисунки 11, 13, 15) и с его использованием (рисунки 12, 14, 16).

Изобретение осуществляют следующим образом.

Источником пуринового основания является любой природный или полученный химически модифицированный рибо-нуклеозид (соединение II, рисунок 2) (например аденозин, инозин, гуанозин, 2-фтораденозин, 2-метоксиаденозин, 2-хлораденозин, 6-О-метилгуанозин и др.).

В качестве источника 1-α-фосфата-D-арабинозы используют 1-β-D-арабинофуранозилурацил (соединение I, рисунок 2) (CAS Number: 3083-77-0) или 1-α-фосфат-D-арабинозы (соединение III, рисунки 2, 6-8) (I.D. Konstantinova, K.V. Antonov, I.V. Fateev, A.I. Miroshnikov, V.A. Stepchenko, A.V. Baranovsky, I.A. Mikhailopulo. A Chemo-Enzymatic Synthesis of β-D-Arabinofuranosyl Purine Nucleosides. // Synthesis, 2011. N. 10. P. 1555-1560. DOI: 10.1055/s-0030-1260010).

При приготовлении фосфатного буферного раствора добавляют каталитическое количество арсената натрия или калия (от 0.1% до 10% по молям).

Температура и рН раствора определяются требованиями ферментов нуклеозидфосфорилаз.

В качестве ферментов используют пуриннуклеозидфосфорилазу (ПНФ, КФ 2.4.2.1) и уридинфосфорилазу (УФ, КФ 2.4.2.3).

Проведение процесса получения любых модифицированных нуклеозидов - производных β-D-арабинозы описанным способом позволяет получать нуклеозиды с выходом более 90%. Данные, подтверждающие достижение технического результата, представлены в таблице.

Далее изобретение иллюстрируют таблица и следующие графические материалы:

Таблица. Сравнительные данные по получению нуклеозидов ряда D-арабинозы без использования арсената натрия и с ним. Приведены данные состава реакционных смесей, время синтеза (ч) и конверсия пуринового β-D-рибозида в β-D-арабинозид. Подробно методики приведены в примерах 1-11.

Рисунок 1. Принципиальная схема реакции трансгликозилирования.

Рисунок 2. Схема реакции трансгликозилирования с использованием арсената натрия.

Рисунок 3. Схема ферментативного синтеза 9-(β-D-арабинофуранозил)-2-фтораденина (флударабина) с использованием двух ферментов ПНФ и УФ.

Рисунок 4. Схема ферментативного синтеза 9-(β-D-арабинофуранозил)-аденина (Ara-А) с использованием двух ферментов ПНФ и УФ.

Рисунок 5. Схема ферментативного синтеза 9-(β-D-арабинофуранозил)-6-O-метилгуанина (неларабина) с использованием двух ферментов ПНФ и УФ.

Рисунок 6. Схема ферментативного синтеза 9-(β-D-арабинофуранозил)-2-фтораденина (флударабина) из 2-фтораденозина и 1-α-фосфата D-арабинозы с использованием одного фермента ПНФ.

Рисунок 7. Схема ферментативного синтеза 9-(β-D-арабинофуранозил)-аденина (Ara-А) из аденозина и 1-α-фосфата D-арабинозы с использованием одного фермента ПНФ.

Рисунок 8. Схема ферментативного синтеза 9-(β-D-арабинофуранозил)-6-O-метилгуанина из 9-(β-D-рибофуранозил)-6-О-метилгуанина и 1-α-фосфата D-арабинозы с использованием одного фермента ПНФ.

Рисунок 9. Схема ферментативного синтеза 9-(β-D-арабинофуранозил)гипоксантина (Ara-Hyp) с использованием двух ферментов ПНФ и УФ.

Рисунок 10. Схема ферментативного синтеза 2-хлор-9-(β-D-арабинофуранозил)аденина (Cl-AraA) с использованием двух ферментов ПНФ и УФ.

Рисунок 11. Данные ВЭЖХ реакционной смеси синтеза флударабина без арсената натрия с использованием двух ферментов ПНФ и УФ.

Рисунок 12. Данные ВЭЖХ реакционной смеси синтеза флударабина с арсенатом натрия с использованием двух ферментов ПНФ и УФ.

Рисунок 13. Данные ВЭЖХ реакционной смеси синтеза видарабина без арсената натрия с использованием двух ферментов ПНФ и УФ.

Рисунок 14. Данные ВЭЖХ реакционной смеси синтеза видарабина с арсенатом натрия с использованием двух ферментов ПНФ и УФ.

Рисунок 15. Данные ВЭЖХ реакционной смеси синтеза неларабина без арсената натрия с использованием двух ферментов ПНФ и УФ.

Рисунок 16. Данные ВЭЖХ реакционной смеси синтеза неларабина с арсенатом натрия с использованием двух ферментов ПНФ и УФ.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1.

Получение 9-(β-D-арабинофуранозил)-2-фтораденина (флударабина, соединение IX, рисунок 3).

Смесь 17.116 г (0.06 моль) 2-фтораденозина (CAS Number: 146-78-1, соединение VII, рис. 3), 22.0 г (0.09 моль) 1-β-D-арабинофуранозилурацила (соединение VIII, рис. 3) и 0.882 г (0.003 моль) NaH₂AsO₄ в 2 л 60 мМ калий-фосфатного буфера (рН 7.0) термостатируют в течение 72 часов при 48°С в присутствии 3750 ед. акт. ферментного препарата ПНФ (62.5 ед. акт. на 1 ммоль 2-фтораденозина) и 5625 ед. акт. ферментного препарата УФ (62.5 ед. акт. на 1 ммоль 1-β-D-арабинофуранозилурацила). Контроль полноты процесса осуществляют с помощью ВЭЖХ. Процесс считается законченным, если содержание исходного 2-фтораденозина (соединение VII, рис. 3) в реакционной смеси составляет <0.2%.

Реакционную смесь охлаждают до температуры 8°С. Выпавший в осадок целевой продукт отфильтровывают, промывают водой (3×20 мл) и этиловым спиртом (1×20 мл), затем высушивают в эксикаторе до постоянного веса. Выход: 15.75 г (92%). Чистота продукта по данным ВЭЖХ 99-99.4% (метод от 0 до 20% элюента В за 20 минут, элюент А - вода с 0.1% ТФУ, элюент В - 70% ацетонитрила в воде с 0.1% ТФУ, колонка Nova-Pak С18, 4.6×150 мм, 4 мкм). Т.пл. 260-262°С. λ_max, нм (ε, М^-1 см^-1): 262 (14800). Спектр ¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆), (δ м.д.): 8.17 (с, 1H, Н-8), 7.76 (с, 2Н, NH₂), 6.11 (д, J=5.0 Гц, 1Н, Н_1'), 5.61 (д, J=5.3 Гц, 1H, OH_2'), 5.51 (д, J=4.7 Гц, 1Н, ОН_3'), 5.05 (т, J=4.3 Гц, 1H, ОН_5'), 4.14 (м, 1H, Н_2'), 4.13 (м, 1Н, Н_3'), 3.77 (м, 1Н, Н_4'), 3.66 (м, 2Н, Н_5').

Пример 2.

Получение 9-(β-D-арабинофуранозил)-аденина (Ara-А, соединение XII, рис. 4).

Смесь 2.84 г (0.01 моль) аденозина (соединение XI, рис. 4), 3.66 г (0.015 моль) 1-β-D-арабинофуранозилурацила (соединение VIII, рис. 4) и 0.294 г (0.001 моль) NaH₂AsO₄ в 0.2 л 50 мМ калий-фосфатного буфера (рН 7.0) термостатируют в течение 16 часов при 52°С в присутствии 300 ед. акт. ферментного препарата ПНФ (30 ед. акт. на 1 ммоль аденозина) и 495 ед. акт. ферментного препарата УФ (33 ед. акт. на 1 ммоль 1-β-D-арабинофуранозилурацила). Контроль полноты процесса осуществляют с помощью ВЭЖХ. Процесс считается законченным, если содержание исходного аденозина (соединение XI, рис. 4) в реакционной смеси составляет <1%.

Реакционную смесь концентрируют в вакууме (15 мм рт. ст.) до 0.1 л, охлаждают до температуры 8°С. Выпавший в осадок целевой продукт отфильтровывают, промывают водой (3×20 мл) и этиловым спиртом (1×20 мл), затем высушивают в эксикаторе до постоянного веса. Выход: 2.65 г (93%). Чистота продукта по данным ВЭЖХ 99-99.4% (RT=10.2 мин, метод от 0 до 10% элюента В за 20 минут, элюент А - вода с 0.1% ТФУ, элюент В - 70% ацетонитрила в воде с 0.1% ТФУ, колонка Nova-Pak С18, 4.6×150 мм, 4 мкм). Т. пл. 260-262°С. λ_max, нм (ε, М^-1 см^-1): 262 (14800). Спектр ¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆), (δ м.д.): 8.17 (с, 1Н, Н-8), 8.12 (с, 1Н, Н-2), 7.19 (с, 2Н, NH₂), 6.25 (д, J=4.3 Гц, 1H, H_1'), 5.60 (уш. с, 1H, ОН_2'), 5.49 (д, J=3.3 Гц, 1H, ОН_3'), 5.05 (уш. т, 1H, ОН_5'), 4.13 (м, 2Н, Н_2' и Н_3'), 3.78 (м, 1Н, Н_4'), 3.68 и 3.63 (2м, 2Н, Н_5').

Пример 3.

Получение 9-β-D-арабинофуранозил-6-O-метилгуанина (неларабина, соединение XIV, рис. 5).

В 590 мл дистиллированной воды при нагревании растворяют 3.50 г (11.75 ммоль) 9-(β-D-рибофуранозил)-6-О-метилгуанина (CAS Number: 7803-88-5), 4.3 г (17.6 ммоль) 1-(β-D-арабинофуранозил)урацила, 0.294 г (0.001 моль) NaH₂AsO₄ и 1.605 г (11.8 ммоль) дигидроортофосфата калия. Доводят рН реакционной смеси до 7.0. В реакционную смесь добавляют 352 ед. пуриннуклеозидфосфорилазы (30 ед. акт. на 1 ммоль 9-(β-D-рибофуранозил)-6-О-метилгуанина) и 616 ед. уридинфосфорилазы (35 ед. акт. на 1 ммоль 1-β-D-арабинофуранозилурацила). Раствор термостатируют при 52°С в течение 7 суток. По окончании процесса реакционную смесь концентрируют в вакууме (15 мм рт. ст.) до объема 50 мл и хроматографируют на обращеннофазовом сорбенте Octadecyl=Si 100polyol (0.03 мм), размеры колонки: 25×400 мм Целевое соединение элюируют 2% ацетонитрила в воде. Фракции содержащие продукт объединяют, растворитель удаляют в вакууме (15 мм рт. ст.). Продукт сушат в вакууме (5 мм рт. ст.) над пятиокисью фосфора. Выход: 3.33 г (95%). Чистота продукта (по данным ВЭЖХ) 99.25% (RT=9.6 мин, метод от 0 до 20% элюента В за 20 минут, элюент А - вода с 0.1% ТФУ, элюент В - 70% ацетонитрила в воде с 0.1% ТФУ, колонка Nova-Pak С18, 4.6×150 мм, 4 мкм). λ_max 286, 244, 214 нм. Масс-спектр, m/z: 298.1208 [М+Н]⁺, 166.0777 [base+H]⁺. Расч. 298.2765 [М+Н]⁺, 166.1613 [base+H]⁺.

¹Н-ЯМР (ДМСО-d6, δ, ppm, J, Гц): 7.92 (с, 1Н, Н-8), 6.41 (с, 2Н, NH₂), 6.12 (д, J=4.7, 1H, Н_1'), 5.60 (уш. с, 1H, ОН_5'), 5.48 (уш. с, 1Н, ОН_3'), 5.04 (уш. с, 1H, ОН_2'), 4.09 (дд, J=3.9 и 4.1, 1Н, Н_3'), 4.06 (дд, J=4.2 и 4.4, 1H, Н_2'), 3.75 (м, 1Н, Н_4'), 3.65 (м, 1H, Н_5а'), 3.60 (м, 1H, H_5b').

¹³С-ЯМР (ДМСО-d6, δ, ppm): 160.98 (С6), 154.44 (С4), 139.50 (С8), 113.62 (С5), 84.69 (С-4'), 83.82 (С-1'), 75.96 (С-2'), 75.81 (С3'), 61.44 (С-5').

¹⁵³N-ЯМР (ДМСО-d6, δ, ppm): 239.56 (N7), 205.19 (N1), 188.81 (N3), 163.61 (N9).

Пример 4.

Получение 9-(β-D-арабинофуранозил)-2-фтораденина (флударабина, соединение IX, рисунок 6).

Смесь 1.70 г (0.006 моль) 2-фтораденозина (CAS Number: 146-78-1, соединение VII, рис. 6), 5.8 г (0.024 моль) 1-α-фосфат-D-арабинозы (соединение III, рис. 6) и 0.09 г (0.3 ммоль) NaH₂AsO₄ в 250 мл 60 мМ калий-фосфатного буфера (рН 7.0) термостатируют в течение 24 часов при 50°С в присутствии 375 ед. акт. ферментного препарата ПНФ (62.5 ед. акт. на 1 ммоль 2-фтораденозина). Контроль полноты процесса осуществляют с помощью ВЭЖХ. Процесс считается законченным, если содержание исходного 2-фтораденозина (соединение VII, рис. 6) в реакционной смеси составляет <0.2%.

Реакционную смесь охлаждают до температуры 8°С. Выпавший в осадок целевой продукт отфильтровывают, промывают водой (3×10 мл) и этиловым спиртом (1×10 мл), затем высушивают в эксикаторе до постоянного веса. Выход: 1.67 г (98%). Чистота продукта по данным ВЭЖХ 99-99.4% (метод от 0 до 20% элюента В за 20 минут, элюент А - вода с 0.1% ТФУ, элюент В - 70% ацетонитрила в воде с 0.1% ТФУ, колонка Nova-Pak С18, 4.6×150 мм, 4 мкм). Т. пл. 260-262°С. λ_max, нм (ε, М^-1 см^-1): 262 (14800). Спектр ¹H-ЯМР (ДМСО-d₆), (δ м.д.): 8.17 (с, 1Н, Н-8), 7.76 (с, 2Н, NH₂), 6.11 (д, J=5.0 Гц, 1Н, Н_1'), 5.61 (д, J=5.3 Гц, 1Н, ОН_2'), 5.51 (д, J=4.7 Гц, 1Н, ОН_3'), 5.05 (т, J=4.3 Гц, 1Н, ОН_5'), 4.14 (м, 1Н, Н_2'), 4.13 (м, 1H, Н_3'), 3.77 (м, 1Н, Н_4'), 3.66 (м, 2Н, Н_5').

Пример 5.

Получение 9-(β-D-арабинофуранозил)-аденина (Ara-А, соединение XII, рис. 7).

Смесь 2.84 г (0.01 моль) аденозина (соединение XI, рис. 7), 9.68 г (0.04 моль) 1-α-фосфат-D-арабинозы (соединение III, рис. 7) и 0.294 г (0.001 моль) NaH₂AsO₄ в 0.2 л 50 мМ калий-фосфатного буфера (рН 7.0) термостатируют в течение 4 часов при 52°С в присутствии 300 ед. акт. ферментного препарата ПНФ (30 ед. акт. на 1 ммоль 2'-дезоксиаденозина). Контроль полноты процесса осуществляют с помощью ВЭЖХ. Процесс считается законченным, если содержание исходного аденозина (соединение XI, рис. 7) в реакционной смеси составляет <1%.

Реакционную смесь концентрируют в вакууме (15 мм рт. ст.) до 0.1 л, охлаждают до температуры 8°С. Выпавший в осадок целевой продукт отфильтровывают, промывают водой (3×20 мл) и этиловым спиртом (1×20 мл), затем высушивают в эксикаторе до постоянного веса. Выход: 2.60 г (92%). Чистота продукта по данным ВЭЖХ 99.0-99.4% (RT=10.2 мин, метод от 0 до 10% элюента В за 20 минут, элюент А - вода с 0.1% ТФУ, элюент В - 70% ацетонитрила в воде с 0.1% ТФУ, колонка Nova-Pak С18, 4.6×150 мм, 4 мкм). Т. пл. 260-262°С. λ_max, нм (ε, М^-1 см^-1): 262 (14800). Спектр ¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆), (δ м.д.): 8.17 (с, 1H, Н-8), 8.12 (с, 1Н, Н-2), 7.19 (с, 2Н, NH₂), 6.25 (д, J=4.3 Гц, 1Н, Н_1'), 5.60 (уш. с, ОН_2'), 5.49 (д, J=3.3 Гц, ОН_3'), 5.05 (уш. т, ОН_5'), 4.13 (м, 2Н, Н_2' и Н_3'), 3.78 (м, 1Н, Н_4'), 3.68 и 3.63 (2м, 2Н, Н_5').

Пример 6.

Получение 9-β-D-арабинофуранозил-6-O-метилгуанина (неларабина, соединение XIV, рис. 8).

В 590 мл дистиллированной воды при нагревании растворяют 3.50 г (11.75 ммоль) 9-(β-D-рибофуранозил)-6-О-метилгуанина (CAS Number: 7803-88-5), 11.4 г (47.0 ммоль) 1-α-фосфат-D-арабинозы, 0.294 г (0.001 моль) NaH₂AsO₄ и 1.605 г (11.8 ммоль) дигидроортофосфата калия. Доводят рН реакционной смеси до 7.0. В реакционную смесь добавляют 352 ед. пуриннуклеозидфосфорилазы (30 ед. акт. на 1 ммоль 9-(β-D-рибофуранозил)-6-О-метилгуанина). Раствор термостатируют при 52°С в течение 7 суток. По окончании процесса реакционную смесь концентрируют в вакууме (15 мм рт. ст.) до объема 50 мл и хроматографируют на обращеннофазовом сорбенте Octadecyl=Si 100polyol (0.03 мм), размеры колонки: 25×400 мм Целевое соединение элюируют 2% ацетонитрила в воде. Фракции содержащие продукт объединяют, растворитель удаляют в вакууме (15 мм рт. ст.). Продукт сушат в вакууме (5 мм рт. ст.) над пятиокисью фосфора. Выход: 3.20 г (91%). Чистота продукта (по данным ВЭЖХ) 99.0-99.25% (RT=9.6 мин, метод от 0 до 20% элюента В за 20 минут, элюент А - вода с 0.1% ТФУ, элюент В - 70% ацетонитрила в воде с 0.1% ТФУ, колонка Nova-Pak С18, 4.6×150 mm, 4 мкм). λ_max 286, 244, 214 нм. Масс-спектр, m/z: 298.1208 [М+Н]⁺, 166.0777 [base+H]⁺. Расч. 298.2765 [М+Н]⁺, 166.1613 [base+H]⁺.

¹Н-ЯМР (ДМСО-d6, δ, ppm, J, Гц): 7.92 (с, 1Н, Н-8), 6.41 (с, 2Н, NH₂), 6.12 (д, J=4.7, 1Н, Н_1'), 5.60 (уш. с, 1H, ОН_5'), 5.48 (уш. с, 1Н, ОН_3'), 5.04 (уш. с, 1Н, ОН_2'), 4.09 (дд, J=3.9 и 4.1, 1Н, Н_3'), 4.06 (дд, J=4.2 и 4.4, 1Н, Н_2'), 3.75 (м, 1Н, Н_4'), 3.65 (м, 1Н, Н_5а'), 3.60 (м, 1H, H_5b').

¹³С-ЯМР (ДМСО-d6, δ, ppm): 160.98 (С6), 154.44 (С4), 139.50 (С8), 113.62 (С5), 84.69 (С-4'), 83.82 (С-1'), 75.96 (С-2'), 75.81 (С3'), 61.44 (С-5').

¹⁵³N-ЯМР (ДМСО-d6, δ, ppm): 239.56 (N7), 205.19 (N1), 188.81 (N3), 163.61 (N9).

Пример 7.

Получение 9-(β-D-арабинофуранозил)-2-фтораденина (флударабина, соединение IX) без использования арсената натрия.

Смесь 1.7 г (0.006 моль) 2-фтораденозина (CAS Number: 146-78-1, соединение VII), 2.2 г (0.009 моль) 1-β-D-арабинофуранозилурацила (соединение VIII) и 0.882 г (0.003 моль) в 0.2 л 60 мМ калий-фосфатного буфера (рН 7.0) термостатируют в течение 120 часов при 48°С в присутствии 375 ед. акт. ферментного препарата ПНФ (62.5 ед. акт. на 1 ммоль 2-фтораденозина) и 563 ед. акт. ферментного препарата УФ (62.5 ед. акт. на 1 ммоль 1-β-D-арабинофуранозилурацила). Контроль полноты процесса осуществляют с помощью ВЭЖХ. Процесс считается законченным, если по данным ВЭЖХ содержание исходного 2-фтораденозина (соединение VII, рис. 3) и продукта флударабина (соединение IX) не изменяется.

Реакционную смесь охлаждают до температуры 8°С. Выпавший в осадок целевой продукт отфильтровывают, промывают водой (3×20 мл) и этиловым спиртом (1×20 мл), затем высушивают в эксикаторе до постоянного веса. Выход: 1.2 г (70%). Чистота продукта по данным ВЭЖХ 99-99.4% (метод от 0 до 20% элюента В за 20 минут, элюент А - вода с 0.1% ТФУ, элюент В - 70% ацетонитрила в воде с 0.1% ТФУ, колонка Nova-Pak С18, 4.6×150 мм, 4 мкм). Т. пл. 260-262°С. λ_max, нм (ε, М^-1 см^-1): 262 (14800). Спектр ¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆), (δ м.д.): 8.17 (с, 1H, Н-8), 7.76 (с, 2Н, NH₂), 6.11 (д, J=5.0 Гц, 1Н, Н_1'), 5.61 (д, J=5.3 Гц, 1Н, ОН_2'), 5.51 (д, J=4.7 Гц, 1Н, ОН_3'), 5.05 (т, J=4.3 Гц, 1Н, ОН_5'), 4.14 (м, 1Н, Н_2'), 4.13 (м, 1Н, Н_3'), 3.77 (м, 1Н, Н_4'), 3.66 (м, 2Н, Н_5').

Пример 8.

Получение 9-(β-D-арабинофуранозил)-аденина (Ara-А, соединение XII) без использования арсената натрия.

Смесь 1.4 г (0.005 моль) аденозина (соединение XI), 1.8 г (0.0075 моль) 1-β-D-арабинофуранозилурацила (соединение VIII) в 0.1 л 50 мМ калий-фосфатного буфера (рН 7.0) термостатируют в течение 24 часов при 52°С в присутствии 150 ед. акт. ферментного препарата ПНФ (30 ед. акт. на 1 ммоль 2'-дезоксиаденозина) и 250 ед. акт. ферментного препарата УФ (33 ед. акт. на 1 ммоль 1-β-D-арабинофуранозилурацила). Контроль полноты процесса осуществляют с помощью ВЭЖХ. Процесс считается законченным, если остаточное содержание исходного аденозина (соединение XI) в реакционной смеси остается неизменным.

Реакционную смесь концентрируют в вакууме (15 мм рт. ст.) до 0.05 л, охлаждают до температуры 8°С. Выпавший в осадок целевой продукт отфильтровывают, промывают водой (3×5 мл) и этиловым спиртом (1×5 мл), затем высушивают в эксикаторе до постоянного веса. Выход: 0.65 г (45%). Чистота продукта по данным ВЭЖХ 99-99.4% (RT=10.2 мин, метод от 0 до 10% элюента В за 20 минут, элюент А - вода с 0.1% ТФУ, элюент В - 70% ацетонитрила в воде с 0.1% ТФУ, колонка Nova-Pak С18, 4.6×150 мм, 4 мкм). Т. пл. 260-262°С. λ_max, нм (ε, М^-1 см^-1): 262 (14800). Спектр ¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆), (δ м.д.): 8.17 (с, 1H, Н-8), 8.12 (с, 1Н, Н-2), 7.19 (с, 2Н, NH₂), 6.25 (д, J=4.3 Гц, 1H, Н_1'), 5.60 (уш. с, ОН_2'), 5.49 (д, J=3.3 Гц, ОН_3'), 5.05 (уш. т, ОН_5'), 4.13 (м, 2Н, Н_2' и Н_3'), 3.78 (м, 1Н, Н_4'), 3.68 и 3.63 (2м, 2Н, Н_5').

Пример 9.

Получение 9-β-D-арабинофуранозил-6-O-метилгуанина (неларабина, соединение XIV) без использования арсената натрия.

В 200 мл дистиллированной воды при нагревании растворяют 1.17 г (4.0 ммоль) 9-(β-D-рибофуранозил)-6-O-метилгуанина (CAS Number: 7803-88-5), 1.46 г (6.0 ммоль) 1-(β-D-арабинофуранозил)урацила и 1.605 г (11.8 ммоль) дигидроортофосфата калия. Доводят рН реакционной смеси до 7.0. В реакционную смесь добавляют 120 ед. пуриннуклеозидфосфорилазы (30 ед. акт. на 1 ммоль 9-(β-D-рибофуранозил)-6-O-метилгуанина) и 210 ед. уридинфосфорилазы (35 ед. акт. на 1 ммоль 1-β-D-арабинофуранозилурацила). Раствор термостатируют при 52°С в течение 7-8 суток. По окончании процесса реакционную смесь концентрируют в вакууме (15 мм рт. ст.) до объема 10 мл и хроматографируют на обращеннофазовом сорбенте Octadecyl=Si 100polyol (0.03 мм), размеры колонки: 20×300 мм Целевое соединение элюируют 2% ацетонитрила в воде. Фракции содержащие продукт объединяют, растворитель удаляют в вакууме (15 мм рт. ст.). Продукт сушат в вакууме (5 мм рт. ст.) над пятиокисью фосфора. Выход: 0.78 г (67%). Чистота продукта (по данным ВЭЖХ) 90-91% (RT=9.6 мин, метод от 0 до 20% элюента В за 20 минут, элюент А - вода с 0.1% ТФУ, элюент В - 70% ацетонитрила в воде с 0.1% ТФУ, колонка Nova-Pak С18, 4.6×150 мм, 4 мкм). λ_max 286, 244, 214 нм. Масс-спектр, m/z: 298.1208 [М+Н]⁺, 166.0777 [base+H]⁺. Расч. 298.2765 [М+Н]⁺, 166.1613 [base+H]⁺.

¹Н-ЯМР (ДМСО-d6, δ, ppm, J, Гц): 7.92 (с, 1Н, Н-8), 6.41 (с, 2Н, NH₂), 6.12 (д, J=4.7, 1Н, Н_1'), 5.60 (уш. с, 1Н, ОН_5'), 5.48 (уш. с, 1Н, ОН_3'), 5.04 (уш. с, 1H, ОН_2'), 4.09 (дд, J=3.9 и 4.1, 1H, Н_3'), 4.06 (дд, J=4.2 и 4.4, 1Н, Н_2'), 3.75 (м, 1H, Н_4'), 3.65 (м, 1H, H_5a'), 3.60 (м, 1Н, H_5b').

¹³С-ЯМР (ДМСО-d6, δ, ppm): 160.98 (С6), 154.44 (С4), 139.50 (С8), 113.62 (С5), 84.69 (С-4'), 83.82 (С-1'), 75.96 (С-2'), 75.81 (С3'), 61.44 (С-5').

¹⁵³N-ЯМР (ДМСО-d6, δ, ppm): 239.56 (N7), 205.19 (N1), 188.81 (N3), 163.61 (N9).

Пример 10.

Получение 9-(β-D-арабинофуранозил)гипоксантина (Ara-Hyp, соединение XVI, рис. 9).

Смесь 0.27 г (1.0 ммоль) инозина (CAS Number: 58-63-9) (соединение XV, рис. 9), 0.314 г (1.3 ммоль) 1-β-D-арабинофуранозилурацила (соединение VIII, рис. 9) и 0.031 г (0.1 ммоль) NaH₂AsO₄ в 50.0 мл 50 мМ калий-фосфатного буфера (рН 7.0) термостатируют в течение 48 часов при 52°С в присутствии 30 ед. акт. ферментного препарата ПНФ (30 ед. акт. на 1 ммоль аденозина) и 45 ед. акт. ферментного препарата УФ (35 ед. акт. на 1 ммоль 1-β-D-арабинофуранозилурацила). Контроль полноты процесса осуществляют с помощью ВЭЖХ. Процесс считается законченным, если содержание исходного инозина (соединение XV, рис. 9) в реакционной смеси составляет <1%.

Реакционную смесь концентрируют в вакууме (15 мм рт. ст.) до 5 мл и хроматографируют на обращеннофазовом сорбенте Octadecyl=Si 100polyol (0.03 мм), размеры колонки: 15×150 мм Целевое соединение элюируют водой. Фракции содержащие продукт объединяют, растворитель удаляют в вакууме (15 мм рт. ст.). Продукт сушат в вакууме (5 мм рт. ст.) над пятиокисью фосфора. Выход: 0.26 г (98%). Чистота продукта по данным ВЭЖХ 98.2% (RT=8.34, метод от 0 до 10% элюента В за 20 минут, элюент А - вода с 0.1% ТФУ, элюент В - 70% ацетонитрила в воде с 0.1% ТФУ, колонка Nova-Pak С18, 4.6×150 мм, 4 мкм). Масс-спектр, m/z: 268.0800 [М+Н]⁺, 136.0400 [base+H]⁺. Расч. 268.0808 [М+Н]⁺, 136.0385 [base+H]⁺. Спектр ¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆), (δ м.д.): 8.08 (с, 1H, Н-8), 8.00 (с, 1Н, Н-2), 6.20 (д, J=4.9 Гц, 1Н, H_1'), 4.15 (м, 1H, Н_2'), 4.13 (м, 1Н, Н_3'), 3.77 (м, 1H, Н_4'), 3.68 (м, 1Н, Н_5'), 3.63 (м, 1Н, Н_5').

Пример 11.

Получение 2-хлор-9-(β-D-арабинофуранозил)аденина (Cl-AraA), соединение XVIII, рис. 10).

Смесь 0.30 г (1.0 ммоль) 2-хлор-аденозина (CAS Number: 146-77-0) (соединение XVII, рис. 10), 0.29 г (1.2 ммоль) 1-β-D-арабинофуранозилурацила (соединение VIII, рис. 10) и 0.003 г (0.01 ммоль) NaH₂AsO₄ в 50.0 мл 50 мМ калий-фосфатного буфера (рН 7.0) термостатируют в течение 48 часов при 52°С в присутствии 60 ед. акт. ферментного препарата ПНФ (60 ед. акт. на 1 ммоль аденозина) и 78 ед. акт. ферментного препарата УФ (65 ед. акт. на 1 ммоль 1-β-D-арабинофуранозилурацила). Контроль полноты процесса осуществляют с помощью ВЭЖХ. Процесс считается законченным, если содержание исходного 2-хлор-аденозина (соединение XVII, рис. 10) в реакционной смеси составляет <2%.

Реакционную смесь концентрируют в вакууме (15 мм рт. ст.) до 10 мл и хроматографируют на обращеннофазовом сорбенте Octadecyl=Si 100polyol (0.03 мм), размеры колонки: 15×250 мм Целевое соединение элюируют в градиенте 0-20% ацетонитрила в воде. Фракции содержащие продукт объединяют, растворитель удаляют в вакууме (15 мм рт. ст.). Продукт сушат в вакууме (5 мм рт. ст.) над пятиокисью фосфора. Выход: 0.297 г (99%). Чистота продукта по данным ВЭЖХ 99.8% (RT=9.42 мин, метод изократический 7% элюента В за 20 минут, элюент А - вода с 0.1% ТФУ, элюент В - 70% ацетонитрила в воде с 0.1% ТФУ, колонка Nova-Pak С18, 4.6×150 мм, 4 мкм). λ_max 262, 210 нм. Спектр ¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆), (δ м.д.): 8.20 (с, 1Н, Н-8), 7.44 (с, 2Н, NH₂), 6.14 (д, J=5.15 Гц, 1Н, Н_1'), 5.63 (1Н, уш. с, ОН_2'), 5.54 (1Н, уш. с, ОН_3'), 5.07 (1Н, уш. с, ОН_5'), 4.16 (м, 1H, Н_2'), 4.11 (м, 1H, Н_3'), 3.77 (м, 1Н, Н_4'), 3.67 и 3.63 (2м, 2Н, Н_5').

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ получения модифицированных пуриновых нуклеозидов ряда β-D-арабинофуранозы. Способ осуществляют взаимодействием пуринового рибонуклеозида с 1-β-D-арабинофуранозилурацилом или 1-α-фосфатом D-арабинозы в калий-фосфатном буфере в присутствии пуриннуклеозидфосфорилазы или смеси пурин- и пиримидиннуклеозидфосфорилаз в присутствии солей ортомышьяковой кислоты. Изобретение обеспечивает упрощение технологии получения модифицированных пуриновых нуклеозидов ряда β-D-арабинофуранозы из природных или химически модифицированных нуклеозидов β-D-рибофуранозы. 1 табл., 16 ил., 11 пр.

Способ получения модифицированных пуриновых нуклеозидов ряда β-D-арабинофуранозы взаимодействием пуринового рибонуклеозида с 1-β-D-арабинофуранозилурацилом или 1-α-фосфатом D-арабинозы в калий-фосфатном буфере в присутствии пуриннуклеозидфосфорилазы или смеси пурин- и пиримидиннуклеозидфосфорилаз в присутствии солей ортомышьяковой кислоты.