Способ выделения штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти Российский патент 2017 года по МПК B09C1/10 

Изобретение относится к области охраны окружающей среды и может быть использовано для очистки нефтезагрязненных почв и грунтов и восстановления нефтезагрязненных земель.

Известны публикации, в которых показано, что создание микробиологических препаратов на основе микроорганизмов-деструкторов нефти, а также изучение в почве их ценозов с целью регуляции численности и активности невозможно без выделения чистых культур эффективных деструкторов [1-2]. Общепринятыми способами выделения микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов является получение накопительных культур. Согласно таким способам образцы почвы или воды вносят в питательную среду, где единственным источником углерода выступает нефть или нефтепродукты. Пробы инкубируют 7-10 суток при оптимальных условиях роста микроорганизмов, а затем из выросших колоний выделяют чистые культуры [3-6]. Недостатком этих способов является то, что микроорганизмы-деструкторы нефти отбирают на питательной среде в оптимальных условиях влажности, температуры и питания. Между тем, в почве действуют многочисленные биотические и абиотические факторы, которые влияют на рост и способность микроорганизмов к разложению нефти. Таким образом, при использовании способа накопительной культуры выделяют потенциальные, а не реальные микроорганизмы-деструкторы нефти, которые эффективны в конкретных почвенно-климатических условиях. В результате практически все имеющиеся сведения о разнообразии, таксономическом составе и активности почвенных микроорганизмов-деструкторов нефти, полученные с помощью подобных методик, существенно искажены. Биопрепараты, созданные на основе штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти, отобранных с помощью такого способа, часто характеризуются низкой эффективностью и нестабильным действием в регионе применения.

Известен способ выделения микроорганизмов-деструкторов нефти, включающий отбор проб с нефтезагрязненных почв и грунтов, выделение ассоциации активных аборигенных штаммов-деструкторов нефти и нефтепродуктов, активацию полученной ассоциации и дальнейшую наработку биомассы ассоциации в ферментерах при оптимальных параметрах культивирования. Для выделения микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов используют жидкую питательную среду Маккланга следующего состава: NaNO₃ - 2,0 г/л; KH₂PO₄ - 1,0 г/л; MnSO₄ - 0,013 г/л; MgSO₄⋅7H₂O - 0,5 г/л; ZnSO₄ - 0,002 г/л; Fe₂(SO₄)₃ - 0,001 г/л. В качестве единственного источника углерода и энергии добавляют стерильный гексадекан (1 мас. %). Культивирование проводят в качалочных колбах на термостатированной качалке при температуре 30°С и частоте вращения 100 мин-1 в течение 3 суток [7]. Однако в известном способе преимущество получают бактерии с достаточно высоким температурным оптимумом роста 30°С, которые непригодны для использования при более низких температурах. Между тем, в северных регионах, в частности в Канаде, России и др., нефтезагрязненные почвы, требующие очистки, находятся в климатических условиях, при которых активность почвенной микрофлоры лимитируется низкой температурой. В известном способе в качестве источника углерода используют гексадекан, что предполагает выделение микроорганизмов, способных окислять именно этот углеводород. Для выделения микроорганизмов-деструкторов нефти требуется дополнительная проверка, т.к. не все микроорганизмы, разлагающие гексадекан, обладают ферментами для разложения нефти.

Известен способ, включающий отбор нефтезагрязненных образцов, приготовление питательных сред с разной концентрацией нефти за счет добавления полисорбата-80, делающего нефть растворимой в воде, высев нефтезагрязненных образцов на среды, культивирование микроорганизмов в оптимальных условиях, отбор штаммов микроорганизмов, выросших на средах [8]. Известный способ позволяет отобрать потенциальные нефтедеструкторы, активно разлагающие нефть в оптимальных условиях культивирования.

Известен способ, включающий отбор проб с нефтезагрязненной поверхности, выделение чистых культур углеводородокисляющих бактерий, культивирование их на плотной питательной среде, определение каталазной активности у выросших штаммов микроорганизмов, смешивание взвеси клеток микроорганизмов с жидкой средой Раймонда, куда добавлена нефть или нефтепродукты в качестве единственного источника углерода, инкубирование взвеси в течение 12 суток, высев на плотную питательную среду, определение у исследуемых штаммов микроорганизмов каталазной активности, отбор штамма микроорганизма как активного деструктора нефти и нефтепродуктов при снижении каталазной активности по сравнению с исходной на 30% и более [9]. В предложенном способе отбирают микроорганизмы, снижающие каталазную активность на питательной среде в оптимальных условиях роста. Такие микроорганизмы не могут гарантированно проявлять высокую приживаемость и эффективность при разложении нефти в естественных условиях. Кроме того, для определения каталазной активности требуются дополнительные материальные затраты, специальное оборудование и обученный персонал.

Известен способ, наиболее близкий к заявляемому изобретению [10], включающий отбор проб с нефтезагрязненной поверхности, просушивание образцов до воздушно-сухого состояния, селекцию углеводородокисляющих бактерий на жидкой минеральной среде с добавлением нефти с места загрязнения при температурах инкубирования +5°С, +15°С, +25°С и +35°С, отбор культур для пересева и дальнейшую наработку в отдельности всех отселектированных микроорганизмов в ферментерах при параметрах культивирования, оптимальных для выделенных микроорганизмов.

Недостатками известного способа являются:

1. Сложность отбора микроорганизмов-деструкторов нефти на жидкой минеральной среде, связанная с тем, что нефть не растворяется в воде [11].

2. Низкая приживаемость в естественной нефтезагрязненной почве микроорганизмов-деструкторов нефти, которые отобраны по способности адаптироваться только к одному фактору - температуре.

3. Возможная низкая эффективность при разложении нефти отобранных микроорганизмов-деструкторов и нестабильность действия в силу их неадаптированности к совокупности абиотических и биотических условий места применения.

Техническим результатом заявленного изобретения является способ отбора микроорганизмов-нефтедеструкторов нефти в полевых условиях, включающих все разнообразие абиотических и биотических факторов, что обеспечивает получение штаммов бактерий и грибов с высокой способностью к нефтедеструкции в естественной почве, а также хорошей приживаемостью в месте применения. Способ не требует культивирования микроорганизмов-деструкторов нефти на жидкой питательной среде.

Сущность заявленного изобретения поясняется Фиг. 1 - Фиг. 4, на которых представлены:

На Фиг. 1 - Мембранный фильтр, пропитанный нефтью.

На Фиг. 2 - Мембранный фильтр, обернутый мельничным газом.

На Фиг. 3 - Картридж, куда вставлен фильтр, обернутый мельничным газом.

На Фиг. 4 - Картридж с мембранным фильтром, помещенный в почву. Позиция а - показана поверхность почвы.

Научными предпосылками заявляемого способа является установление существенной роли почвенных микроорганизмов - бактерий и грибов - в процессе естественного разложения нефти и нефтепродуктов в почве. Предполагается, что углеводородоокисляющие микроорганизмы обладают мобильным ферментным аппаратом и способны перестраиваться на использование углеводородов нефти [12-14].

Скорость разложения нефти зависит от концентрации и качественного состава углеводородов, а также от почвенно-климатических условий региона загрязнения [15-16, 1]. Разные группы и виды микроорганизмов сильно различаются по способности использовать различные классы углеводородов и требованиям, предъявляемым к условиям обитания: обеспеченности почвы кислородом, кислотности, содержанию элементов питания и др. [17].

Для изучения почвенной микрофлоры прямыми методами давно и успешно используются мембранные фильтры. Будучи непригодными для микроорганизмов в качестве питательного субстрата, мембранные фильтры позволяют проводить длительные наблюдения за поведением и взаимоотношениями бактерий и грибов в почве, а также выделять объекты исследования на питательные среды [18-19].

Заявленный способ был апробирован в загрязненной нефтью почве в лабораторных и полевых условиях.

Примеры конкретной апробации заявленного изобретения приведены ниже.

Примеры отбора микроорганизмов-нефтедеструкторов в полевых условиях.

Новизна предлагаемого способа заключается в том, что без промежуточных процедур отбирают штаммы микроорганизмов, способных окислять нефть и нефтепродукты, в конкретных условиях их применения, включающих почвенные (абиотические и биотические) и климатические (температура, влажность) факторы, а также другие особенности нефтезагрязненных почв. Данный способ отличается простотой и не требует значительных материальных затрат.

Для отбора микроорганизмов-нефтедеструкторов необходимо:

1. Инкубировать в почве картридж, содержащий пропитанный нефтью мембранный фильтр.

2. После периода инкубации высеять с мембранного фильтра бактерии и грибы.

3. Изолировать выросшие штаммы микроорганизмов в чистые культуры.

Пример 1. Подготовка картриджа к инкубированию в почве.

Заявленный способ основан на использовании мембранных фильтров, пропитанных нефтью. Мембранные фильтры представляют собой тонкую пластинку нитроцеллюлозы, пронизанную многочисленными извитыми порами. Такие поры позволяют почвенному раствору проникать в толщу фильтра и создавать на его поверхности условия, весьма приближенные к условиям почвенной среды. Размер пор может быть различным, в зависимости от марки фильтра, в том числе меньше, чем размер клеток прокариот. Это позволяет выделять как грибы, так и бактерии, заселившие поверхность фильтра.

При подготовке картриджа мембранные фильтры размером 1×1 см кипятят 20 мин в дистиллированной воде в закрытой посуде для удаления возможного загрязнения и стерилизации. Для предотвращение контаминации дальнейшие манипуляции желательно проводить в стерильных условиях. Фильтры высушивают до воздушно-сухого состояния на стерильной фильтровальной бумаге, затем погружают в предварительно простерилизованную нефть и выдерживают 180 с. Пропитанные нефтью фильтры раскладывают на фильтровальную бумагу и высушивают (Фиг. 1). Затем каждый фильтр оборачивают мельничным газом с размером пор 100-120 мкм (Фиг. 2) и закрепляют в картридже (Фиг. 3). К каждому картриджу привязывают леску длиной 20-25 см.

Мембранный фильтр, предварительно пропитанный нефтью, будучи помещен в почву, является приманкой для микроорганизмов, способных использовать циклические углеводороды в качестве источника углерода.

Пример 2. Инкубация картриджей в почве.

Интродукцию картриджей можно осуществлять на любом участке почвы (грунта) без учета особенностей рельефа, растительности, техногенных изменений и т.д. С помощью лопаты или шпателя в почве (грунте) делают вертикальную щель и помещают в нее картридж на глубину не менее 5-10 см от поверхности почвы, оставляя леску на поверхности. На расстоянии 10-15 см от щели втыкают лопату (шпатель) и прижимают почву (грунт) так, чтобы края щели сомкнулись. Это обеспечивает создание условий аэрации и влажности, максимально приближенных к естественным. Рядом с интродуцированным картриджем втыкают колышек, к которому привязывают леску, что облегчает поиск картриджа после окончания инкубации (Фиг. 4). Оптимальное время инкубации картриджей в почве - не менее 20-30 суток в весенне-летний период, 45-90 суток осенью и зимой.

Пример 3. Выделение микроорганизмов-нефтедеструкторов с мембранных фильтров и получение чистых культур.

После окончания периода инкубации картриджи извлекают из почвы и помещают в стерильные емкости для транспортировки. Желательно проводить посев в день извлечения картриджей. Если такая возможность исключена, то картриджи хранят 2-3 суток при температуре +5°C. Непосредственно перед посевом картриджи раскрывают, каждый извлеченный фильтр помещают в пробирку с 10 мл стерильной воды, встряхивают на ротаторе 10 мин. После этого готовят серию десятикратных разведений и высевают полученную суспензию поверхностно на твердую среду МПА для изоляции бактерий-деструкторов нефти и на твердую среду Чапека для изоляции грибов-нефтедеструкторов. Выросшие колонии оценивают по морфологическим признакам и все морфолого-культуральные типы изолируют в чистые культуры.

Пример 4. Сравнительная оценка способности окислять летучие фракции нефти у микроорганизмов, выделенных с мембранных фильтров и непосредственно из почвы.

Эффективность применения заявляемого способа проверена в условиях полевого эксперимента на дерново-подзолистой почве под растениями люпина и овсяницы. Картриджи с мембранными фильтрами (20 шт.) были интродуцированы в почву в начале июня. Время инкубации - 30 суток. С мембранных фильтров в чистые культуры изолировали 11 морфолого-культуральных типов бактерий и 7 морфолого-культуральных типов грибов. Одновременно с извлечением картриджей с поля отобрали образцы почвы и после приготовления десятикратных разведений произвели поверхностный посев на среду МПА и среду Чапека. Из почвы в чистые культуры изолировали 39 морфолого-культуральных типов бактерий и 18 морфолого-культуральных типов грибов. Уменьшение разнообразия бактерий и грибов на мембранных фильтрах свидетельствует об их избирательном заселении определенными видами микроорганизмов.

Для оценки способности выделенных микроорганизмов к усвоению летучих фракций нефти использовали бумажный фильтр, пропитанный нефтью. Такой фильтр помещали на внутреннюю сторону крышки чашки Петри. Для проверки нефтеокисляющей способности бактерий в чашки разливали твердую питательную среду Маккланга следующего состава: NaNO₃ - 2,0 г/л; KH₂PO₄ - 1,0 г/л; MnSO₄ - 0,013 г/л; MgSO₄⋅7H₂O - 0,5 г/л; ZnSO₄ - 0,002 г/л; Fe₂(SO₄)₃ - 0,001 г/л. Грибы проверяли на твердой среде Чапека без добавления сахарозы. После застывания сред производили поверхностный посев чистых культур бактерий и грибов. Образование колонии являлось признаком способности штамма усваивать летучие соединения нефти. Для характеристики активности культур при окислении циклических углеводородов оценивали скорость роста и размер колоний по 3-балльной шкале.

Было установлено:

1. Все штаммы бактерий (100%), выделенные с мембранных фильтров, были способны окислять летучие фракции нефти.

2. Среди бактерий, выделенных с мембранных фильтров, 54,5% проявляли максимальную активность (3 балла) при окислении летучих фракций нефти; 36,4% - среднюю активность (2 балла); 9,1% - низкую активность (1 балл).

3. Из числа бактерий, изолированных из почвы, способностью окислять летучие углеводороды обладали 43,6% штаммов.

4. Среди бактерий, выделенных из почвы, не обнаружено штаммов, обладающих высокой и средней активностью при разложении летучих фракций нефти. Низкую активность (1 балл) проявляли 23,1% культур; очень низкую (0,5 балла) - 20,5%.

5. Все штаммы грибов (100%), выделенные с мембранных фильтров, были способны окислять летучие фракции нефти.

6. Среди грибов, выделенных с мембранных фильтров, 57,1% проявляли максимальную активность (3 балла) при окислении летучих фракций нефти; 28,6% - среднюю активность (2 балла); 14,3% - очень низкую (0,5 балла).

7. Из числа грибов, изолированных из почвы, способностью окислять летучие углеводороды обладали 50% штаммов.

8. Среди грибов, выделенных из почвы, 27,8% проявляли максимальную активность (3 балла) при окислении летучих фракций нефти; 5,5% - низкую активность (1 балл); 16,7 - очень низкую активность (0,5 балла).

Как показывают результаты апробации заявляемого способа, все выделенные с мембранного фильтра штаммы бактерий и грибов способны разлагать летучие фракции нефти. При этом более половины из них демонстрируют высокую активность окисления циклических углеводородов, что позволяет рекомендовать заявляемый способ как эффективный метод отбора микроорганизмов-деструкторов нефти, способных к ее разложению в конкретных почвенно-климатических условиях, с целью создания биопрепаратов для очистки нефтезагрязненных почв и грунтов.

Используемые источники информации

1. Шамраев А.В., Шорина Т.С. Влияние нефти и нефтепродуктов на различные компоненты окружающей среды // Вестник Оренбургского государственного университета. 2009. №6. С. 642-645.

2. Кобзев Е. Н., Шкидченко А.И. Оценка углеводородокисляющей активности микроорганизмов // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. Т 39. №1. С. 25-31.

3. Нгуен Тиен, Сопрунова Б.О. Поиск и выявление новых бактериальных штаммов с полифункциональными свойствами в техногенных субстратах // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2011. Т. 13 №5(3). С. 167-170.

4. Киреева Н.А., Григориади А.С., Хайбулина Е.Ф. Ассоциации нефтеокисляющих микроорганизмов для биоремедиации нефтезагрязненных почв // Вестник Башкирского университета. 2009. Т. 9. №2. С. 391-394.

5. Бабаев Э.Р., Мамедова П.Ш., Кулиева Д.М., Мовсумзаде М.Э. Выбор активного микроорганизма-деструктора углеводородов для очистки нефтезагрязненных почв Балаханского месторождения // Башкирский химический журнал. 2009. Т. 16. №1. С. 103-106.

6. Plakunov V.K., Zhurina M.V., Beliaev S.S. Resistance of the petroleum-oxidizing microorganism Dietzia sp.to hyperosmotic shock in reconstituted biofilms // Microbiologiia. 2008. №77(5). P. 581-590.

7. Патент RU 2 352 630 C1, опубликовано 20.04.2009. «Способ выделения и активации консорциума аборигенных микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов» (прототип)

8. Патент CN 104388312, опубликовано 12.10.2014. «Screening methodfor petroleum degrading bacteria, method for preparing petroleum degrading bacteria inoculant from screened bacteria, and application of inoculant».

9. Патент RU 2 426 781 C2, опубликовано 20.08.2011. «Способ выбора штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов».

10. Патент RU 2241745, опубликовано 10.12.2004. «Способ выделения деструкторов нефти и нефтепродуктов» - прототип.

11. Егоров Н.С. Микробиология и биотехнология. 1987. М.: Высшая школа. 143 с.

12. Renner K.О., Agwu О.A. The status of the soil microbial flora and oil content of Imore, a coastal community in Lagos state, Nigeria after petroleum spill and fire outbreak // International Journal of Biosciences (IJB). 2012. Vol. 2. No. 2. P. 27-35.

13. Zrafi-Nouira I., Saidane-Mosbahi D., Abdelghani S., Bakhrouf A., Rouabhia M.. Crude Oil Metagenomics for Better Bioremediation of Contaminated Environments // Dans "Introduction to Enhanced Oil Recovery (EOR) Processes and Bioremediation of Oil-Contaminated Sites". Edited by Laura Romero-Zeron. ISBN 978-953-51-0629-6. 2012, P. 318.

14. Габбасова И.M. Деградация и рекультивация почв Башкортостана. Уфа. Гилем. 2004 г. 284 с.

15. Ильин Н.П. и др. Наблюдение за самоочищением почв от нефти в средней и южной тайге // Добыча полезных ископаемых и геохимия природных экосистем. М.: Наука, 1982. С. 245-258.

16. Куликова И.Ю. Биодеградация нефтяных загрязнений // Экология и промышленность России. Астраханский государственный технический университет. 2008 г.

17. Кононова В.В., Самсонова А.С., Семочкина Н.Ф. Сурфактантобразующая микрофлора: свойства и практическое использование. Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты // Сборник научных трудов ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси». 2007 г.

18. Шахназарова В.Ю., Струнникова O.К., Вишневская Н.А. Влияние влажности на развитие Fusarium culmorum в почве // Микология и фитопатологии. 1999. Том 33. Вып. №1. С. 53-59.

19. Струнникова O.К., Шахназарова В.Ю., Вишневская Н.А., Муромцев Г.С. Применение мембранных фильтров и иммунофлюоресцентного окрашивания для наблюдения за развитием почвообитающих микромицетов. // Микология и фитопатологии. 1998. Том 32. Вып. 2. С. 65-71.

Способ выделения микроорганизмов-деструкторов нефти содержит селекцию микроорганизмов-деструкторов с последующим их выделением в чистую культуру. Селекцию проводят с помощью мембранного фильтра, предварительно пропитанного нефтью, который погружают в очищаемую почву на глубину 5-10 см от поверхности почвы и выдерживают там от 20 до 90 суток, а выделение микроорганизмов-деструкторов нефти, способных к ее разложению в конкретных почвенно-климатических условиях, осуществляют с мембранным фильтром. Мембранный фильтр помещают в пробирку с 10 мл стерильной воды, встряхивают не менее 10 минут, после чего полученную суспензию высевают поверхностно на мясо-пептонный агар для изоляции бактерий деструкторов и на среду Чапека для изоляции грибов-нефтедеструкторов. Использование данного изобретения обеспечивает получение штаммов бактерий и грибов с высокой способностью к нефтедеструкции в естественной почве, а также хорошей приживаемостью в месте применения. 4 ил.

Способ выделения микроорганизмов-деструкторов нефти, включающий селекцию микроорганизмов-деструкторов с последующим их выделением в чистую культуру, отличающийся тем, что селекцию проводят с помощью мембранного фильтра, предварительно пропитанного нефтью, который погружают в очищаемую почву на глубину не менее 5-10 см от поверхности почвы и выдерживают там от 20 до 90 суток, а выделение микроорганизмов-деструкторов нефти, способных к ее разложению в конкретных почвенно-климатических условиях, осуществляют с мембранного фильтра, который помещают в пробирку с 10 мл стерильной воды, встряхивают не менее 10 мин, после чего полученную суспензию высевают поверхностно на мясо-пептонный агар для изоляции бактерий-деструкторов и на среду Чапека для изоляции грибов-нефтедеструкторов.